MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS · Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Digestión con la enzima ~ofl y deteminación

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MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍADE PLANTAS

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARALA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECAGENÓMICA BIBAC DE BANANO (Musa ssp)

Leticia Peraza Echeverría

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.


Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas

Desarrollo de un protocolo para la construcción de unabiblioteca genómica BIBAC de banano (musa ssp)

Tesis que presenta para obtener el grado deMaestro en Ciencias

Leticia Peraza Echeverría

CENTRO DE INVESTIGAclóN CIENTÍFICA DE YUCATAN

Mérjda, Yucatán, México

2003


AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se realizó en los laboratorios de la Unidad de Bi.otecnología del Cen{ro delnvestigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY), bajo la dirección del Dr Andrew C.James K. y el Dr Dieter Kaemmer a quienes agradezco su amistad, confianza yapoyo.

Agradezco de mariera importante la beca-crédito recibida durante el primer año de lamaestría, al Conseio Nacional de Ciencia y Tecnología con el número de registro162940.

A los revisores externos, Dr. Miguel Gómez Lim y Dr. Jean Philippe Vi.elle del Centrode lnvestigación y Estudios Avanzados del l.P.N. (CINVESTAV, Unidad lrapuato), porsusvaliosassugerenci.asquepermitieronenriquecerestetrabajo.

A los revisores internos Dra Cecilia Rodri'guez G. y Dra. Blondy Canto C. por suamistadysusexcelentescomentariosyaportaci.onesparamejorarestetrabajo.

A la Dra. Mi-Kyung Lee por su valioso apoyo {écnico y amistad durante la estancja deentrenamiento en la técnica para la construcción de bibliotecas genómicas BIBAC,realizada en el laboratorio de SoW and Crop Center del Texas A & M University, bajola direcci.Ón del Dr Hong-Bin Zhang, a quien también agradezco su amistad yconfianza.

A Pablo, Tere, Rosa e llka, compañeros de posgrado, por su amistad.

A todos y cada uno de mis amjgos del grupo de plátanq por su amistad,compañerismo, entusiasmo y apoyo.


DEDICATORIA

AmimadreDalja,miabuelaEstílitaymiabueloSebastián(q.p.d)porquesinsuamor,apoyo y enseñanza no hubiera yo llegado hasta donde me encuentro ahora.

A mis hijos Ricardo, Eyner y Eri.ck por su amor jncondicíonal, su paci.encja y suentusjasmo.

A Santy, Vicky, Wi.lly y Mary por su cariño, ejemplo y confianza.

Sin ustedes hubiera sjdo imposible


Contenido

ResumenAbstractlntroducción

Capítulo l Antecedentes

Generalidades del género MusaEl genoma del género Musalmportancia económica de bananos y plátanos en MéxicoSelección e Íntroducción de cultivares resístentesObtención de nuevos clones generados en los programasde mejoramiento convencionalBanano silvestre Calcutta 4 (Musa aoum/.naía ssp Ouma-nnicoides)lntroduccjón de plantas genéticamente mocljficadas a travésde la transformación genéticaVector binario tipo cosmido pCLD04541Principales pasos para la construcción de una biblioteca ge-nómica con insertos de ADN de alto peso molecularObjetivo generalObjetivos específicosEstrategia experimentalReferencias

Capítulo ll Preparación del vector binario pcLD04541

lntroducciónMateriales y métodos

Obtención y purificación del vector de clonaciónpCLD04541

Purificación del vector pCLD04541 mediantegradiente de cloruro de cesío

Linearización del vector pCLD04541 con la enzimaBamH 1 o Hi.ndl 11Desfosforilación del vector pCLD04541 linearizado

ResultadosObtención y purificación del vector de clonaciónpCLD04541Linearización y desfosforilación del vectorpCLD04541

DiscusiónReferencias

33

3333

35

35

363637

37

373941

capítulo '11 Preparación de fragmentos de alto peso molecular

lntroducciónMateriales y Métodos

Material vegetalExtracción de núcleos de Calcutta 4Deteminación de las condiciones óptimas para ladigestión parcial del ADN genómico con las enzimaBamHl o Hi.ndlll

Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kbpor electroforesis de campo pulsante (ECP)

ResultadosExtracción de núcleos de Calcutta 4Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb porelectroforesis de campo pulsante (ECP)


Capítulo lv Obtención de clonas BIBAClntroducciónMateriales y métodos

Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADNseleccionados en las fracciones Fl y F2Digestión con la enzima ~ofl y deteminación deltamaño promedio de inserlo

Resultados


Discusión generalConclusionesPerspectivasAnexo

Ligación del vector V41 con los fragmento de ADNseleccionados en las fracciones Fl y F2Número de colonias necesarias para tener unabi bl ioteca representativa

45

506163

656566

66

6868

RESUMEN

Los bananos y plátanos representan un cultivo de gran importancia,

:,|':c::ta:mb::::oenA:?Smgs,Íseessupnoabí:spg:aA::,fuecnet:trda:á":staesdeenAsta:r,yáE::n:syue|Caribe Sin embargo, este cultivo es amenazado por plagas y enfermedades quecausan cuan{iosas pérdjdas en el rendimiento, y por consecuencia en las ganancias,ap'r%cg\raan#?scodnees#.?orp.e#t.e,33osíyiÉ_-¿;ii:'á5S;í:e_yd_uv|cu!'or*:Snuqeung'aseeF:fsag=an=ofiÉadssprograrnas de mejoramjento para la producción de híbridos resistentes a lasprincipalesenfermedades,nosehaobtenidoalafechaningúnbananooplátanoquecubra los requerimientos necesarios que exige el mercado internacional, en respectocomo por ejemplo, la palatabilidad y la fisi.ología postcosecha.

Es um necesidad entonces, el buscar nuevas altemativas para la obtenciónde plantas resistentes de banano que mantengan las caracteríslicas originales depalatabilidad, tamaño de racimo y el tiempo de almacenamien{o, por ejemplo Unaalternativaquepuedeserutilizadacomoherramientaparaelaislamientodegenesdei.nterés (como los de resistenci'a a enfermedades), es la construccíón de bibliotecasgenómicasconinsertosdeADNdegrantamaño(enpromediomayorque100kb)a

#¿redneseesrp:C::tseF:S:Ssteen;eÉac:/rfyerAm,e„d;8:asc,ye:!"'Zpaanr:°sveegcut%r:#||:r::asn':fser:::'::resistencia parcial o total a vanedades susceptibles de importancia económica, através de la transformacjón mediada por Agnoóacíeri.um. Esta herramienta no solopodrá ser utjlizada para el aislamiemo de genes, sino también para el estudiocompletodelgenomadelgéneroMusa,delcualseconocemuypoco.

Ean ss'o bp:e#ann'=¡.t:3ribaa.j?,nsêr.S,e^'.3uC^C'en_ó_ _=I_ bapaio silvestre dipio.ide Musa?acsu%gnaat?c,sosnpesbugEt2#na,gcoida:5-t:,OP6-.c^f,--c;iS;v8i3cvoÍ_t#=:ed.:;.ao,bsi'gxóegs:£pa=Egogds?ab%eucsearlas condiciones Óptimas para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC,debido a que este banano es la principal fuente de resistencia contra la Sigatoka

:t:,?zr:d:peasraui:'zc:g:a:,:n'of:epá:g:,apTacsósdme,dTej:nr:rTo,,eáteonoc:?nvaedn.c,:nca[DOEJ5Z:?t:Ícual ti.ene un tamaño de 29 kb. El vector pCLD04541 fue purificado utilízando dosgradientes de cloruro de cesjo, posteriormente se linearizó con la enzima BamHl oHÍ.ndTIl y se desfosforiló.

Se aislaron núcleos de hojas jóvenes obtenidas de plantas ex vtíno y seincluyeron en agarosa de bajo punto de fusión formando bloques, los cuales fuerondigeridosconproteinasaKparaliberaralADNyexponerloaunadigestiónparcialconla enzjma BamHl o Hr.ndHl, ensayando previamente diferentes concentraciones decada una para determinar las concentracjones Ópti.mas a las cuales se obteníanfragmentos de ADN entre 100 y 400 kb Para la obtención de estos últimos seprocedjódedosformas:1)realizandounaprimerayúnicaselecci.óndefragmentosdeADN,y2)efectuandoprimeraysegundaselecci.ÓndefragmentosdeADN.

tantodeE±tv::tooor.238akrbz,a::mf:ed:gÉ£:2d534moaon:rba,::g:,%en::,eunnt:rce::c:3;f:aoTaTe]n2o314 (inseftovector) Se electroporaron 20 Ltl de células competentes DH10B usando

k_5G;L2,H:edsep:%3c,8:y2;eF,asqeueá:::r:Tngeed,,onsueLeecrt¿vod:Bcco::n::tsra::C::n#:aTn€e:(blancas)Posteriormente,afindecaracterizarlasligacionesobtenidasencuantoaltamaño de inserto y el número de colonias con vector sin inserto (clonas vacías) seanalizaron colon.ias al azar (de F1), aislando el ADN recombinante med.ian¢ minipreparación y digiriéndolo con la enzima Non para liberar al inserto y determinar sutamañopromedioSeseleccionarondosligaciones,unaprovenientedelasfracciones

¡,r:o;ríí:2s;:::deB¡rT:#ecnot:su:,:aeTa::g:onmHe,:,á,¡ec:nnseuftnotg::2:#oym,:d::rae„Fnasc:::

Con estas ligaciones se pueden constrw dos bibliotecas genómicas BIBAC

ii;,Ía::?án:oddceá:;:;i::n:cr:r;r:,:.:;dr:d::e:rtoeng:un:o:x::t,::::n::s:r::,:ti;'ro`:o:rai:la,:o:p:rn:;":ei:;estarán listos para ser utilizados en la transformación genética de plantas medianteAgrobacterium

ABSTRACT

countr,e:::a:::t:a|dAE;,a=úánnsdaer:stmAPs,:a:Lecrreopti,eypaahr:cu:#,:n,o.pdosord;:::ooi,:,:bananasarethesourceofanimportantinputofforeigncurrencyinLatinAmericaand

:hneor%rLbsbFoasnsesH:nw:hv:ry,teh,'dsac:3Pth:tphrroefi:teb|,:;,bayffepcet:nt§8:fh€Lseeassme:„t:::dcuacuesr:and the large banana expo" companies Although many resistant hybrids havebeen obtained from conven{ional breeding programs, to date none of the resistantbanana hybrids developed attain international s{andards, in respect of for example,palatabi.lityandpostharvestphysiology

M js therefore necessav to search for new alternatives to obtain diseaseresistant banana plank that maintain their original traits such as palatiabmw bunchsize and sheM life. An alternati.ve triat can be used as a tool for the isolation of

:nfteáfsset:nsgeg:ens:stasnutchw::r:s:s::enscea::necsu,,t,,::hmeui:eosf:arggeen;n::chg;rnao,::c,árnar,::

;ohTcs;r::tne3ewiha,:'tga'n:do::cbu::[:e:goh,,taDnTAAárooór:c!::,:;ogukbbs,e::,:gt';,,|:svp::::3í:to transfer parcially or totaw this resistance by Agnoóacíenum-mediated

:r,3:sí:rc::t:o:igtn:f,::n%oennooT,Fca::s:|Pcoensafnotrti:ssct:gt;bá:tx:r#sasguecnhoLb:ar,esmay

lnthisworkthewimdmbananaMusaaoum7naíasspbumannícoidestype

:fa,::s%t:hcweasksn:,::te:gt:,::tnsár,::tkag%na:omk,:„£:adv,,sbeug:dsef:r,stth[:mp:,rnpossoeur::

:::#t't%T:'e3r3%dL3go4P5r4°íg,rawmh:chhTahse:esc,tz°eroufs28kf8r+t::8:B84;4aísvt::to:'nwaa?

#TtrÁfi;gmu;',nogr#:di?,Uannddsd°efpcheos:;To#::'gegradlents,Subsequentlyitwashneanzed

Nuclei were isolated from young leaves obtained from ex vitro plants, thesewere embedded in agarose plugs (LMP), and di.gested with proteinase K. A wjderange of restriction enzyme concentrations were used to obtain the optimal partialdigestion conditions wm BamHl or H/ndlll in order to obtain fragments between 100

::g,42°)°fii:t::d°sper:::8U::zsews:i:c't:oS;e:ft°DR&{a;rna:r£%Tt:n+She`),nae:::zte%'Zvees:J:C*::Iigated independenw wm the fragments from F1 (100-250 kb) and F2 (250400 kb)using molar ratjos of 1.2 or 1.4 (inseh..vector). Twenv mi.croli.tres of competent cells

LDeHdíuo:)w#rteet::eccyt:#:,a,t:ÍGW,áhnd|;-HéAo[2Á,ft::t2:,Lgiht:d.::!e:nod,p,:act::g,nnaLn:cells (white) were recorded Subsequently, with the aim of characterizing the ligations

í::tJ:c,tno:::oiázt:daE;thme,nn,:re::rd?gfeesTepdvw:toh,o;;efls,ecn:,yo:,:stowreer,ee:::d,::,,yns:L:cáenddtheaverageinsensizeestimatedbypulsed-fieldelectrophoresis.

ave,ageT,#e,Lg3izoen:fw,e2r:i:,:Cnt:dth:noethf::Trof:gfra?nJseft,ged:;eedst:áthwpt:mHT;dY,',thwit:

:Fbaavne::3ed:Fceuh"S'Zec:fníb2e2c2o7n5tbruc#oih4eosxet'hgea#:;Fo#:eBn':#:s:::°gTv',:;'baragr¿eo/:ofprobabilivofincludingaugenesinthelibravThisisthefmttransformation-readybanana genom.ic library constructed with a binary vectctr.

lNTRODUCCIÓN

Los bananos y plátanos, pertenecientes al género Musa, son

F.,gTen!Io±LS?_#,con_ape_soa_rs€=ohne#osana&aioc±su*iaeotFiicg#FiasR.b!3_f_5!?=_ag_géoon?fdoeECs_r#E:,pngrc£enes8'hp:°p'£::ed?[°9P5°5r)C'°nar°n 'OS genomas A y 8 respectivamente (Simmonds y

Los cultivares comestibles son considerados tanto alimento básico, como

:Tg-:rhóap|:eosfu::Leeá:sgaÁa:,:,:,s;:n,g:a,p::seei::avJ:§c:ft,Joesa:ÍLo:,:i,c::,,?se:rpóupé:oseíap^ror_:_z_ü.nt:'gaomyphga:azngsedeencvuaí,net€a:d¿€:!tF:,aa-d<.o=S=£.,E.á"s?.d^c::|`'9vPopa='i£eesnt¥c'eo¿taae#nús££:Éde:por un amplio rango de variedades, Ias cuales incluyen tanto bananos que soningeridos como fruta de postie (porque en su madurez son dulces y fácilmentedigeribles) como plátanos que son generalmente más almidonosos y pueden seringeridosmaduroseinmadur®Estosúltimossonfritos,cocidosotostadosDeeste

¡EUut:sesg:ovpeYeídge7n2)°btener tamb'én harlnas, mermeladas, puré e inciuso cerveza

tone,adaLsampertorfcuacs?'áé,aa:u:Laiesn,:f,98mo,on:.:,p:osdudc:dg,reendeÁdf::a:eAs::d:i"g::;ficdo:AméricaLatmylasregionesdelCaribe(FAO,2000)Alrededordel87%detodoslosbananos y plát~ crecidos en el mundo son producidos a pequeña escala enhuertosfamiliares,paraautoconsumooparalaventaenelmercadolocaloregional,y

ita;iob:aí;:tdi:,:i¡ne:o:cáu:i:::tií:,a]Í#T::aegeccj:jjrn¡:i;f,;;i;Fii::ii!ijnfí:;:o;?m;:o;:r.:;:a:y:ej

i!u:fi:e;rfiíijíjiE::P;añjr;::;e;c:Í:te;n:fi.ioi:tsc;oij;Í:i,;:sg!:i;ií:íj!i'Ís!,Íí:i::;ic:£:id;::::n;jsc;c::!Ici::jac=;ie;s::;de Panamá, ocasionada por el hongo Fusanum oxyspowm Schlecht f cubense(Purseglove,1972)EstecuMfuesustituidoporcultivaresdelsubgrupoCavendish,

:'xep:!:oc,gned:s;e:n::ose|encT:t,:::u:i,:::osfn,gea:tbe:,rg:,:sut:,s::g:Lp:oT:n:::ece:?,b,,:

#áosepn^f::T;,áag"d,es,:mineaadc:sE,gatoeknafe::gerdaádqg:edeessoe=::on|:oq:dapo:eed,,a::enq:

#,acá:Í:sc::,;nuuearg:rfeusnegnut:c,ud:;;eg:roopeasrtaoe:,:vead::sa:obs,teonsted,,:r3:rucdc,hóunmhaansáa4o

Dentro de las estrategias planteadas para superar tanto las plagas yenfermedades,asi.comomejorarlascaracteri.sticasagronómicasenlaproduccióndelbanano(PersleyyDeLanghe1987)sehapropuesto:

5

a)LainlroducciónyseleccióndecultivaresresistenlesSehantratadodesustiw

:::t,,:,aerne,:s,,ot::l:sendimpe,r::aan::nt:au,s,c:::,rbe,te:t:,o,rlg::t)Yacr::oseehe:F:oensatgodseÁ?rTc:

avc:y:tsat:,kóenepfo:,óalhgeg3,e,:,snper:dbua:tgooré:,daeT,bd:sac,aasso:,fne:esnec,tausv:nc?ampp::::a3#oa:nla

b)Laobiencióndenuevosclonesati.avésdelosprogi.amasdemejoramiento

iiieir:m::c:;Íaeí:::r::#,:;:;;oiíí;3;:o,s;:p3::s;t,:id;:a3i::i;p5rait;f:ó::::n:¡r;n:go:1íi:JC;;::eir`:eí;:;esencialmente en el meioramiento de parentales masculinos, con la consecuentecreacióndediploidessintéticos,seguidodecruzassimplesconloscultivarestriploides

e3nqe:Í,::;niti:1:9:;É,:asBdre::;::c;::or;geáihgtb;,:s:;Í::ri:i:,i,;ia:cb:;d:;;::;neu:toeh:a:a::::o:iiei8:!:es,

i:áá:n:or::y::rnp:a:ft:::eo::,;:i:::aesi:hEaepr:a::d:ut:,i;oevn:f:::;,:e:ti::l::i:::£etto:r:eT:e;:rt::::;una buena ó excelente producción de racimos Los parentales femeninos utilizadosPma::c#::arr::::tse:tí::`d:SjTf::::t::"`::::rsmdeed8:á::r°fsu'e%`:nterFsb:::i%S::Leen:i'b::

Pisang Lilin y el banano silvestre Musa acuminafa spp burmannico/des, mejor

g:gn:tc:!:nc:gT:,,,:§,,?::osaa,::fta:"ía(yDa::aa,%:ebalng::,áesteu,t,moesres,Stenteala

ct La producción de plantas genéticamente modificadas a través de latg,:nnés,i:aT::::nmgoedTfifctácdaasEt,,eT:,ogrraaT,eai:oncTÓon,eá:L:áopaarat:aaot:e:c#,ad:apLaant3:

icioc:n;áa::n,t.en::i#:bs::u?3:u:p::.ii3e:s:t!e:::idí#ní:::n:::nLÉo:sr:3:!,:;::s:r:e:srai!h:o:sJr:c:::Fü:t;

::,ses:t%gr:p:stdáe:%sgepj3::::sg#t,a,,ará::::eFace,::;:dTcac:::,,nd:ecsaráocTe¡,,:tt,::sendt:resistenciaatravésdelatransformacióngenétimeslaalternatMenelmeioramiento

:net:o3:::,nóontes:3:egroaoc%nL:sttar3,nesfg:má:Lóensgeennéet¡C:e:::daensuecr,eda:f,::::p:oormyo::

iídñ:i:i;íj:;:s:;d;:i:;n::;íiíi;i;ís:ÓÍ;;:;;i:ia;ije;#;j:i:ÍÍ::níg;;,;;;:u;;;:jfi:::caiígi;:sjA:£d;:o::i;:;ii[#ii(i!;id!odesoxirribonucleico) de gran tamaño (mayor que 100 kb) listas para usarst en latiro:,i:.f:o:q:icu::en.éono;:u:ecn:t::i:a:3:a!t:e:,ig:ats:vj:opir:as,:,se`áa:nr::s:'::|::i:áai:o::::`Ta:r:::i3sirugs:;:;

6

de dichas bibliotecas pueden ser del tipo "Cromosoma Bacteriano Artificial Binario"

•íB;bíi;eíiii:;í::rsa::i:Tií;jnii:£hí::;:;i;s;íi;ci:d;j:emeiAS:!:íj::#::aí!:::oin¡;b:,a:nn::,inig::r!a:|::íie;ñ¥;;aigenómiffi BIBAC que pueda ser usada inmediatamente en la transformación deplantas.

