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Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Doutorado em Biologia Celular e Molecular
ALTERAÇÃO NO PADRÃO DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS AO
PERFIL LEUCEMOGÊNICO DA LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA INFANTIL:
ANTES E DEPOIS DA QUIMIOTERAPIA DE INDUÇÃO
Goiânia, 2013
ii
iii
Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Doutorado em Biologia Celular e Molecular
ALTERAÇÃO NO PADRÃO DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS AO
PERFIL LEUCEMOGÊNICO DA LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA INFANTIL:
ANTES E DEPOIS DA QUIMIOTERAPIA DE INDUÇÃO
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação, Doutorado em
Biologia – Área de Concentração:
Biologia Celular e Molecular, do
Instituto de Ciências Biológicas, da
Universidade Federal de Goiás,
como requisito para a obtenção do
título de Doutora.
Orientanda: Lysa Bernardes Minasi, M.Sc.
Orientador: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, PhD.
Co-orientadora: Profa. Dra. Daniela de Melo e Silva
Goiânia, 2013
iv
v
O desenvolvimento das atividades experimentais da presente Tese contou com a
colaboração das seguintes instituições: Universidade Federal de Goiás (UFG) –
Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular do Instituto de Ciências
Biológicas (ICB); Núcleo de Pesquisas Replicon do Departamento de Biologia da
Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC Goiás); Laboratório de Citogenética
vi
Humana e Genética Molecular do Estado de Goiás (LaGene/Lacen/SES-GO);
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Setor de
Imunofenotipagem do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer de
Goiás.
vii
A MINHA QUERIDA MÃE,
Pelo exemplo, incentivo e pelo amor,
DEDICO.
Agradecimentos
A realização deste trabalho só foi possível devido à colaboração de diversas
pessoas, agradeço:
À minha mãe, Heloísa Cury Bernardes Minasi, meu pai, Arivan Minasi (in
memoriam), minhas irmãs, Lays Bernardes Minasi e Lys Bernardes Minasi, e todos os
meus familiares, pelo amor, confiança e por terem sido continuamente meu alicerce,
desde o início.
Ao Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, pela orientação exemplar, apoio,
generosidade, amizade e confiança ao longo destes 5 anos, sem os quais seria
impossível a finalização deste estudo. Minha eterna gratidão!
A Profa. Dra. Daniela de Melo e Silva, pela co-orientação positiva, disposição,
generosidade e pela sugestão do método utilizado. Obrigada pela amizade e carinho.
Ao Prof. Cláudio Carlos da Silva pelo apoio e sugestões. Obrigada pela amizade
e carinho.
Os meus agradecimentos especiais aos meus queridos amigos do Núcleo de
Pesquisas Replicon, agradeço pela compreensão e ajuda no desenvolvimento deste
estudo.
A grande amiga Fernanda Ribeiro Godoy pelo incentivo desde o início desta
etapa, principalmente na fase prática do estudo, sem ela tudo seria mais difícil. Aos
meus queridos amigos Alex Silva da Cruz, Emília de Oliveira Alves Costa, Thaís
Cidália Vieira, obrigada pela amizade, companheirismo e rizadas. Ao meu namorado,
Danilo Conrado Silva, pela paciência e companheirismo neste período e por sempre
estar ao meu lado.
Ao Dr. Raul Chavarria pelo grande incentivo e apoio para a realização deste
estudo.
Aos profissionais do Hospital Araújo Jorge, em especial à farmacêutica Caroline
do Setor de Imunofenotipagem e a Dr. Patrícia Carneiro do setor de Oncologia
Pediátrica.
Aos professores do Programa de Pós Graduação do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Goiás pela troca de experiências. Agradeço À
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela Bolsa de
Doutorado oferecida.
viii
Meu cordial e afetuoso agradecimento a todas as pessoas que direta ou
indiretamente contribuíram para minha conquista.
SUMÁRIO
Instituições Participantes iii
Dedicatória iv
Agradecimento v
Lista de Figuras viii
Lista de Tabelas ix
Resumo 10
Abstract 11
1. Introdução 12
1.1 Leucemia Linfóide Aguda 12
1.1.1 Aspectos Epidemiológicos 14
1.1.2 Aspectos Moleculares 16
a) Genes ETV6 e RUNX1 (TEL e AML1) 19
b) Genes BCR e ABL1 22
c) Gene PTEN 23
d) Gene TAL1 (SCL, TCL5) 24
e) Genes BAX e BCL2 25
1.1.3 Fatores Prognósticos para a LLA 26
2. Justificativa 31
3. Objetivo 32
3.1 Objetivo Geral 32
3.2 Objetivo Específico 32
4. Material e Métodos 33
ix
4.1 Delineamento do estudo 33
4.2 Caracterização das Amostras Biológicas. 33
4.3 Grupo Amostral 34
4.4 Extração de RNA 34
4.5 Transcrição Reversa e PCR Array 34
4.6 Análise Estatística 36
4.7 Considerações Éticas 36
5. Resultados 37
6. Discussão 47
7. Conclusão 59
8. Apêndice 61
9. Referências Bibliográficas 67
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Frequência das alterações genéticas na LLA infantil. 18
Figura 2. Níveis de expressão dos genes investigados em associação ao perfil
leucêmico de crianças com LLA ao diagnóstico e D+28 e controles saudáveis.
40
Figura3. Comparação entre a expressão dos genes associado ao perfil leucêmico
da LLA infantil e seus controles por ocasião do diagnóstico após a normalização
dos dados referentes aos genes isolados.
41
Figura 4. Comparação entre a expressão dos genes de acordo com a leucometria ao
diagnóstico.
43
Figura 5. Distribuição dos níveis de expressão em pacientes com LLA-B, LLA-T
e CD10+.
44
Figura 6. Representação gráfica da expressão dos genes em cada grupo de
pacientes com LLA avaliados.
45
Figura 7. Dendograma indicando os graus de amplicação dos genes em cada
grupo estudado nos pacientes com LLA infantil em Goiás.
46
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela I. Fatores Prognósticos associados à estratificação de risco na LLA
infantil.
28
Tabela II. Condições de ciclagem recomendadas. 35
Tabela III. Aspectos clínico-laboratoriais das crianças com LLA participantes da
investigação de genes associados ao perfil leucêmico por qPCR array em Goiânia
(Brasil), segundo o GBTLI LLA-99.
38
Tabela IV. Padrão de expressão gênica ao diagnóstico e no D+28. 40
Tabela V. Padrão de expressão gênica de crianças com LLA segundo
estratificação da idade ao diagnóstico.
42
Tabela VI. Padrão de expressão gênica em crianças com LLA segundo
leucometria ao diagnóstico.
42
Tabela VII. Padrão de expressão gênica nos imunofenótipos B e T e marcador
CD10+ na LLA ao diagnóstico.
44
Tabela VIII. Padrão de expressão gênica nos grupos de baixo e alto risco para
recaída.
45
12
RESUMO
A LLA é uma desordem maligna que origina de uma célula precursora do
sistema linfo-hematopoético comprometida para o desenvolvimento da linhagem de
linfócitos B ou T. A aquisição pela célula precursora de uma série de anormalidades
genéticas, altera seu processo normal de maturação, conduzindo a parada na
diferenciação celular e vantagem proliferativa do clone leucêmico sobre as células do
tecido hematopoético. Mais de 50 alterações genéticas recorrentes tem sido
identificadas na LLA. Estas frequentemente envolvem genes com papel conhecido ou
putativo no desenvolvimento dos linfócitos e no processo da leucemogênese. Neste
estudo, a variação da expressão dos marcadores moleculares, foi analisada utilizando a
metodologia de PCR array, em 16 crianças com LLA ao diagnóstico e no final da
quimioterapia de indução. Tais pacientes foram diagnosticados no HAJ e na SCMG, no
período de maio de 2012 a janeiro de 2013. As amostras de medula óssea ou sangue
periférico foram enviadas ao NPReplicon-PUC-GO. No presente estudo foi possível
observar uma correlação negativa entre as variáveis sexo e o imunofenótipo (p = 0.016),
ou seja, pacientes do sexo feminino tem uma maior associação com o imunofenótipo B
e menor associação com o imunofenótipo T. Foi observado também uma correlação
positiva entre imunofenótipo e idade (p = 0.04), imunofenótipo e marcador CD10+ (p =
0.03), imunofenótipo e grupo de risco (p = 0.015) e marcador CD10+ e grupo de risco
(p = 0.043). Antes do tratamento o gene RUNX1 encontrou-se com um aumento da
expressão em 5,0 vezes em relação ao grupo controle e após a quimioterapia de indução
foi observado uma redução na sua expressão. O padrão de expressão do gene TAL1
apresentou significativa diminuição, com exceção da análise pós tratamento que
demonstrou um aumento da sua expressão. Uma correlação positiva foi observada entre
a expressão de BAX e BCL2 (r = 0,94 e p < 0,0001). A partir do perfil de expressão de
cada gene analisado, demonstramos no presente estudo uma diferença significativa no
padrão de expressão gênico da LLA ao diagnóstico e após a terapia de indução.
Concluímos nossa observação com relação ao perfil de expressão gênica nos pacientes
com LLA incluídos neste estudo, mas para definirmos um painel de marcadores
moleculares é necessário a avaliação de diversos outros genes que participam do
processo da leucemogênese na LLA com auxílio de outras metodologias.
Palavras chave: expressão gênica; leucemogênese; fase de indução.
13
ABSTRACT
The ALL is a malignant disorder that originates from a precursor cell lympho-
hematopoietic system compromised for the development of B or T lymphocyte lineage.
The precursor cell acquisition by a series of genetic abnormalities alters the normal
process of maturation leading to cellular differentiation arrest and leukemic clone
proliferative advantage on cells of hematopoietic tissue. More than 50 recurrent genetic
alterations have been identified in the ALL. These often involve genes known or
putative role in the development of lymphocytes and in the case of leukemogenesis. In
this study, the variation in the expression of molecular markers was analyzed using PCR
methodology array on 16 children with ALL before treatment and at the end of
induction chemotherapy (D +28). These patients were diagnosed in HAJ and SCMG,
from May 2012 to January 2013. Samples of bone marrow or peripheral blood were sent
to NPReplicon-PUC-GO. In the present study we observed a negative correlation
between gender and immunophenotype (p = 0.016), females have a greater association
with immunophenotype B and less associated with immunophenotype T. We also
observed a positive correlation between immunophenotype and age (p = 0.04),
immunophenotype and marker CD10 + (p = 0.03), immunophenotype and risk group (p
= 0.015) and marker CD10 + and risk group (p = 0.043). Before treatment the gene
RUNX1 met with increased expression by 5.0 times compared to the control group and
after induction chemotherapy was observed a reduction in its expression. The
expression pattern of the gene TAL1 showed significant decrease, with the exception of
post-treatment analysis showed that an increase in its expression. A positive correlation
was observed between the expression of BAX and BCL2 (r = 0.94 and p <0.0001. We
demonstrated a significant difference in gene expression pattern of ALL at diagnosis
and after induction therapy. We conclude our observation regarding the gene expression
profile in patients with ALL enrolled in this study, but to define a panel of molecular
markers is necessary to evaluate several other genes involved in the process of
leukemogenesis in ALL with the help of other methodologies.
Keywords: gene expression; leukemogenesis; induction phase.
14
1. Introdução
1.1 Leucemia Linfóide Aguda
A transformação celular maligna envolve a obtenção de uma série de alterações
genéticas e epigenéticas que modificam os programas de desenvolvimento celular
normal, resultando em um clone neoplásico com propriedades de crescimento
desregulado. Acredita-se que para as leucemias agudas o acúmulo de várias alterações
transformem uma célula hematopoética normal em uma célula leucêmica, que
apresentará parada na diferenciação celular, aumento da proliferação celular,
diminuição da apoptose, manutenção de telômeros e maior capacidade de auto
renovação. Em conjunto, estas modificações celulares resultam na geração de um clone
de células blásticas leucêmicas altamente proliferativo com uma vantagem de
sobrevivência e ilimitado potencial de replicação (Kennedy & Barabe, 2008).
A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é uma desordem maligna que origina de
uma célula precursora do sistema linfo-hematopoético comprometida para o
desenvolvimento da linhagem de linfócitos B ou T. A aquisição pela célula precursora
de uma série de anormalidades genéticas, altera seu processo normal de maturação,
conduzindo a parada na diferenciação celular e vantagem proliferativa do clone
leucêmico sobre as células do tecido hematopoético (Ribeiro, 2001).
A etiologia da LLA ainda é objeto de ampla discussão entre os especialistas.
Alguns fatores têm sido associados à leucemogênese como: os efeitos da exposição
individual à radiação ionizante, exposição a fármacos, constituição genética e
imunológica que gera suscetibilidade individual e, finalmente, a infecção viral dos
afetados. Além dos fatores de riscos ambientais, algumas anomalias cromossômicas
constitucionais estão associadas a uma maior susceptibilidade à LLA, como síndrome
de Down, síndrome de Bloom, Síndrome de Nijmegen, Anemia de Fanconi e Ataxia-
telangiectasia (Greaves, 1997; Wiemels et al., 1999; De Oliveira et al., 2004; Greaves,
2006).
Há amplos registros na literatura que associam a LLA à Síndrome de Down
(SD). Estudos sugerem um risco aumentado de 10 a 20 vezes de leucemia em crianças
com SD, sendo a LLA presente em 1 para cada 300 crianças com SD versus 1 em 3500
crianças sem a SD (Maloney, 2011). Entretanto, a relação entre os agentes
15
predisponentes e o desenvolvimento das leucemias pode apenas ser demonstrada em
uma proporção pequena dos casos. Assim, ainda permanece obscura a resposta da
maioria das questões sobre a causa das leucemias.
Os principais sinais e sintomas da LLA são atribuídos à substituição das células
hematopoéticas normais pelas células leucêmicas, assim como, pelo crescimento
descontrolado destas células no tecido linfóide e em sítios extramedulares. As queixas
mais comuns incluem fadiga, letargia acompanhada de febre e dores ósseas e
articulares. Adenomegalia também é um achado comum e geralmente é generalizada e
indolor (Lukes, 1998).
A classificação morfológica da LLA foi desenvolvida em 1976 por um grupo de
hematologistas Franceses, Americanos e Britânicos (classificação FAB), para definir os
subtipos morfológicos com base em quatro variáveis observadas ao microscópio ótico,
que são: (1) Diâmetro celular; (2) Forma do núcleo; (3) Número e protuberância dos
nucléolos e (4) Quantidade e aspecto relativos ao citoplasma (Dos Anjos et al., 2000).
