20
NAMA : Luh Putu Desy Puspaningrat, NRP: B253140131 JUDUL ARTIKEL : ESX-1-mediated Translocation To The Cytosol Controls Virulence Of Mikobakteri ABSTRAK Spesies Mikobakteri, termasuk Mycobacterium TBC dan Mycobacterium lepra merupakan bakteri patogen yang dapat menginfeksi manusia. Patogen ini secara eksklusif melokalisasi dalam phagosome sel inang. Namun sebagai relevansi biologis translokasi mikrobakteri untuk sitosol masih belum jelas. Penelitian ini menggunakan teknik mikroskop elektron untuk membangun hubungan yang jelas antara translokasi dan virulensi Mycobacterium. Spesies Mycobacterium patogen ditemukan mentranslokasi ke sitosol, sedangkan spesies non-patogenik tidak melakukan translokasi. Peneliti mampu menghubungkan translokasi sitosol dengan patogenisitas dengan memperkenalkan system sekresi ESX-1 (tipe VII) dalam nonvirulent Mikobakteri bovis BCG. Selain itu, peneliti menunjukkan bahwa translokasi tergantung pada C- terminus dari awal-disekresi antigen ESAT-6. Pemotongan C- terminal dari ESAT-6 terbukti menghasilkan hubungan translokasi ke virulensi pada tikus yang telah dilemahkan. Penelitian ini menjelaskan mekanisme molekul translokasi dari mikobakteri. PENDAHULUAN

Luh Pt Desy,,Mikromol

Embed Size (px)

DESCRIPTION

sip

Citation preview

Page 1: Luh Pt Desy,,Mikromol

NAMA : Luh Putu Desy Puspaningrat, NRP: B253140131

JUDUL ARTIKEL : ESX-1-mediated Translocation To The Cytosol Controls Virulence Of

Mikobakteri

ABSTRAK

Spesies Mikobakteri, termasuk Mycobacterium TBC dan Mycobacterium lepra

merupakan bakteri patogen yang dapat menginfeksi manusia. Patogen ini secara eksklusif

melokalisasi dalam phagosome sel inang. Namun sebagai relevansi biologis translokasi

mikrobakteri untuk sitosol masih belum jelas. Penelitian ini menggunakan teknik mikroskop

elektron untuk membangun hubungan yang jelas antara translokasi dan virulensi

Mycobacterium. Spesies Mycobacterium patogen ditemukan mentranslokasi ke sitosol,

sedangkan spesies non-patogenik tidak melakukan translokasi. Peneliti mampu menghubungkan

translokasi sitosol dengan patogenisitas dengan memperkenalkan system sekresi ESX-1 (tipe

VII) dalam nonvirulent Mikobakteri bovis BCG. Selain itu, peneliti menunjukkan bahwa

translokasi tergantung pada C-terminus dari awal-disekresi antigen ESAT-6. Pemotongan C-

terminal dari ESAT-6 terbukti menghasilkan hubungan translokasi ke virulensi pada tikus yang

telah dilemahkan. Penelitian ini menjelaskan mekanisme molekul translokasi dari mikobakteri.

PENDAHULUAN

Bakteri pathogen telah berevolusi dalam mekanisme infeksi untuk menghindari sistem

imun sel inang. Mycobacterium tidak terkecuali, dan beberapa spesies pathogen dapat

menyebabkan penyakit yang parah pada manusia. Tuberculosis telah menyebabkan lebih dari 2

juta kematian per tahun, dan lepra telah menyerang 2-3 juta orang. Memahami mekanisme

virulensi Mycobacterium adalah penting untuk pengembangan vaksin dan pengobatan infeksi.

Kemampuan Mycobacterium dalam menyerang phagosomal yang matang dan berada dalam

phagosomal di makrofag sel inang merupakan dasar virulensi mikobakteri tersebut. Namun

Baru-baru ini peneliti melaporkan bahwa Mycobacterium tuberculosis mampu mentranslokasi

dari phagolysosomal ke dalam sitosol sel inang (van der Wel et al.,2007).