Enelpresentetrabajosedesarrollounprotocoloparagenerarunabibliotecagenómica del banano silvestre Calcutta 4, como se mencionó an{eriormente, este

:::raanoE,P::::orrs:,,:t=n,:,naadc:nftur:dv:r::pso::fseJTdeo,apdceibá¡g::,,a:T::;:::ft:,.geaé:k:los vectores binarios convencionales (PBC) La construcción de es{a biblioleca, asi'

:::Ff:tuurcoareancte:ríáas::é:,dceo::tht:?edne,:ess,ps:,emn:::spg:as::spt:,:orq;:ni:::aa.sfeorr;t:,rz:g:dichogenesalgúnbananodeinteréscomerci.al

REFERENCIAS

DeLangheE.A.(1992)Geneticimprovementofbananaandplantainthenew

J:a;:'t:t2::§ií§:¡a§:§a:Íd;§Ín;;°:§:§;i!§íijiíiiiii:§:§§íi;í;:¡Í§::;j;i;;Í;b:a;Si:;;:::fi|;:;;i;;ní:;Ís;usi:;bs::i;n;:et:m;:a:SScjentia Horticul{urae 25, ppl 37-147

:P:e;e:eg:§Í:ii:::eii:Íii;P;rLi:§;íiig§jg:fr:;(:F;d§;::n:£:t:::7n;;n:B;::::S:h::a:nd:L:j:r:d:;s';:b;::;;íísg:acnt::er

sa-T::oa:,::::én:a::cgsní;infete:b:u;,e:tf:nbL:nToaah:Hf#::es::!:re4,s|:s7:nct::fpu,,:r:agr,cu,turePossibilities ln Disease of bananas, abacá and enset, Jones, D R (Ed) Cabi

sá-;pán::Ls;;n;gr::p::á:s:,Í6é::cTreonpno,:t,eES::aT:,,kaues:,spp,|9c#,"EÍ::S3:P,,cABB

group) protoplast isolation from regenerable embryogenic cew suspension

7

:::,:Lo;Ía§n,;3:::#e;p;íjj:3Í{:§n;::;:::o6í:Kf%,r,Í9::t¡o;ny::¡3e:;í::aoía;¡;dna:p:an:::::na:n{:::,:vp:ptTe:,,aTao'Qba:T:ar2ás83Jg'kLin-npni:¡3:):c?ñ;an,:g,:a5l:::ta:b:ij#ot::Fnpi:so:Erb£::adg,::t:rs

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CAPITULO 1

Antecedentes

GENERALIDADESDELGÉNEROMusa

:%fs°:Td%:::°n:eí:?onr%€ash:eorrg:C:e:a::eci;r,:a!Toegs:::'iaass:v:a:n€t:a'}°miá°£r:Unce:S::;od¥:a:r:§tseár:ádna::s:

fi::ñ::Í;:::u:Ld:aocs;!,;;;a:Sspii::d;eí:n:fír;#j:a:;ivíñií,;:er:;i:ttíi,,;oiiii#,:;í;f:;d::i:;:;j,:iea;d,iae:;::i:

f:rn::c:¡f:csa:c¡:::::e;:,,g:s,aá%a,::d#:ucau::ddaób:::d:::o;:,#gr£:s:,sáénnzgu:,sÉ:fñná,e::Lasbrácteasylasfloresinseftadasindependientementesobmelpedúnculo

:::u:onT::::nioesdneucá::a3ásí,ceespt:a?afr,:r,:ss%asr:oui,nf::c::ná|ecsu::t:::::r:ossqnuueds:distales,lasbrácteassondecolorrojizo,púrpuraovioleadebtialasantocianinas

í%J:rrn:t:°:S'):::áecii¡;!v'8;:i:rd::¿*oé;;:ic::!§::::%iió:g:gÉd:r(dge:yíe::::ie:a;:9:8as;;S,€:'g::rE:

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¡§S;;:C::rn±:sV:a:rtí,:r:;:íí:;d:ets;í:::ojn#e:nB;¥S¡b#;[r::mS,§,B:ír,Í,3¡eES;,et,#:t#:lnc ân--~-_ ^ -_

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;:á;nt:ri::b;;%ie:!!:i?:a::gíi:n:5;£:dg;:fínaieí|jí:jíi::;a!:Í:Íe::7cáji;:sj::eí:eá::::Lai:eii:r:ii:::i::ií¡;

EL GENOMA DEL GÉNERO Musa

estud,o::,s,tae:sot::c#r:rTa::Ó:p:::cr,=nddeé,gÁgoNm:eg:doMás:,u:aí,r::teTsutyüd:f,cJuey,partjculares.

Sehanutilizadovariostiposdemarcadoresmolecularesybioquímicospara•:¡;;e::gea::,8,::e::te:;:g:é:¡::oy,aEas:tá::,:aa?:aniier:st,a:::Tna:nticp:ersrome:tn:!Í;:d!%:o::::,iu:,:'X:í::::

itgr;b3uay,oBeunhea:thoo,,::,hdaenr::::eci:odso::,r:rcst,uorna:essddee::osmc::om:::myatsra`nFsi:£c::naéá

:n::ií§;:::';a;iriis;Í::¡;:i:_;b_::;Í:;;i;:(!íis:;:j{§;ie;d:Íiiec2;íi|ij;;i:§:ití:§e:a,:;::ii!°;Ssaoe:%;:;::::Piiigi;:;ii:;:íi

:t-órjcró-n ael cariotipo en Musade òs cromosomas (1 -2 _T_T!_9e .east:ag::£,rd°¿

descrita (Baurehs eí al.,1996),'V'u.,\^. _-.

::::::::=::;:::-:::::::;::::-:::::-::::-:::::::::;:=;s::--:::::::-:::::::_;:-:-::::-::::ii;s:::::,:::-:::-;:::-:s:::::-:::::,--:-:-:=;--::-::::-::=::::1:;-:::;:.:::::i-:::-:-::-:-::=::::

t,:::|£|ik|ceeáns::,,32::u:¡,,:::zga;::o:ng;!¡¡cn;:::cira:dta;:snvi¡:,in:ti;:oh::p:3`::r:2rn:kgo;,,'oA:Si:ms::ui::i:i

hMaunsac,o:,g_:_or::s_,:eeca:,::;C;ag:go:,r::ru3;:a:n:;::sdi:,erib:tg:;eiy:Íjtó#mo::aa-:láoe¡::;ig:t::::ii

a detalle.

A n'ivel deSe ha identificado

sye:::::Lac:aT:r:3,:^n;cTalt:T;S:T:#,:;:d::,tqa:;,;:ecp:J::::::i;:nun::un::t

¥§¡;:Í.::::,:,;::;Írá:a.N,te_Guc¡;nrd::fásetí:::H;::m::n,a,:,dyeá,::d§::rpL:eon:cÍ:,,édrc:;u_:_:al„ 1998), y unabanano; algunostransferencia quemetalotion.ina.

En la actualidad, las nuevas tecnologias están permitiendo dar un nuevo

::fcoeqsuaen#ár,eac:,,ó:eg:::o::edsetu,g,?n::s,tigg:,::me,:ae,d:r::taegFan::onóuml:ahde:¡abT`nean;:

:ñ:;§;;:::r;s::;íííí;:t;;;8oÍ:Í§t:p;:%3síñ:::h;¡Ír:¡;s::r:Í¡:n:;£;;a;nj:í{t:e:nj:Í;íjz:atst¡:::;e;e;:p:§brt;a:¡§ebc¡;;íÍ§;c::e:;

clonación de genes, la secuenciación del genoma completo, el mapeo fisico y la10

fttiia:::aeí:,;i;ám;ieba,;is;:;c;a:s:sa:!:tio::e:ní;o:i::;;rí;ci!ere::ói¡;jts:::#;:¡;n;i;a:::,:Bi;?naA:g:::::¡,rTs:::sr

%§,:,tt::n,c::o§::n:et:eí:j:us:e::bí:,u:et:ett:¡;„;;pc¡::,t3r:„ort:,Sr:g:odo:;a::amroe,áge:é,:,::rd,:

•osobJeE;á:spt:g:ieg3obs,b!:tnetgsdeie.Tá:nusnoar::p,:fear:taecroenr:fTtin::npáLaacá:p#:,?

;i[:c::;Ug:a::SgpeencotgudnedFomc::f::Sc8::::n;:;::cmo°h:St':e°,rgaon+Z::[:n,estructura

IMPORTANCIAECONÓMICADEBANANOSYPLÁTANOSENMÉXICO

adcvc==tis=vaag:rr:3ud:ÉÉaasrnhgS.é=s^xSc*_o:n:a#ítyát:a¿n#p3%becabinD?ÍT¡£mo#eg!Q##^:-Spdr_e?_=É,,?ose

si|:prc:oiíf::e:ai:asb;:s:7;ó:RhEáoh;oa:nied:úcse;":muít,,:J::,,:::c:o:,gToyenanerti:d:a:ss,::,af:,it::adrd:es,:;uc%Í;ep:an:j95 % se destina al consumo nacional (Orozco-Romero ef at 1998) A nivd de

£gte::aías,LFa#:r,2#e:oiFaÁ,á:,2t3í,,,oyo::p:,es,eqpi,,;t:,:#heandg:?dcuocnc,g„:::.::9a3gs

p#:¥fds:esn:a:;M::;í:;:3%::::¡óT::::[;::á¡:f;to::íjí;tí:r:g::e:nufi§:;;:¡:g;::dcd:e:§;á£í;á:s:ya¡:;,g:5t:;:o;o:ys::q;;rjenfermedad ha modificado el mane/o de la§ plantaciones, principalmente los

•i::r::je:snaty:s::h:3:5Paeapr::Ó3ngyood;,fn:on::;C,::;Í:;:;;;:::8:ee:;at,hTa,a:gu:t::Zi:u::oapTr¡:ítt:°:StemT;;

;n:vte3na:ia;:::axíi;c:ta;Te:n,,:g:::7c:oó:::o:noeí|:i:i::Do:S:áí:3Feu:nLá¡::m:::te::ei,!iise::;í;á,negraolaSigatokaa""sinotambiénporbacterias,virusyplagas,provocandoasi.mjsmoladismjnuciónenelrendjmi.entodelosfrutos

ino°`nrê±aes±:=a§!=£g==edie).=°snet|ea#Óe:a=,#°tsodeuf=rc:^°ns^dae^.=t9=_ata"e,sehnpropuestotresestrategias1)laseleccióneintroduccióndecultivaresresistentes,2)Ia

t;:;e::;n::#:anc:::yg3¡:,:::Ío#o::je:y;:Db¡¡aLnn:td:;Shg:dTe%tá:7¡Sme:::gLaomd:f:caáaesamt::ovréasm¿eení:

11

SELECCIÓNEINTRODUCCIÓNDECULTIVARESRESISTENTES

s,gn,ficaEJa:anseir:8L°d|i:endt:nddeeio`:cui|:vaot:kdae#%raasphp:s:a#::::troudnuac,dr:dnuucecj%:cultivaresresistentesotolerantesalaenfermedadEnAméricacentral,poreiemplo,sehansustituidolasvariedadeslocalessusceptiblesconloscultivaresdebananosdecocina(ABB)talescomoChato,PelipitaySaba(Jarreteía/,1985)

oca,,zadpoorenoter,aoepsat:edeeÁfr,,:::,tu::,e,cn::or:gc;o#:rodperofaggrbcu:tuit,:artrsoT;Fpi:,d`:':t)é

::Í;;Í:;§:¡;í:§Íje;:;§:;¡ñs;u{;::;e§:u:::;:§::::t:e:s:;:j::§;;:Í:§:j{;::eí;jd;§ut;¡;;;t:;;:¡:r;;:§;§:::;;Í::::§o::;§;s

OBTENCIÓNDENUEVOSCLONESGENERADOSENLOSPROGRA"DEMEJORAMIENTOCONVENCIONAL

•::i::::íí,;!níi:r!r:irs:j;;s,:d¡e;n:v2;2s:ti!a::i?itggc:ris::E:nn(::gHg,g,S::ínucn:d:íahodá:::P:r;r3:ri:mo:,::;dá:

parenta,E:T:#adme,enct:"?veanrét:c3,::Tá::c!oenb:l:sáaqbuaesasdoonef:l:,esse,eAC:,,á,:nda:Lpeol:en,

i:uiivies:dL¡:;;guis::s:gr:s::;u:nti:u::?s:;;gsn;:sie:Íein;ic;r,Í:ts:!:i:Íci:!tp;r::ggr#giía:;aé;,:iicatij:`jz:;:d:;

::,T:,,::ni;:;istg:ep:!e:,,pa,rág;a,,Pdr:g,udcoc,:ns:eaíap,::ds:sstesn,:,t:t,:::tr:i:trs%:::::negra,laSigatokaamarillayelmaldePanamá

r:e:sc::d;:n:i\;;i,,:ní:;,:ea::r::cti:p;:Í3á,;!::p:a:i::oÍ;o:.:a:jsn:s:Íe:;sio:r::::ia;Íbariigjsí,,,:F;idiír::c:#:;i;ri::iai

¡j¡::;j;;::so:§a::#:M¡jsr;;í{:¥;§:P¡:#ñr§,;:¡;:::Í;§ta;;*R§oíjd¡:[;:j:r:o::::;j#:§::§dr¡;:a;=Ío:jní¡r;ñ¡í:p;;::etT3:;12

:=-::--:_:::Í=:Í::_Í::::::s:::_::ií-::::=-=:::i:::::i

Laintroduccióndehi'bridosresistentesparasustituirloscultivaressusceptibles

:Rn:a:::#:Oksa:,:::tí#j,dqoueFiiÁ-p2a3|,a#:)aene:es3|eesrt:,a:mu:nateveág#ar3on:cnesóduabd:

;,:v:::au:co|s:aduT::j:u;;.,íii::7:::,r:9:?:6;,:u:eyma,:ení::|:|:g:ucnp:rohg:r:sTd::dao::pT:ed:!oi::,:,,ct,:í#s:::,:á:

BANANO SILVESTRE DIPLOIDE CALCUTTA 4 « acumi.naía sspburmann¡co¡dás,

LasplantasdiploidessilvestrescomoCalcutta4seoriginarondelaespecieMacumínaíaCollaytienensucentmdediversidadeneloes{edeMalasiadondesehareportado qm cuatro de las cinco subespecies se sobrelapan, éstas son

;,:íia¥n:a:€e:SpS'ftm:°%ac3ecn;"as'í:sm(:|i:r!:m:#aian:d°S#'::Sir;j:°X:e:spigu7;;:i§:sr:):a:;g:Tsr°on;:;::t2e7'a°csy33:Tnyas,:::dEacu,:fe°nr;,rdeaqdui::rngseaunatemperaturaóptimadecrecimiento

Calcutta4,esunaplantamonoicaLainflorescenciaesunaespigacomplejay

:::s::ted,g:uuen§tpoesd::cdu¿osvf;Faosrossoodr:ne:;:::js,adsefl:,r:so::á:,Ta:r¿euge,aedsat3ne:ngrpuops::,g:

!rrií;É;oiíe,sas:Í;,R;íj;a,:c:o:::::Fn;jrí::ií!:;dry:l;::ro:;;o,:::goTfs:,:;:uí|::is::s:ei::p;o;dá:3:o:s;r:n;:n;a:íi:,loscuakssoneventualmenteeliminadosLasfloresfemeninassonaproximadamentede"cmdelargo,conunovarioinferiortriJocularbiendesarrolladoylasmasculinasdeaproximadarrúáhté-6'¿#lcvovna'goe=ntTaeTg:e'5l

:ot:::::Ld:e:,:rup::ái:á2::c:áf'::;;,:á::JTe:go:a:s::r:;:se:a:dn:::o:í::::?sirsn:o:ssofa:ú;:uiponans::fcd:udcJ:r::

13

semillas,aproximadamentede5mmdediámetro,sonsubgòbosasoangulares,mwduras,conendospermoyconunembriónmuypequeñoenelexwmdelmicrópm

¡:%t;¡¡í:::a;::;::c¡fí§;;¡:e;;;Ñ¡n;:#;:§ÍÍ:a;!:ñf;¡Ío:3s::Ír;;,¡::::u:;¡:::::osÍ;§¡¡;Í;:ñ;;;;j:;:;:d;:í;:r:::í¡:§:¡í::s:Ír;;de nulo .interés comercial.

Desde el punto de visb taxonómico este banano se clasifica (segúnPurseglove,1972)comosemencionaacontinuación.

C'aseSubclase Lilió s'ida MonocotiledóneaLilidae'

OrdenFamilia Zin iberaesMusaceaeMusa

GéneSecc ro¡ÓnEUMusaÑñacupjp3±6ÚFñáannicog±

Es ecieSubesec.ie

EstasubespeciesedistribuyegeográficamentedesdeSriLanka,"delesteyBurmacaicufta4,esconsideradadesdeeipuntodevisüdesuresistencia,Como

una linea pm (true-breeding), adecuada para su utilización en el me]oramiento

i:i;;íj:!Í:i:Íp;Ín:sj::::£:í;::¡:i:;;ii:;;i:ri;:in;iii:i;::;Íiicií;rií:;ii:;:c;ieiíu;Í:::í:;itp;:jáir:ail;i::iíiíF;;;¡Í;!!;;:i;;s

p:ri.;tdaotHEo::i;:ri,:e#::;f::::;`r%i::a;d:oe;L::sí,u:l;:rtií:feFii,:r3a:pTo:io:::T;:b;:o:,a:noasng::i::o::::

E:áat:cn,3:,aTaB,s,goant:aaesnpeegcr,:,Sá,::::res:sa::#3,::Mm,ódme::ds;r::nut:ar::í;::Lót:,eens::

i;i:v:u;:s:::ni,::e:,:,ai:al:qi:;:3oi:a:Ís;;j:ii,fciü;ii:sl:á;:t;:::rc:i,;p;i,r:aT:3,:e::niií:,di:ie:g;Í::a:d:ar:ai::;;genético de la res.istencia a la S.igatokaPO' Vuy'alt„", v. _-_,

14

jj;r;Í:i::i;:;ie;;i;Í::;i:f:!Íri;nií;jjí¡;s;t:;:Íjnñi;;iííi;o;s;;;:iiise;:;;;Í:i¡::;:i;;:i:ipie;i!;:d;i;Í:!;vii¡j:s

TRAVÉéNDTER:AD¥ifLÓsNFgEfATéróTNA%ÉNEENTi:LSAMENTEMOD,F,cADASA

Elmejoramientomo'ecularenplantasutilizandounaampliagamadetécnicas

t:E;Íjt;;idr;;ngii;:;i:;e:i:::::Ííi:;:,:i\ÍÍ:::i:ó;;íiíjí|:!;;Íi:;:i:tj:;!j:íji::d;Ó::iaíí:Ís:aíjin;e;i,;;j;s¡;:ii;Í:s:ci;¡;a,"alternativaalmejoramientoclásico,sinocomounaherramientacomplementariaLos biólogos moleculares y los me/oradores tradicionales deben traba/ar

:::::t3:Fonst:u7t:vr:r::et:á,:=:i:csosg,#csh:,em:nrte:risgy5)Pararea"za"spruebasde

MmeE8.:o?nm*..cna° C°nvencEonal del b"m y p"m a .ravés de .atransformación genétjca

La primera prioridad en el me/oramiento del banano es la generación de

;u:;bvraar::ent:ec,á3rcgoanq::s,:;::cbaas:doenef:rTae::greosdu:c,3,nagsaesxuai,,neseT:r::gmo:n,:,

::a:i:a:iiahg:#;:tn:oa?:::L:ps::3icñ;;:s:,;:d:ar:cgFi:e:;!Ísmy,;;á:oe:g:a:gn:ci::n::,:de:|eti.::!g:r:;;totalesterilidadfemeninaEsporestoquelaintroducciónderesistenciaatravésdela

¿rGág;orLTa:£:sgf:feent,cfa:st::FeadteerÁstLv:oTáunye:t:a¡j,svacr:a+:ssoumT:,3reaT,:ennttaost:ság:;fundamentodelai.ngeni.eríagenética.

A#::ji!!:;;%Íe;e;nu;Sj:;;::;ié;;:;u:ncs;d;:iu!:§::;;!gíi;:;;js§:;e:y:g::;i;:u:§::fi:i:á:Í:in§::Íe§:::;;íj:;:a;a;idi:j:a;§g;DNA,paraintroducmciial"tmdegenalascélulasvegetales,latransferenciadel

15

T-DNAesreguladaporunprocesocompèioqiie`nvolucraalosge"devri"de la bacteria.

:::acv,::,,:si,ag::o:::,,:aa::e:nné:%:s,!i:r:ma:áaedd;:íi;,eacT::,:o::!sd,:dd:riÉn:sÍ!;:or:c`:me:;¥o:h:asns:u,;

:E£:fiíj:a:;;P::°:aTí:eq;¡;Sr:e::::n;§{:::;:;¡¥:::8:Í:::¡;;:,:r;;Í:g:eeun:bee:r::t:n:;r::d:;:;¡;dn=es:p°::8;S;::::gr::::sn:

(Sági ef a/.,1997).