Segundo a classificação FAB, a LLA possui subtipos diferenciados de acordo com o
estágio de desenvolvimento celular e foi classificada morfologicamente em: L1, L2 e L3
(Farias et al., 2004)
Com o desenvolvimento das técnicas de citometria de fluxo, o padrão de
expressão dos antígenos de diferenciação das células passou as ser utilizado. A
imunofenotipagem na LLA é bastante precisa, permitindo identificar a linhagem celular
e o nível de diferenciação em que se encontra o processo leucêmico. Além disso, a
distinção de marcadores celulares anormais permite o seguimento do paciente para
avaliação da resposta terapêutica. Na LLA, a linhagem de células B representa 80 a 85
% dos casos enquanto a de células T representa de 15 a 20% dos casos (Pui et al.,
2008).
O grupo EGIL (European Group for the Immunological Characterization of
Leukemias) simplificou a caracterização das LLA, padronizando as diferentes
nomenclaturas utilizadas por diferentes pesquisadores na área de imunofenotipagem
celular. As LLA infantil de células B são subdivididas em 4 estágios: B-I (Pró-B), B-II
(Comum), B-III (Pré-B) e B-IV (B-maduro), do fenótipo mais imaturo para o mais
maduro. O subtipo mais comum é o B-II ou LLA-comum correspondendo a 75% dos
casos e os subtipos mais raros são o mais imaturo representado por 5% dos casos
pediátrico e o mais maduro presente em 2% a 5% dos casos. As células da linhagem T
16
podem ser caracterizadas em três estágios de acordo com os antígenos de superfície
celular: pré-T (T-I); T-imtermediário (T-II) e T- Maduro (T-III) (Bene et al., 1995;
Bene, 2005; Bacal et al., 2003).
O tratamento para LLA compreende três fases: indução da remissão,
intensificação ou consolidação e manutenção. A maioria dos medicamentos utilizados
foram desenvolvidos antes de 1970, no entanto, suas doses e combinações foram
otimizadas com base nas características biológicas das células leucêmicas, resposta ao
tratamento (DRM), farmacodinâmica e farmacogenômica identificadas nos pacientes,
resultando em uma alta taxa de sobrevida (Stanulla & Schrappe, 2009).
A terapia de indução da remissão compreende um período de 4 a 6 semanas,
sendo esperado a restauração (remissão completa) da hematopoese em 96 a 99% das
crianças. A quimioterapia geralmente inclui um glicocorticóide (predinisona ou
dexametasona), vincristina e asparaginase. Crianças classificadas com LLA de alto risco
ou muito alto risco recebem uma ou mais drogas adicionais incluindo antraciclina.e
ciclofosfamida, entretanto, a intensificação da terapia de indução pode levar ao aumento
da morbidade e mortalidade. Pacientes BCR-ABL positivo tem pior prognóstico, mas se
beneficiam com tratamento quando adicionado os inibidores de tirosina quinase
(imatinibi, dasatinibi, etc) (Bassan & Hoelzer, 2011).
A terapia de intensificação pós-remissão (consolidação) melhora a resposta do
paciente mesmo nos que foram classificados como de baixo risco. Os protocolos
comumente usados incluem metotrexato em altas doses com mercaptopurina diária, e
uma combinação de alta dose de asparaginase administrada por um período prolongado,
juntamente com vincristina, dexametasona ou baixa dose de metotrexato. A terapia de
manutenção normalmente tem a duração de 2 anos ou mais e compreende
principalmente, mercaptopurina diariamente e metotrexato semanal com ou sem pulsos
intermitentes de vincristina e dexametasona (Bassan & Hoelzer, 2011; Pui & Evans,
2006).
1.1.1 Aspectos Epidemiológicos
Estima-se que a incidência dos tumores pediátricos no mundo varie de 1% a 3%
do total de casos de câncer. O percentual mediano dos tumores pediátricos observados
nos Registros de Câncer de Base Populacional (RCBP) brasileiros encontra-se próximo
17
de 3% (Brasil, 2008). Como, para o Brasil, em 2012, à exceção dos tumores da pele não
melanoma, estimam-se 384.340 casos novos de câncer, depreende-se, portanto, que
ocorrerão cerca de 11.530 casos novos de câncer em crianças e adolescentes até os 19
anos (Brasil, 2012).
A leucemia é o tipo mais frequente de câncer infantil na maioria das populações,
correspondendo entre 25% e 35% de todos os tipos, sendo a Leucemia Linfoide Aguda
(LLA) a de maior ocorrência em crianças de 0 a 14 anos. Na população infantil, a LLA
é cinco vezes mais incidente do que a Leucemia Mielóde Aguda (LMA), sendo a causa
de aproximadamente 3/4 de todo o diagnóstico de leucemia em crianças (Belson et al.,
2007). A LLA representa aproximadamente 15% de todas as neoplasias malignas em
indivíduos entre 1 e 15 anos de idade, 5% entre 15 a 19 anos e <10% em maiores de 20
anos (Sallan et al., 2006).
Embora a LLA possa ocorrer em qualquer idade, sua incidência é maior entre
crianças de 2 a 5 anos, numa proporção de cerca de 70% dos casos. A incidência
diminui com o avanço da idade. Entre adolescentes e adultos jovens, a incidência das
leucemias agudas é de cerca de 20%, voltando a aumentar após a sexagésima década de
vida (Farias et al., 2004). Estima-se que 6.000 novos casos (masculino: feminino
prevalência de cerca de 1,3:1) de LLA são diagnosticados anualmente nos Estados
Unidos. Os pacientes são principalmente crianças, cerca de 60% dos casos ocorrem em
pessoas com idade inferior a 20 anos (Siegel et al., 2012).
No Brasil, as últimas informações disponíveis para a mortalidade mostram que,
no ano de 2009, o óbito por neoplasias, para a faixa etária de 1 a 19 anos, encontrou-se
entre as dez primeiras causas de morte. A partir dos 5 anos, a morte por câncer
correspondeu à primeira causa de morte por doença em meninos e meninas (Brasil,
2012).
Um estudo foi conduzido em 12 países da América latina durante 25 anos (1984-
2004), com objetivo de avaliar a mortalidade em crianças menores do que 15 anos e
adultos jovens (15 a 24 anos) com leucemia. Os resultados deste estudo indicaram que a
taxa de mortalidade entre os adultos jovens apresentou um declínio, contudo menos
significativo do que o observado em menores de 15 anos. A taxa de mortalidade para
adultos jovens no México apresentou um aumento significativo para ambos os sexos.
Para os outros países (Brasil, Chile, Colombia, Cuba, República Dominicana, Equador,
Paraguai, Uruguai e Venezuela) não foi evidenciado mudanças na taxa de mortalidade
18
nas últimas duas décadas. Os resultados do estudo apontaram para uma necessidade
global de avanços terapêuticos, especificamente para a população de adultos jovens,
semelhantes as melhorias ocorridas nos protocolos terapêuticos da leucemia infantil. Os
autores ainda chamaram a atenção em especial para o aumento significativo nas taxas de
mortalidade observadas no México (Curado et al., 2011).
Em alguns países em desenvolvimento, aonde a população de crianças chega a
50% da população, a proporção do câncer infantil representa de 3% a 10% do total de
neoplasias. Já nos países desenvolvidos, essa proporção diminui, chegando a cerca de
1%. A mortalidade também possui padrões diferentes. Enquanto, nos países
desenvolvidos, o óbito por neoplasia é considerado a segunda causa de morte na
infância, correspondendo a cerca de 4% a 5% de óbitos entre crianças de 1 a 14 anos,
em países em desenvolvimento essa proporção é bem menor, cerca de 1%. Estas
diferenças nas taxas pode ser explicada pelo fato de que nos países em desenvolvimento
as mortes por doenças infecciosas apresentam-se como as principais causas de óbito
infantil (Ferlay et al., 2010).
Estudo realizado em Goiânia com 263 casos de câncer infantil, no período de
1988 a 1996, envolvendo crianças menores de 15 anos, avaliou as tendências de
incidências de mortalidade por neoplasias infantis. Os resultados demonstraram que as
leucemias e linfomas ocorreram em 45,3% dos casos. As leucemias representaram as
neoplasias mais comuns, correspondendo a 27% de todos os casos de câncer infantil em
Goiânia. Em seguida os linfomas e os tumores do sistema nervoso central que
contabilizaram 18,3% dos casos. No grupo das leucemias, o tipo mais predominante foi
o da leucemia linfóide aguda (LLA), correspondendo a 66,2% de todos os casos
registrados. Em relação aos casos de mortalidade por câncer infantil em Goiânia, no
período de 1978 a 1996, 371 crianças menores de 15 anos morreram de neoplasias
malignas, representando 2,3% a mortalidade geral das crianças durante o período
referido. A maioria dos óbitos ocorreu entre os meninos menores de 5 anos (Curado et
al., 2000).
1.1.2 Aspectos Moleculares
A LLA é uma doença heterogênea com subtipos que diferem acentuadamente
em suas características celulares e moleculares, assim como na resposta ao tratamento e
subsequente risco de recidiva. Estudos genéticos têm sido utilizados para classificar a
19
LLA infantil em diferentes subtipos. O desenvolvimento de tecnologias genômicas de
alta resolução tem revolucionado o campo da genética aplicada aos estudos do câncer.
Nos últimos anos, a comunidade científica tem se empenhado para identificar um
padrão de perfil genômico da LLA, por meio de metodologias de alta resolução. A
determinação de assinaturas gênicas permite uma melhor compreensão do processo de
leucemogênese que pode influenciar na responsividade terapêutica, e finalmente
poderão ser traduzidas em novas ferramentas prognósticas e identificação de alvos
terapêuticos.
Aproximadamente 75% dos casos da LLA infantil abrigam alterações
cromossômicas recorrentes detectáveis pelo estudo do cariótipo, FISH ou técnicas
moleculares (Beroukhim et al., 2010). Na LLA-B, estas alterações incluem
hiperdiploidia com ganho de pelo menos 5 cromossomos incluindo X, 4, 6, 10, 14, 17,
18 e 21, hipodiploidia com menos de 44 cromossomos, e translocações recorrentes
como, t (12,21) (p13; q22) que codifica ETV6-RUNX1, t (1,19) (q23; p13) codificando
TCF3-PBX1, t (9;22) (q34, q11) que codifica os genes de fusão BCR-ABL1, rearranjo de
MLL em 11q23 com uma gama de outros genes envolvidos e rearranjo de MYC com
genes que codificam receptores de antígenos (Campana & Pui, 2013). As principais
alterações genéticas das LLA-B e LLA-T estão apresentadas na Figura 1.
A análise por Hibridação Fluorescente in situ (FISH) tem demonstrado que a
fusão ETV6-RUNX1 é a anormalidade genética mais comum da LLA na infância, sendo
encontrada em aproximadamente 25% dos casos. A translocação está associada com
baixa contagem de leucócitos, idade entre 2 e 10 anos, início precoce da doença,
imunofenótipo da linhagem B e bom prognóstico (Artigas, 2006).
Embora a LLA hipodiplóide já esteja reconhecida como um subtipo de alto risco
para recidiva e que pode ser subdividida citogeneticamente em near-hipodiplóide (24 a
31 cromossomos), baixa hipodiploidia (32 a 39 cromossomos) e alta hipodiploidia (40 a
43 cromossomos) a base genética destas variantes foram descobertas recentemente em
um estudo utilizando metodologias para avaliação do genoma por completo e
sequenciamento de exomas. Casos near-haplóides apresentaram alterações envolvendo a
sinalização de receptores de tirosina quinase e sinalização de Ras, enquanto os casos
com baixa hipoplodiploidia demonstraram alterações nos genes TP53 e RB1 (Holmfeldt
et al., 2013)
20
A LLA-T é caracterizada por mutações que levam a ativação do gene NOTCH1
e rearranjos de fatores de transcrição TLX1 (HOX11), TLX3 (HOX11L2), LYL1, TAL1,
TAL2, LMO1, LMO2 e LYL1, assim como na LLA-B rearranjos com gene MLL podem
ser observados. Outros achados recorrentes na LLA-T são a ativação constitutiva da
sinalização down-stream ao receptor de células T (TCR), independentemente do
encontro com o antígeno, devido a mutações seguintes de genes que codificam quinases
assim como ABL1, LCK e RAS. Alternativamente, deleções de genes que codificam
reguladores negativos da sinalização celular assim como fosfatases e PTEN levam a
transcrição constitutiva de genes de sobrevivência (Szczepański, 2010; Graux, 2011).
Os rearranjos envolvidos com o TCR são responsáveis pelo aumento da expressão de
protooncogenes, alguns deles estão envolvidos diretamente ou indiretamente no
desenvolvimento da leucemia de células T, são eles NOTCH1, MYB, HOXA, TAL1 e
outros (Graux 2011).
Com o surgimento de metodologias que avaliam o genoma por completo novas
alterações já foram identificadas e tem um papel importante na leucemogênese. Uma
das alterações recentemente identificadas está caracterizada pelo aumento da expressão
do gene CRFL2 em 5% a 7% dos casos de LLA-B e notavelmente presente em 50% dos
* iAMP21 (intrachromosomal amplification of chromosome 21)
Figura 1. Frequência das alterações genéticas na LLA infantil
Adaptado de Mullighan, 2012
Alterações genéticas mais frequentes na LLA-B
Novas alterações gênicas na LLA
Outras alterações genéticas na LLA-B
Alterações genéticas mais frequentes na LLA-T
Outras alterações genéticas na LLA-T
21
pacientes com LLA e Síndrome de Down. Muitos destes casos apresentam
translocações envolvendo um gene tirosina quinase (JAK), e provavelmente os pacientes
necessitarão de um tratamento quimioterápico mais intenso. Outro subtipo é
denominado de LLA BCR-ABL1-like, correspondendo a aproximadamente 10% dos
casos de LLA-B e exibe um padrão de expressão gênico similar a LLA-B com alteração
em IKZF1 e BCR-ABL1 positivo (Pui & Evans, 2013).
A amplificação intra cromossômica do cromossomo 21 ocorre em 2% dos casos
de LLA-B, e foi originalmente definida, utilizando a técnica de FISH, como um ganho
de pelo menos três cópias do gene RUNX1. Estudos subsequentes demonstraram que a
região de amplificação é tipicamente grande e complexa e frequentemente acompanhada
de deleção em regiões sub-telomericas do cromossomo 21. As consequências funcionais
da amplificação ainda são desconhecidas, mas é importante identificar este tipo de
alteração, pois este subtipo está associado com pior resposta ao tratamento (Moorman et
al., 2010; Robinson et al., 2007).
Mais de 50 alterações genéticas recorrentes têm sido identificadas na LLA. Estas
frequentemente envolvem genes com papel conhecido ou putativo no desenvolvimento
dos linfócitos e no processo da leucemogênese. Geralmente os genes envolvidos
codificam reguladores do desenvolvimento dos linfócitos (PAX5, IKZF1, e EBF1),
fatores de transcrição (ETV6, ERG), moléculas de sinalização dos linfócitos (BTLA,
CD200, BLNK, VPREB1), reguladores do ciclo celular, da apoptose e supressores de
tumor (CDKN2A/CDKN2B, ATM, BCL2, BAX, RB1, PTEN,) e menos comumente,
reguladores de resposta aos fármacos (receptor NR3C1de glicocorticoides) (Mullighan,
2011).
