MỞ ĐẦU - blogtiengviet.netblogtiengviet.net/media/usersd/domboy909/307.pdf · của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,

Mạc Văn Trọng

[email protected] or [email protected]

1

MỞ ĐẦU

Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học,

trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein. Các nucleic acid đóng vai trò

quan trọng trong sự lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sau. Hơn nữa,

các thông tin này sẽ được biểu hiện trên cơ thể thông qua sự tạo thành các phân tử

protein. Trong các quá trình sao chép cũng như tổng hợp protein luôn xuất hiện

nhiều biến đổi, đây chính là nguồn gốc của sự tiến hóa và tính đa dạng của sinh giới.

Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết. Khi hiểu rõ

cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển

các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất

các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh…..

Có rất nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiên cứu

vật chất sống, trong đó điện di là một kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích,

xác định và tinh sạch các đoạn DNA bằng cách dựa vào sự dịch chuyển của chúng

trong môi trường điện trường.

Mạc Văn Trọng


2

NỘI DUNG

I. NGUYÊN TẮC CHUNG

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động

của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,

protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng.

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch

chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích

thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ

khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn

đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc

polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc

polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch

đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và

các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.

Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các

phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử

DNA hoặc RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb.

II. ĐIỆN DI AGAROSE GEL

Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành

phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%.

Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ

nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.

Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp

agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 oC và sau đó được làm

lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC. Bản chất quá trình đông lại của agarose

là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ. Các

Mạc Văn Trọng


3

chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích

thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá.

Hình 1. Cấu trúc hoá học của agarose và cấu trúc agarose gel

1. Nguyên tắc

Các phân t ử nucleic acid co khôi lương va điên tich khac nhau đươc tach ra

khi di chuyên tư cưc âm sang cưc dươn g cua hê điên di trong môt điên trương co

điên thê va cương đô thich hơp . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ

thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường... Điện di

agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và

tinh sạch các đoạn DNA

Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel

đươc nhuôm ơ nông đô thâp cua thuôc nhuôm huynh quang ethidium bromide (EtBr)

và co thê phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

2. Các yếu tố ảnh hưởng

2.1. Kich thươc cua phân tư

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ

dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các

tôc đô ty lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tư cua chung.

Mạc Văn Trọng


4

Hình 2. Môi quan hê giưa kich thươc DNA va độ linh đông điên di cua no

2.2. Nông đô agarose

Đoan DNA mang kich thươc khác nhau dich chuyên ơ cac tôc đô khac nhau

qua cac ban gel chưa cac nông đô agarose khac nhau .

Bảng 1. Các thông số điên di DNA băng agarose gel

Hàm lương agarose

(%) trong gel

Kich thươc DNA mạch

thăng (kb) sư dung co

hiêu qua

0,3 60-5

0,6 20-1

0,7 10-0,8

0,9 7-0,5

1,2 6-0,4

1,5 4-0,2

2,0 3-0,1

0,5%

0,9%

1,2% 1,4%

0,7%

5

4

3

2

Log

10 c

ủa c

ác

cặp n

ucl

eotide

đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr

điện di: 1 V/cm trong 16 giờ

1 2 3 4 5 6

Mạc Văn Trọng


5

Hình 3. Điên di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5%

và C: 2%.

Theo hình trên, sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba

nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở

cùng một điện áp trong một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được

phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.

2.3. Câu hinh cua DNA

Các DNA dạng vong đong , vòng đứt và mạch thẳng có cùng một kh ối lượng

phân tư se dich chuyên trên agarose gel ơ cac tôc đô khac nhau.

DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid

cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.

Hình 4. Kết quả điên di vơi plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại

mạch thẳng ở bên phải.

1 2 1 2 1 2

A B C

DNA mạch vòng DNA mạch thẳng

Dạng vòng đứt

Dạng vòng đóng

Mạc Văn Trọng


6

2.4. Thanh phân base va nhiêt đô

Điên di cua DNA trong agarose gel không bi anh hương ro bơi thanh phân

base cua DNA hoăc nhiêt đô . Trong agarose gel , tính linh động điện di tương đối

của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong kho ảng từ 4 o

C

đến 30 oC. Nói chung, agarose gel thương đươc chay ơ nhiêt đô phong.