3Ío::::i::tic;:;±,:iin;jg;e;i::;:eii;s;£Í;:Í:;a:r,:;í::,t:tri::a;;you:3::2:::;o;ii:Íee:a:isí::;;!:::i:nt:v!ííjs::i:#ii:yjó;;ii

li:o:v:;ne,:A:,:cs;og:9:;F::;eeng:ornee:e:ter,ou,aorreasc,odne,bsaenaT:":aenshf::mr:á:n::::oopla;i::taé

i%r:,r!:Íeg::7:¡::a:e,e::E;;i;!b;s;;:upii!:!s::::1;a:n:eix;:eiñr!;;:::::e;;átri;lEÍ:;;::;a;n;s;;!iii,¡diein:(;B:iík:i:;i:tii

i::5ii::a;n;gb!f;ei§;§::t?:a}s:g:éd::;i:s%nep:i{¥iai:a:i;:;iae:::%:,:dce;;í§::ip8r§::;P:;:;i:n:Spii%::;e:ii:¥d:Mediantelastecnologiastradicionalesdemeioramientomoleculareraposible

:::rno,s:f:íj:eg:r:,:3::esdese:ie::c:::ndte::f3;#::dd:o:sdt:3i::e::::,;uri:a:::vcad?;:;:g;:n::i:á:pd:r3mj`:i

!j::ii:;ii;i:aí::,ii:ia;:,ijíi!í::;iq;l:::i¡s;yir¡;,gini:,;:jilc;:iie::::Ó:fi:gi:C!e:S,efs::;:iFj:t:e:;;i;

BibliotecasgenómicasconinsertosdeADNdegianümaño(%a4mkb)

hospedeu,::b(,g::i:r::sgoel:ra,::ra:;qdueef,n:::t,ecnoeTofraugn:enctoo,:c:,,Ó:zadred:e*iañ

16

genómico,inse"eniinvector,estosfragmentossesobreJapanyensucon/untorepresentana,9eriáñ=énñtrtedc=ourheosrgoasn:tamgon

;:iíií:i:§:§;¡ih;;§:;;Íiici::;Fi;¡Í[§Íeí;Í;:;e;Í:;§::;§:i::Í;i§::jba:i:ií:ij:í:£:A;ij:tíi§n§§:#i;iaiinf!:Íiáiaí;§:i;§d§e!e

i:sstaso!!t;:'i:ot:o,ip:ti;g,:i:a:Ó,egso,Ísi::t:ond::i:;í:o,sAert;£:ods:::eiaa:,:::i3;:d,ant:rnése,hamnapsédo,

:;á:r:§;£:t::j§;o§t:;n:fig;oÍ;::¡::::;:;Í:¡;Í:¡;:Í::Í:AÍ;y;,¡t¡;íu§:T§:n;:;:§;:;:í§:§;SÍ:j§;::Íje:ny:t;:§:Í;¡j;:::;§:e[:clonaciónbasadosenbacteriacomoloscósmidos,fosmidos,bacteriófagosPl,BACs,PACsy:?:s_::ñi:¿t-e_m`=:eac%#a°c.'ó°nsb%Sg3do°es:feóvsarid'SÉ;:oi£o:eu.rióyEa%

::r:nx:Le:L::sAm:::nts::mn,acs#:b;tsrs:;?:ssm,t:ae::ro:::,rEg::;a::qu:i::f,:c;a!e::e.:L:e,v:aend::e:::rf:qt::,:is;,;:

Ír:o::;;;¡:,::uína°;bp§j§;;tr¡¡:;:Síd:ñ§::t¡¡ÍC:;jd;°r8::U;a:¡;::aec:Í:e§§::r:;:;::¡fi;gb:°n:;°;::t;:Ísn:síjg;s;e;:s;§;fí;::j:í:g:;fósmidos,yhash400kbparalosBAC,PACyPBC

s::tvee;:o:po:séfscso:;:a:ns::,sa:s:;tae:ra::::,:,ii::Ls:i:::bná::e:s::o:::F;;:g;,Sfyea:,i;i:!e:m::sedn:f::so:qa:ce:Ó:n,de BAC.

:;;:ni::aígíg:::ii:;Í:í:í;pis;o:?:ph:;;ñop:A;id2:o::Í:níj:;i:p::;;:i:o;Ío!n;k:ija:ri:Íjáiiii:níjji;;Í:!:;a:::a!ij;i:ir;:e:;::#f%t°oSs (qGU,:d:,+¿eenfdaa/? 2roeog;?nes largas del genoma o más aun cromosomas

17

BibliotecasBACdesaTrolladasenelgéièroMusa

•smo3:ei:t:e:ár#aubdr:r;ar:::udneo,3:::!::,v::Je:,:,o:e::eratee,Cdoenssa,:::Fo`::erunnactoanpa:

fisicodebananoutilizandolatécnicadehibridización/ns/Wporfluorescencia(BAC-

f::Hp,,::ern::it;;gn,:,::ant,;nng,berse,ákpearpao::t:i,#,taer,hzhaoc;ó:fdai,,2óroa3S,,ocac,ondepuntosde

checaspeo:so.táracg:sht:úyeennde"::t::3,,g:e:aotÉÁ,8ad:`x3:::#,á,:Bju::`faB:si:::c`:CGU,:bas,e¿á„Ca°8:Leomm:::a8:n:::,jams,£¿bdi.o)tecasconsmasparaeigenomaA(The

18

YAC

BAC

i!:piíñií:jíiÁ::a:t;eai:tíde:ii:á:Í.:s:á:n;;q:ÍT::aíoíui;jr,i.:r!:É!;Í::faucr:N:YmA£:;,,,;c:oa:e;:R:nu§É;;u:_:^cfa:_:_ut,óg::t:ucdt:__--\v``.'Olluu'a

:íí{e:;a;i#:apíiidís¡s:::;í::a;íd;§eií:;}oai,ií;b;d:af;o§§x:i¡Íj§:;&íj!;;í;°°!:Bg

19

_. _...u u iusraio eseri

íjn:,:;rei::::q:Í;C;UE!¥j::#a:;tg#fin:d;;§i',

TransferenciadeADNdeal.opesomolecularalgenomadeplantas

(Tanksley ef a/.,1995).

conten,::b:,o::cavsecgt::eósm.::nsar:oosn:,ns:::o;a:ae,:DY'a::foa#oacpl:snodmeol::,uu',aarévegetales

¡e¡ats:Te:;oei:t;::;ij;ií::ngs;m:ii::::oi:í::j:;áa:3;ae:ro:::s::L::::n:;:`Íj:is:t:::;:s:Ía:pv::r;ii:apn;ig3`:Íi

clonac.ión.

•hn:edrieo:odse,,gá:nt;ammb:::„q,:eBia-,á:%eb,,,,dsaedftá:n,Vaesnt:?onna:sP,::T,:r::::::i::i:)s::

:;i:a:d:o::di:;a:':Tg:e:r§,,Ódn:9:9:8P);::=:j:2sntc:°:P:;§:C%e:::a}t:d:s:oi;V::%:j:S:e:ri:::||:gue:n!;20

t3.a=e%]3bo§:os°n::.ab#m8:®vpea:rt=oer=:%p:aecrnha%§odp%#°óósnsigvonescbtda°e::e=:,vabe:sE#,;n§egs,npb#nomog§dc°gs=APp#N:áadegemsná:esr

de 100 kb_

deADN:::irseud:::+¿°es3PoBocksb:::müoi::eBSAdcesc)°npaArcysmantenerestab/esfragmentos

tíí:i:i;:§::°r;:iiiu§;::::ii:i::Í:i:i:§;§;;iri:;;iííi§;§osií§Sií;u;Íi;!:Íjii;§:;§:í;§i{j;§;§iij¡;§§Íin§;§::i§;Íjí:;§jí;:Í:;:)

:í3!;::Ó;ieiíi;;;;ji;o!jo;::;d::i:ia:q:Tee::::y;g:!;;;j::q,:2j!eotábi::;:mg,u::oáa!ii¡t;áit;;::;aáp;a;:j::::o;pi:r:o;:;nr

Estatecnologíadetransformaciónhacontribuidoenlac/onaciónbasadaen

j,:anTá3sg:::sp`¡i;:,a#n,nte,piirg:,,os#,:c:douenne:ee:nt::ter::e:n,,if;::d::;fn:ur:::::,:ó:::::c:n::¡n:t!:ai:::á,,?,:agne;::ái::e:ncz?=aosadqeu:::§r:t:ems:tiebnoc,:£ntranagrupadosporeJemp,o,osque

Enlosañ%recientstÍasbibliotecasgenómicasquecontieneninsertosde

§:§::o:ff:cd;ó¡::r;;a:j;¡a:n;::ípÍÍ:e§í::p::a:§:F:;:í::;í§a;s:Í;:¡t:,;;a¡;pg::s:í:ges§::;,¡:yí::::¡::¡aí;í§;ft::s:,,;;;:sus característi.cas más notables.

21

vegetalesconstruidasenvectoresBACyBIBAC,consuscaracteris"prmcüWCuadro l Algunas bibl.iotecas genóm`cas vegmonocotiledóneas,D,dicot.iledóneas. Roferenclas

OrganlsmoSorgo•`¡.:'.:..`¡

Tamaño deTg:;,ooTdaeDMbM750 Tamaño8:Q.Tseodi°o Equival®ntosdelgenoma6x Tipos devector Aplicacione§Mapeofisicoycònación::#:;

Woo eta/.1994

1 57 kbpBeloBAC 11

de resistencia basado entec::o:pi:i:ii:óííefld:Íó;toiifto;::3;i:p.aeo)

Friiters ef aí.,1997Vinazeíg1a/,1998

D 2300-2700111 kb

2x pBeloEAC 11

LechugaLc!ucasaííva)

(a Manzarà

D 7509532250 1205x pBeòBAC ' 8¿;ngaec*:nd(eb:ess::tae::Lae'vTypmapst

Hamìlton ef a/. ,1999Dongefa/,1999(Malusxdormsiica)Tomate\::`:.::`::.;.`....`

D 1254632x BIBAC 2CLD04541 ffiracteris icomodegenecomMapeorisicogcnoClonación(ba

s do resistenciaoelVOyginDéticodei

A,godón(GossypiumhirsutLimCañadeazúcaí(Sacnanjmspp)D

120130kbPpBe\oBAC 11plnd`goBAC451 masada en el mapeo)ntíael

Tomkins eí aí.,1999LllaveFgkgyg°Ía''

M 30005600800-93045x del gen de reCionaciónpovemaliza `stencia co'zól1:Í:y:i::,eg::!ó:n"

Tngo (genoma A)m::::::gum)Papa(SO'anumtubemsum(G/ys,::amax)MD

1 1 5 kb155kb148kb56x37x

pBeloBAC 11BeloBAC`1

resistenciinvec:`£aB:':tDesarrol\odecobehiiramestud\ldentiíicaccontieneng

n en el área de laicamoiecuiarunabibliotecacon laásamp\iaparaelnomaSong eí a/„ 2000Tomk'inse(a/.,2000

D 111527 4x P BeloBAC 1' ode' 8,::edsepcLoá:vso:udee'ter\cla Yu el a/„ 2000

(£:%aeduam M 5ooo i06kb 6& P ~%•Amamp`m~detragmentosderestricciónpol`mórficos..RARErestricciónporendorùcleas®asistidopwReMvulasre

CONTINUACIÓN DEL CUADRO 1

OrganjsmoM Tamaño de Tamaño Equivalentes Tipo de

Aplicaciones Referencia0D 9enomahaploide(Mbp) promediodeinsorto del genóma vector

Petunia inflata D 1158 1364 76x B'BAC 2 Aislamiemo de grandes fragmentos de Mccubbin eí a/ ,ADN conteniendo el locus de auto-incomoatibilidad(S,\ 2000

Brassica napus D 1150 1 05 kb 7x PCLD04541 ldentificación de clonas ligadas al locusderestauracióndefertilidad Wu eí a/„ 2000

MelónD 450-500 118 kb 154x plndigoBAC 536

ldentificxición de clonas ligadas al locu8

Luo eí a/., 2001(Cucijmis melc» (Fom-2) que confiere resistencia almarchitamientodelmelóncausadaporFusanum

CítncoD 380 80kb 96x pBeloBAC 11

Construcx>ión de un contiguo de 1.2 Mb

Yang ef a/., 2001(PO"rus que incluye el locus del gen de latrifol'ala) resistencia contra el virus de la tristezadeloscítricos

Lotusiaponicus D 450 94kb 6x pCLD04541 Clonación basada en el mapeo yconstrucc(óndeunmapafisico Men eí a/ , 2001

BetabelD 758 125 kb 8x pBeloBAC 11

Análisis del genoma dol betabel a través Gindullis eí a/„ 2001(Beta vumans) de la caractenzación del centrómero delmutantePR01

Banano,

M 600 100 kb 9x plndlgoBAC-5

D®8arrollo do un mapa físlco a .ravós

Vilarinhos et a/„2002Calcu" 4 do BAC-FisH. o8ta t)lbllotoca sorá una(„usa horramlonta l mpoiunto dontro dol

acumlnsú| consorclo intomaclonal dol oonomad®Mu88

GlrasolD 3000 80kb 45x pBeloBAC n

ldentificación de clonas que comienen Gentzbittel eí a/(Helianthus genes putativos de receptores 2002annuus` transmembranales

Arroz M 420 130 kb 67x pCLD04541 Clonación basada en el mapeo de genes Tao eí a/„ 2002(Oryza sativa) de resistencia y mapeo fisico

Arabidospsis D 120 1 62 kb 115x BIEmc 2 Para facilitar la ldentlficación de genes a Chang eí a/ , 2003thal'ana trsvés de un escrutinio decx?mDlememaclón

ROsa D 500 1 02 kb 52x pBeloBAcl' Ensamble de "contiguous° de clones Kaufmann eí a/(Rosa rugosa) BAC que ext.enden al fidr7, el locus queconfiereresistenciaalamanchaneara 2003

VECTOR BINARIO TIPO COSMIDO pCLD04541

El vector pCLD04541 fue construido inseftando un fragmento de 9.1 kb quecontiene al sitio cos (para el empaquetamiento en lambda), el gen 35S-NPTll (qLieconfiere resistencia a kanamicina) y un sitio múltiple de restricción "dark Bluescript'(dBS), dentro del sitio de restricción Scal del plásmido pSLJ1711 (Jones eí a/ ,1992);éste a su vez fue derivado del plásmido pRK290 (Difta eí a/ ,1980), (figura 2).

El sitio múltiple de restricción dark Bluescript (dBS) contiene sitios paramúltiples enzimas, varios de estos son únicos en todo el plásmido, de tal manera quepermiten linearizar al vector para la introducción del ADN foráneo; además, este sitioproporciona un color azul intenso, diferente al color azul que normalmente sedesarrolla en colonias de E. co//. sobre 5-bromo4-cloro-3-indolid-beta-D-galactosido(X-Gal) e lsopropiltiogalactosido (lpTG), lo que contrasta mejor y permite distinguhmás fácilmente las clonas blancas positivas Esto último representa una gran ventajaen un vector binario de baja copia (5-8 copias por equivalente cromosómico). Como semuestra en la figura 2, el pRK290 contiene un gen bacteriano que confiere resistenciaa tetraciclina.

Para consultar sobre su secuencia y mapa de restricción, el número deaccesión es AF 184978 en el Genebank.

(28i2) sínj:5zpsrRI-K (69" (4¥oS`íg|(is|2),j

Figura 2. Vector tipo cósmido pCLD04541 de 29 kb. dBS, sitio múltiple de re§tricción del ''dark bluescript"; *

::,no:md,:,:ea:t¡:c;,,Ógne:ná=rsés=tséns::áoap:ertarae:,:,TnEaque,am,entoen,ambda,35S-NPT„ionfiereres,stenc,aa

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PRINCIPALES PASOS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECAGENÓMICACONINSERTOSDEADNDEALTOPESOMOLECULAR

La metodologi'a para la construcción de bibliotecas con insertos de ADN dealtopesomolecularhasjdosjgnificativamentemejoradadesdequelossi.stemasBAC,PAC y PBC fueron establecidos. En la figura 3 se muestra el procedjmientogeneralmente utiljzado en la cons{rucción de bibliotecas con insertos grandes (lamayoría de más de 100 kb), su clonación en bacterias y su ordenami.en{o (Zhang,2000). Este mjsmo esquema ha sido utilizado exitosamente en la construcci.Ón devarias bibliotecas BAC, PAC y BIBAC de plantas, ani.males, insectos ymicroorganismos, y consi.ste en los siguientes pasos.

a) Preparación del vector. El vector debe estar totalmente purificado y ser de lamás alta calidad (Íntegro y m de ADN bacteriano), se debe realizar unadjgestjón apropiada (nunca sobredi.gerido o poco digerjdo) y desfosforilarlocompletamente.

b) Extracción de núcleos. Se extraen núcleos de las hojas y estos son jncluidosen agarosa, donde posteriormente son someti.dos a di.gesti.ón con la enzimaprotei.nasa K (para di.gerir las proteínas nativas entre las que se encuentranlas de la membrana nuclear) y dejar libre al ADN genómico.

c) Djgestjón parcial del ADN genómico. La parte técnica más djfícil delprocedimiento es la obtención de fragmentos de ADN del tamaño requerido(100400kb),estosúltimossonobtenidosatravésdeunadjgestiónparcialdel

áepeNccFoenaa,¿%::sounmgo¿;c::ara;caor:tseaT,duot,,,::n¿ooseí:ocTruoef:reds:sadgear::ajp:pulsante (ECP).

d) Ligacióm La inserción de los fragmentos selecci.onados en el vector es otrode los pasos cruciales, debido a que se debe optimjzar la relacióninseho:vector.

e),Er3rbs,í:tremc:c,::tbr::tsefrá:::,c,,g:ná,:,cÉc:Óo7,d:o:,oe|aASDPNoS,:,cvá#,:::taemabs,F::::

el número total de clonas requeridas para tener completa la bibliotecadependen estrechamente de las células competentes utiljzadas. Una ligacióneficienti3 introduci.da en células competentes con una efici.encja de{ransformación menor a 10" colonias/Hg de ADN requerjrá, entre otros, de unmayor número de eventos de transformación, de un mayor número de cajasPetri, lo que al m encarecerá de manera impohante la construcción de labiblioteca. Por lo tanto, se recomienda utjlizar siempre células comercialescomo las DH10B de GibcoBRL que poseen una efi.ciencia de transformaciónmayor a 10`° colonias/Hg de ADN.

25

Objetivo general

Establecer las condiciones Óptimas para la construcción de la biblioteca

genómica del banano silvestre Musa acum/naía ssp burmannicoídes tipo Calcutta 4,utilizandounvectordetipoCromosomaBacterianoArtificialBinario(pCLD04541).

O bjetivos es pecificos

1.- Purificar el vector binario pCLD04541 a través de una lisis alcal.ina yutilizando dos gradientes de cloruro de cesio Linearizar al vector con la enzimaBamHl o Hi.ndlll y desfosforilarlo.

2.- Obtener núcleos de hojas de Calcutta 4, incluirlos en agarosa de bajo

punto de fusión y digerirlos con proteinasa K. El.iminar la proteinasa K lavando losplugs con PMSF

3.- Digerir parcialmente al ADN genómico con la enzima BamHl o Hi.ndlll paraobtener fragmentos entre 100 y 400 kb.

4.-Ligar los fragmentos seleccionados de 100 a 250 kb y de 250 a 400 kb alvector pCLD04541 (linearizado y desfosforilado) utilizando una relac.ión 1.2 o 14(inseno.vector) para cada zona (Fl o F2).

5.- Transformar células de E. co// DH10B (por electroporación) con lasl.igaciones realizadas, util.izando 1.5 o 2 LLl de cada una,.

6.- Caracterizar las ligaciones en cuanto al tamaño promedio de inserto y elnúmero de clonas sin inseho. Calcular con base en el tamaño promedio de .inseho elnúmero total de clonas que serían necesarias para tener representado 10x el genom.ahaploide de Calcutta 4 con un 99 % de probab.ilidad de encontrar cualqu.ier secuenciade interés.

E§trateg ia experimenta l

Se purificó, Imearizó y desfosforiló el vector pCLD04541, paralelamente seextrajeron núcleos de hojas ióvenes de Calcutta 4 crecidas en invernadero y seincluyeronenbloquesdeagarosadenominados"plugs".Éstosfueronexpuestosauna

;:,ruc:#edne,:,s:ánci:::ozleJ:asaa#,a:a::bne,a;nad,?Ds:uEt:,,ióD:,gcet::fT;S:,:u:ed:gae#:pulsante para separar los fragmentos originados en el rango de 100 a 400 kb, Ioscuales fueron ligados al vector pCLD04541 bajo dos relaciones molares de inserto:vector,1:2 y W Se transformaron, por electroporación células de E. coW (DH10B)con 1.5 o 2 Ltl de las ligaciones efectuadas; Ias células transformadas fueronplaqueadas en el medio selectivo LB con tetraciclina, X-Gal e lpTG. Las cé"recombinantes (blancas) fueron analizadas para estimar el tamaño promed.io delinserto y ei número de clonas sin inserto. Con esto se determinó que relación Tolarinserto:vector y que cantidad de l.igac.ión utilizada en la transformación fueron meiorespara obtener una mayor eficiencia de transformac.ión. Por último se estimó el númerototal de clonas que se requieren para tener una bibl.ioteca representativa de Calcutta4_

26

DELAQ4muTTA 4

em#bkdgeef"ug#oT3#%rrosa

L,neaá,::fco]gfno%nc,g:::+%,#,,w

Vector ljnearizado

Transformación de E. co//.