Os genes comentados abaixo representam os genes que estão comumente
alterados na LLA infantil e que foram avaliados no presente estudo. As alterações no
perfil de expressão dos mesmos podem ser decorrentes principalmente de alterações
citogenéticas e alterações do número de cópias (ganho ou perda). As deleções são mais
comuns do que as amplificações gênicas e são normalmente focais estando relacionadas
a apenas um gene. A natureza e a frequência destas alterações estão associadas a
linhagem celular e o subtipo citogenético da LLA (Inaba et al.,2013).
a) Genes ETV6 e RUNX1 (TEL e AML1)
. O gene TEL (do inglês Translocation Ets Leukemia gene) foi inicialmente
identificado por sua fusão com o gene PDGFRβ (do inglês, platelet-derived growth
22
factor receptor beta) em um paciente com Leucemia Mielomonocítica Crônica com a
t(15;12)(q33;p13) (Raimondi et al., 1997). Posteriormente, ele foi renomeado para
ETV6 (do inglês ets variant gene 6) por uma comissão de nomenclatura para evitar
confusão com a abreviação de telômero. O gene codifica um fator de transcrição da
família ETS (do inglês E-26 transforming specific), como outros membros desta
família, funciona como um regulador transcricional sequência específico de ligação ao
DNA (Wang et al., 1998).
O produto deste gene contém dois domínios funcionais: PNT (do inglês, N-
terminal pointed domain) que está envolvido na interação proteína-proteína e o domínio
C-terminal de ligação ao DNA. Embora geralmente presente em malignidades
hematopoéticas, o gene TEL está normalmente expresso em tecidos hematopoéticos e
não hematopoéticos. Estudos knockout do gene TEL em camundongos sugeriram que
ele está envolvido na hematopoese da medula óssea e manutenção da rede vascular.
Sendo, portanto, a primeira proteína transcricional necessária para a hematopoese na
medula óssea (Rubnitz et al., 1999). Estudos recentes, que relataram rearranjos
cromossômicos envolvendo 12p13 observaram associação do gene TEL em leucemias
de origem mielóide e linfóide (Irvin et al., 2003; Berna Berveloo et al., 2001),
fibrossarcomas congênitos (Knezevich et al., 1998) e carcinoma secretório análogo
mamário (Connor et al., 2012)
Uma evidência adicional de que ETV6 pode desempenhar o papel de supressor
de tumor vem de estudos in vivo e in vitro da sua função fisiológica. Rompaey et al.,
(2000) observaram que a superexpressão do gene TEL retardou a proliferação de
diversos tipos celulares pela indução da parada do ciclo na fase G1 e ainda inibiu a
transformação celular mediada por RAS. O aumento da expressão de ETV6 de células
de eritroleucemia em camundongos aumentou sua diferenciação em eritrócitos enquanto
que a introdução de um mutante dominante negativo de ETV6 bloqueou este efeito. Foi
também demonstrado que a expressão do ETV6 tem um pico durante os 3 primeiros dias
de diferenciação das células da eritroleucemia. A indução da expressão de ETV6 em
células NIH3T3 levou a um aumento na apoptose, possivelmente através da repressão
transcricional direta do promotor de Bcl-XL. Apesar de reconhecer que os níveis de
TEL excederam as da proteína endógena, o efeito inibitório descrito forneceu uma
justificativa para a presença da perda do alelo TEL em leucemias e alguns tumores
sólidos (Bohlander, 2005).
23
O RUNX1 (do inglês Runt-related transcription fator), também conhecido como,
AML1, CBFA2, CBFA2, EVI-1, AMLCR1, PEBP2Ab e AML1-EVI-1 está localizado na
região do cromossomo 21q22, é essencial no desenvolvimento de todas as linhagens
celulares hematopoéticas, incluindo das células linfóides. Ele codifica um fator de
transcrição que contém um domínio Runt com 128 aminoácidos e um domíno de
transativação com 80 aminoácidos. Através do domínio Runt, RUNX1, é capaz de ligar
ao DNA de seu alvo, este domínio também permitirá a heterodimerização com CBFβ
que aumenta a atividade de ligação ao DNA da proteína RUNX1. A atividade de ligação
ao DNA com o CBFβ é crítica para a expressão tecido específica de vários genes
hematopoéticos específicos (Mavrothalassitis et al., 2000; Mikhail et al., 2002).
O RUNX1, em condições normais, se liga a sequências regulatórias
transcricionais do tipo enhancer como um heterodímero com o CBFβ, e juntos recrutam
um complexo de ativação transcricional que incluem proteínas com atividade de
acetilases histonas. Os resíduos de lisina acetilato destas proteínas nas histonas centrais,
abrem à estrutura da cromatina e levam a ativação transcricional do gene RUNX1, que
tem um papel central na hematopoese. A presença da proteína de fusão ETV6-RUNX1
resultante da t(12;21) mantem à habilidade de ligação a sequência enhancer e forma o
heterodímero com CBFβ. Diferentemente da proteína RUNX1 normal, ele recruta um
correpressor transcricional que inclui proteínas com atividade de desacetilase, que
remove os grupos acetil das histonas, resultando no fechamento da cromatina e
repressão da transcrição. Estas modificações na cascata de transcrição, mediada pelo
AML1 normal, alteram a capacidade de renovação e diferenciação da célula tronco
hematopoética (Pui et al., 2004).
Foi observado que o nível de expressão do AML1 estava significativamente
elevado nos grupos de LLA com a presença e ausência da t(12;21) quando comparado
com o grupo controle. Isto pode ser devido o fato de que a expressão de AML1 é
necessária para a proliferação, visto que o AML1 regula a transição da fase G1 para S do
ciclo celular. Estudos ainda demonstraram que a alta expressão do TEL-AML1, AML1-
TEL, e AML1 está relacionada com pior prognóstico quando existe positividade para a
t(12;21) na LLA infantil (Stams et al., 2005).
A haploinsuficiência de RUNX1 tem sido relacionada com uma forma de
desordem plaquetária familial com predisposição para leucemia mielóide aguda (LMA).
Ademais, mutações pontuais em neste gene têm sido relatadas na LMA e na leucemia
24
mielóide crônica (LMC), resultando em um defeito funcional da proteína, assim como a
amplificação em tandem já foi observada em alguns casos de LLA infantil. Estas
observações fortemente sugerem que o nível de expressão de RUNX1 é crucial para a
diferenciação hematopoética, e que o aumento da expressão ou a haploinsuficiência
deste gene pode ser um importante fator que contribui para a patogênese e progressão da
LLA (Mikhail et al.,2002; Song et al., 1999).
Estudos conduzidos, com crianças portadoras da LLA, observaram uma
amplificação em tandem do RUNX1, sugerindo que a sua expressão aumentada tenha
um papel etiológico na LLA. No entanto, ainda não está muito claro se cópias
adicionais deste gene resultam na sua expressão aumentada. Utilizando-se o método de
RT-PCR, foi observado uma expressão significativamente maior em relação ao grupo
controle em 18 das 41 crianças avaliadas com LLA (43,9%). Na maioria dos casos o
aumento da expressão de AML1 estava associada com anormalidades no cromossomo
21, trissomia do 21 não constitucional ou cópias em tandem do gene no der(21).
Entretanto, parece que existem outros mecanismos que resultam na alta expressão de
AML1 sem mudanças óbvias do gene. É possível que nestes casos a atividade do seu
promotor possa estar alterada (Niini et al., 2000; Mikhail et al.,2002; Mkrtchyanet al.,
2012).
b) Genes BCR e ABL1
O gene de fusão BCR-ABL1 é resultado da t(9;22)(q34;q11). A região de quebra
no gene ABL ocorre principalmente entre os éxons a1 e a2. No cromossomo 22 a quebra
mais frequente e predominante na LLA é na minor cluster region (m-bcr) entre os éxons
e1 e e2. Porém em 1/3 dos casos de LLA Ph+, a quebra ocorre na major cluster region
(M-bcr) entre os éxons e2 e e3 ou e3 e e4. As proteínas quiméricas p210 e p190
resultam dos rearranjos M-BCR/ABL e m-BCR/ABL, respectivamente. As células
blásticas na LLA tipicamente expressam p190, mas a expressão da p210 tem sido
observada em alguns casos, principalmente em adultos. A proteína de fusão promove
uma desregulação da atividade de tirosina quinase (Scharappe et al., 1998; El-Sissy et
al., 2006; Hantschel, 2012).
O termo breakpoint cluster region (BCR) refere-se a uma área de 5.8 Kb no
cromossomo 22. O produto normal do gene BCR é de 160Kda e contem inúmeros
domínios. Estes incluem um domínio de oligomerização, domínio quinase atípico S/T,
25
domínio de ligação ao homólogo de SH2, domínio GEF (guanine nucleotide 25poptóti
25popt) e um domínio GAP com atividade de GTPase (Clokie et al., 2005).
A proteína c-ABL faz parte da classe de SFKs (família Src de quinases), e é o
protótipo de uma subfamília que inclui dois membros, o c-ABL e Arg. Demonstra uma
organização modular e são caracterizadas por uma região N-terminal, seguida do
domínio SH3, SH2 e núcleo central. Está localizada em vários sítios celulares, incluindo
núcleo, citoplasma, mitocôndria, retículo endoplasmático e córtex celular. O c-ABL
nuclear modula a resposta celular induzida por danos no DNA, e participa da inibição
do crescimento celular e promoção da apoptose. O papel do c-ABL citoplasmático tem
sido relacionado à participação em cascatas de sinalização celular que são ativadas por
estímulos extracelulares (Panjarian et al., 2013).
O c-ABL interage com uma variedade de proteínas celulares, incluindo
adaptadores da sinalização, quinases, fosfatases, reguladores do ciclo celular, fatores de
transcrição e proteínas do citoesqueleto. Têm participações funcionais em intervalos de
processos celulares como regulação do crescimento e sobrevivência celular, stress
oxidativo e resposta a danos no DNA, dinâmica da actina e migração celular. Um
controle temporal e espacial da atividade de quinase do c-ABL é essencial, como uma
atividade aberrante que está associada com oncoproteína BCR-ABL que leva a
diferentes formas de leucemia em humanos. Semelhante a muitas tirosinas quinases, a
família ABL compreende uma forma oncogênica que exibe uma estrita localização
citoplasmática e uma atividade de quinase desregulada. Esta inclui a oncoproteína
retroviral v-ABL da leucemia de murinos e a fusão BCR-ABL em humanos que está
relacionada com a LMC e LLA (Hantschel & Superti-Furga, 2004).
c) Gene PTEN
O supressor de tumor PTEN (tumor homólogo de tensina e fosfatases) foi
identificado em 1997 como um gene relevante, localizado na região 10q23. Foi definido
como um candidato a supressor de tumor baseado na presença de frequentes inativações
do mesmo em tumores humanos em estágios finais. Consequentemente, PTEN se tornou
objeto de intensa pesquisa nos últimos anos (Chu & Tarnawski, 2004). O gene PTEN
contém 9 éxons e uma região open reading frame de 1,209 nucleotídeos codificando
uma proteína com 403 aminoácidos que apresentam um domínio N-terminal, um
domínio estrutural C2 e um motivo de ligação PDZ classe I ao domínio C-terminal. A
26
principal função catalítica do PTEN é desfosforilar o fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato
(PtdIns(3,4,5)P3), que é um potente ativador da 3-fosfoinositide-kinase dependente
(PDK) e AKT. Como consequência, a perda da função do PTEN leva ao aumento dos
níveis de PtdIns (3,4,5)P3 e a uma depressão da PI3K-AKT que estimulam o
crescimento e a sobrevivência celular (Song et al.,2012).
O gene PTEN está envolvido na inibição da migração e proliferação celular e
participa da modulação do crescimento celular e apoptose. É um regulador negativo das
vias PI3K-AKT que influenciam na regulação celular e apoptose. Portanto, pode
contribuir no desenvolvimento de tumores. Está comumente deletado ou inativado em
diversos tipos de câncer incluindo próstata, mama, cérebro e malignidades
hematológicas. Sua atividade é fortemente regulada, a nível transcricional e pós
traducional, por fosforilação, oxidação e acetilação (Zhang et al., 2012).
d) Gene TAL1 (SCL, TCL5)
O gene TAL1 está localizado em 1p32, é um regulador chave no
desenvolvimento das células tronco hematopoéticas. É expresso em células progenitoras
hematopoéticas, mastócitos e progenitores eritróides e de megacariócitos. A proteína
TAL1 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix de classe II (bHLH) que forma
um heterodímero com as proteínas E (bHLH classe I), que incluem TCF3/E2A e
TCF12/HEB (Tremblay et al.,2010). É caracterizado por um domínio que serve de
mediador para a ligação ao DNA e duas alfa hélices conectadas por um loop que estão
envolvidas na formação de um complexo homodimérico e heterodimérico. A
superexpressão ou ativação aberrante de fatores de transcrição bHLH, ativados por
translocações cromossômicas, é um evento oncogênico frequente na LLA-T (Kassouf et
al., 2010).
A expressão anormal de TAL1 está presente em aproximadamente 60% dos
casos de LLA-T como resultado de diferentes rearranjos cromossômicos. Em 3% dos
casos da LLA-T na infância, a translocação t(1;14)(p32;q11) coloca o gene TAL1 sob o
controle de sequências enhancer do receptor TCRA/D. Adicionalmente, 16 a 30% das
LLA-T abrigam um pequeno rearranjo intra cromossômico que coloca TAL1 sob o
controle de promotores do gene vizinho SIL1. Além disso, a superexpressão deste gene
pode ser detectada sem que haja a presença de rearranjos cromossômicos, não se
sabendo ao certo qual tipo de mutação que provocaria este fenômeno. (De
Keersmaecker et al.,2005).
27
Casos de LLA-T com expressão aumentada de TAL1 demonstram parada no
desenvolvimento em estágios finais dos timócitos. O potencial oncogênico de TAL1 é
ilustrado pela indução da LLA-T em camundongos transgênicos expressando TAL1
durante o desenvolvimento dos timócitos. Nas células leucêmicas, as formas de TAL1
formam primariamente um complexo transcricional inativo que contem proteínas E e
fatores LMO, LMO1 e LMO2, resultando na diminuição da expressão dos genes alvos
da proteína E. Portanto, embora TAL1 possa estar presente em complexos
transcricionais ativando a expressão de alguns genes alvo, tem sido proposto que a
atividade oncogênica de TAL1 possa ser mediada primariamente pela redução dos
níveis da atividade transcricional de promotores normalmente controlados pelas
proteínas E (Van Vlierberghe & Ferrando, 2012).
e) Genes BAX e BCL2
Existem dois caminhos distintos que levam a apoptose. O primeiro, chamado de
via intrínseca, que é dependente de mitocôndria e é solicitado a partir de um stress
intracelular como exposição à radiação, ausência de fator de crescimento, privação de
citocinas, drogas citotóxicas e é regulado por proteínas da família BCL2. O segundo
caminho é o da via extrínseca, que funciona independentemente da mitocôndria. Esta
via é ativada por receptores de morte de superfície celular CD95 (Apo1 ou Fas)/TRAIL/
família do receptor de necrose tumoral 1 (TNF) que estão localizados na membrana
plasmática e ativam diretamente a via da caspase (Tait &Green, 2010).