3. Phương pháp điên di

3.1. Thiết bị điên di

Hình 5. Cấu trúc thiết bị điên di agarose gel

Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và

buồng điện di.

+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di

với nguồn điện.

+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.

Mạc Văn Trọng


7

+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di. Buồng có rãnh để cài

lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch.

3.2. Đêm pH

Một số đệm điện di DNA thích hợp là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-

borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM va

pH 7,5-7,8. Trong đó, TAE sư dung nhiêu nhât , nhưng kha năng đêm lai thâp . Đêm

TBE và TPE đêu co kha năng hoa tan tôt cac đoan DNA va kha năng đêm cao hơn .

Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau trong ba loại đệm trên.

Đệm giúp thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn.

Bảng 2. Các loại đêm sử dụng phổ biến trong điên di

Đêm Nồng độ dung dịch sử

dụng Dung dịch stock (1 lít)

Tris-acetate-EDTA(TAE)

40 mM Tris

20 mM acetic acid

1 mM EDTA

(50) 242 g Tris base

57,1 mL glacial acetic acid

100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)

Tris-borate-

EDTA (TBE)

89 mM Tris 89 mM boric acid

2 mM EDTA

(10) 108 g Tris base

55 g boric acid 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)

Tris-phosphate-

EDTA (TPE)

80 mM Tris- phosphate 2 mM EDTA

(10)

108 g Tris base 15,5 mL H3PO4 85%

40 mL EDTA

3.3. Quy trinh điên di

3.3.1. Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng

tôt nhât trong thi nghiêm la type -II-agarose co nôi thâm thâu thâp (low-endo-

osmotic). Nó dê dàng chảy ra va tao thanh môt dung dich trong suôt , kêt qua la gel

đan hôi thâm chi ơ cac nông đô thâp . Tuy nhiên , type-II-agarose dê bi bân b ởi

sulphate polysaccharides (SP), hơn nưa SP con ưc chê cac enzyme như ligase ,

polymerase va RE . Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được

làm sạch cân thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất

cho cac enzyme nay.

Mạc Văn Trọng


8

Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vao 100 mL đêm 0,5 TAE. Đun

trong nồi khử trùng hoăc lò vi sóng cho đên khi agarose tan hoan toan . Nêu qua

trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Đê nguôi khoang

60oC va đô vao bu ồng điên di co cai s ẵn lươc. Chiêu day gel khoang 5 mm la thích

hơp. Sau 30-40 phút, khi gel đa đông cưng, gơ lươc ra.

3.3.2. Đăt mâu DNA vao giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA

cao hoăc thâp. Chăng han theo ty lê sau:

DNA (1 g/1 µL ) : 1 L

Đêm mau bromophenol (10 loading dye):1 L

Nước cât 2 lân: 9 L

Tổng số : 11 L

Dùng micropipette hút 11 L dung dich trên cho vao giêng .

Thương đăt mâu sau khi đa đô dich đêm 0,5 TAE vao buồng điên di cho ngâp

gel, ít khi đăt mâu trước rồi đổ đệm sau . Thường dùng micropipette loại 20-200 L

và đặt bu ồng điên di trên ban co nên đen . Khi tăng điện thế của quá trình điện di,

các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. DNA dịch

chuyên tư cưc âm đên cưc dương . Quan sat sư d ịch chuyên băng mau bromophenol

để biết lúc nào cân ngưng điên di.

3.3.3. Nhuôm DNA băng EtBr

Phương phap quan sat DNA trong agarose gel thuân lơi nhât la dung thuôc

nhuôm huynh quang EtBr . Sau khi chay điên di xong lây nhe ban gel ra khoi khuôn

và ngâm vào dung dịch EtBr nông đô 0,5 g/mL, trong thơi gian 30-45 phút, tôt nhât

trên một may lăc nhe (đô 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một binh riêng đê

xư ly va rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, môi lân 15-20 phút. EtBr

thương pha săn ơ dang đâm đăc 5 mg/mL va giư ở 4oC trong tôi.