(cepa DH10B)

Ligación

(T4 'jgasa)

^

Plásmido coninserto

. Digestión parcial de ADN con- BamHl o Hindlll y selecci.Ón defragmento de 100400 kb utilizando

ECP

Células recombinantes en medio LBselectivo con Tetracicli`na, X-Gal e

lpTG

Ordenamiento al azar de cadabiblioteca

Figm2.Esciue"generalparalaconstruccióndelabiblio{ecadeCalcutta4utilizandoelvectorbinario

!:pooor:é::#:.::|:#b#ote®E,noordseen:eT:e:t:qsuee:esfi::Leoieqnuaeda,:sdec:ocnuaesm3ua€:np.ss::,::esne,gu=ndc::,::

?'-8inL::-ab::Poef:::r:-,3|np¿::i-;aé:as_aD?#:,áaó:,á::t,,gi,Gd,e,::rpnr:rp:,'t,:ga%::dmofores,Sdeffimpopu,sante,

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32

CAPITUL0 11

Preparacjón del vector binario pCLD04541

lNTRODUCCIÓN

ElprimervectorbinarioBACdesarrolladoparaserusadoenlatransformación

:::ae:t:j::fit:p:ieto:b:t:i:Ía!dn:due;'gga::nndèEaecTa::ti:acd:eíít,pp:::c;,,á::n,2,,-e2muc:oap;i;.,c:e#:o,,::

r:jjiri:::r::un`t::?ár::;,,tdee:va:aq:;e:s:|!,::;t:ae,:a3:tí":3:,:::n:sd:e::t:p:oa::n;:Zah:::iíro:o;o!r:cícéónfa?saor:

Comosemencionóenelcapítuloantenor,losplásmidosycósmidoscomolosBACsyPACs,puedenmantenerestablesgrandesinsertosdeADNforáneo,ademásdequepermitenunamejormanipulaciónypurificacióndelADN,yunamejorselección

;asrt::3:i4:,:,aá,et:;fo(:a:d::ó:naz:,iern::d:ut;v:ogsd8!,á,g::c5;p,#:ig;vR:,ien:t:;:dL:;myuot:f;:aii:;¡r:a::;:relaboracióndebibliotecascomplementariasyelgen/aczcomomarcadordeselecciónde células recombi.nantes.

La preparación del vect" de clonación BAC o BIBAC es uno de los puntosmás críticos duranb la construcción de bibliotecas genómicas y consiste en lapurificacióm la linearización (corte del vector con una enzima de restricción), y ladesfosforilaciónparaevitarlarecircularizacióndelvectordurantelaligación

MATERIALES Y MÉTODOS

ElvectorpCLD04541fuedonadoporelDrHong-BinZhangdeTexasA&MUniversity, College Station, TX

OblenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541

Texas AS&e#n,:v::s,;:tco:,%á%,,astraet%onTaTdxa en e, manua, de, Dr Zhang t2ooo, de

;éLSDeo4P:a4q|Tesaorgrnecmé:uá:ossdó:,,d:t:CBk,tdr:pt:naco,,;g?LT|eox:rárc::sá:r:::3:,:o5ng:i,VR:,8í10gm)conteniendo15Hgmdetetraciclina,60Hg/mlde5-bromo4-cloro-3-indolyl-

::,tt:v-:-ag3;a:!oá,:roaíte-%La,,:,n:cHhgéT;adr:,:s:t[::::áonga,:cct:,so,:,:Í,Fn|:)dyu::srec,Óe,

33

2-Seseleccionóumcoloniaazul,seinoculóen50mldemedioLBconteniendo15

53/rT`,ad:btteet:ac:;Ci`::,¥nsóec:,U:t`Vóa37C'Cenagitación(2"rpm)durantetodaianoche

3-Setomaron5mldelinóculo,seadicionarona500mldemedioLBcon15Wdetpert:::`rc:`rnoan:nsteot:r!t'Y,?roas3:c°uFt,::ag`tac`Óna250rmdurantetodaianochese

:#:ScPuuai;udeed%-%;°rasdecreclmlentodelcuwosemidioladensidadópticaa6oo

5-Seañadieron5mldeunasoluciónstockdecloramfenicol(34mg/mlenetanooporcadalitrodecuMysecontinuóincubandopor14horasa37°Cenagitacióna250rpm.

getr;feusguasr:enna,::2d°agpg::,,,ta5eT`To%4mi:epT°Estf:,r¿°rmenteseeliminoeisobrenadante

6.- Se alicuotaron las céiuias en i,iiiuu ù,,v. ._ __ _ _

7-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10rnma4°Cyseeliminóel

igobr:nMai:n::u:::ar:i3,,p2áahsMedr:STur:sP-eHng,,:pCHagipast,,,aen,om,de,aso"„

8-Se añadió a cada tubo 1 ml de una solución de lisozima (10 mg/ml, recién

3rae,gaá:gdea,,:Ta:opTrTd::::iu-,:Fe,spHEs8,myusye,#ánat:eumnp:Latgr:a::b:eunete,ap?,::zLl:sea eficiente.

:o7osdeeasñ38`)óyas=#e£:PÓ°g:r°anmdòd:,'taubs:`£`nónm'|cr::`édne,%raedpeazr:dhaa!?a2q¥ed:eNf%9mHóunasoluciónmuyviscosaytransparentePosteriormenteseincubóentiielopor5min

10 -Se adicionó 15 ml de la solución 111 fria (5 M de KOAc, pH 4 8-5 3) y se agitósuavemente por inversión para mezclar, formándose un precipitado blanco queconsiste en el ADN cromosomal bacteriano, el ARN de am peso molecular y elcompleio de potasio/SDS/proteína/membranas Finalmente se incubó en hielo por 5min.

11-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10mma4°Cysefftúe`sobrenadante de cada tubo a través de cuatm capas de "cheesecloth", el filtrado secolectó en tubos limpios.

12-Se añadieron 06 volúmenes de isopropanol a cada tubo y se incubó atemperatura ambiente por 10 min.

13 -Se centrifugó a 15 300 g (rotor JA" de Beckman) por 10 mm a temperaturaamb.iente y se eliminó el sobrenadante.

34

células en cinco tubos de centrifuga de 250 ml y se. _ __ _i:.ì.Á ai e^hrenadante

14 - Se invir(ieron los tubos para que todo el líquido escurriera, se enjuagaron las

ggáe:e,sroi:r':i-t#odsec3:c:t:::,,a:o7ro|oío:,n,eamt:ei:teurraatuarTba,;nbtF;n::,cseentdr::ggnaó,eisobrenadanteysede,Óst=:cá;.€=.óarsvti,,,=.

15.-Se disolvi.ó todo el ADN en 15 ml de TE.

PurificacióndelvectorpCLD04541(V4nmedian.egiadientedeclorurode cesio.

1 L Se vertú la solución de ADN plasmídico m ml) en una probeta graduada (de

t2o:a:8í6gíá,Seagregóío8gdec,orurodeces,osÓ„porcadam,deso„ten

2 -Se añadió 12 ml de una solución s(ock de bromuro de etidio (10 mg/mo a lasolucióndeADN/Cscl,semezclómuybien,sedeterminóelvolumendeestasolución(21"asícomoelpesodelaprobetacontodosestoscomponentesDNA+Cscl+EB

:;27|d2::,,,d:,'ópae:n:tr:::2::naár,P:aá:á;itp:;ini|epn:t:3ed:e!::osR:r3;:::tá:a:,e2d3;ugeD-N;¡.2¡8s5!,:gE;á,¥s;tig

g:,:Sc',::deensttuuvb°osdednetr:edn:;,fruagna9°oi¥,%eer:í°tuqbue:edsedBee:k5jaín6yg:g'eqsu:hgreapr::'t:o':glicerol hasta casj el tope de los tubos.

396og%o:,¡gv#pynor:o2oS2:e:¥É#ng£:o*:eánn„3fuu,:o%n¥aw"3gcdeent:\e"c5:axnL.tsvoe\d:a#cdke#:on:o=

4 - Se sacaron los tubos de la centrífuga con mucho ciiidado Se observaron dos

viea:n:::sg:diu:b;::r:araoig:un::a:ed:e:i=hraéfruá::i,:urg:::t::,:,t::f:::::Lipgrix:,i::r:bm3:i;:,á::::y:v,:,,alvectorcircularV41Seformótambiénunapastillarojaenelfondodeltubo,queconteni'a un comple/o de ARN y bromuro de etidjo

5 -Se inserffi una agup (número 21) en la pane superior del tubo para permim laentrada de am La colecta de la banda inferior, que correspondía al vector V41, sereahzóuki:Zban8°e:,::J:r'qnugea::nmaugyuJ,amg:'nnaunTee::;:rezadeipiásmido,fuenecesario

hacerunadoblepurificaciónengradienedeclorurodecesio,repitiendodelpaso1al5.

6 - Se recuperó la banda desaturado con agua (biencompletamente el bromurojncolora de ADN/Cscl.

_ _ _ ' -' 'v`,`-' , ' ' '',\J

d:9:[t:dq,:, ::tt:Ses:eha:tsaar:au)e ::Sobbtuqv:eunsae ::T:,:':

ADN, se lavó con una solución de alcohol-isoami.Iicoagl.tada antes de iiearia\ h --.--.-

35

::-,nu:#::::du:Óis:oa|Pás%o::irg!,:rgJ:aA!2:eN?(éia::ái:#Tpvo3r,e:Tneiniisoa:eo4:%ap:rs,e5amñ,:d,òy::

8 - Se eliminó el sobrenadante, se lavó la pastilla con etanol al 70% (dos veces),

gnÁrbf#g::dd:S:,:,ot2eí088(t:t3reJfÉ20Ftneapme:*t:asn!E%:e'rom#'|:e£:::iirapc:3th"aey|ADN plasmidico en iin gel de agarosa al 1%, utilizando como estándar el ADN delambda.

LinearizacióndelvectorpCLD04541conlaenzimaBamHlocon"M

La mezcla de reacción para linearizar con la enzima BamHl se realizó

adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaestéril,238hADNV41,100Lil(10Lig),amohiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Lil,espermidina40"20hBamm(10U/m2Wparaunvolumenfinalde400ulSeincubóa37°Cpor2horas,

go3S;eor¿ormenteSeleañadió1tilmU)másdeenzimaysedeióincubandooühoraLa mezcla de reacción para linearizar con la enzima H/ndm se rea%

adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaesté"240Lil,ADNV4t98Lil(5ug),amortiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Hl,espermidina40"20Lil,H/ndm(10U/m2hparaunvolumenfinalde400LilSeincubóa37ÓCpor2horas

posteriormenteseleañadió1W(10U)másdeenzimaysedeióincubandootrahora

near,zaE:r,f,=a:,ó%adme±,veocto=:,neHa,r:áf,ÍoseAa::c,oT:zc:andveo,:ema::,Ó¡4odoe,HT;ctdo:

a 37 OC_

fíc:::í¡;,te:i;e:it::iuH!,::3iM;;:g:rEÍ55n;r:fnumro,!,t:óp6!2;t;ioeiim::s;ri:du::i:c:e:n#:d:o:ri::5,lí;áíi;j:P::;d::r

10 mim se descaftó el sobrenadante y se lavó la pastilla con etano` al 70%, secentrifugó a 10 621 g por 5 min, se secó la pastilla y se disolvió en 400 H de H20bidestest.ilada estéril.

Desfosforilación del vectoT pCLD04541 linearizado.vector l.inear.izado estuvo48 5 ul; vector linearizado

constituida por los siguientes componentes.. H20 bidest., 4ü o H vt;uù, ,„ ..... ____400 Hl (35 HgJ+/"H y 5 Lig-BamHl ), amortiguador de reacción 10x de CIAP

(fosfatasaalcalinaintestinaldeternera)50LilylaenzimaCIAP*(BioLabsde05U/W1 5 Hl, para un volumen final de 500Lil Se incubó a 37 ac por 1 h La reacción se

ie%::nr:a::iai,:i:b:,e:T:,:,,::FPTrfoos5e#cuE:a8535ocH,pg:3%Dms,na)3:o/áeío5eonfr,àrd:*La enzima CIAP se diluyó a 0 5 U/Ltl con el amortiguador de dilución de

La mezcla de reacción para desfosforilar el. .__i_^ ^^n`n^nan+a<. H.O bidest.

lnvitrogen-

36

(5755H±o,sseea::t':';nsóe:e'natr,Tu::C:a,d7eg¿ega:C;°o:

§4§;;::ne;n;::::;:¡;rí¡:T¡p;;:;;u:¡u:É¡;¡:u¡:í;;;:b§:;an¡Ío;Í;s;:€:íír:,íÍ3:p:¡;j::#Í;:Ey:;Á::c:í:v;:¡f::p¡j§g;:;po::;

§o%:c:ett¡,;:á::ngd:e:,::e:::¡eísn§o,::::5Tr:Tc#na:c:ód:eeí§:¡:gcáar::Dmñ::d;¡áfi;¡,:eregne,2doeoaH:adr:s:2£

Prueba de desfosforilación

ídr::::t:i:ri:j:;|:n;;:Í;i::s;iícig:;oí;íi:jíñ¡:!c:::f;í;g;ÍÍ;d:;;eí::;:;::g:!zíii!Í:::!te:;uíjq:::r:í;::ie:;p;;,ig;¡:e:T:o::

RESULTADOS

ObtenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541

El vector pCLD045" fue aislado mediante el método de lisis alcalinaconvencional,mlanecesidaddeutilizarunKitSeutilizóunaaltaconcentraciónde

Í§Í:§rja¡jí;§jr:::,,::t:,;::::ríqíj,;:Ó:::&:§:ÍÍ:¡;;;dj:fi;uÍ§t§Ó;jr:::e:n;c;#Íj:#í:j;:§c;,e;;r¡;;;¡:E::;::c;;op:s;á:s:m;:í;concentracjón estimada fue de 200 ng/Hl.

Linearizaciónydesfosforilacióndelvectorpcld04541

desfosfo:,fadno:C::gaurí:n::faetifz:rétqoudeo%:rae*ara%:Í¿fLcacc::nfedne:,,P:áesT:db°e":t::zrázrafe°no:

§jníug:o:n:£:£c::::dan:tr:£::t§;3rí::n:r¡:::eípíoe::{::c:E:é:r:Ó::án:d:Sv;t3er:qc:í::s:::;ct;:dá:r:énotd:eEj,::;cáa::n:ta::,;

;f:i,;ií:ai;o;Íin:ií,icí:i;:iiiii!;a::::Í;É#í¡iís::;:ci:;;:::aréi!,s;:;a;i,,:iv:;i,i,;á::fi:g::fi;Í;a:i:a:;:;,

37

Se obtuvieron en total 4 Lig/200 ul, seconcentración estimada fue de 20 ng/LLl. Se oDtuviewH " `vu, . r3__

gíe3Fár:Lo,aoa„,:nu3á:,:addeo2%ou:y,asee:L#;:enH::odT„a;2geos:osEf:r,,Fag3rrFa3cBo::eTt:::,tá:•~ .--- J^ fna ha % nm se obtuvo 3.5 ug/100 Hl, se prepararon alicuotas de 20 Hl y

estimada fue de 35 ng/ul,se almacenaron a -20 ac.

ADN de lambda (ng)

5 10 15 20 25 V41

ADN de lambda (ng)

F"m3A)Cumestándardelambdaparaestimarlaconcenmmde`vestüpCLD045WWlineanzadoconlaenzimaBamHl(20ng/LLl)8)Curvaestandardelambdapmestim#laconcentracm

::lá:cfoonre:?uLe:o#=:a:?á,á,,,,no,oa:,:aTdBOEcgn5l:7eoni,,m3%:,,:md,:!::rlgáH,t,nE:::r:::r:::Smeu:;a::aert,áios

38

Prueba de desfosforilación

:§:,,fu:osaf:¡#%:g::e::;eás::e:§:¡:j:;;;;::rí:::rg{acíjr:a:Íí§o:rí[%nsníí:ít,rA:¡¡o:r;£e:a;;::bsd:Eí;;§;¡¡;±oce;b:c::n;g:;azules del 5 0/o.

DISCUSIÓN

Elgradodepurezadelplásmidoesunfactordeextremaimporianciaenlaconstrucciónde"bibliotecaBACoBIBAC,porloqueesnecesarioasegurarsedeobtenerunADNplasmídi.colomáspuroposi.ble.

t,poBACS:EiEArspoEnna:fc:,::r=t::sevsércat:er::asBÁ8,a,o,:cpuuar,:=::ó:n:::::,avne:tnor::rd=aenng#n;,e_b;aaram_€_ogg,adi,7_a82"Í:-#¿po£cÉíeu`:Éc:gvens€,B:#:`:?a~sp_¡tLr!ag3gs?S.:ees=sueÉggg?t::=Én

É:E:ZnboasJac::3:as,e,haa2o::apáaosepnormcoédrfí:iryeiuv:cutráf;ceanc,::arnet3uát,ansue:eprroobd,:m®a:=s

g::opre:dpué3,Gí3Aecsi:efi::omsahasnes,daonecí:as,tdr::d:t,y::tnodr:su:oenst:::en,ukT)eáoendoem::gáa;

$2rngv!éis:'3="e£t%gEortsa,sgñd`-g-cm*TÍ:#re=Ssyo,sapr:t:`¡Sgnt,dsoom,=gn?eii£,Te.y,:dkg:i:dgisÉOÉte:£=oaáíoí2001).

LapurificacióndelvectorpBeloBAC11(elmásutilizadodelosBACs)seha

j;#u;;n:::::'í::sae:do:::::a:r:ot#:ei;:m:3oíse::eseTe:c:t:?Tr:a:j:s;e:n:t?erg:::r:;sa:;reo:::oÁ::,f:ao3n::n:g:

iají!zÍ:,::i:Íia::i;Ír:i:nra;;jj::t:e;::::::;:Íi;¡;í:ngí!:!¡d;:t;;::ip;uñTíi:ir::iji;;::g;f;ííi::zíi;:u;:;:a:o:n:jí;ir;ií;,ciue utilizan los "ki.ts" antes menci.onados

pmr:ef:tr,a:LOTsueríf:;::ir:essm:;n:pA:ieá;goedTo:ir:g:::,:r::igd:eed;::rda::,u:rea,rio:s-2:;:,,:u:r,::don:t::eési:io:

bíi:::|síi;i;a;eiai;¡jaia:o;i;::;ia;i;:Íg:;q;u¡jí::f;iiu;Íi:::,::;is;i;:;ai#;ñíe;;o;;r;ií:jieiíi:;;:¡:::i;i:;:;;ii:;

39

2332g,r::,:?t2ifneg:,,oá:rso,deCes,o,Mekseme-ooo,Me-„,,2oo""

acentr,t:gsaecpóanra:Lóngrdaed`,ep|i:sm`dde°¥e4nts:de:dApe¥:rq°uT:bsr:oTi:rb;:tdeor:anc%'nac|roar:::3:

::iáoaic,qo::r3ed:e:eus::-abr:F:::n,ceae:,#)e:3ram:téóJ:s:b:enní:3nd:f:r::c::assgid:a::,::3

:Í:i:nit;:¡a;g;;:is;:.;:;i;é:::,v:q::i:í:si:tu;:;:d;:h:t,ííní:!i:ií!s¡t`:;;::i:iii;aí,;qi!:;::;tuui::;i:j:i:i:ii:í;r::jii!ji

::re::£:::aná,iebr:o:E?:uoreo::g:ft:;,:o|ihe:s:táaec:!,::d:oes:,:e:nrei:sá:ms:ñ:gc:u:i,soEnds!::ír::TnTd::::,r:e:a::tá;

á,:cg::L:::tá::t:13risdáemn;ero:i:,,oarr,r2odoel,Ces,oqueCont,eneCant,dadesSaturantes

Otro punto importante a considerar es la desfosforilación del vector V41

:¡:osir;;g;:ñ:;;n!;;::eisivrn;:;ij:a;::;s;;:r:ij:;:;:jza:;:!;iz;::;i:idiioi:ieoíii;:;i:i;:,::,;i:;;d;:o%;iii;iig!:;;:i:ñ;i:so!:iic(eznnz:+2a)'(8:bLdb?oaoFsU:t:rb2°oSo;rc0factoresesencialesparaiaoptimaactividaddeia

i:a:!;i:íi;i::I:::;Ííeo;:eii:::jíií,i:iy;;zÍ;Í::;¡;oí;Í:e;g:í¡;i!ije:1ji:;;:ijíiií::iíí::!:iii;jie;n:;ciií[iij:!u::;a

concentraciónX,esnecesariodiluirlaconelamortiguadordedilucióndelnvitrogemq#:gezcn:án,:,:nseee:t£:t,:::nc%Tpaosn::tnecséndt:a::¿:%rsmnaeg::a:,á:ptuíé;#ed:,,#£2e;ZdTam#

des,osfoEr:,::,Tner:ed:::::Tob,ndaenntt::(::iorná:;ob,:::::!::,te::i:seds,r:ná;::E:e8:do,o(Zhang, 2000).

40

Aunque la purificacíón del vector pCLD04541 siguiendo el método degradientes de densidad con cloruro de cesio requirió de destreza manual y de muchomás tiempo en comparación con otros métodos de purificación reportados en laliteratura, el resultado fue la obtención de ADN plasmídico altamente purificado,linearizado y desfosforilado el cual fue utilizado para establecer el protocolo para laconstrucción de la biblioteca genómica BIBAC de Calcufta 4.