O gene BCL2 foi primeiramente descrito em linfoma folicular de células B a
partir da identificação dos pontos de quebras provenientes da t(14;18). Este gene está
localizado na região cromossômica 18q21.3. A expressão aumentada da proteína BCL2
é encontrada não apenas em linfoma folicular não Hodgkin’s, mas também em tumores
hematopoéticos e tumores sólidos, independente da t(14;18) (Tsujimoto et al.,1985;
Cory & Adams, 2002).
A família da proteína BCL2 consiste em pelo menos 30 proteínas, caracterizadas
pela presença de mais de 4 motivos com sequências curtas (menos de 20 resíduos de
aminoácidos) denominados de domínios homólogos ao BCL2. Esta família é dividida
em 3 diferentes subclasses baseada nas suas características funcionais e estruturais
(Adams & Cory, 1998).
28
A família anti-apoptótica inclui as proteínas BCL2, BCL-XL, BCL-W, e MCL1.
BCL2 parece inibir a apoptose pela preservação da integridade da membrana
mitocondrial com seu domínio carboxi-terminal hidrofóbico ligado à membrana externa.
BCL2 previne a oligomerização de BAX/BAK que de outra maneira conduzem à
liberação de várias moléculas apoptogênicas da mitocôndria. BCL2 liga e inativa BAX
e outras proteínas pro-apoptóticas, desse modo inibindo a apoptose (Adams & Cory,
1998; Youle &Strasser, 2008).
Como membros da família pro-apoptótica estão BAX, BAK e BOK, que
apresentam uma sequência similar aos domínios BH1, BH2 e BH3 da família acima
descrita, com exceção do domínio BH4. A proteína BAX é uma proteína monomérica
no citosol, que interage dentro da mitocôndria durante a apoptose e subsequentemente
oligomeriza, resultando na liberação de fatores apoptogênicos como citocromo c e a
ativação da cascata de caspase (Leibowitz &Yu, 2010; Petros et al., 2004).
Níveis aumentados de BCL2 podem estar associados com diminuição da
apoptose dos blastos circulantes, além de antagonizar a morte celular induzida por
fármacos. A expressão de BCL2 está relacionada com inibição da morte celular
programada de muitos tipos celulares, e esta função anti apoptóticas parece ser
modulada pela sua habilidade de heterodimerizar com outros membros da família,
principalmente o BAX. A susceptibilidade a apoptose pode, portanto, ser dependente da
razão entre as proteínas BCL2 e BAX. A expressão de BCL2 é regulada negativamente
enquanto a de BAX é regulada positivamente pela proteína p53. A relativa expressão e
função destas moléculas pode, por consequência, determinar a extensão da apoptose
(Srinivas et al., 2000).
1.1.3 Fatores Prognósticos para a LLA
Até 1980, a LLA era a causa mais comum de morte em crianças acometidas com
câncer. Desde então, com as novas técnicas de tratamento da doença, a mortalidade por
leucemia tem diminuído significativa e progressivamente. Atualmente a sobrevida para
a LLA pediátrica melhorou cerca de 90% em ensaios que utilizam a estratificação de
risco dos pacientes. O sucesso na melhora da taxa de cura é decorrente da utilização de
características biológicas das células leucêmicas, resposta ao tratamento e modificação
de tratamento com base na farmacodinâmica e farmacogenômica dos pacientes. No
29
entanto, as abordagens inovadoras são necessárias para melhorar a sobrevida e reduzir
os efeitos adversos do tratamento. O prognóstico para crianças menores de 1 ano e
adultos ainda continua desfavorável, sendo importante melhorar a taxa de cura destes
indivíduos (Inaba et al., 2013; Gariochea, 2001).
Apesar das grandes descobertas genéticas, utilizando tecnologias de alta
resolução, permitirem um melhor entendimento da base genética da LLA, as abordagens
atuais para avaliação de risco na LLA ainda dependem de uma série de achados clínicos
e laboratoriais, como contagem inicial de leucócitos, idade no momento do diagnóstico
e resposta precoce ao tratamento. Crianças com a faixa etária entre 1-9 anos de idade
têm uma melhor resposta ao tratamento quando comparado a crianças com menos de 1
ano de idade e adolescentes. A leucometria é uma variável contínua, a sua diminuição
confere uma melhor resposta ao tratamento quimioterápico. São considerados critérios
mínimos para que a LLA-B de células precursoras seja classificada como sendo de
baixo risco a presença da faixa etária de 1 a 9 anos de idade e contagem de leucócitos
inferior a 50.000/mm3, entretanto estes aspectos clínicos e laboratoriais apresentam
pouco valor prognóstico para a LLA-T (Pui et al., 2011).
O impacto prognóstico da idade e contagem de leucócitos pode ser parcialmente
explicado pela sua associação com anormalidades genéticas específicas. Por exemplo,
há uma preponderância de casos com alterações genéticas favoráveis como a
hiperdiploidia (> 50 cromossomos) ou ETV6-RUNX1 em pacientes com idade entre 1-9
anos. Embora muitas anormalidades genéticas, incluindo algumas identificadas
recentemente, estejam associadas com a evolução clínica, apenas algumas são usadas
rotineiramente para estratificação de risco (Pui & Evans, 2006). A Tabela I apresenta os
fatores prognósticos comumente usados para a estratificação de risco e terapêutica em
triagens clínicas atuais.
30
Tabela I. Fatores Prognósticos associados à estratificação de risco na LLA infantil
Fatores Favorável Desfavorável
Idade (anos) 1-9 < 1 ou > 9
Contagem de Leucócitos < 50.000/mm3 ≥ 50.000/mm
3
Imunofenótipo Células B precursoras Células T e Células B maduro
Genótipo
Hiperdiploidia (> 50
cromossomos)
ETV6-RUNX1(TEL-AML1)
Hipodiploidia (< 44
cromossomos)
BCR-ABL1 e MLL-AF4
DRM* após fase de indução < 0.01% células leucêmicas ≥ 0,01% células leucêmicas
*DRM: Doença Residual Mínima
Historicamente, crianças do sexo masculino apresentam uma pior resposta ao
tratamento em relação ao sexo feminino, mas com o uso de protocolos de tratamento
contemporâneos esta diferença de resposta ao tratamento entre os sexos não é mais
observada (Siverman et al., 2001; Pui et al., 1999) O impacto prognóstico adverso para
o sexo masculino tem sido abolido em algumas triagens clínicas cuja razão da
Sobrevida Livre de Evento (SLE) seja ≥ 80% (Pui et al., 2004a).
Alterações genéticas com prognóstico favorável associadas com precursores B
envolvem a hiperdiploidia (mais de 50 cromossomos), a fusão ETV6-RUNX1 ou t
(12:21) e as aneuploidias, em particular as que incluem as trissomias dos cromossomos
4, 7, 10, 17 e 18. A hiperdiploidia provoca maior sensibilidade dos blastos à
quimioterapia. Acredita-se que este fato esteja relacionado a achados in vitro de
apoptose espontânea destas células e à sua sensibilidade em acumular altas doses de
metotrexato. Pacientes hiperdiplóides possuem três a quatro cópias do cromossomo 21,
o qual carreia um gene que codifica a redução do transporte de folato (Friedmann et al.,
2000).
A t(1;19) (q23;q13) com fusão dos genes TCF3-PBX1, está associada a um
prognóstico ruim com doses convencionais de quimioterapia, porém, a recente
intensificação da terapia demonstrou uma melhora na sobrevida para as crianças
portadoras da translocação próxima de 90% (Pui et al., 2008).
A LLA com a presença da t(9;22) que resulta no gene de fusão BCR-ABL, foi
considerada como sendo um tipo de leucemia de altíssimo risco para os pacientes que
apresentavam este tipo de alteração genética mesmo quando o tratamento incluía o
31
transplante de células tronco hematopoéticas. Atualmente, estes pacientes, que possuem
o cromossomo Ph (Philadelphia) positivo, apresentam uma grande melhoria com
relação ao tratamento instituído, ou seja, respondem mais precocemente ao tratamento,
pois recebem em conjunto com a quimioterapia padrão um inibidor de tirosina quinase
(mesilato de imatinibi) (Schultz et al., 2009).
Pacientes com a LLA de células T geralmente apresentam uma menor taxa de
sobrevida livre de eventos do que aqueles com a linhagem B, e / ou uma maior taxa de
falha na indução, recidiva precoce e recaída no Sistema Nervoso Central (SNC). Entre
os pacientes com LLA-T, é importante identificar aqueles com LLA-ETP (early T-cell
precursors), os pacientes com esta forma de leucemia têm resultados prognósticos
bastante desfavoráveis, mesmo com uso da terapia contemporânea, portanto requerem
abordagens de tratamento mais intensiva e inovadora (Counstan-Smith et al., 2009). A
LLA de células T com contagem de leucócitos >100.000/mm3 ao diagnóstico é uma
indicação para terapia direcionada mais intensa ao Sistema Nervoso Central (Pui et al.,
2004a).
A persistência de linfoblastos na medula óssea ou sangue periférico de pacientes
com LLA durante a terapia de indução de remissão indica uma resposta subótima e está
associada com um aumento significativo do risco de recaída. Portanto, a qualidade e a
rapidez da resposta ao tratamento é um dos mais importantes fatores prognósticos. A
avaliação da Doença Residual Mínima (DRM) pode ser feita através de diferentes
metodologias como, citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase (PCR) para
investigar transcritos de fusão, genes que codificam imunoglobulinas (Ig) e receptores
de células T (TCR). Pacientes com ≥ 1% de células leucêmicas no final da terapia de
indução da remissão estão associados com pior resposta ao tratamento. Assim como, é
indicativo de alto risco para recidiva quando se observa, após a avaliação de DRM em
qualquer fase do tratamento, mais de 1% de células residuais tumorais. Enquanto que
aqueles que atingem uma remissão molecular ou imunológica (<0,01%) apresentam
uma excelente resposta ao tratamento quimioterápico (Stow et al., 2010).
Alguns autores já relataram a associação entre os níveis de DRM durante a
terapia de indução com características genéticas da doença. Pacientes com o rearranjo
BCR-ABL1, mutações no gene IKZF1 e subtipo early T-cell precursors têm uma alta
prevalência de DRM positiva, enquanto que aqueles com fusão dos genes TCF3-PBX1 e
32
ETV6-RUNX1 comumente apresentam níveis mais baixos ou indetectáveis de células
tumorais (Mullighan et al., 2009; Campana, 2008; Coustan-Smith et al., 2009).
2. Justificativa
A última década experimentou grandes avanços nas áreas dos diagnósticos
molecular e bioquímico. Diversas ferramentas foram desenvolvidas para serem
aplicadas à medicina, muitas delas são técnicas aplicadas ao diagnóstico laboratorial das
doenças e muitas podem ser usadas para se compreender a biologia e os mecanismos
oncogênicos das leucemias. Por outro lado, apesar da amplitude investigativa no
diagnóstico das leucemias, usando estratégias da genética molecular e da citogenética,
predominam as decisões clínicas e diagnósticas com base em critérios qualitativos e/ou
quantitativos, a partir de variáveis que foram identificadas e desenvolvidas há mais de
três décadas. A avaliação do prognóstico com base nestas variáveis ainda permanece
insuficiente para identificar pacientes com alto risco de recidiva que se apresentam
como de baixo risco ao diagnóstico. Atualmente, os hematologistas possuem à sua
disposição estratégias terapêuticas e de diagnósticos eficientes, que os fazem confrontar
as lições dos indicadores clássicos de prognóstico.
33
Existem atualmente diferentes técnicas de diagnóstico para as alterações
celulares, imunofenotípicas e moleculares subjacentes ao processo leucêmico, que
gradativamente ganham reconhecimento e passam a ser padronizadas para serem
incluídas na rotina clínica. Os resultados destas estratégias de diagnóstico são
importantes para promover um melhor gerenciamento dos casos pelos médicos
assistentes. A inovação do presente estudo consiste em usar os dados dos resultados das
ferramentas de genética molecular para medir a variabilidade biológica da leucemia
linfóide aguda, além de oferecer potencial para a identificação de genes potencialmente
envolvidos nos mecanismos subjacentes à evolução clonal leucêmica. Confrontando os
dados a serem gerados no presente estudo, com os dados derivados dos prontuários dos
pacientes, espera-se que os resultados divulgados e discutidos possam contribuir para
ampliar a caracterização da LLA, e, assim, auxiliar na definição de estratégias clínicas e
no seguimento da doença.
3. Objetivos
3.1. Geral
Analisar a variação da expressão dos marcadores moleculares, utilizando a
metodologia de PCR array, em crianças com LLA ao diagnóstico e no final da
quimioterapia de indução.
3.2. Específicos
1. Contribuir para a elaboração de um painel de marcadores moleculares que
possam estar associados com aspectos clínicos, prognósticos e biológicos da
LLA.
2. Avaliar a distribuição do padrão de expressão das alterações moleculares ao
diagnóstico e no final da terapia de indução
34
3. Explorar sistematicamente a relação entre as variáveis clínico e biológicas dos
pacientes e a potencial associação com os dados do presente estudo na
determinação do prognóstico.
4. Material e Métodos
4.1. Delineamento do Estudo
Foi realizado um estudo prospectivo conduzido no LaGene- Laboratório de
Citogenética Humana e Genética Molecular-SES/GO e no NPR- Núcleo de Pesquisas
Replicon da Pontifícia Universidade Católica de Goiás, em parceria com a Santa Casa
de Misericórdia de Goiânia (SCMG) e Hospital Araújo Jorge (HAJ) da Associação de
Combate ao Câncer de Goiás (ACCG). Os casos de LLA infantil foram obtidos junto ao
Setor de Hematologia Pediátrica da SCMG e Setor de Pediatria do HAJ. De cada caso
foram obtidas amostras biológicas por ocasião do diagnóstico, anteriormente ao início
do tratamento e no 28º dia após início do tratamento (D+28) para avaliação molecular.
4.2. Caracterização das Amostras Biológicas
35
Os médicos responsáveis por cada setor das Instituições colaboradoras, a época
do diagnóstico da LLA, realizaram a coleta de medula óssea ou sangue periférico para
estudo morfológico e/ou imunofenotípico. Da amostra obtida foi utilizado 1,5 mL para
o estudo molecular. No 28° dia da quimioterapia de indução, foram coletados, pelos
responsáveis de cada setor, amostras de medula óssea para realização do exame
morfológico e imunofenotípico para monitoramento da DRM, desta amostra foi retirado
1,5 mL de medula óssea para avaliação dos marcadores moleculares por PCR array.