EtBr đươc dung đê phát hi ện DNA sơi đôi va RNA sơi đơn . Tuy nhiên, ái lực

(affinity) của thuôc nhuôm đôi vơi nucleic acid sơi đơn la tương đôi thâp va co hiêu

Mạc Văn Trọng


9

suât huynh quang không cao . Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của

nucleic acid và cho phép phát hiện dê dàng chúng ở trong gel.

Thương EtBr (0,5 g/mL) đươc đưa vào trong agarose gel đ ể phản ứng nhuộm

xảy ra trong suốt quá trình điện di. Măc du tinh linh đông điên di cua DNA sơi đôi

mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng kha năng xac đinh

gel trưc tiêp dươi anh sang UV trong suôt qua trinh điện di hoăc ơ giai đoan cuôi co

ưu thê ro rêt . Tuy nhiên , nêu cân co thê ch ạy điện di gel không co EtBr va chi

nhuôm DNA ho ặc RNA sau khi điên di xong . Gel đươc ngâm trong đêm điên di

hoăc H2O chưa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng.

Hình 6. Sơ đồ minh họa các bươc trong quá trình điên di agarose gel

3.3.4. Quan sat va chup anh

Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302

nm). Dùng thiế t bi chuyên dung đ ể phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel

Documentation System).

a. Khuôn đổ gel

Dung dịch agarose gel

Băng dính

Lược

Giếng

b. Gắn lược và đổ agarose gel

vào khuôn c. Lấy lược ra khỏi khuôn gel

Micropipette

Nguồn điện di

Cable

Đệm điện di

Nắp

Buồng điện di

d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di

Vị trí gắn lược

Mạc Văn Trọng


10

(a) (b)

Hình 7: Quan sát DNA dươi ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điên di DNA

trên agarose gel (b)

3.4. Môt số phương pháp thu hôi DNA tư agarose gel

a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp

Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt

ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với ty lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M,

sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA

được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng

phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện

diện của các nhân tố ức chế trong agarose.

Agarose gel có nhiệt

độ nóng chảy thấp

Cắt

Đoạn DNA quan

tâm

Đoạn DNA quan

tâm

Cho vào trong đệm

với ty lệ 1:1

Chiết bằng phenol/chloroform

và kết tủa

Bổ sung muối đến

nồng độ 0,5M

Dung dịch gel có

DNA

70oC

Hình 8. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm

băng cách dùng agarose có nhiêt độ nóng chảy thấp

Mạc Văn Trọng


11

b) Ly tâm

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm

chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp

bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml. Cột này được

cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000

rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp

bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách

ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để

dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể

được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương

pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.

c) Điện di vào bẫy

* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của

băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di

nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di

agarose gel chứa

băng DNA

Cắt

Đoạn DNA quan

tâm

cho vào đệm chiết,

làm nóng hòa tan hoàn toàn

ly tâm ở 10.000-

15.000 rpm trong

10-15 phút.

thủy tinh đặt trong

một cột lọc

cho vào tube ly tâm

rửa cột vài lần

DNA liên kết với màng

dung ly DNA ra khỏi màng

Hình 9. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm

băng cách dùng ly tâm

Mạc Văn Trọng


12

có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng

pipette.

* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng

DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di

trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó

được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC.

DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.

d) Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng 4

M. Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với

các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các

tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo, tiến hành rửa và kết tủa

tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp. Tuy

nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp.

Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn

Cắt một rãnh nhỏ phía trước

băng DNA quan tâm

Làm đầy bằng glycerol

Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA

từ gel vào trong dung dịch glycerol

Chiết dung dịch glycerol-DNA

bằng pipette

Cắt một rãnh nhỏ trước

băng DNA quan tâm

Đặt trong khe một mẫu

giấy loại NA-45

Điện di nhanh trở lại để

chuyển DNA từ gel vào

mẫu giấy

Rửa mẫu giấy và dung

ly DNA trong đệm

Tách chiết DNA bằng

phenol

và kết tủa

Hình 10. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm băng cách dùng

điên di vào bẫy. (a): cách 1, (b): cách 2

(a) (b)

Mạc Văn Trọng


13

(>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị

phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.