Dalam penelitian ini, peneliti menyelidiki apakah ada hubungan antara kehadiran

sekresi ESX - 1 diberbagai spesies Mycobacterium ( baik patogen atau nonpathogenic ) untuk

Page 2: Luh Pt Desy,,Mikromol

mentranslokasi ke sitosol. Peneliti menunjukkan virulensi yang sangat berkorelasi dengan

kemampuan mikobakteri untuk mentranslokasi ke sitosol pada sel fagosit manusia. Selain itu,

peneliti menunjukkan bahwa semua spesies patogen memiliki sebuah system sekresi ESX - 1

yang mengeluarkan ESAT - 6. Untuk menguji apakah sistem sekresi ESX - 1 diperlukan dan

cukup untuk translokasi, peneliti memperkenalkan kembali perpanjang dari gen RD1 cluster dari

M. tuberculosis dalam M. bovis BCG ( Pym et al . , 2003) dan menunjukkan bahwa BCG dengan

RD1, sistem sekresi ESX – 1 mentranslokasi ke sitosol dan memperlihatkan fenotipe lebih

pathogen. Penelitian ini menunjukkan bahwa translokasi sitosol adalah proses ESAT - 6

tergantung hanya relevan untuk pathogen spesies mikobakteri. Temuan ini memberikan wawasan

penting tentang virulensi mikobakteri dan menunjukkan translokasi yang merupakan kunci untuk

patogenesis mikobakteri .

METODE

Cultur Sel

Sel THP - 1 dikultur dalam medium RPMI -1640 ( Invitrogen ) dengan 10 % FCS dan

100 unit ml - 1 penisilin / streptomisin pada 37 derajat dan 5 % CO2 . Diferensiasi dari garis sel

monositik menjadi makrofag distimulasi dengan menambahkan 10 ml ng - 1 phorbol 12 -

miristat 13 - asetat ( PMA ) 1 hari sebelum infeksi. Hari selanjutnya, sel diberi media segar tanpa

PMA dan pen/strep. DC primer manusia diinfeksi dengan M. tuberculosis H37Rv.

METODE

Kultur BakteriCultur Sel

Mikroskop Electron SDS-PAGE dan

Immunoblot

Page 3: Luh Pt Desy,,Mikromol

Kultur Bakteri

Beberapa spesies mikrobakteri patogen, oportunistik dan non-patogenik diisolasi atau

diperoleh melalui beberapa laboratorium (Tabel S1). Semua strain mikobakteri ditumbuhkan

untuk log-fase dalam 7H9 dilengkapi dengan 10% ADC dan 0,05% Tween80. Bakteri dicuci

dengan media RPMI-1640, disentrifugasi dua kali di 750 r.p.m. selama 7 menit dan ditambahkan

ke sel THP-1. Strain mutan BCG :: pYUB, BCG :: ESX-1, H37RvDRD1 dan H37Rv EsxAD84-

95 dikultur dalam 7H9 dengan ADC, 0,05% Tween80 dan higromisin. Mutan disonikasi

ditambahkan ke sel di sebuah MOI 10, kecuali untuk M. tuberculosis H37Rv yang digunakan

MOI 2, percobaan berlangsung hingga hari ke 6. Sel yang diinkubasi dengan bakteri selama 1

jam pada 37 ° C (M. marinum dan M. gilvum pada 32 ° C), dan kemudian sel dicuci 3 kali

dengan RPMI- 1640 untuk menghilangkan bakteri ekstraseluler. Infeksi berhenti pada titik-titik

waktu yang ditentukan dengan menambahkan paraformaldehid atau paraformaldehid /

glutaraldehid (Peters et al., 2006). Kultur dilanjutkan sampai sel mati atau sampai hari ke-14

untuk infeksi BCG

Mikroskop Electron

Semua sampel disiapkan untuk mikroskop electron. Untuk pelabelan immunogold,

monoklonal LAMP - 1 ( PharMingen H4A3 ) 1 : 150, monoklonal LAMP - 2 ( H4B4 ), CD63

monoklonal ( Sanquin M1544 ) 01:15, ubiquitin poliklonal ( Sigma U5379 ) 1 : 300 atau

pelabelan berurutan dengan pertama anti - ubiquitin dan kemudian digunakan anti - LAMP – 1.