Adicionalmente, 3 amostras de medula óssea e 3 amostras de sangue periférico de
doadores saudáveis foram incluídas no grupo controle.
A coleta foi feita utilizando-se seringas esterilizadas e com EDTA. As amostras
de sangue periférico e medula óssea foram transferidas para tubos PAX gene Blood
RNA®
(PreAnalytix, Qiagen/ BD Company) e congeladas a -20ºC até o momento da
extração do RNA. As mesmas foram transportadas refrigeradas pelo pesquisador
responsável ao Laboratório.
As amostras controle de medula óssea foram obtidas junto ao Serviço de
Imunofenotipagem do HAJ e as amostras de sangue periférico, foram obtidas de
doadores saudáveis do NPR da PUC-GO.
A inclusão de portadores da LLA no presente estudo obedeceu aos seguintes
critérios: Crianças menores de 19 anos de idade com diagnóstico de LLA, que
voluntariamente doaram amostras biológicas previamente ao início da quimioterapia,
que apresentavam tumor primário, cujos prontuários apresentavam informações como
sexo, idade. Foram excluídos amostras de crianças que não preencheram os critérios
acima mencionados e amostras com volume insuficiente para a realização da
metodologia.
4.3. Grupo amostral
Foram avaliados no total, 16 amostras de medula óssea ou sangue periférico para
LLA na infância, com idade variando de 0 a 19 anos, sendo que as amostras foram
obtidas previamente ao início da quimioterapia e no D+28 dos pacientes. A participação
individual no estudo e a doação das amostras biológicas foram voluntárias, mediante
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) pelos pais ou
responsáveis dos participantes. Antes do início da coleta das amostras a pesquisadora
36
responsável pelo estudo fez os esclarecimentos necessários para o entendimento da
proposta investigativa e os esclarecimentos necessários para a adesão.
4.4 Extração de RNA
A extração do RNA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante do
Kit PAXgene Blood RNA®
(PreAnalytix, Qiagen/ BD Company). Após o isolamento o
RNA foi quantificado em um espectrofotômetro NanoVue PlusTM
(GE Healthcare,
EUA) e posteriormente, um gel de agarose a 3% foi usado para, avaliar a integridade do
RNA e o grau de contaminação da amostra com DNA genômico. Em seguida a solução
aquosa de RNA foi armazenada a -80ºC, para posterior reação de transcrição reversa.
Para garantir a pureza do RNA, foram avaliados os seguintes parâmetros de
absorvâncias:
A260:A 230 ≥ 1,7 (Avaliar contaminação por proteínas)
A260:A 280 = 1,8 a 2,0 (Avaliar contaminação por sais, polissacarídeos e
compostos orgânicos como fenol)
4.5 Transcrição Reversa e Real Time PCR Array
Para a síntese de cDNA foram usados os produtos do Kit RT2 First Strand
®
(Qiagen/Alemanha) e posteriormente, desenvolvido a PCR em tempo real utilizando o
kitRT2 Profiler PCR Arrays
®(Qiagen/Alemanha) em combinação com o RT
2 SYBR
Green Mastermixes®
(Qiagen/Alemanha) de acordo com instruções do fabricante. A
reação foi conduzida no termociclador Bio-Rad IQTM
5® (USA), as condições de
ciclagem da PCR estão listadas na tabela II. 25µL do mix foi adicionado em cada poço
da placa que continha o primer específico para cada gene estudado.
Cada array contém um painel de 96 poços, com 8 primers específicos dos genes
que estão sendo pesquisados e 4 poços contendo os controles que são: controle para
gene de referência (GAPDH) para a normalização dos dados, controle do DNA
genômico que detecta a contaminação do ensaio com DNA genômico não transcrito,
controle da transcrição reversa que testa a eficiência da reação de transcrição reversa e,
controle positivo da PCR que consiste em uma sequência de DNA artificial pré
dispensadas na placa, é responsável pela detecção da eficiência da PCR .
Tabela II. Condições de ciclagem recomendadas.
37
Ciclos Duração Temperatura Comentários
1 10 min 95ºC
40 15 s 95ºC
1 min 60ºC
1
1 min
2 min
2ºC/min
95ºC
65º C
65º C/ 95ºC
Curva de melting
Neste ensaio foram analisados o RNA de sangue periférico ou medula óssea dos
16 pacientes selecionados. O padrão de expressão dos 8 genes selecionados (ETV6,
PTEN, RUNX1, TAL1, ABL1, BCR, BAX e BCL2) foram comparados antes e depois da
quimioterapia no D+28, e entre pacientes doentes e saudáveis.
A PCR foi realizada visando determinar a expressão relativa dos genes ETV6,
PTEN, RUNX1, TAL1, ABL1, BCR, BAX e BCL2, com o auxilio de softwares
específicos. Após a validação dos controles e avaliação da curva de melting, para
análise dos dados, os valores dos Cq (quantification cycle) foram exportados para o
software disponibilizado no site da SABiosciences (www.SAbiosciences.com
/pcrarraydataanalysis.php).
Primeiramente, os dados foram normalizados a partir dos valores do gene de
referência, o software faz então o cálculo do ΔCT e ΔΔCT. A partir destes dados, ele
comparara os valores dos grupos controles com os casos e fornece os valores da
diferença, que é o Fold-Change ou o Fold-Regulation. Ambos têm o mesmo
significado, apenas a escala numérica que é diferente. Valores de fold-change foram
utilizados na análise dos níveis de expressão neste estudo. Valores maiores do que 1
indicam que o gene possui uma regulação positiva ou uma up-regulation. Enquanto,
valores menores do que 1 indicam uma regulação negativa ou down-regulation. É
fornecido também o valor de p, calculado utilizando o teste t-Student’s das replicatas
dos valores de ΔCT para cada gene do grupo controle e grupo teste. Para a análise da
expressão, foram avaliados o valor de fold-change.
4.6. Análise estatística
38
No presente estudo, todos os testes estatísticos foram realizados com um
Intervalo de Confiança de 95% e nível de significância (α) ≤ 0,05. Teste de Matriz de
correlação para verificar o grau de associação entre as variáveis. Teste Exato de Fisher
com objetivo de observar se houve diferença entre duas variáveis independentes. Para a
realização do Teste Exato de Fisher foi excluído um paciente que apresentou os valores
do fold-change bastante aumentado, pois o mesmo após a análise discriminante
demonstrou-se como um outlier. Estas análises estatística foi realizada utilizando o
BioEstat v5.0 (Ayres & Ayres, 2007).
Foi aplicada uma análise de componentes principais (PCA) com o objetivo
principal de sintetizar os dados obtidos de cada paciente. Para verificar a diferença entre
os pacientes antes e após o tratamento, foi realizado o procedimento de permutação
multi-resposta (“Multi-response permutation procedures – MRPP”). Esse é um
procedimento não-paramétrico para testar a significância de possíveis diferenças entre
grupos. A PCA e a análise MRPP foram realizadas no programa PC-ORD (versão 5;
McCune & Mefford, 2006).
4.7 Considerações Éticas
A presente proposta de estudo foi submetida e aprovada pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP) da PUC-GO. Toda a documentação referente às autorizações
institucionais, individuais e do CEP foi arquivada no Núcleo de Pesquisas Replicon da
PUC-GO e poderá ser disponibilizado sob pedido formal.
5. Resultados
Um total de 16 pacientes com idade variando de 0 a 19 anos diagnosticadas com
LLA foram encaminhados das instituições de origem, no período de maio de 2012 a
janeiro de 2013, ao Núcleo de Pesquisas Replicon/ PUC-GO.
Os critérios FAB e Imunofenotípicos foram usados para o diagnóstico dos
pacientes. As Instituições colaboradoras seguem o protocolo Brasileiro de Tratamento
da Leucemia Linfóide Aguda em Crianças (GBTLI LLA-99). As informações clínicas e
laboratoriais foram obtidas dos prontuários médicos e estão descritas na Tabela III.
39
Dos 16 pacientes incluídos no estudo, 62,5% foram do sexo feminino e 37,5%
do sexo masculino. A média de idade foi de 8,4 anos (0-19 anos). Apenas um caso com
11 meses de idade. No presente estudo a faixa etária mais frequente foi de 1 a 9 anos de
idade, correspondendo a 56,3% dos casos, seguida de 37,5% para ≥ 9 anos. Na faixa
etária mais frequente da LLA, 37,5 % das crianças apresentaram idade variando de 2 a 5
anos. A estratificação dos grupos etários foi definida segundo o critério adotado pelo
GBTLI LLA-99, que são os mesmos usados para a avaliação de prognóstico. No
presente estudo, a razão entre os sexos feminino e masculino foi de 2:1.
Os imunofenótipos das amostras dos 16 pacientes foram definidos por
Citometria de Fluxo (CF), cerca de 68,7% corresponderam a LLA B e 31,3% a LLA T.
O imunofenótipo B mais frequente foi a LLA B-II, observado em 72,8% dos casos,
seguido da LLA B-III em 18,2% e LLA B-I em 9%. Os imunofenótipos LLA T-II e
LLA T-III representaram 80% e 20% dos casos T estudados, respectivamente. A
expressão do marcador CD10 estava presente em 75% dos casos. Sendo que, 83% dos
casos CD10+ estavam distribuídos na LLA-B. A ausência do marcador CD10 foi
detectado em 75% dos casos de LLA-T.
Características Nº (%)
Nº de Pacientes incluídos no estudo 16
Idade ao diagnóstico
≥1 ano e < 9 anos 9 (56,3%)
< 1 ano 1 (6,2%)
≥ 9 anos 6 (37,5%)
Sexo
Tabela III. Aspectos clínico-laboratoriais das crianças com LLA participantes da investigação de genes
associados ao perfil leucêmico por qPCR array em Goiânia (Brasil), segundo o GBTLI LLA-99.
40
Feminino 10 (62,5%)
Masculino 6 (37,5%)
Leucometria ao diagnóstico
< 50.000/ mm3 7 (43,75%)
≥ 50.000/ mm3 9 (56,25%)
Envolvimento do SNC ao diagnóstico 0
Envolvimento mediastinal ao diagnóstico 1(6,25%)
Envolvimento testicular ao diagnóstico 0
Imunofenótipo
Células B 11 (68,7%)
Células T 5 (31,3%)
Antígeno Calla (CD10) positivo 12 (75%)
Antígeno Calla (CD10) negativo 4 (25%)
Doença Residual Mínima (D+28) 12
Negativa 10 (83,33%)
Positiva 2 (16,67%)
Recaídas
Medular 1(8,3%)
SNC 0
Combinadas 1
Grupos de Risco
Baixo Risco 7 (43,8%)
Alto Risco 9 (56,2%)
Rearranjos moleculares 3
BCR/ABL 1
E2A/PBX1 0
ETV6/RUNX1 2
Óbitos 3 (18,7%)
SNC: Sistema Nervoso Central
A remissão morfológica no vigésimo oitavo dia da indução (D+28) foi obtida em
todos os casos. No entanto, a Doença Residual Mínima (DRM), determinada por CF, foi
positiva em 2 casos (20%). Entre os casos, registrou-se 1 recidiva medular e 1
combinada e três crianças foram a óbito. Segundo informações contidas nos prontuários,
apenas 3 pacientes apresentavam avaliação de rearranjos moleculares (BCR/ABL,
E2A/PBX1 e TEL/AML1). Apenas 1 paciente apresentou o rearranjo BCR/ABL, sendo
este, o único paciente que apresentou recidiva medular e foi a óbito.
41
O protocolo GBTLI LLA-99 prevê a estratificação dos pacientes em dois grupos
de risco de recidiva: baixo risco e alto risco, utilizando como critério a classificação do
National Cancer Institute (NCI) e resposta terapêutica in vivo avaliada no 7º, 14º e 28º
dias do tratamento de indução. No presente estudo os casos foram classificados em
grupos de risco pela equipe médica assistente logo após o diagnóstico da LLA. A
distribuição do risco de recaída entre os casos estudados foi de 43,8% e 56,2% para
baixo e alto risco, respectivamente.
Ao realizarmos o teste de Matriz de Correlação Linear foi possível observar uma
correlação negativa entre as variáveis sexo e o imunofenótipo (p = 0,016), ou seja,
pacientes do sexo feminino tem uma maior associação com o imunofenótipo B e menor
associação com o imunofenótipo T. Foi observado também uma correlação positiva
entre imunofenótipo e idade (p = 0,04), imunofenótipo e marcador CD10+ (p = 0,03),
imunofenótipo e grupo de risco (p = 0,015), marcador CD10+ e grupo de risco (p =
0,043) e marcador CD10+ e RUNX1 (p = 0,04).
Foram avaliados o padrão de expressão gênica em amostras de crianças com LLA,
antes e depois da quimioterapia de indução, e comparadas com um grupo controle
usando qPCR array. Os padrões de expressão destes genes antes e depois da
quimioterapia de indução estão listados na Tabela IV.
Genes Diagnóstico D+28
Fold Change 95% IC Fold Change 95% IC
ETV6 1,30 (0.00001, 2.86) 0,43 (0.00001, 0.97)
PTEN 1,23 (0.00001, 2.77) 0,66 (0.07, 1.16)
Tabela IV. Padrão de expressão gênica ao diagnóstico e no D+28
42
RUNX1 5,00 (0.00001, 11.05) 1,01 (0.00, 1.96)
TAL1 0,10 (0.00001, 0.24) 1.09 (0.00001, 2.54)
ABL1 3,86 (0.00001, 7.91) 1,55 (0.14, 2.72)
BAX 2,12 (0.00001, 4.41) 1,51 (0.00001, 2.99)
BCL2 3,18 (0.00001, 6.91) 1,26 (0.00001, 2.68)
BCR 3,20 (0.00001, 6.06) 1,22 (0.00001, 2.56)
IC: Intervalo de Confiança
A Tabela IV e a Figura 2 demonstram que ao diagnóstico os pacientes
apresentavam cinco genes com expressão aumentada, os genes PTEN e ETV6 com
aumento discreto em relação ao grupo controle, e o TAL1 se apresentou hipoexpresso
quando comparados ao grupo controle. É digno de nota a super expressão do RUNX1,
nos pacientes com LLA antes do tratamento, cinco vezes maior que o controle, e
evidenciou-se uma diminuição em 10 vezes em relação ao grupo controle do gene
TAL1. Após a quimioterapia de indução, os pacientes apresentaram diminuição na
expressão de todos os genes que encontravam-se aumentados ao diagnóstico e aumento
da expressão apenas do gene TAL1.