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41

CAPITULO 111

Preparación de fragmentos de ADN de alto peso molecular

INTRODUCCIÓN

EI ADN genómico de alto peso molecular (megabase) debe ser de altacalidad (Iibre de fragmentos pequeños, de sales y de impurezas), esto es un requisitoesencial en la construcción de bibliotecas BAC o BIBAC EI ADN megabase es muysusceptible a la ruptura física durante su preparación, Ios métodos más utilizados para_ _ J_ _í'_.'__ .J---+-'-~ ^ J^

problema son.. el aislamientó de protoplastos de células vegetales o decélulas vegetales y animales, Ios cuales son incluidos en una matriz de

agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en foi.ma de bloques cúbicos (plugs) o enforma de microesferas. La agarosa en los plugs o en las microesferas actúa como unamatriz sólida y porosa, permitiendo la difusión de los diferentes reactivos para laliberación del ADN y la subsiguiente manipulación (Schwans y Cantor,1984)

En plantas, se ha utilizado más ampliamente el método de extraccìón denúcleos (Zhang ef a/.,1995), que consiste en el rompimiento físico de la pared celular,el aislamiento de los núcleos y su inclusión en agarosa formando plugs o enmicroesferas. Este método es simple, resulta en una baia contaminación por ADN decloroplasto y mitocondria, es económico y se puede aplicar a una gran variedad deespec.ies vegetales (Zhang eí a/., 1995). Posterior a la preparación de los plugs, esnecesario determinar la digestib.il.idad del ADN megabase, ya que la presencia de altascantidades de polisacáridos o fenoles (que en algunas especies vegetales seencuentran en grandes cantidades), pueden inhibir la acción de las enzimas derestricción. EI ADN genómico debe ser parcialmente digerido, para producirfragmentos del tamaño deseado para su clonación

Para la separación de los fragmentos grandes de ADN no se utiliza laelectroforesis convencional, ya que utiliza un campo eléctrico estático (Birren y Lai,1993). Bajo estas condiciones las moléculas se alargan y se alinean con el campo ymigran hacia el ánodo a través de un proceso llamado ``reptación"; esto significa que elADN se mueve como una serpiente, esto es, la ``cabeza" selecc.iona el camino y el"cuerpo'' le sigue Normalmente las moléculas más grandes de 20 kb no pueden

separarse entre sÍ, ya que tienen la misma área de sección-cruzada después de quese alinean en el campo eléctrico.

Se ha demostrado que después de remover el campo eléctrico, las moléculasde ADN alargadas se relajan, regresando a su estado no pehurbado. La proporción derelajación es dependiente de la longitud del ADN (Klotz y Zimm,1972). Esta propiedadse explotó para separar grandes moléculas de ADN cambios periódicos en laorientación del campo eléctrico forza a las moléculas de ADN a relajarse, al removerseel primer campo, y a elongarse para alinearse con el segundo campo.

42

evitar estenúcleos de

La efectividad de la interrupci.ón y cambio de dirección del campo se demostróa través de la separación de cromosomas de levadura, los cuales son de tamaño enkHobases (Schwarts y Cantor,1984) Esta electroforesis fue denominada electroforesisde campo pulsante (ECP) (PFGE-Pulse Field Gel Elec{roforesis). EI ADN debecambiar su conformaci.ón y reorientarse antes de que pueda mi.grar en la dirección delsegundo campo. El tiempo requerido para esta reorientación se correlaciona con lalongM de la molécula. Moléculas muy grandes de ADN se tomarán más tiempo pararealinearse, en comparación con las moléculas pequeñas, debido a la barrera físicaque presenta la matriz de agarosa

La selección de los fragmentos de ADN de tamaño determinado se efectúautilizando geles preparativos sometidos a electroforesis de campo pulsante. Se realizauna primera selección del ADN parcialmente digerido; si éste es muy concentrado,fragmentos pequeños de ADN co-migran con los grandes durante la electroforesis, yaque se quedan atrapados entre estos. Para enriquecer la preparación con fragmentosde ADN de gran tamaño y eliminar los de menor tamaño, se hace necesaria unasegunda selección de fragmentos, que permi.te aumentar el tamaño promedio de losinsertos en la biblioteca.

Finalmenle, Ios fragmentos seleccionados de ADN son recuperados del gelutilizando la enzima gelasa que degrada el gel, o a través de la electroeluciónutilizando tubos de diálisis (Strong eí a/.,1997). Este segundo método es ampliamenteutilizado; Ia electroelución se lleva a cabo u{ilizando electroforesis de campo pulsante

En el presente capítulo se describe la extracción de núcleos de Calcufta 4, elprocesamiento de los mismos (inclusión en agarosa de bajo punto de fusión),digestión de la membrana nuclear con proteinasa K y la inac{ivación de esta enzimacon fenilmelil sulfonH fluoride (PMSF), la estandarización de las condiciones Óptimaspara la digestión parcial con la enzima BamHl o H/.ndlll y la ob{ención de fragmentosde ADN de alto peso molecular (100 a 400 kb).

MATERIALES Y MÉTODOS

Matei.ial vegetal

Se utilizaron 45 plantas de Calcutta 4 micropropagadas /'n v/fno y adaptadas acondiciones de invernadero del CICY; se regaron dos veces por semana, sefenilizaron cada 15 días y se expusieron a la luz solar (77.63 Hmol a 168.6 Hmol).Cuando alcanzaron una altura promedio de 80 cm, aproximadamente dos meses en elinvernadero, las plantas reci.bieron un tratamiento de obscuridad por 72 horas, previoa la cosecha de las hojas, para promover la degradación del almidón acumulado, quees difícil de remover durante el procedimiento de exti.acción de núcleos, por lo quedismi`nuye la calidad del ADN. Posterior al tratamienlo de oscuridad se colectaron lasprimeras dos hojas jóvenes de cada planta, se pesaron en paquetes de 50 g cada unoy fueron inmediatamen{e congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C.

43

Extracción de núcleos de Calcutta 4

Se utilizaron 100 g de hojas congeladas a -80 °C. Este mater.ial se procesópara la obtención de los núcleos siguiendo la metodología reportada por Zhang ycolaboradores (1995).

1.-Se molieron 100 g de tejido congelado (en dos morteros) adicionando suficientenitrógeno líquido para evitar el descongelamiento del material, por aprox.imadamente20 min hasta la obtención de un polvo fino. lnmediatamente, éste es transferido a 1litro de la solución HB lx (anexo 1) conteniendo 2% de polivinilpirrolidona (PVP40)

(modificación), 0.15% de P-mercaptoetanol y 0.5% de Triton X-100; se dejó incubaren hielo con agitac.ión muy suave durante 10 min, se filtró con dos capas de"cheesecloth" y una capa de "miracloth" y se recuperó el filtrado en tubos de centrífuga

previamente enfriados y estériles de 250 ml.

2.- Se centrifugó el filtrado util.izando un rotor (Beckman) de ángulo fijo a 1 800 g por20 min a 4 ac, se eliminó el sobrenadante y se añadió, a cada tubo, 1 ml deamortiguador de lavado previamente enfriado (anexol). La pastilla se resuspendiósuavemente con ayuda de un pincel estéril previamente remojado en el amortiguadorde lavado frío.

3.- Se colectaron todas las resuspensiones nucleares en un solo tubo de 40 ml(oakridge) utilizando puntas cortadas; se llenó el tubo con amortiguador de lavado.

4.- Se centrifugó utilizando un rotor de ángulo móvil (sw.inging bucket centrifuge) a1,800 g por 15 min a 4 °C, posteriormente se decantó el sobrenadante y la pastilla seresuspendió en amortiguador de lavado con la ayuda del pincel; este paso se repitió 4veces. Esta etapa es muy impoftante porque minimiza la contaminación con organeloscomo mitocondria y cloroplasto.

5.- Después del Último lavado se resuspendió la pastilla de núcleos en una pequeñacantidad (aprox 1 ml en total) de amohiguador HB 1 x sin P-mercaptoetanol (anexo 1).Los núcleos se almacenaron en hielo hasta su incliisión en agarosa

lnclusión de los núcleos en agarosa (plugs) de bajo punto de fusión(LMP)

1 -Se prepararon 5 ml de agarosa de bajo punto de fusión (BRL USA) al 1%utilizando el amortiguador HB lx sin mercaptoetanol ni Triton X-100; Ia solución seprecalentó en baño María a 45 °C antes de usarse.

2.- La suspensión de núcleos se precalentó a 45 °C por 5 min; se mezclaronvolúmenes iguales de agarosa y núcleos agitando muy suavemente de vez en vez, seutilizó una punta coriada para pipetear la suspensión de núcleos.

3.- Se mantuvo la mezcla núcleos-agarosa en el baño a 45 °C mientras se llenabanlos pozos del molde, añadiendo 90 ul por pozo y utilizando la misma punta cortada, el

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molde se mantuvo sobre hjelo. Cuando la agarosa estuvo completamente solidificada,los moldes se transfirieron a un tubo falcon de 50 ml conteniendo 10 volúmenes delamortiguador de ljsjs (anexo 1).

4 - Se incubaron los plugs en el amortiguador de lisis por 48 h a 50 °C con agitacjónsuave; después de 24 h el amortiguador se cambió por uno nuevo

5.- Se lavaron los plugs con 0.5 M de EDTA (pH 9.0-9.3) durante una hora a 50 °C,posteriormente con 0.05 M de EDTA (pH 8) por una hora, en hi.elo, por úl{imo sealmacenaron en 0.05 M de EDTA, pH s a 4°C. En este paso los plugs conteniendo elADN megabase puede ser almacenado por un año a 4 °C sin que sufra unadegradación signjficativa.

Determinación de las condiciones óptimas para la digestión parcial delADN genómico con las enzima BamHl o #/.nd"

Se efectuaron 2 experimentos para determinar la concentración óptima de laenzima de restricción que generara fragmentos de ADN de al{o peso molecular en elrango de 100 a 400 kb. En el primero se utilizó la enzima BamHl y fue realizado en laUniversidad de Texas A & M. En el segundo se utilizó la enzjma Hí."H y fue realizadoen el CICY.

Previamente a la digesti.Ón, los plugs que habían estado almacenados en 0.05M de EDTA se depositaron en un tubo falcon de 50 ml y se lavaron (den{ro de lacampana de extraccíón) tres veces con 10 volúmenes de TE frío conteniendo 0.1 mMde fenilmetH sulfonil fluoride (PMSF-PhenylMethyl Sulfonyl Fluoride) para eliminar la

proteinasa K que afecta la acción de las enzimas de restricción. Cada lavado seincubó en hielo por una hora Posteriormente, se dieron otros tres lavados (también deunahoracadauno)conTEfríoeincubandoenhieloyfinalmentesealmacenóa4°C.

VerificacióndelaintegridaddelADNenlosplugsypruebadedigestión

Para determinar si el ADN no se encontraba degradado y con contaminantesque interfirieran en la digestión, se corrieron tres pruebas. 1) digestión con la enzimaBamHI, 2) digestión con H/.ndlH y 3) análisis de los plugs sin digerir. Para ello se utilizóelectroforesjs de campo pulsante.

La digestión parcial del ADN genómico, se efectuó utilizando dosamortiguadores; el amorti.guador de digestión 1 que conlenía todos los componentespara la digestión a excepción de la enzima de restricción y la albúmjna sérica bovi.na(BSA-Bovine Seric Albumin), en este amortiguador se incubaron los plugs por 30 min(dos veces) con la finaljdad de permftm que los componentes se difundieran dentro delos plugs. El amortiguador de digestión 2 contenia todos los componentes para ladigestión incluyendo la enzima y el BSA.

Para determinar las condiciones ópti.mas de diges{ión parcial o prueba dedigestión se utilizaron 2 plugs, mientras que para la djgestión parcial a gran escala se

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utilizaron 10 plugs; cada plug se seccionó en 24 paftes util.izando un filo estérw (figura4 A). Para la prueba de d.igestión parc.ial se utilizaron seis pedacitos de plug porreacción La mezcla de reacción se preparó como se describe a continuacióm lamezcla de reacción del amoftiguador para la d.igestión 1, por cada concentración deenzima a utilizar, fue de: 867 Hl, H20 bidest., 22.5 Hl (3.75 Lil x 6), ADN megabase; m

Hl de amortiguador 10x de la enzima BamHl (hecho en el lab.); 2 Hl, espermidina lM.,1LLl, DTT IM; como esta mezcla de digestión se utilizó para dos incubaciones (de 30min cada una), las cantidades se duplicaron.

Para el amoniguador de digest.ión 2, Ia mezcla de reacción para cadaconcentración fue la s.iguiente: 137 til, H20 bidest., 22.5 ul de ADN (6 pedacitos).,17

Ltl, amortiguador de la enzima BamHl o "H 10x; 0.34 Lil, espermidina lM, 017 Ltl,DTT I M., m Hl, BSA (10 mg/ml), 2-10 Lil de enzima BamHl o H/."H de 1 U/Lil o 0.1U/Li.l; el volumen final de reacción fue de aprox. 200 Hl de mezcla por tubo. Seensayaron concentraciones de 0, 0.3 U, 0.6 U 1.2 U, 2 4 U y 4 8 U de enzima BamH/incubando a 37 °C por s m.in. En el caso de la enzima H/" para la prueba dedigestión se ensayaron las concentraciones de 0, 0 3 U, 0.6 U,1.2 U y 2.4 U deenzima, como se había mencionado, los expermentos con H/.ndlH fueron realizadosen el CICY, por lo que se ensayaron 3 diferentes tiempos de incubación a 37 °C, loscuales fueron.12 min,16 min y 20 min.

Las reacciones efectuadas con diferentes concentraciones de BamHl o H/.ndHl(cada una con seis pedacitos de plug), se analizaron en un gel de agarosa al Wopreparado en O.5x de TBE (anexo 1). Para esto los pedacitos de plug se depositaronen un solo pozo y el marcador de lambda de 50 kb en los pozos extremos. Los pozosdel gel fueron sellados con 1% de agarosa. El gel se depositó en la base deelectíoforesis de un CHEF DR n (BioRad) utilizando como amortiguador de corridaTBE O.5x. Las condiciones de corrida fueron. pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h.

Al final de la corrida, el gel fue teñido con una solución de bromuro de etidiodurante 30 min y desteñido durante 30 min con agua destilada. Para llevar a cabo laprimera selección de fragmentos de alto peso molecular, se seleccionaron tresconcentraciones de enzima BamHl o de H/.ndlll, que formaban una zona decompresión bien definida entre 50 y 500 kb.

Procedimiento de digestión a gran escala.

Experimento realizado en la Universidad de Texas A & M

Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitoscorrespond.ientes a 10 plugs (240 pedacitos en total) en el amortiguador 1 durante 30min; éste se reemplazó con el mismo volumen de amortiguador 1 y se incubó por otros30 min Posteriormente se transfir.ieron seis pedacitos de plug en tubos de eppendoride 1.5 ml y se les añadió 170 Lil del amortiguador de digestión 2, adicionando al finalla concentración de enzima correspond.iente a cada tubo. Las concentracionesensayadas fuei.on de 0.1 U, 0.2 U y 0.3 U de BamHl y se utilizaron 80 pedacitos de

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plug por cada concentración en un total de 40 tubos. Todas las reacciones seincubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante s min.La reacción se detuvo ponjendo los tubos eppendori inmediatamente en hi.elo yadicionándo 1/10 del volumen de EDTA 0.5 M, pH S

Eme£imep!g±ea!±za9gj2!igQ)LY

Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitoscorrespondientes a 10 plugs (240 pedaci.tos en total) en el amortiguador 1 duran{e 30min;éstesereemplazóconelmismovolumendeamohiguador1yseincubóporotros30 min Posteriormente se transfirieron seis pedacitos de plug en lubos de eppendoff

gael.:5nrmlnxr?e.,!e^sa^ñ_adTg_:|o_uL5_e_,_?T"n.,gLéiir-ói€iiGtti*Ógnì:`fi.ic:or-ancdpovf,„,Enoan,la concen{ración de enzima correspondiente a cada tubo. Las concentracionesensayadas fueron de 0.2 U, 0.3 U y 0.4 U de H/'ndlH y se utilizaron 80 pedacitos deplug por cada concentración, en un total de 40 tubos. Todas las reacciones seincubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante 12min, 16 min y 20 min. La reacci.ón se detuvo poniendo los tubos eppendoriinmediatamenteenhieloyadicionando1/10delvolumendeEDTA(0.5M,pH8).

Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesjsde campo pulsante (ECP)

Prjmera se[ección de fragmentos

La digestión parci.al a gran escala utilizando 10 plugs se analizó en un gelpreparatM3 de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en esta ocasión, Ios dientes del peinefueron sellados dejando únicamente libres los pozos de los extremos para el marcadorde 50 kb. Cada pedacito de plug fue ordenado en fila india dentro del pozo, es deciruno después del otro, hasta depositar los 240 pedacitos de plugs, si era necesario seformaban "dos pisos" (Fi.gura 4 8). Posteriormen{e, el pozo se selló con la mi.smaagarosa al 1%. Las condiciones de comda para la primera selección fueron.amortiguador de corrida O.5x de TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s, 6 V/cm, 12.5°C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h.

Al final de la corrida el gel se colocó sobre hielo y se prosigui.ó a cortar losextremos del mismo, estos incluían al marcador ^ y unos 5 mm de los extremos delcarril conteniendo los plugs Estos bordes fueron teñidos con una solución de bromurode etidio durante 30 min, desteñidos con agua bidestilada duranle otros 30 min yfotografiados sobre un transiluminador de UV para localizar la zona comprendida entre100 y 400 kb. Con ayuda de una regla se localizó la regjón de i.nterés y se cortó el gelpreparativoparatenerlosfragmentosde100a250kb(F1)yde250a400kb(F2)

Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través deelectroelución (1)

Las membranas de diálisis de 14 KD (Gibco BRL) se cortaron de acuerdo alanchodelgel,selavaronprimeroconaguadestiladaestérilfríayluegoconO.5xde

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TBE,frío.ElgelcorrespondientealazonaF1,quecomprendialosfragmentosde100a 250 kb y el de la zona F2, que comprendía los fragmentos de 250 a 400 kb, fueron

13.75HI 11 1

1 \ 1 1

Plug

Piezas de plug ordenadas en elpozo del gel

M Gel preparativo

Figum 4. A) División en 24 pahes "iguales" de un plug conteniendo ADN de abpeso molecular; se utilizaron 6 partes para cada concentración en la mezcla dedigestión parc.ial. 8) Forma en que se ordenan en el gel preparatM (uno despuésdel otro) las 240 partes de los 10 plugs para la primera selección de fragmentos;M, marcador de lambda de 50 kb.

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ln{roducidos cada uno a los tubos de diáljsi.s, cerrando primero un extremo con un clip;se añadió por tubo de 400 a sOO til de TBE O.5x frío, y se cerró el otro extremo conotro clip para posteriormente colocarlos en la cámara de electroforesis del CHEF DR11 Las condiciones de corrida fueron: amohiguador de corrida O.5x de TBE, pulsoinicial 40 s, pulso final 40 s, 6 V/cm, 12.5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ánguio,tiempo de corrida 4 h, Después de las 4 h, Ios {ubos de diálisis fueron girados " yla corrida continuó por 50 s, para despegar el ADN eluído de la pared del tubo dediálisis.

Segunda selección de fragmentos

Se elaboró otro gel preparati.vo de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en es{eàc^ aa A.ìiJ:Á ^J ..^:__ _ ._ ___..caso se dividió el peine a la mitad y se sello cada mitad procurando dejarinHi`/;Ai.aJaÉ` ..h^ ^1 ^ --.. _ ..., ___ _ •---------....-- r/.`-`.uiciiiu`+ ut;/aiindividuales, uno al centro y uno a cada extremo. para depositar el marcadortres pozos

de 50 kb.

Después de deposi.tar el marcador, Ios pozos fueron sellados con la mismaagarosa al 1%. EI ADN electoeluído se recuperó de los tubos de diálisis con una puntacortada (todo debe estar en frío). EI ADN de cada zona, Fl y F2, fue puesto en tuboseppendoff de 1 5 ml. A cada fracción se le añadíó lm del volumen del amortiguadorde carga 10x (anexo 1), se agitó muy suavemente hasta homogenizar y se depositi5 algel preparatM3 prevjamente sumergido dentro de la cámara de electroforesis Lascondiciones para la segunda selección fueron.. amortíguador de corrida O.5x de TBE,pulso i.nicial 5 s, pulso final 5 s, 4 V/cm, 12 5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo,tiempo de corrida 6 h.

Al final de la corrida el gel fue puesto sobre hielo y se prosiguió a cortar losextremos del gel los cuales incluían al marcador y unos 5 mm de los extremos delcarril conteniendo las muestras de ADN. Estos extremos fueron teñidos con unasolución de bromuro de etkl® durante 30 min y luego fueron desteñidos con aguadurante 30 min, para fotografiarse sobre un transiluminador de UV y localizar laszonas Fl y F2. Con ayuda de una regla se localizaron y se cortó el gel preparativopara obtener la banda correspondiente a los fragmento de 100 a 250 kb y lacorrespondjente a los fragmentos de 250 a 400 kb.

Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través deelectroelución (2)

Se procedió exactamente de la misma manera como se mencionó en lapurificación de fragmentos de ADN de la primera selección, solamente que se debeañadh de 200 a 350 Hl de TBE O.5x al tubo de diáli.sis en lugar de 400 a 800 Hl comoocurre para la recuperación de la banda de primera selección.

Diálisi§

lnmediatamente después de la electroelución los tubos de diálisis con{eniendolos ADNs electroeluídos se dializaron en un m de O.5x TE (anexo 1) estérw y frío,durante 5 h a 4 °C ícuarto frín` ha.ianrh .-mhi^-.^ i` [`, j_ Ti-£_!_ .(cuarto frío), haciendo cambios de o.5x dé_ T-E-iríó' d-uTa-h'''e'cáává

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hora (4 veces).

Deteminación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2)

Se colectó la solución de ADN de cada tubo (midiendo el volumen) utilizandouna punta cortada y se depositó en tubos eppendori (1.5 ml) por fracción. Se tomaron5 Hl de cada fracción, se añadieron 2 Hl de amortiguador de carga (anexo 1) y seanal.izaron en un gel de agarosa al 1% en O.5x de TBE, empleando concentracionesconocidas del marcador lambda como estándar (5, 10, 15, 20, 25 y 30 ng). Lascondiciones de corrida fueron: 70 V, amortiguador 0 5x de TBE, 30 min de corrida.Posteriormente el gel se t.iñó con bromuro de etidio por 30 min y se destiñó por otros30 min. Finalmente se tomó una fotografía del ADN revelado con luz UV y sedeterminó su concentración en base a los estándares de concntraciones conocidas

RESULTADOS

Extracción de núcleos de Calcutta 4

Siguiendo el protocolo de Zhang y colaboradores (1995), se pudieron obteneraproximadamente 200 bloques de agarosa (plugs) conteniendo ADN de alto pesomolecular a partir de 100 g de tejido de hojas de plantas de invernadero expuestas aun tratamiento de oscuridad por 72 h.

Cabe mencionar que estos bloques tenían iina coloración café muy tenue ytransparente ( figura 5). Estos fueron almacenados a 4 °C.

Selección de fragmentos de ADN de 100 a 400 kb mediante electroforesisde campo pulsante (ECP)

ADN de alto peso molecular.

Para estimar la calidad del ADN de alto peso molecular se seleccionaron alazar 12 plugs (figura 6); un barrido significa una degradación del ADN y una zona decompresión significa que el ADN está Íntegro, en cuanto a la cantidad, Ia intensidad dela zona de compresión indicaria si es elevada, media o baja. Los resultados indicaronque el ADN aislado de Calcutta 4 estaba muy poco degradado y que la cantidadestimada del ADN de alto peso molecular era media EI ADN de alto peso molecularpudo ser digerido con la enzima BamHl y con la enzima Hi.MH (figura 7 y 8) Esteexperimento indicó que no contenía componentes que interfirieran con la digestióndel ADN, por lo que los plugs eran de muy buena cal.idad para el establec.imiento delas condiciones óptimas para la construcción de la biblioteca.

En Texas, por sugerencia del Dr Zhang se decidió trabajar con la enzimaBamHl para establecer un protocolo para la construcción de la biblioteca genómicaBIBAC para CalcLitta 4, debido a que el vector pCLD04541 había sido linearizado conesta misma enzima. En la figura 7 A, se observa que a una concentración de 0 3 U deBamHl se forma una zona de compresión entre 100 kb y 400 kb, mientras que amayores concentraciones, el ADN se sobre-digirió; por lo tanto, para realizar la

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primera selecci.ón de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se decidió utilizar0.3 U y dos concentraciones debajo de ésta.. 0.1 U y 0.2 U

En el CICY, se determinó la concentración óptima de enzima H/.ndlll y el

::Tcpeontróapct,'Ómnodgeo,:cúbá:,é:z:m:7yoac,2Enm,|adfi;grnr:uzac:¿ns:39soecw:eq,::m::::mejor zona de compresión entre 100 y 400 kb, por lo que se decidió trabajar con estaconcentración y dos concentraciones más, 0.2 U, y 0.4 U de H/.ndlll.

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Figura 5. Plugs de Calcutta 4 almacenados en 0 05 M de EDTA.

M Plugs M plugs

zona de compresion

Figura 6. Análisis del ADN de alto peso molecular de plugs de Calcu" 4 para estimar ia caiidad ycantidad Concliciones de ECP. agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h de corrida M, marcador de lambda de 50 kb Tinción cm bromuro deetidio

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A388kb -

97 kb _

Unidades de BamHI

M 0 03 061.224 4.8 0 M

Unidades de Hindlll

+r- +rJLy-12 min 16 mjn 20 min

:i3rmma7ó8:r#39eo8'gd:S:íóc:bpaa:íJ:'pdoer3DmYnd;É)t°®Pneia°eT:¡'icau£,rnefflT,baei¡g°m:T,T':g;,nAy)2Co°L!:de incubación a 37 °C Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h M, marcador de lambda de 50 kb Tinción con bromuro deetldio.

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Selección de fragmentos obtenidos con BamHI

Primer experimento. En la figura s se muestran los extremos del gel teñidocorrespondiente a la primera y única selección de fragmentos de ADN de Calcutta 4;las flechas indican los puntos de corte realizados en el gel antes de su tinción, pararecuperar las fracciones. La fracción F1 (100 kb a 250 kb), fue recuperada realizandodos cortes en el gel, uno a los 8.2 cm de la regla de referencia y el segundo corte a los7.6 cm; para recuperar la F2 (250 a 400 kb), se realizó un tercer corte a los 7.0 cm Elgrosor de cada sección de gel cortado fue de 6 mm máximo, ya que una cantidadmayor a ésta no entra en el tubo de diálisis. En la figura 9 se muestra el gel teñido conbromuro de etidio, expuesto a luz UV y ensamblado de nuevo para mostrar donde secoftaron las dos zonas. Los fragmentos obtenidos fueron directamente electroeluídosy dializados para posteriormente ligarlos al vector V41.

Segundo experimento En la figura 10 se muestran los extremos del gel teñido de laprimera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron paraaislar las fracc.iones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100 kb a 250 kb) fuerecuperada realizando dos cohes en el gel, uno a los 6 5 cm de la regla de referenciay el segundo a los 5 9 cm, esto es, 6 mm de grosor. La segunda fracción F2 serecuperó haciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 5.3 mm. Enla figura 11 se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, endonde se separaron las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugsde Calcutta 4.

En la figura 12 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segundaselección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir elADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida. Esta segundaselección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre losfragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (ladoizquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2 8 cm y a los 2.3 cm dela regla de referencia. En la figura 13 se muestra el gel reconstruido y el área dondese recuperaron las zonas (Fl y F2)

Selección de fragmentos obtenidos con H/.ndlll

Tercer experimento. En la figura 14 se muestran los extremos del gel teñido de laprimera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron paraaislar las fracciones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100kb a 250 kb) fuerecuperada realizando dc)s cohes en el gel, iino a los 9.2 cm de la regla de referencia

:lsegundoalos8.6cm,estoes,6mmdegrosor.LasegundafracciónF2serecuperóhaciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 8.0 cm. En la figura 15se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, en donde sesepararon las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugs de Calcufta4.

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Extremos del gel preparativoM1>M

388kb +

97kb +

Figura s Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentos deADN (prímer experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar lazona que contenga los fragmentos de ADN en{re 97 kb y 388 kb. Las flechas indican los corles que seefectuaron en la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés Concentración de BamHl01, 0 2 y 0 3 U/200 Lil de reacción. Condiciones de ECP: agarosa 1°/o, 0 5x TBE, pulso inicial 90 s ,

pulso final 90 s , 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h. de corrida; M, marcador de ^ de 50 kb

Digestión de ADN de alto peso molecular

388 kb -97 kb - Porción no

teñida

Figura 9 Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto aUV. Se muestra la porción no teñicla correspondiente a los fragmenlos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a400 kb) recuperados para la segunda selección La inten§idad del ADN de Calcutla 4 teñido conbromuro de etidio refleja la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de ^ de 50 kb

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ME¥emos del gel Prepa+ M

388kb +

97kb +

Figura 10 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentosde ADN (segundo experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizarla zona que contenga los fragmentos de ADN entre 97 KB y 388 kb. Concentración de BamHI 0 1, 0 2

y 0 3 U/200 iil de reacción Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final90 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (t)omba),16 h de corrida, M, marcador de lambda de 50 kb

Digestión de ADN de alto peso molecular

388kb -97kb -

Porción noteñida

Figura 11 Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto aUV. Se muestra la porción no leñida correspondien{e a los fragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a400 kb) recuperados para la segunda selección La intensidad del ADN de Calcutta 4 teñido conbromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de lambda de 50 kb

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Extremos del gel-M

485kb -

Figura 12 Alineación de los extremos del gel para la segunda seleccíón de fragmentos de ADN(segundo experimento), teñido con bromuro de elidio y examinado con luz UV para localizar la bandaque contenga los fragmentos de ADN Condiciones de ECP agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inícial 5 s,pulso final 5 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h de corrida; M, marcador de lambda de 50 kb

MF1

á:raebanda +

F2M

_ 48.5kb

Figum 13. Reconstrucción del.gel de la segunda selección. Teñido con bromuro de etidio yexaminado cx)n luz UV para localizar la banda Fl que corresponde a los fragmentos de 100 a 250 kb

y la banda F2 a la fracción de fragmentos de 250 a 400 kb M, marcador de lambda de 50 kb.

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Extremos del gel preparativo<CM

>MC

388_kb

97kb -

Figura 14 Alineación de los extremos del gel para la primera selección de fragmentos de ADN (tercerexperimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la zona quecontenga los fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb. Las flechas indican los cortes que se efectuaronen la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés. Concentración de H/.ncíIH 0 2, 0 3 y 0.4U/200 Hl de reacción. Condiciones de ECP. agarosa 1%, O.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s,6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida, C, control sin enzima, M, marcador de lambda de 50

DLgestión de ADN de alto peso molecular

388 kb -97kb _

PorcLón de gel noteñida

Figura 15. Reconstrucción del gel de la primera selección de los fragmentos de ADN. El gel fue teñidocon bromuro de etidio y expuesto a UV. Mostrando una porción no teñida correspondiente a losfragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) recuperados para la segunda selección Laintensidad del ADN de Calcufta 4 teñido con bromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los

plugs M, marcador de lambda de 50 kb.

58

En la figura 16 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segundaselección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir elADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida Esta segundaselección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre losfragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (ladoizquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2.7 cm y a los 2.1 cm dela regla de referencia.

Extremos del gel

Sa°nndeadeia{

48.5kb _

-=-----ií:É:---

Figura 16 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la segunda selección de fragmentosde ADN (tercer experimento) el gel fue teñído con bromuro de etidio y examinado con luz UV paralocalizar la banda que contenga los fragmentos de ADN La banda Fl corresponde a los fragmentosde 100 a 250 kb y la banda F2 corresponde a los fragmentos de 250 a 400 kb Condiciones de ECPagarosa 1°/o, O.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 5 s, 6 V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h decorrida; M, marcador de lambda de 50 kb.

Volumen de las fracciones recuperadas después de la diálisis

Primer experimento. Se recuperaron 770 L.I de la fracción Fl y 800 Ltl de lafracción F2.

Segundo experimento. Se recuperaron 280 Hl de la fracción Fl y 160 til de lafracción F2.

Tercer experimento. Se recuperaron 334 Lil de la fracción Fl y 294 Ltl de lafracción F2.

Determinación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2)

Primer experimento En la figura 17 se muestra el gel donde se determinó laconcentración de cada fracción proveniente de una sola selección de fragmentos,usando diferentes concentraciones estándar de ADN de lambda. Se estimaron 40 ngpara la fracción F1, pero como se depositaron 5 Hl en el pozo entonces la

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concentración fue de s ng/Hl; para la fracción F2 se estimaron 30 ng, como sedepositaron 5 Hl entonces la concentración fue de 6 ng/Lil.

Segundo experimento. En la figura 18 se muestra el gel donde se determinóla concentración de cada fracción obtenida en las dos selecciones de fragmentos, seestimó 15 ng para la fracción F1, como se depositaron 5 Lil en el pozo entonces setiivo una concentración de 3 ng/Hl. Para la fracción F2 se estimaron 5 ng, como sedepositaron 5 Ltl entonces se obtuvo 1 ng/Hl. Esta Última concentración fue muy bajapor lo que no es recomendable utilizarla De preferencia se recomiendanconcentraciones entre 2 a 10 ng/Lil, ya que son las más adecuadas para trabajar enlos siguientes pasos.

ADN Lambda

5ng 10ng 15ng 20ng 25ng FI F2

Figura 17. Gel para deteminar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 provenientes deprimera selección de fragmentos (primer experimento) La concentración se estimó utilizando mcurva estándar de lambda Condiciones de corrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corridaTinción con bromuro de etidio.

ADN de lambda

5ng 10ng 15ng 20ng 25ng 30ng FI F2

Figura 18. Gel para determinar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 de la segunda selecciónde fragmentos (segundo experimento) La concentración se estimó utilizando una curva estándar de lamt)da.Condiciones de cx)rrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corrida Tinción con bromuro de eticlio.

60

Tercer experimento. En la figura 19 se muestra el gel donde se determinó laconcentración de cada fracción obteni.da en las dos selecciones de fragmentos; seestimó 20 ng/LLl para la fracción Fl y para la fracción F2 se estimaron 15 ng/iil.

ADN de lambda

1

5 10 i5 2o FI F2 FI F2

Figura 19. Gel para deteminar la concentración de ADN de las fracciones Fl y F2 de la segundaselección de fragmentos (tercer experimento) La concentración se estimó utilizando una curvaestándar de lambda. Condiciones de corrida agarosa 1% en O.5x TBE, 70 V, 30 min de corridaTinción con bromuro de etidio.

DISCUSIÓN

El segundo paso crítico en la construcción de una biblioteca genómica es lapreparación del ADN de alto peso molecular parcialmente di.gerido (Frijters eí a/.,1997) Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para obtener suficiente cantidad yalta calidad de ADN.

Las hojas del banano contienen altos niveles de poljfenoles y polisacáridos(Vilarinhos eí a/., 2002) por lo que se modificó la preparación del material vegetal y delos núcleos. En el caso del materia vegetal las plantas de Calcutta 4 se sometieron aoscuridad durante 72 para reducir la cantidad de carbohidratos como se ha reportadopara Loíus /.aponí.cus (Men eí al., 2001) También el método de extracción fueligeramente modificado,. se añadió PVP40 al amohiguador de extracción de núcleosya que este componente reduce la co-precipitación de los polifenoles con los núcleos.Esta mi.sma modificación se realizó en la construcción de la biblioteca genómica demanzana debi.do al alto contenido de compuestos fenólicos en sus hojas (Vinazer eía/., 1998). A pesar de que los plugs luvieron una coloración ligeramente café,posi.blemente debido a la oxidación del remanente de polifenoles, no se afectó ladigestión del ADN de alto peso molecular.

Por otra parte, en la construcción de la biblioteca de sorgo se reportó quellevando a cabo una segunda selección de fragmentos se podían eliminar los insertosde tamaño pequeño (Woo eí a/.,1994) En la construccjón de la biblioteca de arroz seobservó que con una segunda selección de los fragmentos de ADN se incrementó, deun 60 % a un 80%, Ia proporción de insertos mayores que 120 kb (Zhang eí a/.,1996). Estos resultados indican que una doble selección de fragmentos de ADN

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resulta necesaria y crucial para incrementar el tamaño promedio de los insertos en labiblioteca a construir. La segunda selección permite eliminar fragmentos pequeños deADN y obtener insehos de tamaño más uniforme En los experimentos realizados enTexas con el ADN de Calcutta 4 se efectuó una primera selección de fragmentosdebido a que se estaba estableciendo el protocolo y era necesario saber si el sistemaestaba funcionando baio las condiciones indicadas por el Dr. Zhang. Posteriormentese realizó una segunda selección de fragmentosde ADN para aumentar el tamañopromedio de inserto. En los experimentos realizados en CICY se efectuó directamentela segunda selección de fragmentos a partir de la digestión con la enzima Hmdlll,debido a que ya se sabia que este sistema funcionaba en banano.

De los fragmentos obtenidos por la digestión con BamHl, se observó que en elprimer experimento, en donde se realizó la primera selección, la concentración deADN fue alta para F1 (8 ng/Hl ) y F2 (6 ng/ul) mientras que en el segundoexperimento, en donde se realizaron dos selecciones secuenciales, se obtuvo menosADN; 3 ng/Lil para F1, y 1 ng/Lil para F2.

En el tercer experimento (fragmentos obtenidos por la digestión con Hi.ndlll) se

pudo recuperar más ADN (20 ng/ Hl en Fl y 15 ng/Hl en F2,) debido a que en laelectroelución (2), se añadió solamente 200 Lil de TBE O.5x.

En cuanto a la selección del sitio (BamHl o H/.ndlll) para construir la biblioteca,cabe mencionar que, estudiando el centrómero del minicromosoma de Beía w/gar/.sse demostró que existe un sesgo en la representatividad de regiones centroméricas aldigerir el ADN de 8 w/gari.s con la enzima BamHl e hibridar con sondas específicaspara satélites que se encuentran en esta zona (pTS5) (Gindullis et al 2001). Se sugirióque la posible causa de esto podría ser que las secuencias repetidas de los satélitescentroméricos se encuentran relativamente conservados y homogéneos o que BamHlfue inhibida por la metilación de los satélites, puesto que una alta proporción decitosina metilada ha sido previamente encontrada en esta familia, en particular en elpTS5 (Heslop-Harrison ef a/., 1999). Por otra parte, se obtuvieron fragmentos derestricción que contenían al satélite pTS5 con un tamaño menor a 150 kb en lasdigestiones con EcoRl y H/.ndlll, y con BamHl se produjeron fragmentos de hasta 340kb. De estas er`zimas, H/.ndlll fue la única que produjo fragmentos de restricción en elrango de 120 kb cuando fueron hibridados con las dos sondas (pTS4.1 y pTS5). Estodemostró que es mejor construir una biblioteca con H/'nc/lll ya que producefragmentos de restricción que incluyen las regiones centroméricas, por lo tanto, hayuna mejor representativtdad del genoma en estudio (Gindullis eí a/., 2001 ).

En este capítulo se presentaron los resultados de las digestiones parciales delADN de Calcutta 4 con la enzima BamHl o con Híndlll, de tal forma que el protocolopara desarrollar la biblioteca con cualquiera de ellas está establecido, y en un futuropueden ser ambas construidas, complementándose una con otra y evitar se tengaalgún sesgo en la representatividad del genoma.

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63

caracterization of two r'ice bacterial artificial chromosome libraries from theparents of a permanent recombinant inbred mapping population. Molecularbreeding, 2, pp 11 -24

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CAPITULO IV

Obtención de clonas BIBAC

INTRODUCCIÓN

La efici'encia de clonación en términos de número y tamaño promedio deinserto de las clonas recombinantes, obtenidas utilizando el vector convencionalbinario pCLD04541 (V41) o los vectores BAC (pBeloBAC11) y BIBAC (p20818), variadramáticamente con las preparaciones de los fragmentos de ADN genómico (Wu eía/, 2000). En {odas las ligaciones en donde se han utilizado fragmentos de ADNseleccionados, el vector V41 siempre mos{ró una eficiencia de clonación simi.Iar a losvectores BAC y BIBAC. La eficienci.a de transformación de las diferentes ligacjonesobtenidas fueron de 100 a 10 000 colonias blancas por microlitro de ligación y el rangodel tamaño promedio de los insertos obtenidos osciló entre 50 y 150 kb (Wu ef a/.,2000). Estas diferencias reflejan la influencia del método de preparación del ADN dealto peso molecular, de la digestión parci.al, de la selección de fragmentos dedeterminado tamaño y de la concentración y calidad del ADN que se va a clonar.Dentro de estos factores, la digestión parcial del ADN resulta ser el paso más crítico ydifícil de controlar.

Una óptima digestión parcial debe producir en su mayoría fragmentos de ADNentre 200-500 kb, con una concentración de aproximadamente 1.5 ng/Hl. Cuando eltamaño de los fragmentos de ADN genómico son muy grandes (> 500 kb) o laconcentración es muy baja (< 0.1 ng/HI), se obtienen muy pocas clonasrecombinantes (Wu eí a/., 2000).

La cantidad de los fragmentos de ADN utilizados para llevar a cabo la ligaciónes tan importante como la calidad del mi.smo Se requiere de una gran cantidad deADN genómico parcialmente digerido (2L10 ng/HI) para compensar la baja eficienciade tran§formación que se obtiene al in{roducir el vector portando los insertos de grantamaño (Frijters eí a/., 1997). Un sol)recargo de ADN en el gel durante laelectroforesis, con la finalidad de incrementar la cantidad a recuperar del ADNparcialmente digerido, puede resultar en la co-migración de fragmentos pequeños deADN atrapados dentro de los grandes. Además, Ios fragmentos pequeños se liganpreferentemente al vector y las transformaciones con estos resultan más eficientes,por lo que la bi.blioteca resultaría con i.nsertos de tamaño promedio menor que 80 kb,lo cual no es recomendable porque implicaría elevar más los costos y el tiempo que seinvertiría en construir la bibli.oteca.