4. Ứng dụng của điên di agarose gel

Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt

hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).

Phân tích các sản phâm PCR (ví dụ: trong chân đoán di truyền phân tử hoặc

in dấu di truyền…).

Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thâm tích Southern,

hoặc RNA trước khi thâm tích Northern.

5. Ưu điểm và nhươc điểm

* Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dê dàng, không gây biến tính

mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dê thu hồi.

* Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm

có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.

II. ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL

Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:

Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn

định bởi TEMED (N, N, N', N

'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi

Hòa tan gel trong dung dịch

muối NaI (4 M).

Bổ sung hạt thủy tinh

vào dung dịch

Rửa và kết tủa tiểu thể

Tách chiết DNA bằng phenol

và kết tủa

Dung ly DNA ra khỏi hạt thủy

tinh trong đệm muối thấp

DNA liên kết với hạt thủy

tinh

Hình 11: Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm băng cách dùng

hạt thủy tinh.

CH2 = CH C NH2

O

Mạc Văn Trọng


14

bắt đầu khi các acrylamide monomer được polymer hoá thành một chuỗi dài.

Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản

ứng polymer hoá, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel

được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Mức độ liên kết

chéo sẽ xác định kích thước lỗ, từ đó phân tách các phân tử protein với kích thước

khác nhau. Kích thước trung bình của các lỗ gel được điều chỉnh bằng cách thay đổi

ty lệ acrylamide và bisacrylamide.

Hình 12. Hình thành liên kết chéo

Hình 13. Hình thành polyacrylamide gel

CONH2 CONH2 CONH2

S2O42-

SO4- + nCH2 = CH nCH2 CH CH2 CH

TEMED

Mạc Văn Trọng


15

1. Nguyên tắc điên di polyacrylamide gel

Dùng để phân tách các phân t ử protein, các đoan DNA , kể cả RNA và

DNA/RNA. Gel phai đươc rot vao giưa hai tâm kinh đươc ngăn cach bơi cac miêng

đệm (gel spacers) để ngăn không cho polyacrylamide tiêp xuc vơ i không khi . Gel co

thê dai tư 10-100cm tuy thuôc vao yêu câu phân tich va chung thương đươc chay trong

phương thăng đưng .

Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5%-

20% tùy thuộc vào kích thước của phân tử protein hoặc đoan DNA quan tâm . Nồng

độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử

lớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để

kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân

tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein.

Hình 14. Polyacrylamide gel

2. Điên di acid nucleic

Điện di polyacrylamide gel đươc dung đê phân tich va thu h ồi cac đoan DNA

có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng

tư 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm.

Hai loai polyacrylamide gel thường đươc sư dung la:

- Polyacrylamide gel không biên tinh dung đ ể phân tách và tinh sạch các

đoan DNA sơi đôi.

- Polyacrylamide gel biên tinh b ằng urea và formamide dung đê phân tách va

tinh sach cac đoan DNA sơi đơn.

Mạc Văn Trọng


16

Trong đó, polyacrylamide gel không biến tính là loại gel hay được sử dụng

nhất. Hiêu quả của sự phân tách DNA trong lo ại gel này phu thuôc vào nông đô cua

acrylamide, kích thước và điện tích của DNA.

Bảng 2. Hiêu qua cua sư phân tách DNA trong

polyacrylamide gel không biên tinh

Hình 15. Cấu trúc thiết bị điên di polyacrylamide gel

Acrylamide (% w/v)

Hiêu qua phân tich

(nucleotide)

3,5 1.000-2.000

5,0 80-500

8,0 60-400

12,0 40-200

15,0 25-150

20,0 6-100

Mạc Văn Trọng


17

2.1. Phương pháp điên di polyacrylamide gel không biến tính

2.1.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel không biến tính

Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20 cm40 cm. Miêng

đệm dày khoảng 0,5 mm-2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong quá

trình điện di nên sẽ làm nhòe các băng DNA , vì thế ng ười ta thường sử dụng các

gel mong . Tuy nhiên , khi khi chay môt lương lơn DNA (>1 g/băng) thì cần

chuân bi gel day .