Foi constatada uma diminuição do padrão de expressão dos genes ETV6 e PTEN
após o tratamento com os níveis dos mesmos inferior ao do grupo controle. Houve uma
redução na expressão do gene RUNX1 após o tratamento ao 28º dia, o nível de
expressão se equiparou ao grupo controle. Com relação aos outros 4 genes cujo padrão
de expressão também estava aumentado, após o tratamento houve uma diminuição dos
seus níveis de expressão, mas não atingiram a normalidade. Com relação ao gene TAL1,
Figura 2. Níveis de expressão dos genes investigados em associação ao perfil
leucêmico de crianças com LLA ao diagnóstico e D+28 e controles saudáveis.
43
houve um aumento da expressão deste gene em 10 vezes em relação ao grupo controle.
Este aumento foi estatisticamente significativo (p < 0,00001), demonstrando que há
relação entre crianças com LLA tratados com o GBTLI LLA-99 e o nível de expressão
do gene TAL1.
A Figura 3 contém um gráfico do tipo ajuste de linha, que compara a expressão
normalizada de todos os genes dos casos ao diagnóstico com a expressão dos genes do
grupo controle. A linha central corresponde aos genes que não apresentam modificação
em sua expressão, e os limites estão representados pelas outras duas linhas externas a
linha central. Para o gene RUNX1 observou-se uma expressão aumentada, enquanto que
o TAL1 exibiu expressão diminuída.
Genes Idade (≥1 ano e < 9 anos) Idade (< 1 ano e ≥ 9 anos)
Fold Change 95% IC Fold Change 95% IC
ETV6 1,11 (0.00001, 3.61) 1,17 ( 0.00001, 2.28 )
PTEN 1,60 (0.00001, 5.00) 0,73 ( 0.00001, 1.69)
Tabela V. Padrão de expressão gênica de crianças com LLA segundo estratificação
da idade ao diagnóstico.
Figura 3. Comparação entre a expressão dos genes associado ao perfil leucêmico da LLA
infantil e seus controles por ocasião do diagnóstico após a normalização dos dados referentes
aos genes isolados.
Diagnóstico vs. Grupo Controle
Lo
g 1
0 (
Dia
gn
óst
ico
2^ -
Del
taC
t)
Log 10 (Grupo Controle2^ - DeltaCt)
RUNX1
TAL1
PTEN
BAX
ETV6 BCL2
ABL1
BCR
44
RUNX1 2,75 (0.00001, 9.50) 5,70 ( 0.00001, 9.89)
TAL1 0,14 (0.00001, 0.50) 0,09 ( 0.04, 0.18)
ABL1 3,31 (0.00001, 10.16) 3,43 ( 0.39, 5.76)
BAX 1,86 (0.00001, 5.88) 1,58 ( 0.00001, 2.76)
BCL2 3,31 (0.00001, 10.87) 1,83 ( 0.00001, 4.66)
BCR 2,83 (0.00001, 7.97) 2,50 ( 0.00001, 4.57)
IC: Intervalo de Confiança
A Tabela V demonstra o padrão de expressão gênica de pacientes com LLA de
acordo com a idade ao diagnóstico, comparado ao grupo controle. Em ambas as faixas
etárias analisadas o gene TAL1 apresentou expressão significativamente diminuída
quando comparado ao grupo controle (p= 0,002). Os genes RUNX1, ABL1 e BCR
também estão superexpressos em ambos os grupos avaliados. Não sendo observado,
portanto, grandes variações na expressão destes genes nas faixas etárias avaliadas.
Genes < 50.000/mm3
≥ 50.000/mm3
Fold Change 95% IC Fold Change 95% IC
ETV6 1,48 (0.00001, 5.23) 0,93 (0.00001, 1.81)
PTEN 2,24 (0.00001, 7.51) 0,62 (0.00001, 1.34)
RUNX1 4,64 ( 0.00001, 17.20) 3,50 (0.00001, 6.91)
TAL1 0,09 ( 0.00001, 0.34) 0,14 (0.00001, 0.28)
ABL1 4,49 (0.00001, 14.70) 2,70 (0.31, 4.80)
BAX 2,70 (0.00001, 8.85) 1,20 (0.00001, 2.37)
BCL2 4,90 (0.00001, 16.51) 1,45 (0.00001, 3.10)
BCR 4,05 (0.00001, 11.01) 1,92 (0.00001, 4.08)
IC: Intervalo de Confiança
A média da contagem de leucócitos dos pacientes com LLA antes do tratamento
foi de 77.781/mm3 e após o tratamento foi de 5.125/mm
3. Ao analisar a relação da
contagem de leucócitos entre pacientes e grupo controle para cada gene descrito na
Tabela VI e Figura 4, foi possível observar uma expressão bastante elevada dos genes
RUNX1, ABL1, BCL2 e BCR no grupo onde a contagem de leucócitos é inferior a
50.000/mm3, sendo que a expressão do BCL2 neste grupo de genes altamente expressos
é o que se encontra com os maiores valores de fold-change (4,90), indicando o gene
mais expresso neste grupo. Para o grupo com leucometria ≥ 50.000/mm3, foi observado
Tabela VI. Padrão de expressão gênica em crianças com LLA segundo leucometria ao
diagnóstico.
45
uma baixa expressão do gene PTEN e TAL1, e um discreto aumento na expressão dos
genes RUNX1 e ABL1. A expressão do gene PTEN neste grupo estava bastante reduzida
quando comparado com a expressão no grupo com leucometria abaixo de 50.000/mm3.
O padrão de expressão gênico observado para as leucemias de células B foi
bastante diverso com relação ao subtipo T. No imunofenótipo B houve aumento da
expressão de todos os genes, com exceção do TAL1, sendo que os genes PTEN e ETV6
apresentavam-se pouco aumentados em relação aos outros genes. O imunofenótipo T
apresentou redução na expressão do gene TAL1 e PTEN e discreto aumento na
expressão dos genes RUNX1 e ABL1. Pacientes que apresentaram positividade para o
marcador CD10 também apresentaram diminuição na expressão do gene TAL1, e
aumento na expressão dos genes RUNX1, ABL1, BCL2 e BCR como pode ser observado
na Tabela VII e na Figura 5.
Genes LLA-B LLA-T CD10+
Fold
Change 95% IC
Fold
Change 95% IC
Fold
Change 95% IC
ETV6 1,60 (0.00001, 4.20) 0,8 (0.00001, 1.70) 1.11 (0.00001, 2.97)
Log 10 (Grupo Controle2^ - DeltaCt)
Lo
g 1
0 (
Leu
com
etri
a: <
50
.000
/ m
m32
^ -
Del
taC
t)
Leucometria: < 50.000/ mm3 vs. Grupo Controle
BCR
RUNX1
TAL1
ABL1
BCL2
Figura 4. Comparação entre a expressão dos genes de acordo com a leucometria ao diagnóstico.
Tabela VII. Padrão de expressão gênica nos imunofenótipos B e T e marcador CD10+ na LLA
ao diagnóstico.
46
PTEN 1,93 (0.00001, 4.87) 0,46 (0.00001, 1.34) 1.62 (0.00001, 4.11)
RUNX1 5,30 (0.00001, 14.59) 4,20 (0.39, 7.43) 3.31 (0.00001, 9.21)
TAL1 0,07 (0.00001, 0.21) 0,21 (0.00001, 0.47) 0,09 (0.00001, 0.27)
ABL1 4,82 (0.00001, 11.91) 2,37 (0.99, 3.55) 3,50 (0.00001, 8.82)
BAX 2,69 (0.00001, 6.66) 1,26 (0.49, 2.07) 1,66 (0.00001, 4.33)
BCL2 4,82 (0.00001, 12.29) 1,28 (0.33, 2.41) 2,53 (0.00001, 6.91)
BCR 3,85 (0.00001, 8.49) 2,17 (0.69, 3.64) 2,38 (0.00001, 5.57)
IC: Intervalo de Confiança
A Tabela VIII representa a distribuição dos níveis de expressão gênica entre os
grupos de baixo e alto risco para recaída. No grupo de baixo risco foi observado uma
super expressão dos sete genes avaliados, sendo que apenas o gene TAL1 apresentou
uma redução significativa em sua expressão, semelhante ao padrão de expressão
identificado no grupo com imunofenótipo B. No grupo de alto risco, destacou-se um
perfil de baixa expressão dos genes ETV6, PTEN e BAX.
Genes Baixo Risco Alto Risco
Fold Change 95% IC Fold Change 95% IC
Figura 5. Distribuição dos níveis de expressão em pacientes com LLA-B, LLA-T e CD10+.
Tabela VIII. Padrão de expressão gênica nos grupos de baixo e alto risco para recaída
47
ETV6 2.30 (0.00001, 8.82) 0,55 (0.00001, 1.26)
PTEN 3.18 (0.00001, 9.96) 0,47 (0.00001, 1.05)
RUNX1 9.10 (0.00001, 28.14) 2.07 (0.00001, 5.16)
TAL1 0.08 (0.00001, 2.53) 0,15 (0.00001, 0.29)
ABL1 6.23 (0.00001, 0.33) 2,09 (0.02, 4.09)
BAX 3.79 (0.00001, 19.19) 0,92 (0.00001, 1.88)
BCL2 6.50 (0.00001, 21.04) 1,16 (0.00001, 2.51)
BCR 6.12 (0.00001, 15.43) 1,39 (0.00001, 2.97)
IC: Intervalo de Confiança
De uma forma esquemática, a Figura 6 representa a expressão de cada gene em
todos os grupos avaliados acima, sendo Grupo1 (pacientes ao diagnóstico), Grupo 2
(pós tratamento), Grupo 3 (Idade ≥1 ano e < 9 anos), Grupo 4 (Idade <1 ano e ≥ 9 anos),
Grupo 5 (< 50.000/mm3), Grupo 6 (≥ 50.000/mm
3), Grupo 7 (LLA-B), Grupo 8 (LLA-
T), Grupo 9 (CD10+), Grupo 10 (Baixo Risco) e Grupo 11 (Alto Risco).
A Figura 7 corresponde ao agrupamento dos genes e dos grupos avaliados neste
estudo. Foi possível observar a formação de grupos gênicos de acordo com seus níveis
de expressão. Os grupos gênicos ETV6 e PTEN e BCL2 e BAX formam os grupos que
apresentaram maior proximidade de expressão. O perfil de expressão do BCR foi similar
ao grupo BAX e BCL2. O gene RUNX1 apresentou um maior distanciamento no padrão
de expressão em relação aos grupos acima mencionados. O gene TAL1 foi o que
apresentou ao extremo quanto ao perfil de expressão, ele foi o único que não se agrupa,
LEGENDA
• Grupo 6 (≥ 50.000/mm3)
Figura 6. Representação gráfica da expressão dos genes em cada grupo de
pacientes com LLA avaliados.
Grupo
Controle
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8 Grupo 9 Grupo 10 Grupo 11
48
pois apresentou um maior distanciamento do padrão de expressão quando comparado a
todos os outros genes.
Figura 7. Dendograma indicando os graus de amplicação dos genes em cada grupo
estudado nos pacientes com LLA infantil em Goiás.
Com relação aos grupos de estudo, o grupo 2 que é o pós-tratamento (D+28) foi o
que apresentou um padrão de expressão mais próximo do grupo controle. Este achado
indicou a responsividade dos pacientes ao tratamento. Os grupos 9, 5 e 3 (CD10+,
<50.000/mm3 e idade ≥1 ano e < 9 anos) apresentaram maior proximidade quanto ao
nível de expressão de todos os genes avaliados, e estes são os grupos considerados de
bom prognóstico. Este agrupamento também foi observado nos grupos 7 e 10 (LLA-B e
baixo risco), que também são condições que levam a um prognóstico favorável, com
menor risco de recidiva. Ambos estabelecem uma ligação de proximidade com o grupo
controle e grupo 2. Com relação aos grupos 11, 1 e 6 (alto risco, diagnóstico e ≥
50.000/mm3) o perfil de expressão destes é bem próximo, por isso foram agrupados,
assim como, os grupos 8 e 4 (LLA-T e Idade <1 ano e ≥ 9 anos). Todos estes grupos são
considerados de prognóstico ruim por apresentarem maior risco de recidiva. O que nos
chama a atenção é uma maior expressão do gene TAL1 apenas no grupo 2,
aproximando-se da normoexpressão observada no grupo controle. Para o grupo 10 que é
o grupo classificado como de baixo risco de recaída, o perfil de expressão de todos os
genes apresentaram-se hiperexpressos com exceção do gene TAL1.
6. Discussão
Gru
po 2
C
on
trole
Gru
po 5
G
ru
po 3
Gru
po 1
0
Gru
po1
1
2 Gru
po 1
G
ru
po 6
G
ru
po 8
G
ru
po 4
Gru
po 9
Gru
po 7
LEGENDA • Grupo1 (ao diagnóstico)
• Grupo 2 (pós tratamento)
• Grupo 3 (Idade ≥1 ano e < 9 anos)
• Grupo 4 (Idade <1 ano e ≥ 9 anos)
• Grupo 5 (< 50.000/mm3)
49
Segundo o Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia
(RCBPGO), durante o período de 1999 a 2003, foram registrados, em Goiânia, 84 casos
de crianças menores de 18 anos com LLA. Após levantamento realizado pelo RCBPGO
para os anos de 2008 e 2009, foi notificado um total de 27 casos de LLA infantil
representativos da cidade de Goiânia e Aparecida de Goiânia. O presente trabalho
compreendeu 16 pacientes que foram incluídos no estudo no período de maio de 2012 a
janeiro de 2013, dois destes pacientes residiam na cidade de Anápolis. Portanto, o grupo
amostral do presente estudo aproximou-se dos dados catalogados pelo RCBPGO, cuja
estimativa do número de casos de LLA infantil para 2012 em Goiânia foi de 21 casos
(RCBPGO, 2013).
A LLA é o tipo mais comum de leucemia em crianças correspondendo a uma
complexa desordem proliferativa do sistema linfo-hematopoético. Desde 1980, com a
introdução da fase de intensificação do tratamento, utilizando múltiplas drogas, a LLA
deixou de ser considerada uma doença fatal e seus portadores passaram a ter uma
sobrevida por um período de cinco anos em aproximadamente 80% dos casos.
O Children Oncology Group recentemente publicou um estudo com 21.626
pacientes incluídos para triagem de LLA no período de 1990 a 2005 e demonstrou que a
sobrevida de 5 anos aumentou de 83,7% (1990-2004) para 90% (2000-2005). Dados
recentes, publicados no ano de 2012, referentes a um estudo que avaliou 6.662 pacientes
no período de 2006 e 2009, demonstraram uma sobrevida significativamente melhor de
92,3% dos pacientes (Hunger et al., 2012). Todo o avanço observado foi o resultado de
intensas pesquisas a respeito das assinaturas gênicas envolvidas no desenvolvimento da
LLA juntamente com os diversos fatores prognósticos e sua relação com a evolução da
doença, o que tem permitido a estratificação dos pacientes em grupos de risco e assim
possibilitando um maior direcionamento do tratamento quimioterápico.