Con la finalidad de incrementar la cantidad y la calidad del ADN que se usarácomo inserto, se ha propuesto realizar una segunda selección de los fragmentosproducidos durante la digestión parcial Esto removerá los fragmentos pequeños deADN que queden atrapados entre los fragmentos grandes obtenidos en la primeraselección e incrementará el tamaño promedio de los inseftos clonados. Sin embargo,es importante mencionar que la eficiencia de transformación se reduce drásti.camente

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cuando se introduce el vector ponando los insenos obtenidos de la segunda selección(Woo ef a/.,1994). Para incrementar la eficiencia de transformación se han propuestorealizar diferentes modificaciones, como el llevar a cabo una pseudo segundaselección qiie consiste brevemente en la selección del ADN a través de tres etapas enel mismo gel. 1) se permite que el ADN de alto peso molecular depositado en lospozos migre al extremo superior del gel (1 cm después del pozo) para llevar a caboeste paso el gel se tuvo que invertir, 2) después que los fragmentos pequeños fueronsacados del gel, se invierte a su posición normal, esto es, a favor de la corrienteeléctrica, para que el ADN de alto peso molecular migre y regrese a su posición en elpozo, 3) finalmente se corre una electroforesis como cualquier otra segunda selecciónpara separar las fracciones de ADN en el rango de 150 a 500 kb. Esta metodologíafue efectiva para remover los fragmentos pequeños de ADN atrapados, sin afectar lacalidad ni la cantidad del ADN; este experimento fue llevado a cabo con ADN de ratón(Osoegawa et a/., 1998) Este mismo procedim.iento ha utilizado también con ADN de8. Wapus, obteniéndose resultados similares, esto es, incrementando el tamaño de losinsertos (Wu eí a/„ 2000).

La principal limitación en la construcción de una biblioteca altamenterepresentativa es el número de transformaciones requeridas para generar el númerode clonas necesarias. Si el propósito es el mapeo físico y la secuenciación del

completo, entonces es necesario tener una redundancia muy elevada delparaconstruircontiguos(contigs)completos(Osoegawaeía/.,1998).

genomagenoma

En la construcción de bibliotecas genómicas BAC o BIBAC, la cepa de E. co//'DHIOB es la más ampliamente utilizada debido a que posee las siguientesparticularidades.. a) una mutación en hsdRMS, endonucleasa endógena, que bloqueala restricción de ADN foráneo, b) una mutación que bloquea la restricción de ADNmetilado (mcrA, mcm, mc¢ y mm), c) una mutación que bloquea la recombinación(recA1 ) y d) permite incorporar ADN de gran tamaño (deoR).

En el presente capítulo se describen las ligaciones del vector pCLD04541con los fragmentos de ADN (Fl y F2) procedentes de la digestión con BamHl oH/.ndlll, la transformación de células de E. co// DH10B con el vector recombinante y elanálisis de las clonas para determinar el tamaño promedio de los insehos y el númerode clonas vacías (sin inserto) de cada ligación realizada.

MATERIALES Y METODOS

LIGACIÓN DEL VECTOR V41 CON LOS FRAGIVIENTOS DE ADNSELECCIONADOS EN LAS FRACCIONES FI Y F2

Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con BamHI (Texas)

Primer experimento

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Se procedió a llevar a cabo la ljgación del vector desfosforilado con losfragmentos correspondientes a las fracci.ones Fl y F2, empleando una razón molar de1 :2 (inseho:vector).

La mezcla de reacción para la fraccjón Fl consisti.Ó en. 695 HI H20 bidestilada,350 Hl de F1 (2 800 ng), 47 Hl de vec{or V41 (940 ng), 280 ul de amortiguador 5x y 28

Ltl de T4 ligasa de 1 U/ul (lnvitrogen), volumen final 1 400 ttl.La mezcla para F2 consistió en: 516 HI H20 bidest , 400 Hl de F2 (2 400 ng),

20 Hl de vector V41 (800 ng), 240 Hl de amortiguador 5x y 24 Hl de T4 Iigasa de 1 U/ul

(Invitrogen),. volumen final de 1 200 HISe realizó la mezcla de los componentes con extremo cujdado, esto es,

girando el tubo eppendorf en posición semi-horizontal. Posteriormente, se incubó a 16°C durante 8.5 h. Se realizó una prueba de ligación, para confirmar la actividad de la

T4 Iigasa, mezclando 1 ul de lambda/H/.ndlll con 10 Hl de la mezcla de ligación

procedente de la Fl o F2 (bajo las condiciones de incubación antes mencionadas).Es importante mencionar que el ADN (inserto) y el vector se deben pipetear

con puntas cortadas para evitar daño mecánico.

Segundo experimento

Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segundaselección (Fl y F2) en una razón molar 1:2 (inserto.vector).

La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 71. Ltl H20 bidestilada,140 Hl de F1 (420 ng), 7 Hl de vector V41 (140 ng), 56 Hl de buffer 5x y 6. Hl de T4ligasa de 1 U/Hl (Invitrogen); volumen final 280 ul.

La mezcla para F2 consistió en 0. HI H20, 160 Hl de F2 (160 ng), 2.7 Hl devector V41 (54 ng), 41 Hl de buffer 5x y 4 Hl de T4 li.gasa de 1 lJ/til (lnvitrogen),volumen final 207.7 HI

Los componentes se mezclaron como se descnbió previamente.

Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con H/.ndlll (CICY)

Tercer experimento

Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segundaselección (Fl y F2) en dos razones molares 1,.2 y 1 : 4 (inserto.vector).

Razón molar 1 :2La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de: 92| HI H20 bidestilada,

100 Hl de F1 (2 Hg),19 Hl de vec{or V41 (665 ng), 266.67 Hl de buffer 5x y 26.66 Hl deT4 ligasa de 1 U/Ltl (Invitrogen),. volumen final 1333.33 Hl.

La mezcla para F2 consistió en: 887.67 HI H20,133.33 ul de F2 (2 Hg),19 Lilde vector V41 (665 ng), 266.67. ul de buffer 5x y 26.66. Hl de T4 ligasa de 1 U/HI

(Invitrogen), volumen final 1333.33 Hl.Los componentes se mezclaron como se describió previamente.

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Razón molar 1 :4La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 902 L.l H20 bidestilada,

100 ul de F1 (2 Lig), 38 til de vector V41 (133 Lig), 266.67 ul de buffer 5x y 26.66 Lil deT4 ligasa de 1 U/Lil (lnvitrogen); volumen final 1333.33 LLl.

Los componentes se mezclaron como se describió previamente.

Transformación de E. co/i. (cepa DHIOB) con el ADN recombinante

Una alícuota de 1.5 HI Ó 2 Lil de la ligación se mezcló con 20 Lil de célulascompetentes de E co//. DH10B (BRL Gibco). La mezcla se depositó en celdas deelectroporación de 0.15 cm (distancia entre los electrodos). Las condiciones deelectroporación fueron voltaje de 350 V, capacitancia de 330 LiF, impedancia a nivelbajo, carga rápida, resistencia 4 Q. Una vez transformadas, Ias células DH10B serecuperaron adicionando 1 ml de medio SOC (anexo) e incubándolas a 37 °C enagitación (250 rpm) durante 50 min. Posteriormente, se plaqueó todo el mililitro encajas de petri de 15 cm, conteniendo medio LB, tetraciclina 15 Lig/ml, lpTG 12 Lig/ml yX-GAL 60 Lig/ml. Las cajas se incubaron a 37 °C durante 24-37 h. La eficiencia detransformación del lote de células de E co//. DH10B cuando se utilizó al plásmidocontrol pUC 19 fue de 9 x 109 cfu/ug.

Digestión con la enzima Wod y deteminación del tamaño promedio delinser(o

La extracción del ADN recombinante se realizó aplicando la técnica deminipreparación y siguiendo el protocolo reponado por Zhang (2000). El plásmidoaislado se digirió con la enzima Wofl con el fin de liberar los insehos. La mezcla dereacción utilizada en la digest.ión con la enzima Nofl fue de.12.75 Hl de ddH20, 5 Lil deADN (vector-inserto), 2 Hl amortiguador 10x NEB, 0 2 Hl de 10 mg/ml de BSA, 0.05 Hlde Wofl (10 U/Hl, BioLabs) volumen final 20 Hl. La reacción se incubó a 37 °C durante3 h, posteriormente (a cada muestra) se le añadió un décimo de volumen del colorantede carga 10x (anexo 1) y se incubó a 65 °C por 10 min para separar los extremospegajosos e inmediatamente se transfirieron a hielo Las reacciones se depositaron enun gel y se utilizó el equipo ECP para separar los fragmentc>s, productos de ladigestión Finalmente se analizó y se determinó el tamaño de los insenos comparandocon el marcador de lambda de 50 kb.

RESULTADOS

Prueba de ligación

La figura 20 corresponde a los resultados de la prueba de ligación para losfragmentos obtenidos en la primera selección (Fl y F2); en el control de ligación losfragmentos pequeños de lambda fueron ligados, esto es, no se observaron bandaslibres en los carriles 1 y 2, en comparación con el control sin ligasa (carril 1), indicandoque la ligasa T4 se encontraba en condiciones Óptimas de actividad.

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lambda/H/.ndlll FI F212

23kb _

Figura 20 Prueba de ligación empleando el ADN seleccionado en las fracciones F1 (100-250 kb) y F2 (250a 400 kb) Para esta prueba se mezcló ILtl de lambda/H/ndlll con 10 Ltl de reacción de ligación de F1 (carTil1 ) y F2 (carril 2). El análisis de la ligación se realizó empleando electroforesis estándar Las condiciones decorrida fueron: agarosa 1 %, 0.5x TBE, 70 V, 30 min de corrida. Tinción con bromuro de etidio.

Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en la§fracciones Fl y F2

lnsertos obtenidos en el primer experimento

El número de colonias blancas obtenidas en la ligación correspondiente a lafracción Fl fue de 230 y para la fracción F2 fue de 5 colonias blancas. Debido a queen la fracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió noanalizar esta fracción La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, nopudo ser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas.

La figura 21 A muestra el análisis de 37 clonas BIBAC de la ligación de lafracción F1. El tamaño promedio estimado de los insehos fue de 93 kb, se observaroninsenos entre 9 kb y 220 kb, agrupándose el 70.27 % entre 9 y 100 kb y sólo un 29 72% mayores que 100 kb, no se presentó ninguna clona sin inserto En la figura 21 8 semuestra la distribución de los insehos, la mayoría de estos se agrupó entre 9 kb y 80kb_

lnser(os obtenidos en el segundo experimento

El número de colonias blancas obtenidas en la ligación empleando la fracciónFl fue de 100 colonias y para la fracción F2 fue de 15 colonias. Debido a que en lafracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió no analizar

69

esta fracción. La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, no pudoser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas.

La figura 22 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC (de 36 analizadas) de laligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 125 kb; seobservaron insertos entre 70 kb y 175 kb, de estos el 28 °/o se agrupó entre 70 y 100kb y el 72 % con insertos mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En lafigura 22 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos seagruparon entre 101 kb y 120 kb.

37 Clonas seleccionadas al azar

1455kb +

97.Okb -

485kb -

V41-

v41_

V41-

9-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220

Fàngo de tamaño de los inseitos (kb)

Figura 21. A) Análisis por ECP de 37 clonas BIBAC procedentes del primer experimento. El asteriscoindica una inserto menor a 10 kb 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño Los plásmidosrecombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron.agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h decorrida. V41, vector pCLD04541 ; M, escalera de lambda Tinción con bromuro de etidio

70

M 19 muestras tomadas al azar

145.5kb +

97_Okb _

48.5kb _

V41_

V41 -v41_

70-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180

Fàngo del tamaño de los insertos (kb)

Figura 22. A) Análisis por ECP de 36 clonas BIBAC (solo 19 de éstas se muestran) procedentes delsegundo experimento 8) Distribución de los insenos de 36 clonas en base a su lamaño. Losplásrnidos fueron digeridos con la enzima ~ofl Las condiciones de la ECP fuercm agarosa 1%, 0 5xTBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalerade lambda; V41, vector pCLD04541. Tinción con bromuro de etidio.

71

lnsertos obtenidos en el tercer experimento

Para determinar que ligación proporcionaba el mayor número de insertos contamaños mayores que 100 kb y sin insertos menores que 10 kb, se estimó el tamañopromedio de inserto de 18 a 20 clonas de cada transformación, para despuésseleccionar la mejor ligación y evaluar aproximadamente 100 clonas.

Tran§formaciones

a) Razón molar 1:2,1.5 Hl de ligacjón para la transformación

El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando laligación de la fracción Fl fue de 187 colonias (61.5 %) y 117 colonias azules querepresentan el 38.4 %. Para la fracción F2 fue de 30 colonias. Estas últimas no seanalizaron por las razones antes mencionadas. La eficiencia de transformación cfu/ugde ADN obtenida para la fracción 1 fue de 1.05 x 105cfu/Hg (cfu= unidade de coloniasformadas).

La figura 23 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC de la ligación con lafracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 115 kb, se observaroninsenos entre 63 kb y 150 kb, agrupándose el 16.66 °/o por tamaños entre 60 y 100 kby el 83 33 % mayores que 100 kb; no hubo ninguna clona vacía. En la figura 23 8 semuestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre 101 kby 120 kb.

b) Razón molar 1 :4, 1.5 ul de ligación para la transformación

El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando laligación de la fracción Fl fue de 271 colonias (55.4 %) y 218 colonias azules querepresentan el 44.5 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformaciónobtenida para la fracción 1 fue de 1 30 x 105 cfu/Hg

La figura 24 A muestra el análisis de 20 clonas BIBAC de la ligación con lafracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 111.25 kb; se observaroninsehos entre 10 kb y 196 kb, agrupándose el 30 % entre 9 y 100 kb y el 70 °/omayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En la figura 24 8 se muestra ladistribución de los insertos , la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 140 kb.

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M 19 muestras tomadasal azar

145.5kb +

970kb -485kb -

V41_

v41_

V41_

=:..:. L.`l F60-80 81-100 101-120 121-140 141-160

Rango del tamaho de los insertos (kb)

Figum 23 A) Distribución por ECP de las 19 clonas BIBAC procedentes del experimento 3 a Elasterisco indica una clona en donde no se digirió bien el plásmido 8) Análisis de los insenos en basea su tamaño Los plásmidos fueron digeridos con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron:agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 ac, 80 rpm (bomba),16 h decorrida M, escalera de lambda de 50 kb, V41, vector pCLD04541 Tinción con bromuro de etidio

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20 muestras tomadas al azar M

145.5kb +97.0 kb

48_5 kb

--V41-

v41_

V41-

9-80 81-100 101-120 121-140 141-200

Rango del tamaño de los inserto§ (kb)

Figura 24. A) Análisis por ECP de 20 clonas BIBAC (clonas procedentes del tercer expe mento, 3b).Los asteriscos muestran las dos clonas con insertos de aproximadamente de 10 kb. 8) Distribuclón delos insertos en base a su tamaño. Los plásmidos fueron digerídos con la enzima ~oÍI Las condicionesde la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm(bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda de 50 kb, V41, vector pCLD04541 Tinción conbromuro de etidio.

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c) Razón molar 1 :4, 2 Lil de ljgación para la transformación

El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando laligación de la fracción Fl fue de 316 colonias (37.5 %) y 526 colonias azules querepresentan el 62.4 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformaciónobteni.da para la fracción 1 fue de 1.68 x 105 cfu/LLg

La figura 25 A muestra el análisis de 18 clonas BIBAC de la ligación con lafracción F1. El tamaño promedio estimado de inseho fue de 125.8 kb; se observaronjnsertos entre 10 kb y 172 kb, agrupándose el 11.11 % de estos por tamaños entre 9 y100 kb y el 88.88 % mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía En la figura25 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre101 kb y 140 kb.

En el cuadro 2 se resumen los resultados obtenidos en los tres experimentos.

En el tercer experimento, las ligaciones 3b y 3c (cuadro 2) presentaron unaeficiencia de transformación elevada, con respecto al número de colonias blancas,esto es, 271 y 316 clonas respectivamente; sin embargo estas ligaciones no seconsideran Óptimas para la construcción de la biblioteca por la presencia de insertospequeños de aproximadamente 9 kb . La ligación 3a (cuadro 2), proporcionó la mayorcantidad de insenos mayores que 100 kb; además no presentó insertos pequeños, porlo que se decidió evaluar mas clonas de esta transformación hasta completaraproximadamente 100 clonas.

Al analizar 94 clonas para completar un total de 112 clonas (94 + 18 = 112), eltamaño promedio de inserto aumento a 122.27 kb; no se encontró ninguna clona contamaño de inserto de 9 kb, como en los otros experimentos. El rango del tamaños delos insertos estuvo entre 27-190 kb y solo hubo una clona sin inserto; agrupándose el14.28 % de estos insertos entre 27 kb y 100 kb. De este grupo, se encontraron dosclonas, una con un inseho de 27 kb y la otra con un inseno de 43 kb (insertos máspequeños); el resto de clonas tuvieron insertos mayores que 60 kb; el 85.71 % de losinsenos fueror` mayores que 100 kb.

En la figura 26 A se muestra el análisis de 41 clonas de un total de 112analizadas y en la figura 26 8 se muestra la distribución de los inseitos en base a sutamaño de las 112 clonas.

Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tieneuna mayor frecuencia de sitios de reconocimiento Wofl, comparado con las plantasdicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de unabanda procedentes de los insertos.

El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Wofl, obteniéndose 5fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gelpor las condiciones de la corrida electroforética.

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18 muestrastomadas al azar M

145.5kb +

97.Okb -

48.5kb -

V41-

v41-

9-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180

Rango del tamaño de los insertos (kb)

Figura 25` A) Análisis por ECP de las 18 clonas BIBAC. 8) Distribución del tamaño de insenos de 18clonas pro®dentes del ter®r experimento, 3c El asterisco muestra un fragmento deaproximadamente 10 kb, la flecha señala una clona sin inserto` Los plásmidos fueron digericlos con laenzima ~oíl. Las condiciones de la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso finali5 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda; V41, vectorpCLD04541. Tinción con bromuro de etidio

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A

1455kb +

970kb +48.5kb -

v41+

V41+

v41+

M 41 clonas seleccionadas al azar M

27-80 81-100 101-120 121-140 141-200 201-250

Rango del tamaño do inserto (kb)

Figura 26. A) Análisis por ECP de 41 clonas BIBAC de un total de 112 analjzadas, procedentes delprimer experimento, 3a. 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño de las 112 clonas antesmencionadas` Los plásmidos recombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima WoÍI Lascondiciones de la ECP fueron. agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5°C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida. V41, vector pCLD04541, M, escalera de lambda. Tinción con

bromuro de etidio.

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Cuadro 2 Resumen de los resultados obten idos en los tres experimentos

Experimento Enzim a Razón molar 1a 2aEficiencia número número

número de

%deln§ertos %deinseftos%de Tamaño

de de de enel enel insertos promedio

de (inserto:vector) selección selección transfor- colonias colonlas colonias rango rango mayor de

restricclón maclóncfu/uq blancas azules analizadas 9- 1 00kb 60-100kb que100kb lnserto(kb)93125

1 BamHl 1 .2 S NO 230. ne 37 70.27 29.722.22

23a3b BamHlHindlll 11 2:2 SS SS1.01 x 10-

100,187* ne117 3618 - 27.7716.66 7.83.3311511125

H ind'll 1:4 S S 1 30 x 10' 27r 218 20 30 701258

3c H lndlll 1.4 S S 1 68 x 1 0' 316_ 526 18 11.11 8888 lllllIL-•1 5 pl de ligación

1 ul de ligac]ónno no evaluado

Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tieneuna mayor frecuencia de sitios de reconocimiento ~ofl, comparado con las plantasdicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de unabanda procedentes de los insertos.

El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Woíl, obteniéndose 5fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gelporque son fragmentos más pequeños.

Número de colonjas necesarias para tener una biblioteca representativa

El cálculo del número de colonias necesarias para construir una bibliotecarepresentativa se realiza utilizando la siguiente ecuación:

N= In (1-P)/ln (1-L/G)

Donde:

N= número de colonias en la bibliotecaP= probabilidad de tener cualquier secuencia de interésL= longitud promedio de inseíto en pares de basesG= longitud del genoma haploide en pares de bases.

Con esta fórmula, si se tiene un 99 % de representatividad, el número declonas calculadas representa 5 veces el genoma haploide.

Aplicando la ecuación con diferentes valores de tamaño promedio de inseno yconsiderando que el genoma haploide de Calcufta 4 es 600 Mpb tenemos

a) con tamaño promedio de fragmentos de 125 kb (2° expto.).

N= ln (1-.99)/ln (1-1.25xl05/6 xlo8) = 22 000 clonas

b) con tamaño promedio de fragmentos de 122 27 kb (3er. expto.)

N= ln (1-.99)/ln (1-1.2227 xl05/6 xl08) = 22 609 clonas

DISCUSIÓN

En el desarrollo del protocolo para la construcción de la biblioteca genómicade Calcufta 4 utilizando un vector binario (pCLD04541), fue necesario empezar conuna primera selección de fragmentos para establecer las condiciones debido a que nose tenía información previa para banano.