2.1.2. Các bước tiến hành:

a) Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gôm bis-acrylamide), 1 TBE, 10%

ammonium persulphate.

b) Lau sach hai tâm kinh dung lam khuôn gel va miêng đêm băng

KOH/methanol hoăc ethanol . Xư ly bê măt cua hai tâm kinh băng dung dich silicon

để ngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn sau khi

điên di xong.

c) Tính toán thể tích của các dung dịch dùng đ ể tạo polyacrylamide gel trên

cơ sơ kich thươc tâm kinh, đô day cua miếng đệm.

Bảng 3. Dung tich cua cac chât dung cho polyacrylamide gel

d) Bô sung 35 L TEMED vao môi 100 mL dung dich tao polyacrylamide

gel, trôn hôn hơp băng cach vortex . Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính .

Dung dich

Sô mL cua cac nông đô (%) khác nhau

để chuân bị gel

3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20,0%

30% acrylamide

(bao gôm bis-acrylamide) 11,6 16,6 26,6 40,0 66,6

Nươc 67,6 62,7 52,7 39,3 12,7

5 TBE 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

10% ammonium persulphate 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

Mạc Văn Trọng


18

Găn nhanh lươc vao , tránh bọt khí ở răng lược (giêng). Đinh cua răng lươc pha i hơi

cao hơn mep gel. Nêu cân, bô sung môt it dung dich tao gel đê lam đây mep gel .

e) Cho phep acrylamide polymer hoa trong khoang 60 phút ở nhiệt độ phòng,

bô sung thêm dung dich tao gel nêu thây gel co vao nhiêu .

f) Sau khi polymer hoa hoan toan , rút lược cân thân , tháo băng dính ra khỏi

đay khuôn gel . Găn khuôn gel vao bu ồng điên di va lam đây bu ồng điên di băng

đệm 1 TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng

băng đêm 1 TBE.

g) Trôn cac mâu DNA vơi m ột lương thich hơp cua đêm 6 gel-loading dye.

Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe .

h) Nôi buông điên di vơi bô nguôn . Polyacrylamide gel không biên tinh

thương chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đên 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi thuốc

nhuôm chi thi dich chuyên đên vi tri mong muôn . Tăt nguôn, lây khuôn gel ra va đăt

lên ban. Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra , tâm kinh lơn ơ phi a sau được dùng làm

giá đỡ và chuân bị nhuộm gel.

Hình 16. Các bươc chuân bị điên di

Mạc Văn Trọng


19

2.2. Phát hiên DNA trong polyacrylamide gel

2.2.1. Nhuôm băng ethidium bromide

Ngâm nhe gel trong dung dich nhuôm (0,5 g/mL EtBr trong 1 TBE). Sau

30-45 phút, lây gel và tấm kính đơ ra, cân thân thâm khô bê măt gel b ằng giây thâm

Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng gi ấy nylon (Saran wrap ), tránh tạo ra bọt khí

hoăc nêp gâp cua Saran wrap. Quan sát và chụp ảnh trên may soi tư ngoai.

Polyacrylamide co thê la m mât huynh quang cua EtBr , do đo không thê phat

hiên cac băng DNA băng phương phap nay nêu ham lương cua no thâp hơn 10 ng.

2.2.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:

Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện một

lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid

(pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.

Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung

dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung

dịch acid của formaldehyde. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi

trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim

loại dưới điều kiện kiềm. Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích

hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối

với các gel mỏng.

Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau:

- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự

khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và

trung hòa các hóa chất không mong muốn (urea và đệm).

- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất

bân dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định.

- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải

thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy nhiên,

đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) chỉ cần 10 phút để có chất lượng

hình ảnh cao mà không làm giảm độ nhạy.

- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết

tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu.

Mạc Văn Trọng


20

- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L),

sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde để giảm các background không đặc hiệu

một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay đổi tùy vào

thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây đến vài phút.

- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh

càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh 7,5%.