Com o avanço do estudo da LLA, os pesquisadores têm apontado para a
presença de alterações genéticas que poderiam ser responsáveis pelo processo de
iniciação ou progressão celular. Atualmente, as alterações citogenéticas e moleculares
são parâmetros de grande relevância clínica, de importância diagnóstica e ainda
permitem informações prognósticas independentes na LLA. Por isso é recomendável
investigar todas as possíveis alterações presentes nas células leucêmicas para se
caracterizar os fatores biológicos envolvidos na transformação e progressão maligna, e
50
para se definir as terapias alvo-específicas, que beneficiarão ainda mais os pacientes
com neoplasias.
Nossos resultados estão em desacordo com o sugerido pelo INCA (2005), que
mencionou frequência de LLA elevada para os indivíduos do sexo masculino quando
comparada com o sexo feminino. Em nosso estudo, a proporção de indivíduos foi maior
para o sexo feminino. No presente estudo 37,5% são pacientes do sexo masculino,
destes 67% corresponderam ao imunofenótipo T, havendo uma associação significativa
entre sexo e imunofenótipo (p = 0,016). Segundo Pui e colaboradores (1999) o
imunofenótipo T estaria presente com maior frequência em indivíduos do sexo
masculino. Hjalgrim e colaboradores (2003) descreveram um estudo que reuniu uma
população de 5 milhões de crianças com LLA e idade de 0 a 14 anos em países
Nórdicos (Suécia, Dinamarca, Finlândia e Noruega). Naquele estudo os autores
relataram que a razão de incidência entre sexo masculino e feminino foi de 2,19 para a
LLA-T e foi constante para todos os grupos etários. A prevalência de LLA em
indivíduos do sexo masculino foi demonstrada por Pui e colaboradores (2004a), como
apresentando uma pior resposta às terapias, comparativamente ao sexo oposto. Por um
longo período, a variável sexo foi considerada um fator prognóstico significativo. De
uma maneira geral, a diferença de resposta entre os sexos poderia estar relacionada com
as diferenças imunofenotípicas e a ploidia nos pacientes com LLA (Pui et al.,1999).
Diversos estudos apontam maior incidência para LLA na faixa etária entre 2 a 5
anos de idade, o que divergiu com os dados do presente estudo, cuja frequência para
esta faixa etária foi de 37,5% (Farias et al., 2004; INCA, 2007; Belson et al., 2007;
Puiet al., 2008). De acordo com o estudo realizado por de Oliveira e colaboradores
(2009), com base no banco de dados dos Registros de Câncer de Base Populacional de
Goiânia e São Paulo, uma taxa elevada para LLA foi observada entre indivíduos do
sexo masculino na faixa etária de 0 a 4 anos de idade, respectivamente 7,8 e 6,2 para
100.000 meninos, respectivamente.
No presente estudo a LLA-B representou 68,7% dos casos estudados. Segundo
Brumpt e colaboradores (2000) a LLA-B foi observada em aproximadamente 85% das
LLA infantil. Conforme a descrição de Bacal e colaboradores (2003) o imunofenótipo B
mais frequente é a LLA B-II, confirmando os achados do presente estudo, que
encontrou uma frequência de 72,8% para este subtipo. A expressão do marcador CD10
foi positiva em 75% dos casos, sendo que 17% representa a positividade na LLA-T, o
51
que corrobora com o estudo de Supriyadi e colaboradores (2012) e com um estudo
Brasileiro realizado por Rego e colaboradores (1996) que associou a expressão de CD10
em 16% dos casos de LLA-T avaliados.
O marcador CD10 regula a linfopoese B no sistema hematopoético. A maioria
das LLA de linhagem B expressa o CD10 e a porcentagem de células que expressam o
CD10 diminui nas células B mais maduras. Entretanto, a expressão de CD10 tem sido
relatada em outros tipos de leucemia. A presença de CD10 está associada a resposta
clínica favorável em pacientes com LLA. Ademais, a presença de baixa contagem de
leucócitos, idade mais jovens, e subtipo FAB L1 também foram associados à presença
do marcador CD10. A expressão de CD10 varia entre os subtipos de LLA, 68% a 96%
dos casos são positivos para CD10 na LLA-B e 18 % a 45% na LLA-T (Greaves et al.,
1992; Campana et al., 2000). Foi observado uma correlação positiva entre a presença do
marcador CD10 e a expressão do RUNX1 (p = 0,04). Esta relação pode estar associada
ao fato de que a positividade para o marcador CD10 e alterações no gene RUNX1 são
condições fortemente presentes na LLA com imunofenótipo B, portanto na medida em
que há positividade para CD10 poderá existir também detecção para a presença do gene.
No presente estudo foi observada uma correlação positiva entre imunofenótipo e
marcador CD10+ (p = 0,03). Pui e colaboradores (1993) e Consolini e colaboradores
(1998) encontraram que a expressão de CD10 nos pacientes com LLA-B e LLA-T, não
teve significância como fator prognóstico independente. Enquanto os resultados de
Supriyadi e colaboradores (2012) demonstraram que na presença de CD10 os pacientes
com LLA têm uma sobrevida significante melhor comparado ao CD10 negativo. A
ausência de CD10 tem valor prognóstico significante negativo especialmente na LLA-T,
enquanto na LLA-B, é apenas marginalmente significante.
Do mesmo modo, foi reconhecida uma correlação positiva entre CD10+ e grupo
de risco (p = 0.043) para os pacientes do presente trabalho, ou seja, a medida em que o
marcador CD10 modifica sua expressão é acompanhado pela mudança do grupo de
risco. Em um estudo realizado por Supriyadi e colaboradores (2012), foi observado que
o antígeno CD10 foi expresso em 148 (70%) dos 211 pacientes avaliados. A frequência
relativa para a positividade de CD10 foi significativamente maior (p<0,001) em
pacientes enquadrados no grupo de baixo risco (83%) quando comparados ao grupo de
alto risco (60%). Pacientes com CD10+ tiveram uma sobrevida global em 4 anos de
52
62% ± 6%, contra CD10- 40% ± 7%. A expressão de CD10 foi associada com a
classificação de risco, p=0,037, onde a maioria dos pacientes CD10- foram classificados
no grupo de alto risco.
A presença do imunofenótipo T é uma variável prognóstica desfavorável assim
como a ausência do marcador CD10. Portanto, a maior frequência do CD10- no grupo
de alto risco estará também presente na LLA-T. Os pacientes com LLA-T, mesmo que
sejam CD10+, apresentam um prognóstico relativamente melhor. Assim, deve-se ter
uma atenção especial com os pacientes que apresentam o imunofenótipo T e não
expressam o CD10.
Alguns estudos relatam que as leucemias que tem associação com o gene
RUNX1, estão relacionados com a alteração da função do mesmo por fusão com outros
genes nas translocações ou mutações no gene que é o maior fator causador de leucemias
em humanos. Novas evidências apontam para a função do RUNX1 como um oncogene,
deixando questões a respeito do papel do RUNX1, prevenir ou acelerar a carcinogênese.
As lesões genéticas específicas neste gene que irão definir o seu real papel no processo
de carcinogênese, ou seja, se ele se comporta como um supressor de tumor ou um
oncogene (Taniuchi et al., 2012).
Segundo Stams e colaboradores (2005), a expressão do RUNX1 nas células
leucêmicas estava 2 vezes maior quando comparado ao grupo controle (P = 0,02) e não
foi observado correlação entre a expressão do RUNX1 e a sensibilidade a L-
asparaginase, predinisona e vincristina (p> 0,05). No presente estudo foi observado uma
hiperexpressão do gene RUNX1, antes do tratamento o gene encontrou-se com um
aumento da expressão em 5 vezes em relação ao grupo controle e após a quimioterapia
de indução foi observado uma redução na sua expressão, atingindo a normoexpressão.
Este padrão de expressão de RUNX1, no presente estudo, demonstra que as células
leucêmicas que apresentam uma elevada expressão deste gene podem apresentar maior
sensibilidade aos quimioterápicos utilizados pelo protocolo GBTL LLA-99 durante a
fase de indução.
Estudos prévios também têm observado a hiperexpressão do gene RUNX1 em
crianças com LLA. Utilizando o método de RT-PCR, FISH ou Microarray foi
observado na maioria dos casos um aumento da expressão de RUNX1 associado com
anormalidades no cromossomo 21, trissomia do 21 não constitucional, cópias em
53
tandem do gene no der(21), dup (21) e hiperdiploidia (Coniat et al.,2001; Mikhail et al.,
2002; Harewood et al., 2003; Attarbaschi et al., 2008). O papel oncogênico do RUNX1
já foi observado em um estudo de análise de expressão gênica por microarray em
carcinoma de endométrio (Blyth et al.,2005).
Segundo Attarbaschi e colaboradores (2008) a presença da amplificação
intracromossômica do cromossomo 21, com aumento da expressão do RUNX1,
diminuiu significativamente a sobrevida dos pacientes quando foram comparados com
outros pacientes sem esta alteração, ambos tratados pelo protocolo Austrian and
German ALL–Berlin-Frankfurt-Munster (ALL-BFM). Nos casos em que a resposta ao
tratamento é demorada, estes pacientes foram encaminhados para o transplante de
medula óssea logo que atingirem a primeira remissão completa.
A partir de modelos em murinos tem se feito um questionamento se os canceres
humanos também manifestam uma superexpressão do gene RUNX de uma forma em
que estes podem ser considerados como oncogenes. Esta forte indicação está
relacionada com uma pequena parcela (3 a 5%) da LLA-B infantil com pior
prognóstico, no qual o RUNX1 é afetado pela amplificação de um grande segmento
(~10MB) do cromossomo 21q. A alta expressão de RUNX1 também tem sido
encontrada na ausência da amplificação gênica em uma proporção significante da LLA-
B, indicando que outros mecanismos eficazes de desregulação podem estar associados,
ou seja, a região promotora deste gene pode conter a alteração (Niini et al., 2000).
As observações do presente estudo reforçam a importância do cromossomo 21
no processo da leucemogênese na LLA. Parece provável que a amplificação de RUNX1
e possivelmente a modificação de outros genes próximo a ele, contribua diretamente na
etiologia da LLA. O fato do perfil de expressão deste gene, em nosso estudo, ter
modificado de hiperexpresso ao diagnóstico para normoexpresso após o tratamento,
transmiti a ideia de que apesar das células leucêmicas de pacientes com LLA ao
diagnóstico apresentarem em sua maioria níveis de expressão aumentada de RUNX1,
elas também respondem melhor ao tratamento quimioterápico, ou seja, menos serão o
número de recidivas nestes pacientes, visto que Lanciotti e colaboradores (2011)
identificaram em pacientes com LLA-B após recidiva, diminuição na expressão de
genes envolvidos na regulação transcricional e apoptose, sendo o RUNX1 um deles.
Portanto, a expressão reduzida de RUNX1 esteve relacionada com maior risco de
54
recidiva em pacientes com LLA. Portanto novos estudos devem ser conduzidos com
objetivo de correlacionar os níveis de expressão deste gene com resposta ao tratamento.
O padrão de expressão do gene TAL1, no presente estudo, apresentou uma
considerável e significativa diminuição. A baixa expressão deste gene esteve presente
em todos os grupos avaliados, com exceção da análise pós tratamento que demonstrou
um aumento da sua expressão.
A presença de transcritos oncogênicos como LMO2, LYL1, TLX1, TLX3, TAL1 e
NKX2-1 são considerados como elementos de assinatura gênica para a LLA-T. Análise
por RT-PCR demonstrou níveis aumentados do TAL1 em 29 (49%) dos 59 casos de
LLA-T avaliados (Sanda et al.,2012; Ferrando et al., 2002). Para o oncogene TAL1, em
estudo realizado por Larmonie e colaboradores (2012), não foi encontrado a expressão
do mesmo em timócitos humano normais, ao contrário do que já foi observado em
timócitos de murinos.
TAL1 nas leucemias de células T, normalmente é observado a superexpressão do
gene, podendo ser resultado de rearranjos específicos que promovem a leucemogênese,
pela indução da sua expressão nas células de linhagem T. Transcritos de TAL1 estão
presentes nas células malignas de diversos pacientes com LLA-T, sendo que muitas
dessas alterações não são as mais frequentemente observadas, sugerindo que a ativação
maligna do TAL1 pode ocorrer na ausência de rearranjos estruturais grosseiros e que sua
ativação representa a maior via para o desenvolvimento da LLA-T. Já foi demonstrado,
que a alteração na expressão deste gene em pacientes com LLA-B é bastante rara (Bash
et al., 1995), como a grande maioria dos nossos pacientes apresentam o imunofenótipo
B, faz sentido a baixa expressão de TAL1 nestes pacientes. Ainda assim, os pacientes
com imunofenótipo T apresentaram expressão diminuída deste gene, isso se torna
importante, pois como TAL1 é um oncogene, podemos concluir que neste grupo de
pacientes avaliados a iniciação e a progressão da LLA não contou com a participação
deste gene, visto que ele foi encontrado com seu padrão de expressão diminuído.
A expressão ectópica de TAL1 em timócitos está associado com a parada de
maturação dos timócitos corticais. Normalmente é uma condição associada a
prognóstico desfavorável, pois os pacientes apresentam dificuldades de atingir a
remissão completa, provavelmente devido a uma maior regulação das moléculas anti
apoptóticas. Foi demonstrado nas células que tem expressão aumentada de TAL1, estes
regulam positivamente o BCL2 e outras moléculas antiapoptóticas, normalmente
55
induzida pela sinalização através do receptor de células T (TCR) nos timócitos corticais,
sugerindo que possa haver diferentes mecanismos de resistência ao tratamento na
presença da expressão aumentada de TAL1 (Ferrando et al., 2002).
Uma correlação positiva foi observada entre a expressão de BAX e BCL2 (r =
0,94 e p < 0,0001). A expressão de BCL2 encontrou-se aumentada no imunofenótipo B,
contagem de leucócitos < 50.000/mm3, idade ≥1 ano e < 9 anos, CD10+ e
hiperexpressão no grupo de baixo risco. Foi observado também, que após o tratamento o
perfil de BCL2 diminuiu em 2,5 vezes em relação ao grupo antes do tratamento, mas
ainda permaneceu com um discreto aumento. Apesar desta constatação, os testes de
correlação para estas varáveis não foram significativos. O paciente que apresentou o
cromossomo Ph+ demonstrou o nível de expressão discretamente aumentado (fold
change = 1,55).
A expressão dos genes de apoptose é diferente dependendo da origem celular e
das características citogenéticas. Linfoblastos do tipo B CD10 positivos produzem altos
níveis de BCL2 e não há correlação com a expressão do BAX ou com a razão
BCL2/BAX e com outras características prognósticas como idade, sexo, cariótipo ou
leucometria no momento do diagnóstico. Finalmente, a baixa expressão da proteína
BCL2 entre os pacientes com LLA é observada em pacientes com idade maior do que
45 anos e pacientes com cariótipo alterado, como presença do cromossomo Philadelphia
(Coustan-Smith et al., 1996; Feng et al., 2010; Craig et al., 2012). Em um estudo
desenvolvido por Uckun e colaboradores (1997), nenhuma característica associada ao
grupo de alto risco apresentou correlação na presença da expressão aumentada de BCL2.
Já as células leucêmicas de pacientes no grupo de baixo risco apresentaram níveis de
BCL2 significativamente aumentados (p = 0,05), assim como foi observada no presente
estudo a hiperexpressão deste gene no grupo de baixo risco.
No presente estudo, os níveis de BAX ao diagnóstico estavam aumentados e na
fase de indução houve diminuição em 1,4 vezes em sua expressão. Em relação aos que
recidivaram, um deles possuía baixa expressão de BAX (fold change = 0,8) e um
discreto aumento na expressão de BCL2 (fold change = 1,5) e o outro paciente,
apresentou uma discreta expressão do BAX (fold change = 1,3) e uma expressão
aumentada do BCL2 (fold change = 2,4), ambos foram a óbito.
56
Altos níveis da proteína BAX tem sido relacionado com um maior risco de
recidiva em crianças com a LLA e prognóstico favorável na LMA. Entretanto, ambos os
níveis de expressão de BAX e a relação BAX/BCL2 são significativamente mais baixos
em pacientes em recidiva comparados com pacientes ao diagnóstico. Além disso,
pacientes ao diagnóstico exibem espontaneamente in vivo o processo de caspase,
enquanto este é completamente ausente na recidiva. Demonstrando a contradição até o
momento da relação dos níveis de expressão da proteína BAX e risco aumentado de
recidiva (Del Principe et al., 2003; Prokop et al., 2000; Hogarth & Hall, 1999).
Numerosos estudos tem relacionado à falha na apoptose e a desregulação do
gene BCL2 com a patogênese e insucesso no tratamento da LLA. Um recente estudo
indicou uma alta frequência na super expressão do RNAm de BCL2 e uma frequência
relativamente baixa na super expressão do RNAm de BAX em LLA e LMA, que
também foi observada no presente estudo, sugerindo que a transcrição alterada destes
genes pode estar envolvida no processo da leucemogênese. Além disso, a expressão de
BCL2 foi diversa nos diferentes tipos de LLA de acordo com estágio de maturação da
célula B. Embora haja uma expressão aumentada de BCL2 em pacientes com LLA,
estudos clínicos não obtiveram correlação com a sobrevida destes pacientes (Campana
et al., 1993; Menendez et al., 2004; Aref et al., 2004; Wojcik et al., 2005). Embora Aref
e colaboradores (2004) relataram que a expressão de BCL2 ao diagnóstico está
correlacionada com responsividade à quimioterapia de indução.
A expressão aumentada de BAX foi associada com resposta desfavorável em
pacientes com LLA. Este achado paradoxo é difícil de ser explicado. Entretanto,
verificou-se que embora homodímeros de BAX promovam a apoptose, ainda é
importante a formação de heterodímeros de BAX e BCL2 para prevenir a morte celular.
Portanto, o equilíbrio na formação de heterodímeros BCL2-BAX (supressores da morte
celular) e homodímeros BAX-BAX (ativadores da morte celular) parece ser essencial na
regulação molecular da apoptose (EL-Mahallawy et al., 2001).
Uma correlação positiva foi observada entre a expressão de ETV6 e PTEN (r =
0,71 e p < 0,003). Os genes ETV6 e PTEN mantiveram-se bem próximos da
normalidade quando avaliados de forma global antes e após a quimioterapia de indução.
Mesmo após o tratamento não houve modificação da expressão para estes genes.
Entretanto, ao analisarmos a expressão destes genes nos diferentes grupos, podemos
observar que o PTEN apresentou-se hiperexpresso, nos pacientes que apresentaram
57
leucometria < 50.000/mm3 (fold change = 2,24) e no grupo de baixo risco (fold change=
3,18), bem como o ETV6 (fold change = 2,30). Em contrapartida, o gene ETV6 e PTEN,
no imunofenótipo T apresentaram-se hipo expressos (fold change = 0,8) e (fold change
= 0,46), respectivamente, assim como no grupo de alto risco (fold change = 0,55) e (fold
change = 0,47), respectivamente.
ETV6 e PTEN são supressores de tumor, portanto a perda ou inativação destes
aumenta a participação destes genes no processo de leucemogênese. De acordo com a
classificação de risco, é possível inferir a relação destes genes com características
associadas a melhor ou pior prognóstico, pois a diminuição da expressão dos mesmos
está presente nos pacientes de alto risco para recidiva e na LLA-T, que também é uma
condição de prognóstico ruim.
Foi investigado a expressão do PTEN nos blastos de 8 pacientes com LLA-B
pediátrica, e foi observado uma baixa expressão do PTEN nestes pacientes. Poucos
estudos tem sido realizados com a expressão do gene e LLA-B, um estudo recente
demonstrou que a região promotora do gene estava metilada em 20% dos pacientes com
LLA, sugerindo que a ausência ou baixa expressão do PTEN pode estar relacionado
com a metilação. Nos casos de LLA-T foi observado expressão ligeiramente aumentada
do PTEN (Yang et al., 2007). Gauffin (2009) analisou por microarray e encontrou uma
alta expressão do PTEN na LLA pediátrica ao diagnóstico comparada com controle.
Curiosamente, as crianças acompanhadas obtiveram uma sobrevida livre de eventos de
5 anos, entretanto, em amostras de recidivas a expressão do PTEN estava diminuída,
sendo portanto um possível candidato para marcador de prognóstico.
Jotta e colaboradores (2010) relataram o impacto prognóstico de mutações no
exon 7 do gene PTEN em pacientes com LLA-T. A análise de sobrevida indicou que
pacientes com alguma alteração do gene tiveram uma tendência inferior de sobrevida
global (OS 48.6±14.8 versus 69.4±7.4%, p = 0.07) e a sobrevida livre de evento (SLE
48.6±14.8 versus 65.2±7.7%, p = 0.15) quando comparado com pacientes sem a lesão
genética. Foi identificado apenas associação entre leucometria > 100.000/ mm3 ao
diagnóstico (p = 0,05).
Mutações de perda de função do gene PTEN ou mutações que ativem a
sinalização da via PI3-kinase ocorrem frequentemente na LLA-T. Enquanto na LLA-B
raros são o envolvimento de deleção do PTEN. Sua inativação está presente na LMA
por mutações, metilação na região promotora ou repressão transcricional (Magee et al.,
58
2012). Além do mais, deleções do PTEN parecem estar correlacionadas com pobre
resposta ao tratamento quimioterápico e à resistência para a inibição farmacológica do
NOTCHI. Entender os mecanismos moleculares do PTEN na patogênese da LLA e
resistência a algumas drogas é um passo importante para melhorar a resposta terapêutica
destes pacientes com LLA (Guo et al., 2011).
Um conjunto significativo de pacientes com o transcrito de fusão TEL-AML1
perdem o alelo TEL não translocado, sugerindo que a perda do alelo normal contribui
para o processo de transformação neoplásica. Adicionalmente, a deleção de um alelo
normal, tem sido frequentemente relatada na LLA infantil com ou sem a fusão TEL-
AML1. A perda de heterozigosidade do alelo TEL é também observada em outros tipos
de leucemia e em tumores sólidos, o que sugere a este gene um papel de supressor de
tumor. Mutações pontuais foram relatadas no domínio ets do alelo não rearranjado de
ETV6 em LLA-T que apresentava a fusão ETV6/ABL2 (Poirel et al.,1998; Stegmaier et
al.,1995; Bohlander, 2005). Observou-se, após análise de array, em 5 dos 11 pacientes
(45%) apresentaram deleção envolvendo o gene ETV6 que variou de 0,2 Mb a 19,4 Mb
(Zakaria et al., 2012).
Chae e colaboradores (2010) relataram um caso de LLA em adulto que
apresentou amplificação do ETV6, que já foi relatada em um caso de Síndrome
Mielodisplásica. ETV6 desempenha um papel central como um gene supressor de tumor
na leucemogênese de diferentes tipos de leucemia, não só através da fusão de cerca de
40 genes, mas também através de deleções, mutações pontuais e possíveis alterações em
seu promotor.
A expressão aumentada de ABL foi observada em praticamente todos os grupos
clínicos avaliados, apesar de não haver correlação significativa entre os mesmos. A alta
atividade de quinase citoplasmática tem sido observada em carcinomas de mama e
câncer de pulmão de células não pequenas. Um aumento nos níveis da proteína tem sido
identificado em câncer de mama e câncer de tireóide anaplásico, além do mais a super
expressão de c-abl, entretanto, não é suficiente, a atividade de quinase requer a
fosforilação da proteína. Por exemplo, a fosforilação de c-Abl induzida por Src,
aumenta a atividade de quinase citoplasmática (Sirvent et al., 2008;Panjarian et al.,
2013).
Abl quinases estão envolvidas em um grande número de anormalidades
cromossômicas em diferentes tipos de câncer que levam a expressão de proteínas de
59
fusão, mas a presença de mutações pontuais nos genes ABL1 e ABL2 ainda não foram
identificadas em canceres humanos ou outras doenças (Hantschel, 2012).
A remoção de ABL induz a defeitos pleiotrópicos, que causam mortalidade pós
parto, assim como linfopenia e osteoporose em camundongos Knock-out, sendo,
portanto importante na homeostase celular. Segundo Kim e colaboradores (2010), uma
deleção completa do gene ABL1 na ausência do rearranjo BCR-ABL, é um fenômeno
raro, com apenas 4 casos descritos previamente. Essa deleção é rara mais é uma
anormalidade genética recorrente em pacientes com LLA-B. Novos estudos são
necessários para avaliar a extensão desta alteração sub microscópica no cromossomo 9,
com deleção de ABL1, assim como o prognóstico e a resposta ao tratamento destes
pacientes com este tipo de alteração.
O gene BCR tem um papel crucial na patogênese de duas leucemias (LMC e
LLA) quando está associado com o gene ABL resultando no cromossomo Philadelphia.
No presente estudo, a expressão deste gene mostrou-se aumentada após o tratamento, no
grupo de baixo risco e leucometria < 50.000/mm3. O aumento da expressão de BCR tem
sido relacionado com a inibição da oncoproteína BCR-ABL, a proteína endógena BCR
forma um complexo com o c-ABL em células hematopoéticas. A expressão de BCR em
células Rat-1 transformadas por proteína Mr 10,000 Abl SH2 reduziu a atividade de
tirosina quinase do c-ABL próximo dos níveis normais e reverteu o efeito oncogênico
nas células ABL1 SH2 tratadas. Foi concluído neste estudo que o BCR é o maior
inibidor da tirosina quinase do c-ABL citoplasmático e que procedimentos que
sequestram BCR, liberam a proteína c-ABL do complexo BCR/c-ABL, que leva a
ativação oncogênica do c-ABL (Ling et al., 2003).
A cura para leucemias em crianças tem aumentado consideravelmente através do
uso de agentes citotóxicos, validados em grandes triagens clínicas randomizadas.
Fatores clínicos, características genéticas da leucemia e resposta inicial ao tratamento
são atualmente utilizados na tentativa de oferecer um tratamento personalizado para
todos os pacientes envolvidos nesta patologia. Avanços na área da genômica tem
conduzido à descoberta de lesões somáticas recorrentes nas células leucêmicas que
oferecem não apenas informações prognósticas adicionais, mas também oportunidades
para a aplicação de tratamento alvo. Finalmente, o reconhecimento dos fatores chaves
que estão associados com risco para a transformação leucêmica e resposta a terapia,
provavelmente conduzirá a estratégias de tratamento mais sofisticadas no futuro.
60
O conhecimento da LLA e suas características genéticas tem substancialmente
aumentado e é o resultado do melhor entendimento a respeito dos mecanismos
moleculares da leucemogênese. Grupos cooperativos devem encorajar os grandes
centros a participar de linhas de pesquisa, que ampliem o conhecimento molecular para
este tipo de leucemia, buscando associar conhecimentos a partir de dados citogenéticos,
expressão gênica e SNP, e porque não formar bancos de células leucêmicas que
ajudarão em estudos a posteriori. Engajar grandes e pequenos centros que acompanham
estes pacientes pode ser difícil, mas apenas a união destes serviços permitirá que
estudos difundam a relevância prognóstica de todas as variáveis e determinem uma
assinatura genética para esta leucemia, que será traduzido em novas terapias alvo.
7. Conclusão
Após a realização da técnica de PCR array em pacientes antes e depois do
tratamento, foi identificado diferenças no padrão de expressão gênica entre estes dois
grupos de estudo. Os níveis de expressão de dois genes nos chamaram a atenção, a alta
expressão do gene RUNX1 e baixa expressão do gene TAL1. A associação entre algumas
variáveis foi estabelecida de forma significativa (p< 0,05) e estes dados corroboraram
com o que está descrito na literatura, sendo elas: correlação negativa entre as variáveis
sexo e o imunofenótipo (p = 0,016), correlação positiva entre imunofenótipo e idade (p
= 0,04), imunofenótipo e marcador CD10+ (p = 0,03), imunofenótipo e grupo de risco
(p = 0,015) e marcador CD10+ e grupo de risco (p = 0,043).
A fase de indução do tratamento da LLA é considerada umas das principais
etapas para definição de prognóstico e evolução dos pacientes nas fases posteriores do
tratamento. A busca sistemática das mutações genéticas e a observação do perfil de
expressão gênica nesta fase do tratamento, além dos aspectos clínico e biológicos, pode
ajudar na decisão médica de intensificar ou não a quimioterapia. Demonstramos no
presente estudo uma diferença significativa no padrão de expressão gênico da LLA ao
diagnóstico e após a terapia de indução, sendo que na fase de indução o perfil
apresentou-se bastante próximo do padrão de expressão do grupo controle, indicando
uma boa resposta dos pacientes tratados com o protocolo GBTL1 LLA-99 na fase de
indução.
A partir do perfil de expressão de cada gene analisado, podemos perceber que
estes genes realmente tem um papel fundamental na iniciação e progressão da LLA,
portanto foi possível compreender o papel destes genes no prognóstico da LLA, e
61
consolidamos alguns conhecimentos que já estavam descritos previamente. Concluímos
nossa observação com relação ao perfil de expressão gênica nos pacientes com LLA
incluídos neste estudo, mas para definirmos um painel de marcadores moleculares é
necessário a avaliação de diversos outros genes que participam do processo da
leucemogênese na LLA com auxílio de outras metodologias.
Estudos adicionais que envolvam a análise de expressão gênica em pacientes
com suspeita de LLA são importantes para definir e identificar genes que possam ser
utilizados como potenciais marcadores preditivos na LLA. Este conhecimento permitirá
o diagnóstico precoce, especialmente para os casos em que os dados clínicos e
laboratoriais não são satisfatórios. Estes achados poderiam ser utilizados rotineiramente
na prática clínica permitindo a assistência nas diversas fases médicas de diagnóstico.
62
8. Apêndice
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