Untuk menentukan spesifisitas antiubiquitin poliklonal, ubiquitin murni ditambahkan di

konsentrasi yang berbeda. Untuk antibodi monoclonal ditambahkan dengan anti - tikus

( DAKO) 1 : 200. Untuk visualisasi antibodi yang mengikat, 10 nm protein A emas digunakan

dan untuk pelabelan ganda pertama 5 nm protein A emas dan kemudian 10 nm protein A emas

digunakan. Sampel dianalisis oleh kuantifikasi double-blind menggunakan mikroskop elektron

CM10 ( FEI , Eindhoven , Belanda ) .

SDS-PAGE dan Immunoblot

Bakteri dicuci dan ditumbuhkan di media 7H9 kemudian ditambah dengan 0,2 %

dekstrosa dan 0,05 % Tween80. Pelet dan supernatan kemudian dipisahkan dari media log – fase.

Page 4: Luh Pt Desy,,Mikromol

Protein dalam supernatan diendapkan dengan 5 % TCA ( w / v ), dan pelet disonikasi. Protein

dipisahkan dengan SDS -PAGE 16 % gel polyacrylamide. Immunoblots diwarnai dengan

antibody monoklonal ESAT - 6 (Staten Serum Institute, Hyb76-8 ) 1 : 500 dan kehadiran

antibodi sekunder peroxidase - conjugated terdeteksi melalui pewarnaan 4-chloronaphthol / 3,3-

diaminobenzidine

Table 1. Karaktersitik dari Spesies Mikrobakteri

Strain Mikobakteri Patogenitas di

Manusia

Gen ESX-1 Sekresi

ESAT-6

Transokasi

di sel

M. tuberculosis H37Rv Pathogenic + +† +

M. tuberculosis ancient

Beijing

Pathogenic + +* +

M. tuberculosis Beijing Pathogenic + +* +

M. tuberculosis Harlingen Pathogenic + +* +

M. tuberculosis 1243 Pathogenic + +* +

M. leprae Pathogenic + +** +

M. bovis Pathogenic + + +

M. marinum Pathogenic + +‡ +

M. szulgai Opportunistic + +† +/-

M. kansasii type I Opportunistic + + +/-

M. kansasii type V Non-pathogenic + + -

M. smegmatis Non-pathogenic + +*** -

M. avium Opportunistic - -† -

M. fortuitum Opportunistic - -† -

M. bovis BCG Non-pathogenic - - -

M. gilvum Non-pathogenic - -* -

Kehadiran gen - ESX 1 diwakili sebagai ( + ) dan kompleks yang tidak lengkap atau

tidak adanya gen - ESX 1 (- ). Sekresi ESAT - 6 dilakukan dengan analisis Western blot.

Referensi menunjukkan data yang ditunjukkan oleh orang lain . * Hasil tidak terlihat, ** T sel

dari pasien lepra bereaksi kuat ke ESAT-6 M. leprae, *** M . smegmatis sebelumnya

menampilkan sekresi ESAT - 6 dalam beberapa kondisi, († dan ‡) dalam mensekresi ESAT - 6

tidak terlalu banyak. Kemampuan untuk mentranslokasi di sel THP - 1 sel dan diberi tanda (+)

Page 5: Luh Pt Desy,,Mikromol

ketika persentase bakteri dalam sitosol lebih tinggi dari 20 % , (+/-) ketika persentase itu antara

2 % dan 20 % dan ( - ) ketika persentase lebih rendah dari 2 %

HASIL dan PEMBAHASAN

Sekresi ESAT-6 dari Mikrobakteri terpilih

Dalam penelitian ini, peneliti memilih beberapa spesies dengan derajat virulensi yang

berbeda (Tabel 1). Ini termasuk lima strain M. tuberculosis, H37Rv dan empat isolat pasien

yaitu M. bovis, M. marinum (E11 dan M), M. leprae, M. szulgai, M. avium, M. fortuitum, M.

gilvum, M. jenis kansasii I dan V, M. smegmatis dan M. bovis BCG (Denmark) (Tabel S1).