2.2.3. Phóng xạ tự ghi:

DNA có thể được phát hiện bằng đồng vị phóng xạ 32

P. Cố định nucleic acid

trong acetic acid 7,5%. Sau đó, tiến hành rửa gel trong nươc khư ion . Dùng giấy

thâm Kimwipe đê thâm khô bê măt gel . Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ và sấy gel ở

80oC trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ. Ủ phim phóng xạ khoảng 24 giơ. Quan

sát kết quả.

Hình 17. Phát hiên DNA băng thuốc nhuộm bạc

Mạc Văn Trọng


21

Hình 18. Hình ảnh điên di DNA có đánh dấu 32

P trên polyacrylamide gel ở phim X-quang.

2.3. Phân lâp cac đoan DNA tư polyacrylamide gel

Phương phap tôt nhât đê phân lâp DNA tư polyacrylamide gel la ky thuât cua

Maxam và Gilbert (1977). Ưu điểm của phương pháp:

+ DNA thu đươc co đô tinh sach cao

+ Phân lâp ca hai loai DNA sơi đôi va sơi đơn tư cac polyacrylamide gel

không biến tinh va biến tính.

Phương thưc sau đây đươc cai tiến tư ky thuât cua Maxam va Gilbert (1977):

- Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng

phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV.

- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm . Không loai bo Saran wrap

khỏi gel trươc khi căt , căt ca gel l ẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ có chứa

DNA quan tâm ra khoi Saran wrap .

- Chuyên gel vao trong E -tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette để

ép mảnh gel theo thành của tube.

- Tính toán thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1-2 thê tich cua đêm chiêt

vào E-tube.

- Đong tube va u ơ 37oC kem theo lăc vong nhe . Đoan DNA nho (<500 bp)

đươc dung ly trong khoang 3-4 giơ, đoan lơn hơn mât khoang 12-16 giơ

- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Chuyên thê nôi vao E-tube sach.

Mạc Văn Trọng


22

- Bô sung thêm 0,5 thê tich đêm chiêt vao E -tube cu co manh polyacrylamide

gel, vortex nhanh va ly tâm. Trôn hai thê nôi lai vơi nhau.

- Bô sung hai thê tich ethanol ơ 4oC, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30 phút.

Thu hôi DNA băng cach ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4oC.

- Hòa tan trơ lai DNA trong 200 L đêm TE (pH 7,6) và bổ sung 25 L cua 3 M

sodium acetate và kết tủa DNA.

- Rưa cân thân tiêu thê vơi ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đêm TE

(pH 7,6) tơi thê tich cuôi cung la 10 L.

- Kiêm tra sô lương va chât lương cua đoan DNA băng điên di polyacrylamide

gel. Lây môt th ể tích nhỏ tối thiểu trôn vơi 10 L TE (pH 7,6), bô sung thêm 2 L

gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide gel ở nồng độ thích hợp.

Hình 19. Sơ đồ tóm tắt phương pháp cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977)

Chạy điện di

polyacrylamide gel

Xác định vị trí DNA

Cắt băng DNA ra khỏi gel,

chuyển vào eppendorf tube

Bổ sung đệm chiết

ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ

Ly tâm 12.000 vòng/phút

ở 4ºC, lấy thể nổi

Kết tủa DNA bằng ethanol ở

4ºC trong 30 phút

Ly tâm 12.000 vòng trong

10 phút ở 4ºC để thu hồi

DNA

Hòa tan trở lại DNA trong

200 L đệm TE (pH 7,6)

Mạc Văn Trọng


23

KẾT LUẬN

Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA. Nhờ

phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng

trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả.

Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này. Nhưng mỗi loại phân

tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau. Điện di agarose gel là

phương pháp tối ưu nhất đối với DNA còn polyacrylamide gel điện di được cả

nucleic acid và protein. Nói chung mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược

điểm riêng, tùy vào từng trường hợp để tiến hành điện di theo cách nào là tốt nhất.

Documents

MỞ ĐẦU - blogtiengviet.netblogtiengviet.net/media/usersd/domboy909/307.pdf · của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA,