SPEKTROSKOPI UV-VIS

Made Laksmi DD/1306480540

Pengertian

Spektrofotometri UV/Vis adalah teknik analisis spektroskopi yang menggunakan sumber radiasi

elektromagnetik ultra violet dekat (190 nm – 380 nm) dan sinar tampak (380 nm – 780 nm) dengan menggunakan instrumen spektrofotometer.

Pada umumnya, spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang

terkonjugasi, dan menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang maksimum suatu

senyawa.

Prinsip Kerja

interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar, dengan materi yang berupa molekul.

Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi. 

Untuk senyawa jernih dapat dianalisis pada panjang gelombang 200–400 nm.

Untuk senyawa berwarna dapat dianalisis pada panjang gelombang 400–700 nm.

Istrumentasi spektrometri UV/Vis

1. Sumber cahaya2. Monokromator3. Kompartemen sampel4. Detektor 5. Pengukur intensitas cahaya

1). Celah keluar sinar monokromatis hanya satu.

2). Wadah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu.

3). Setiap perubahan panjang gelombang, alat harus dinolkan.

Jenis Spektrofotometer UV-Vis

1). Celah keluar sinar monokromatis ada dua.

2). Wadah melalui dua kuvet sekaligus.

3). Alat cukup satu kali dinolkan dengan cara mengisi kedua kuvet dengan

larutan blanko.

METODE

a. Simplisia diekstraksi dengan pelarut tertentu.

b. Buat baseline dengan mengisi kedua kuvet dengan pelarut.

c. Isolat dilarutkan dalam pelarut

d. Isi salah satu kuvet dengan larutan sampel dan kemudian diukur panjang gelombangnya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi spektrum serapan

Jenis pelarut

pH larutan

Kadar larutan

Tebal larutan

Lebar celah

Jenis Pelarut

Pelarut yang digunakan tidak boleh mengabsorpsi cahaya pada daerah panjang gelombang dimana dilakukan pengukuran sampel.

Biasanya pelarut yang digunakan antara lain: Air Etanol 95% Metanol n-heksana Eter Petroleum eter

Pelarut kloroform dan piridina umumnya tidak digunakan karena dapat menyerap UV pada panjang gelombang 200-260 nm, tetapi sangat cocok untuk mengatur pigmen tumbuhan seperti karotenoid.

Pengaruh pH larutan terhadap absorbansi

Senyawa ada yang bersifat basa (mengandung gugus –NH2) atau asam (asam karboksilat, fenol) butuh pelarut yang asam (HCl 0,1 N) atau Basa (NaOH 0,1 N).

Ada senyawa yang sangat sensitif terhadap penyimpangan pH pelarutnya.

Oleh sebab itu pembuatan pelarut harus diperhitungkan secara benar (dalam 1 kali pembuatan).

Pada senyawa yang sangat sensitif oleh pengaruh pH penetapan kadar dilakukan pada titik isobestis.

Yaitu titik dimana pada panjang gelombang tertentu, senyawa senyawa dengan konsentrasi sama, tetapi pH tidak sama memberikan serapan yang sama.

• Perubahan pelarut, pH kadar larutan, tebal larutan dan lebar celah → perubahan serapan/daya serap dan panjang gelombang maksimum zat tersebut.

• Efek yang timbul akibat pada spektrum serapan faktor tersebut diatas: terhadap perubahan serapan (hiperkromik dan hipokromik) dan perubahan panjang gelombang (hipsokromik/blue shift, batokromik/red shift).

• Hiperkromik: adalah bertambah besarnya nilai serapan dibandingkan serapan seharusnya akibat pengaruh perubahan pelarut / pH.

• Hipokromik: adalah turunnya nilai serapan dibandingkan serapan seharusnya akibat pengaruh perubahan pelarut / pH.

• Batokromik: adalah bertambah besarnya panjang gelombang dibandingkan seharusnya akibat pengaruh perubahan pelarut / pH.

• Hipsokromik: adalah turunnya panjang gelombang dibandingkan seharusnya akibat pengaruh perubahan pelarut / pH.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID DALAM DAUN BELUNTAS (Pluchea indica L.)

Cara Kerja

Sebanyak 50 gram serbuk simplisia daun beluntas dimasukkan ke dalam Erlenmeyer (500 ml) kemudian direndam dengan 250 ml pelarut etanol 96% p.a, ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 7 hari, sambil sesekali dikocok.

Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 70°C sehingga diperoleh ekstrak pekat.

Ekstrak pekat dicampurkan dengan etanol 96% p,a kemudian dipartisi dengan n-heksana.

Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji fitokimia flavonoid. Ekstrak yang positif mengandung flavonoid dilanjutkan untuk di isolasi dan pemurnian dengan teknik kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam GF254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan fase gerak campuran dari n-butanol-asam asetat-air (BAA) (4:1:5).

Ketiga isolat hasil KLT yang telah dikerok dan disentrifuge kemudian dibaca pada alat spektrofotometer UV-Vis menggunakan pelarut baku metanol. Dari ketiga isolat tersebut, isolat ketiga yang memiliki hasil spektrum senyawa flavonoid yaitu flavonol seperti yang bisa dilihat pada gambar .

Dari hasil spektrum yang tampak, terdapat dua pita pada isolat ketiga. Pita pertama mempunyai panjang gelombang 372 nm pada absorbansi 0,252 dan pita kedua mempunyai panjang gelombang 276 nm pada absorbansi 0,532 ini menandakan bahwa isolat yang dibaca positif mengandung flavonol.

Hal ini diperkuat oleh markham (1988) bahwa rentang serapan spektrum flavonol mempunyai panjang gelombang 350-385 nm pada pita pertama dan pita kedua pada panjang gelombang 250-280 nm

Keuntungan:

Caranya sederhana

Biasanya hanya sedikit bahan

yang diperlukan

Dapat menganalisa

larutan dengan konsentrasi yang

kecil

Berlangsung cepat, kadang-kadang hanya memerlukan

waktu beberapa menit.

Mendapat informasi

struktur yang lebih terperinci dari spektrum.

Kerugian:

Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan kebersihan

dari kuvet 

Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang

panjang gelombang >185 nm 

Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan energi

eksitasi rendah

Sinar yang dipakai harus monokromatis

Referensi

Harmita, 2006, Buku Ajar Analisis Fisikokimia, Depok: Departemen Farmasi FMIPA UI.

Harmita. 2014. Spektroskopi. Depok; Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia.

Fatimawali, Koirewoa, Y. A., Wiyono. W. I. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dalam Daun Beluntas (Pluchea Indica L.)diakses melalui: http://download.portalgaruda.org/article.php?article=15364&val=1015