Untuk tes pertama apakah kehadiran ESAT-6 spesifik untuk spesies mikobakteri patogen yang

dilakukan dengan pemeriksaan terhadap filtrat kultur M. marinum, M. szulgai, M. jenis kansasii

I dan V, yang mengkodekan ESX-1 dan ESAT-6, dan non-patogenik (Kurang ESX-1) M.

fortuitum untuk sekresi ESAT-6. Sekresi ESAT – 6 dari mikobakteri yang berbeda yaitu M.

marinum E11, M. szulgaiand, M. kansasii menunjukkan ekspresi dan sekresi dari ESAT - 6

dalam fraksi supernatan, terdeteksi dengan monoklonal a- ESAT - 6 antibodi Hib 76-8. M.

fortuitum, yang tidak memiliki wilayah RD1 adalah negatif untuk ESAT - 6. Semua uji ESX-1-

mengandung mikobakteri yang mensekresikan ESAT-6, meskipun jumlah bervariasi. Data

dikombinasikan dengan data dari literatur (Tabel 1) menunjukkan bahwa semua spesies patogen

mensekresikan ESAT-6. Namun, kehadiran dari ESX-1 tidak berhubungan dengan virulensi.

Translokasi Sitosol dari Mikrobakteri Patogen

Untuk menguji apakah translokasi sitosol mikobakteri berhubungan dengan fenotipe

patogen, peneliti memeriksa lokalisasi subselular dari mikobakteri ( Tabel 1 ) menggunakan

elektron mikroskop. Mikobakteri dikultur ke OD600 0,5 dan digunakan untuk infeksi PMA-

activated sel myeloid THP - 1 manusia. Setelah 1-10 hari ( waktu tergantung pada berapa lama

sel kuat di infeksi setiap spesies mikobakteri ) sel-sel yang diproses untuk mikroskop electron

cryo-immunogold. Untuk kuantifikasi tingkat translokasi, hanya sel yang sesuai yang akan

dianalisis, karena morfologi sel yang tidak sesuai dalam eksperimen infeksi sering

mempengaruhi. Bahkan meskipun pelabelan immunogold penanda lisosom yang tidak sesuai, sel

Page 6: Luh Pt Desy,,Mikromol

M. tuberculosis yang terinfeksi berbeda dari sel yang tidak sesuai yang terinfeksi M. bovis BCG,

penentuan lokalisasi subselular dilakukan dalam sel yang sesuai saja. Gambar yang diperoleh

dan dianalisis secara double blind untuk subselular lokalisasi untuk semua spesies (Gambar 1)

menggunakan dua kriteria: (i) ada atau tidak adanya sebuah membrane phagosomal dan (ii) ada

atau tidak adanya endosomal atau lisosom pelabelan immunogold (LAMP atau CD63). Hanya

ketika kedua membran dan pelabelan emas absen, bakteri itu mencapai sitosol. Bakteri dengan

pelabelan phagosomal immunogold dan tanpa membran phagosomal pernah melebihi 2% (data

tidak ditampilkan). Hari dimana persentase tertinggi bakteri sitosol terdeteksi diwakili dalam

Gambar.2.

Gambar 1. Lokalisasi subselular dari spesies mikobakteri yang berbeda di sel THP - 1

yang diberi immunogold untuk CD63. Garis monositik dari sel THP - 1 terinfeksi dengan

berbagai mikobakteri pathogen yaitu : M. tuberculosis 1243, M. bovis dan spesies oportunistik

atau non - patogenik M. szulgai, M. fortuitum, M. avium, M. jenis kansasii I dan V dan M.

Page 7: Luh Pt Desy,,Mikromol

smegmatis. Pada electron mikrograf, misalnya diambil pada hari ke 2 untuk M. tuberculosis

1243 , hari ke 7 untuk M. bovis, hari ke 3 untuk M. szulgai, hari ke 1 untuk M. fortuitum, hari ke

3 untuk M. avium, hari ke 2 untuk M. kansasii I, hari ke 3 untuk M. kansasii V dan hari ke 2

untuk M. smegmatis. Keterangan gambar: tanda bintang adalah sitosol bakteri dimana fagosom

di kelilingi oleh bintang ( sitosol), huruf M adalah mitochondrium dan L adalah lisosom.

Mikobakteri patogen seperti M. tuberculosis, M. leprae, M. bovis dan M. marinum

ditemukan dengan mudah di sitosol. Yang paling penting, peneliti mengidentifikasi pasien yang

terinfeksi M.TBC lebih mudah translokasi ke dalam sitosol (Gambar 2). Sebaliknya, oportunistik

atau non-pathogenik spesies M. avium, M. fortuitum, M. gilvum, M. kansasii tipe V, M.

smegmatis dan M. bovis BCG (Denmark) tetap di phagolysosomal, sementara oportunistik M.

szulgai dan M. kansasii tipe I menunjukkan penurunan translokasi (Gambar 2). Dari pengamatan

ini dapat disimpulkan bahwa translokasi sitosol spesifik untuk mikobakteri patogen akan

berkurang ketika diuji dengan spesies oportunistik. Oportunistik lain dan semua spesies non-

pathogenic tetap di phagosomal. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa lokalisasi sitosol

adalah fitur dari spesies mikobakteri patogen. Dalam penelitian ini spesies yang tetap di

phagosomal adalah M. avium dan M. smegmatis (oportunistik dan masing-masing non-

patogenik), serta M. bovis BCG.

Gambar . 2. Translokasi adalah spesifik untuk mikobakterium patogen . Persentase sitosol

bakteri dengan spesies mikobakteri berbeda. Gambar menunjukkan bahwa bakteri pathogen

jenis M.marinum yang memiliki presentasi sitosol bakteri yang tinggi dibandingkan dengan

bakteri pathogen lainnya dan dengan bakteri opportunistic dan non pathogen.

Page 8: Luh Pt Desy,,Mikromol

Sekresi ESAT-6 di M. bovis BCG Memungkinkan Translokasi Sitosol

Sebelumnya ditemukan bahwa mutasi dihambat oleh CFP – 10 dan sekresi ESAT - 6

translokasi di M. tuberkulosis ( van der Wel et al . , 2007). CFP - 10 dan gen Esat - 6 berada di

daerah RD1, yang juga mengkodekan bagian dari sistem sekresi ESX - 1. Penelitian ini

menunjukkan bahwa ESAT - 6 disekresikan oleh semua pathogen spesies mikobakteri ( Tabel 1 )

dan bahwa spesies patogen mentranslokasi ke sitosol (Gambar 1 dan 2 ). Namun keberadaan

ESAT - 6 secara langsung terkait dengan translokasi sitosol belum banyak diketahui. Untuk

mencapai hal ini, peneliti menggunakan strain M. bovis BCG yang memiliki wilayah RD1

rekombinan yang kembali diperkenalkan ke bakteri ( RD1-2F9 mengandung 32 kb segmen

encoding Rv3861 - Rv3885, disini disebut BCG :: ESX - 1, Gambar. 3A ) dan mampu

mengsekresi ESAT – 6. Untuk menentukan apakah reintroduksi dari sekresi ESAT - 6 dapat

menginduksi translokasi dalam phagolysosomal Mikobakteri. PMA-activated sel THP - 1 yang

terinfeksi BCG :: ESX - 1 kemudian diproses untuk cryo - immunogold mikroskop elektron

untuk menentukan apakah dan pada tingkat apa bakteri translokasi sitosol terjadi. Setelah 7 hari

infeksi, ditemukan set- up 16 % dari BCG :: ESX - 1 bakteri translokasi ke sitosol dan setelah 10

hari ini persentase meningkat menjadi 46 % (Gambar. 3 ). BCG :: ESX – 1 menunjukkan

peningkatan virulensi secara signifikan dibandingkan dengan BCG non - translokasi. Dengan

hasil ini, menunjukkan bahwa reintroduksi dari sekresi ESAT - 6 dikodekan oleh wilayah RD1

ke phagosomal BCG normal memprovokasi BCG translokasi sitosol dan pada gilirannya

meningkatkan virulensi dari bakteri.

Page 9: Luh Pt Desy,,Mikromol

Gambar. 3. RD1 translokasi BCG. Gambar A Skema representasi dari penghapusan dari

wilayah RD1 yang terjadi di M. bovis BCG dan perpanjangan wilayah RD1 yang terjadi di M.

tuberculosis dan diperkenalkan kembali ke M. bovis BCG (BCG :: ESX-1) menggunakan

konstruk RD1-2F9 yang mengandung 32 kb segmen encoding Rv3861-Rv3885. Gambar B,

Persentase bakteri sitosol setelah infeksi di hari ke 4, 7 dan 10 di stimulai oleh sel THP-1.

Dengan tidak adanya RD1 (BCG :: p YUB pengendalian vektor) tidak ada bakteri yang

ditemukan dalam sitosol, tetapi dalam BCG dengan ESX-1 (BCG :: ESX-1), translokasi

terdeteksi pada hari ke 7 dan 10. Gambar C, Elektron mikrograf dari sitosol BCG :: ESX-1 di

hari ke 10 pasca infeksi dalam stimulasi sel THP-1. Pelabelan Immunogold (10 nm) dari struktur

Page 10: Luh Pt Desy,,Mikromol

lisososm LAMP-2 (L). M adalah mitokondria, PM adalah membran plasma. Gambar D,

Elektron mikrograf dari phagosomal M. bovis BCG pada hari ke 1 pasca infeksi,

immunolabelled (10 nm emas) untuk CD63. M adalah mitochondrium, L adalah lisosom.

C-terminus ESAT-6 is required for M. tuberculosis cytosolic translocation

ESAT - 6 dan CFP - 10 yang diketahui disekresikan ke medium kultur filtrat

Mikobakteri yang dimediasi oleh sistem sekresi ESX - 1- dan peneliti telah menunjukkan bahwa

ESAT - 6 terkait dengan translokasi sitosol. M. tuberculosis H37Rv EsxAD84-95 adalah strain

yang berisi penghapusan dari 12 - asam amino ESAT - 6 C - terminus ( Brodin et al . , 2005).

Sementara jenis ini terbukti secara efisien masih mengeluarkan ESAT – 6 dan CFP – 10, hal ini

dilakukan di tikus model yang telah terinfeksi. Untuk menentukan apakah pelemahan terkait

dengan (dalam ) kemampuan untuk mentranslokasi, peneliti menginfeksi sel THP - 1 dengan

H37Rv EsxAD84-95 dan dianalisis dengan mikroskop electron. Gambar dengan kriteria yang

disebutkan di atas dalam studi double blind sebagai ditunjukkan pada Gambar. 4, mutan H37Rv

EsxAD84-95 tetap di phagolysosomes, menunjukkan bahwa C – terminus dari protein ESAT - 6

diperlukan untuk M. tuberculosis translokasi .

Gambar . 4. C - terminus ESAT - 6 penting untuk translokasi . Gambar A. Persentase H37Rv

sitosol (moi 2), H37Rv EsxAD84-95 ( moi 10 ) atau H37RvDRD1 ( moi 10) di hari ke 2 , 4 atau

6 setelah diinfeksi yang distimulasi oleh sel THP-1. Translokasi M. tuberculosis strain H37Rv,

dan non-translokasi RD1 penghapusan mutan dari M.tuberculosis H37Rv( H37RvDRD 1 )

Page 11: Luh Pt Desy,,Mikromol

bertindak sebagai kontrol positif dan negatif. Gambar B. Elektron mikrograf dari

phagolysosomal ESAT - 6 strain H37Rv EsxAD84-95 di hari ke 2 pasca infeksi di sel THP - 1.

Immunogold ( 10 nm ) pelabelan dari struktur lisosom LAMP - 2 ( L ), M adalah mitokondria.

Kedua phagosomal - lokal M. smegmatis dan M. kansasii spesies tipe V telah

ditemukan untuk mensekresikan ESAT – 6, jadi ketidakmampuan bakteri ini untuk

mentranslokasi mungkin karena kurangnya C - terminus spesifik yang tidak ditemukan pada

spesies patogen. Hasil analisis sekuens asam amino ESAT - 6 dari beberapa spesies peneliti

gagal untuk menemukan korelasi antara urutan dan kemampuan untuk mentranslokasi

(Gambar.5). Tampaknya tidak mungkin C - terminus dari protein ESAT - 6 dapat menjelaskan

ketidakmampuan untuk mentranslokasi dan karena itu harus melibatkan faktor lain yang tidak

diketahui. Hasil sekuens C - terminus terhadap mutan H37Rv menunjukkan bahwa ini bagian

dari protein ESAT – 6 M. tuberculosis yang sangat penting fungsinya dalam translokasi dan lagi

menunjukkan hubungan antara virulensi dan translokasi .

Cytosolic translocation results in transient ubiquitin accumulation

Peneliti berhipotesis bahwa phagosome harus menjalani perubahan ultrastructural

selama translokasi. Oleh karena itu, peneliti berusaha untuk mencari tahap translokasi dalam sel

yang terinfeksi M. tuberculosis oleh ubiquitin, yang proteinnya digunakan untuk degradasi

proteasomal. Peneliti mengamati bahwa daerah sekitar sitosol mikobakteri bisa diberi label

dengan antibody terhadap ubiquitin di cryosections (Gambar 5), yang mana dicegah dengan

adanya kelebihan ubiquitin murni, menunjukkan spesifisitas antibodi. Sebaliknya,

phagolysosomes utuh yang mengandung M. tuberculosis, tetapi M. avium atau M. bovis BCG

yang kurang berlabel ubiquitin (Gambar. 5A). Persentase bakteri sitosol immunogold diberi label

untuk ubiquitin meningkat menjadi 30% setelah 96 jam infeksi. Pada saat infeksi, tidak lagi

semua sitosol bakteri yang berlabel ubiquitin, hal ini menunjukkan bahwa kehadiran ubiquitin

disekitar sitosol bakteri bersifat sementara. Peneliti mengamati bahwa, meskipun tahap-tahap

peralihan dari translokasi adalah sangat jarang, phagosome dapat terdeteksi transiently dan

immunolabelled untuk ubiquitin. Ini akan menunjukkan bahwa ubiquitin yang struktur membran

berlabel bisa merendahkan phagolysosomes.

Page 12: Luh Pt Desy,,Mikromol

Gambar. 5. Gambar ini menunjukkan bahwa Ubiquitin pada phagolysosomes terganggu.

Gambar A. Mikrograf elektron dari M. tuberculosis H37Rv pada hari ke 3 setalah infeksi di DC,

immune label untuk ubiquitin dengan 5 nm emas digabungkan dengan protein A dan kemudian

LAMP-1 dengan 10 nm emas. Bintang pada gambar merupakan sitosol bakteri, phagosomal

dikelilingi bintang (sitosol bakteri), M adalah mitochondrium, L adalah lisosom, lingkaran biru

adalah label ubiquitin di sekitar sitosol M. TBC Gambar B. Kuantifikasi pelabelan ubiquitin

terkait dengan kelompok M. tuberculosis. Cluster M. tuberculosis dianggap sebagai positif

ubiquitin ketika 7 atau lebih partikel emas per bakteri yang terdeteksi di wilayah memperluas ke

300 nm dari tepi luar dari bakteri. Persentase phagosomal bakteri berlabel ubiquitin (+),dan

sitosol unlabelled (-). Gambar C DC manusia terinfeksi dengan H37Rv selama 3 hari,

immunogold diberi label untuk ubiquitin menggunakan antibodi ubiquitin dan protein A

terkonjugasi. Pelabelan terlihat di struktur membrane. Bintang sebagai sitosol bakteri, M adalah

mitokondria, lingkaran biru adalah label ubiquitin.

Page 13: Luh Pt Desy,,Mikromol

Why has translocation gone so often unnoticed?

Interaksi awal mikobakteri dengan phagosome hal yang penting terhadap hasil dari

infeksi, tetapi tidak akan memungkinkan untuk mendeteksi sitosol bakteri. Translokasi umumnya

terjadi selama infeksi, pada titik-titik waktu yang berbeda-beda untuk spesies mikobakteri yang

berbeda. Untuk M. tuberculosis ini umumnya 3-5 hari setelah infeksi (van der Wel et al., 2007;

Lee et al., 2008). Kedua, imunofluoresensi mikroskop tidak akan mengungkapkan subpopulasi

bakteri sitosol. Tidak adanya (lisosomal) penanda (Ferrer et al, 2010.; Abramovitch et al., 2011)

tidak dapat diakui sebagai bukti tidak adanya membran phagosomal. Akhirnya, seperti yang

ditunjukkan di sini, lokalisasi subselular mikobakteri dan kemampuan mereka untuk

mentranslokasi tergantung pada spesies, seperti M. avium dan M. smegmatis (Gutierrez et al,

2008;. De Chastellier et al, 2009.; Anand et al, 2010.; Manis et al., 2010).

Sebuah cytolysin tergantung kolesterol yang bertindak secara kolaboratif dengan

phospholipases bakteri yang mengganggu membran fagolisosom (Marquis et al., 1995; Smith et

al., 1995; Schnupf dan Portnoy, 2007). M. tuberculosis mengkodekan hingga empat fosfolipase

Gen C yang diketahui penting untuk pertumbuhan mikobakteri in vivo (Raynaud et al., 2002).

Namun, peran fosfolipase C di translokasi mikobakteri masih belum diketahui.

Concluding remarks

Dalam studi ini, peneliti telah menetapkan mikobakteri yang membutuhkan sistem

sekresi-ESX 1 dan sekresi ESAT-6 untuk translokasi sitosol. Penelitian ini telah menunjukkan

bahwa ESAT-6 disekresikan oleh semua spesies translokasi, hal ini dikarenakan memiliki sistem

sekresi ESX-1. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa secara khusus, C-terminus ESAT-6

penting untuk translokasi. Peneliti telah menetapkan hubungan yang jelas antara kemampuan

spesies mikobakteri untuk mentranslokasi dan patogenisitas. Hal ini diverifikasi oleh

reintroduksi dari M. tuberculosis gen kompleks ESX-1, phagolysosomal M. bovis BCG

menunjukkan bahwa terjadinya kembali translokasi. Rekombinan BCG ini :: ESX-1

menunjukkan secara signifikan peningkatan virulensi dibandingkan dengan nontranslocating

BCG (Pym et al, 2002;.. Brodin et al, 2005). Secara kolektif, peningkatan virulensi dari BCG ::

ESX-1 dan kemampuan dari semua spesies patogen diuji untuk menyajikan hubungan

translokasi. Meskipun translokasi terbukti menjadi penting untuk virulensi di beberapa spesies,

korelasi penting dalam subset dari spesies dari satu genus belum dijelaskan sebelumnya. Jadi di

Page 14: Luh Pt Desy,,Mikromol

sini peneliti menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa translokasi mikobakteri tidak hanya

relevan secara klinis, itu adalah faktor virulensi. Jelas faktor virulensi yang penting untuk

merancang vaksin dan dengan demikian peneliti mengusulkan novel vaksin mikobakteri harus

fungsional dalam sitosol. Vaksin yang saat ini digunakan di seluruh dunia (M. bovis BCG) hanya

terbatas pada fagosom. Hasil yang dijelaskan menunjukkan bahwa translokasi ke dalam sitosol

dimediasi oleh sistem ESX-1 yang akan meningkatkan keampuhan vaksin, tetapi juga

memperingatkan risiko mengembangkan vaksin virulen (Pym et al, 2002;.. Brodin et al, 2005).

Mungkin dengan memanipulasi translokasi dan virulensi dapat meningkatkan kemanjuran

vaksin BCG dan bisa efektif digunakan untuk berbagai infeksi mikobakteri. Dengan membangun

translokasi yang merupakan faktor virulensi untuk mikobakteri, pengembangan vaksin menjadi

layak untuk ditingkatkan.