El tamañc> promedio de los insertos provenientes de la digestión con BamHIcuando se realizó únicamente la primera selección de los fragmentos de ADN, fue de93 kb, agrupándose el 72.2 % en el rango de 9 a sO kb; no estando satisfechos con la

79

distribución del tamaño de los insertos, se decidió no considerar esta ligación para laconstrucción de la biblioteca de Calcutta 4 (puesto que la mayoría de las bibliotecasreportadas presentan la mayoría de insertos con tamaños mayores que 100 kb)(Lijavetzky eí a/, 1999; Wu eí a/, 2000; Luo eí a/, 2001 ; Gindullis eí a/ 2001 ).

Con la finalidad de aumentar el tamaño de los insertos se prosiguió a realizaruna segunda selección de los fragmentos de ADN (Woo eí a/., 1994, Zhang eí a/.,1996). Cuando se realizaron dos selecciones consecutivas el tamaño promedjo deinserto incrementó a 125 kb, y el 72 % se agrupó entre 101 kb y 120 kb. Estadiferencia (93 kb y 125 kb) se debió a que en la primera selección los fragmentospequeños que quedaron atrapados entre los más grandes, fueron más fácilmenteligados al vector, reduciendo así el tamaño promedio de los insertos en las clonas. Enla segunda selección la mayoría de los fragmentos pequeños fueron eliminados, por loque el tamaño promedio de los insertos aumentó, haciendo que esta ligación fueraadecuada para la construcción de la biblioteca de Calcufta 4.

Es imponante remarcar que además de analizar el tamaño promedio deinserto en la muestra seleccionada, es necesario apoyar este dato con el análisis decómo se distribuyen los insenos en base a su tamaño para determinar la calidad de labibll'oteca.

Se ha reportado que la construcción de una biblioteca de una especie con unasola enzima de restricción puede traer problemas en la representatividad del genoma,por el sesgo que puede haber debido a la distribución no uniforme de los sitios derestricción (Wu eí a/., 2000, Tao eí a/., 2002; Yim eí a/ , 2002). Es por esto que sedecidió realizar otra ligación utilizando ADN genómico digerido con la enzima H/'ndlll.

Como ya se había mencionado antes, los experimentos utilizando a la enzimaHi.ndlll se realizaron en el CICY. De las dos ligaciones obtenidas, esto es, variando laproporción inserto:vector (1.2 o 1:4), la que presentó el mejor tamaño promedio deinseho y la mejor distribución de estos (la mayoría con insertos mayores que 100 kb)fue la ligación apli.cando la razón molar 1.2 (experimento 3a), de la cual

posteriormente se analizaron 94 clonas más para completar 112 clonas analizadas.Se pudo observar que el tamaño promedio de inserto incrementó de 115 kb a 122.27kb; aunque con este tamaño de muestra se obtuvieron dos insertos pequeños (27 y 43kb) la gran mayoría de los insertos se encontró por arriba de 100 kb.

Con respecto a la cantidad de ligación (1.5 Hl o 2 Hl) para la transformación debacterias por electroporaclón, cuando se utilizó la razón molar 1 :4 y se transformó con1.5 Lil o 2 Hl de ligación, el número de clonas recombinantes aumentó de 271 a 316repectivamente con respecto al experimento 3a (187 clonas) Sin embargo, sepresentaron fragmentos menores de 10 kb, lo cual es una desventaja desde el puntode vista económico y práctico, porque al tener insertos pequeños estos reducen eltamaño promedio de inserto de la ligación y se requerirán más clonas para cubrir nveces el tamaño haploide; esto trae como consecuencia un incremento en los costos yun incremento en el tiempo necesario para la construcción de la biblioteca. Esta es la

80

segunda razón por lo que la llgación del experimento 3a resultó ser la más adecuada,aunque se obtuvo un número de clonas recombinantes menor (187 colonias).

exper,m::togse:xeir:!'c::/H°gbsdeewÁDUNn):,:a¿:aFfi¿::nnc:+ae::ntr,:n:::roT::':nene|atitde::tj::(Fritjers eí a/.,1997; Wu eí a/., 2000; Vinazer eí a/.,1998). De aquí la importancia deiniciar con un ADN genómico de la más alta calidad y con una concentración

::::'uean:: é#| ::g (ext |a:to `cg,:,5u); áseí Á:i:? puá'::za:o:é;:'::a,e',eact;oa::mep,:ct,::tc:: ::transformación obtenida, no solamente por el tamaño de inserto clonado (mayoresque 100 kb), sino también por utilizar vectores de tamaño grandes (29 kb) como esnuestro caso.

Cabe mencionar que después de analizar el porcentaje de clonasrecombinantes (blancas) y no recombinantes (azules), se puede observar es que hayun gran porcentaje de clonas azules en cada transformación (del 40 al 60 %), estopodría indicar que el vector no se encontraba completamente linearizado, ya que laprueba de desfosforilación realizada indicaba que la desfosforilación fue buena (95 °/ode recombinantes). Estos resultados indican que habría que realizarle una purificaciónal vector linearizado y desfosforilado para eliminar aquel vector que se encuentrecircular, esto se puede llevar a cabo utilizando electroforesis convencional paraseparar el vector lineal del circular y posteriormente recuperar el vector linearizado porelectroelución.

Las dos ligaciones procedentes con los fragmentos de ADN de la segundaselección (una procedente de fragmentos obtenidos de la digestión con BamHl y laotra con H/.ndlll) resultaron ser mejores en cuanto al tamaño promedio de inser(o (125kb y 122.27 kb respectivamente), sj se cx)mparan con algunas de las bibliotecasconstruidas con el mismo vector (pCLD04541 ), como por ejemplo la de Goss)ip/.umh/.rsuíum, 120 kb (biblioteca-H/.ndlll, Dong eí a/., 1999); LoÍus /.apon/.cus, 94 kb(biblioteca-H/.ndlll, Men eí a/„ 2001) o Bras/.ca napus,105 kb (biblioteca-HÍ.nd]H, Wu eía/_, 2000).

Cuando se aisló la parte del gel en la región donde el tamaño de losfragmentos de ADN era muy alto (250400 kb o F2), el número de clonasrecombinante se redujo drásticamente. En la construcción de bibliotecas como la depapa, trigo, arroz y papaya (Song eí a/., 2000; Lijavetzky eí a/.,1999; Tao eí a/., 2002;Mng eí a/., 2001) se encontró también un bajo número de recombinantes en la zonacon fragmentos de ADN mayores que 250 kb. Se propuso que se puede deber a quelos insertos ligados son muy grandes y no fue posible transformar eficientemente E.co/i', aún siguiendo el método de electroporación. Se ha visto también que hay un altonúmero de clonas sin inserto en estos casos.

La región Fl del gel permite la construcción de bibliotecas con un tamañopromedio de inseno aceptable, que va de 100 kb a 250 kb. Sin embargo, lalocalización de esta región es variable, ya que con solo cambiar ligeramente laconcentración del ADN también cambia su movilidad durante la electroforesis, de tal

81

forma que el marcador de tamaño de ADN no proporciona una indicación exacta deltamaño de los fragmentos (Vinazer eí a/.,1998).

En el análisis de las clonas positivas digeridas con la enzima Wofl, es posibleobservar en el gel teñido con bromuro de etidio y expuesto a rayos UV, múltiplesbandas que pueden reflejar verdaderos sitios Wofl dentro de los insertos (figura 26 A)o una digestión incompleta con la enzima. Para diagnosticar si se debe a unadigestión incompleta es necesario comparar la intensidad de la o las bandas delinserto con respecto a las bandas del vector. Debido a que el rendimiento del ADNplasmídico aislado de diferentes clonas BIBAC es bastante comparativo, la intensidadde la fluorescencia en la banda del vector debe ser relativamente uniforme de unaclona a otra. Si no son visibles las bandas del vector en la zona esperada y seobserva una gran banda intensa, se debe asumir que la digestión fue incompleta; estabanda corresponderá al vector y al inseno unidos.

Las clonas BIBAC pueden no producir bandas visibles en el gel quecorrespondan al inserto después de su digestión con Woíl, debido a que el inserto sefragmenta en tamaños pequeños por lo que se salen durante la corrida o porque sondébilmente teñidos. Alternativamente pueden haber vectores sin insertos, los cualesfueron purificados de clonas que resultaron de una alteración en el sitio de clonacióndebido a contaminación con nucleasas, lo que usualmente ocasiona una deleción, ycomo consecuencia un desfasamiento del marco de lectura del gen reportero .

En resumen, con las dos ligaciones obtenidas se pueden construir dosbibliotecas BIBAC del banano silvestre Calcutta 4; una sería construida con la ligaciónde BamHl y la otra con H/.ndlll, permitiendo ser ambas complementarias, de tal formaque se tenga una mejor representatividad y cobertura del genoma. Se tendrían queobtener 22 000 clonas de la ligación con tamaño promedio de inseno de 125 kb y 22609 clonas de la ligación con tamaño promedio de inserto de 122.27 kb para tener unacobertura del genoma haploide de 10x. Estas serían las primeras bibliotecasconstruidas del banano silvestre Calcutta 4 con un vector binario con jnser(os listospara la transformación de plantas mediante A. Íumeraci'ens.

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Discusión general

El método utilizado para la construcción de las bibliotecas con insertostamaño grande (en promedio mayor que 100 kb) tiene que ser adaptado paraespecie bajo investigación. La construcción de bibliotecas BAC o BIBAC implicanesfuerzo que consume mucho tiempo y son muy demandantes. El éxito enobtención de este tipo de bibliotecas recae en la buena preparación del vector ycorrecta selección de los insertos de alto peso molecular (Lou eí a/., 2001 ).

Para optimizar la preparación del vector V41 se requirieron de dos pasossecuenciales de purificación con cloruro de cesio, en lugar de utilizar los métodos depurificación por columna que comúnmente son usados en la construcción de lamayoría de las bibliotecas BAC o BIBAC en plantas (Fritiers eí a/„ 1999; Mozo ef a/ ,1998; Wang eí a/.,1995 o Woo eí a/.,1994) o de combinar la purificación por columnacon la purificación utilizando gradiente de cloruro de cesio (Luo ef a/., 2001, Woo efa/.,1994; Fritjers eí a/.,1997) Siguiendo este procedimiento de doble purificación concloruro de cesio se obtuvo un vector puro, que posteriormente fue linearizado (conBamHl o H/.ndlll) y desfosforilado para ser utilizado en el establecimiento de lascondiciones óptimas de ligación para la construcción de la biblioteca de Calcutta 4.

Junto con la preparación del vector, Ia cantidad y calidad de ADN genómicodigerido parcialmente son los factores más críticos en la construcción de bibliotecasgenómicas con insertos de gran tamaño (Fritjers ef a/ ,1997; Zhang et al 1995)

Primeramente, el tratamiento que se le proporcione al material vegetal antesde la extracción de núcleos es muy importante, de esto depende en gran medida laobtención de ADN de alto peso molecular y de alta calidad. En el caso específico delbanano se siguieron las recomendaciones reportadas en la literatura para otrasespecies. Se utilizaron plantas /.n v/.Íro provenientes de invernadero sometidas a untratamiento de oscuridad total durante tres dias antes de la cosecha de las hojasjóvenes; esto último con la finalidad reducir el contenido de carbohidratos queinterfieren durante la extracción de los núcleos (Men eí a/,, 2001, Vilarinhos eí a/.,2002). En el caso de plantas , como el banano que contienen altos niveles depolifenoles en sus hojas se ha recomendado adicionar componentes al amortiguadorde extracción, como el PVP40, (Vinazer et al 1999) y/o ácido ascórbico (Kaufmann efa/., 2003), que permitan atrapar los compuestos polifenólicos

El método de obtención de ADN de alto peso molecular más frecuentementeutilizado es el de la extracción de núcleos reportado por Zhang y colaboradores(1995), debido a su versatilidad para el aislamiento de ADN de alto peso molecular dediferentes especies, a su sencillez, a su bajo costo y a su muy baja contaminación conADN cloroplástico y mitocondrial. Es por estas razones que para el banano se decidióutilizar este método de extracción de núcleos, modificado con la adición de PVP40 alamortiguador de extracción para reducir la cantidad de polifenoles libres y obtener unADN de alto peso molecular, fácil de digerir con las enzimas BamHl y H/'ndlll. De estasdos enzimas, la más comúnmente utilizada en la construcción de bibliotecas BAC o81 BAC es Hi.ndl 11.

84

Se obtuvieron fragmentos en la zona del gel que contenía los fragmentos deADN de 100 a 250 kb, de acuerdo a lo que se ha visto en el desarrollo de otrasbibliotecas, esto es, que solo una zona del gel proporciona fragmentos de ADN contamaño Óptimo de para ser clonados. Esta zona es detectada únicamente después derealizar las ligaciones de los fragmentos aislados de cada zona con el vector, y detransformar E. co// La ligación que proporcione el tamaño de insenos más elevadaserá la zona de fragmentos adecuada (Vinazer eí a/., 1998; Song eí a/., 2000; Fntjerseí a/.,1997; Lijavezky et al 1999; Mccubbin eí a/., 2000; Tao eí a/., 2002: Ming ef a/,2001). Se observó también que a partir de la primera selección los fragmentosobtenidos y clonados al vector fueron muy pequeños; en el caso del experimento uno,la mayoría de éstos se agruparon en el rango de 9 a 100 kb. En el resto de losexperimentos donde se realizó segunda selección de fragmentos, la mayoría seagrupó en el rango mayores que 100 kb Este dato confirma lo reportado en otrasbibliotecas donde se recomienda realizar sjempre una segunda selección de losfragmentos de ADN para eliminar todos los fragmentos pequeños que quedenatrapados con los fragmentos grandes durante la primera selección (Vinazer eí a/.,1998; Zhang eí a/.,1996; Woo ef a/.,1994).

Las ligaciones en donde se aplicó una razón molar inseno:vector 1:2 y seutilizó 1.5 L.l para la transformación resultaron ser mejores en cuanto al tamañopromedio de inserto, esto es 125 kb con BamHl y 122.27 kb con H/.ndlll, respecto aotras bibliotecas de otras especies donde se ha utilizado el vector pCLD04541, comoejemplos tenemos, las bibliotecas de Goss}ip/.um h/`ffiuníum,120 kb (biblioteca-H/.ndlll,Dong eí a/., 1999), L. /.apon/'cus, 94 kb (biblioteca-H/'ndlll, Men eí a/., 2001) o 8.napus,105 kb (biblioteca-H/'nc/lll, Wu eí a/„ 2000).

Se ha visto que el rastreo o el escrutinio con una misma sonda, en dosbibliotecas de la misma especie pero construidas con diferentes enzimas derestricción, rara vez identifica el mismo número de clonas. Como ejemplo se puedenmencionar los estudio realizados en las bibliotecas de lechuga (Fritjers ef a/ , 1997) ybetabel (Gindullis ef a/., 2001). Estas variaciones se pueden deber a diferentesfactores que incluyen: la heterogeneidad en las secuencias, las diferencias en loscontenidos de GC de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción(BamHl, H/`ndlll o EcoRl), su distribución no al azar y el muestreo de los fragmentos deADN durante la clonación Es por esta razón que se decidió utilizar dos enzimas derestricción diferentes para cortar el ADN genómico de Calcutta 4.

Las siguientes bibliotecas son algunos ejemplos en donde se han utilizadomás de una enzima de restricción para la construcción de bibliotecascomplementarias: melón (Luo eí a/., 2001), arroz (Tao eí a/., 2002), maíz (Yim eí a/.,2002), soya (Meksem eí a/ , 2000) y Arab/.c/ops/'s (Mozo ef a/.,1999).

Debido a los diferentes objetivos en la investigación de genomas compleios,se hace necesario tener bibliotecas, con insertos grandes, preparadas para latrasformación directa a plantas, ya que esto permitirá perfeccionar la clonación basadaen el mapeo, el análisis funcional de las secuencias genómicas, la ingeniería del gen,

85

agrupados de genes, QTLs (Quantitative Trait Loci) y en el mejoramiento molecular deplantas (Tao ef a/., 2002).

Con este trabajo se estableció por primera vez el protocolo para laconstrucción de dos bibliotecas del banano silvestre Calcutta 4, una biblioteca-BamHly otra biblioteca-Híndlll utilizando el vector pCLD04541, con tamaños promedios deinserto adecuados, comparado a otras bibliotecas construidas con el mismo vectorPara construir las bibliotecas físicamente, a partir de la transformación de E. co//' con lareacción de ligación, se tendrían que obtener 22 000 clonas con un tamaño promediode inserto de 125 kb y 22 609 clonas con un tamaño promedio de inserto de 122 27kb, para tener una cobertura del genoma haploide de 10x Estas serán las primerasbibliotecas construidas del banano silvestre Calcutta 4 en un vector binario, queestarán listas para la transformación de plantas mediado por A. íumeíac/.ens.

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88

CONCLUSIONES

o Se purificó el vector pCLD04541 utmzando una doble purificación congradiente de cloruro de cesio, resultando de la pureza necesaria para laligación con los fragmentos de ADN de Calcutta 4.

o Se obtuvo ADN de alto peso molecular a partir de núcleos de hojas deplantas de Calcma 4 procedentes de invernadero y tratadas en oscuridadpor 72 h. Este ADN fue de buena calidad y adecuado para ser digeridoparcialmente por enzimas de restricción como la BamHl o la H/.ndHI.

o Se estableció el protocolo para la obtención de fragmentos de ADNgenómico, en promedio mayores que 100 kb, siendo las ligaciones conuna relación molar inserto:vector de 1 :2, adecuadas para la construcciónde bibliotecas binarias en el banano Calcu«a 4.

89

PERSPECTIVAS

Los resultados presentados en este trabaio son la base y el primer pasodentro del proceso que involucra la construcción de la biblioteca BIBAC de Calcufta 4Para construir y caracterizar cada biblioteca faltan realizar los siguientes puntos:

• Realizar todas las transformaciones necesarias para tener el numero declonas que abarquen 10x el genoma haploide de Calcutta 4, tanto para laligación de los fragmentos procedentes de BamHl como con los de H/.ndlll.Realizar una copia maestra de cada biblioteca y varias copias para trabajar enla preparación de membranas de Nylon de alta densidad de cada una de lasbibliotecas construidas.

• Se hará el escrutinio de las membranas de cada biblioteca con sondas decloroplasto y mitocondria, con la finalidad de determinar la calidad de la mismaen cuanto a contaminación con ADN mitocondrial o cloroplástico; también seevaluará la presencia de algún gen de bajo número de copia para determinarla representatividad de la biblioteca.

• A mediano plazo, se podrían utilizar genes de resistencia análogos pararastrear su presencia y localizar las clonas dentro de la biblioteca que poseanestos genes, y confirmar la función de protección contra alguna(s) de esa(s)enfermedad(es).

Otras aplicaciones:

• Estudios básicos para la evaluación de la estabilidad del genoma receptor delmegalocus, la expresión de los transgenes en las plantas transgénicas, elefeéto sobre ei fenotipio, etc. Evaiuando ia transformación de banano ytambién de otras especies vegetales.Transformación con fragmentos que contengan familias génicas, grupos degenes involucrados en una misma vía metabólica, etc.

90

ANEXO

AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓ" (HB) 10X (1 litro

Reactivo

Trisma base

Cloruro de potasio

EDTA

Espermidjna-HCI

Espermina-HCI

Agua bidestilada

Cantidad

12-19

59.6 9

37.2 9

2.55 9

3.48 9

para 1 litro

Ajustar a un pH de 9.4-9.5 con NaoH. Almacenar a 4 °C.

AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓN (HB) 1X íl litro

Reactivo

HB 10 X

Sacarosa

Agua bidestilada

Almacenara 4°C.

Antes de usarlo añadirP-mercaptoetanol

Cantidad

100 ml

171.15 9

para 1 litro

1.5 ml

20 % DE TRITON X-100 EN AMORTIGUADOR HB I X Í100 ml

HB 10 X

Sacarosa

Triton X-100

Agua bidestilada

10ml

171.15 9

20ml

para 100 ml

91

Concentración final

0.1M

0.8M

0.1M

10mM

10mM


lx

0.5M

0.15 %

Almacenar a 4 °C

AMORTIGUADOR DE LAVADO (HB I X MAS 0 5 % de TRITON X-100),1 litro.

Reactivo

HB 10 X

Sacarosa

Triton X-100

(Stock de 20 %en HB I X)

Agua bidestilada

Almacenara 4°c.

Antes de usarlo añadirP-mercaptoetanol

Cantidad

100 ml

171.15 9

15ml

AMORTIGUADOR DE LISIS (1 L)

EDTA

Na lauril sarcosina

Antes de usarla se añadeProte'r" K

Medk) SOB (1 L\

Bacto triptona

Bacto extracto de levadura

NacI

KCI

Agua bkffilada

Aiustar el pH a 7 y esterilrir.

MEDIO SOC (1 L)

500 ml del stock 1 M

500 ml del stock 2 %

209

59

10 ml del stock 1 M

2.5 ml del stock 1 M

para 980 ml

Al medio SOB estéril se le añade los siguientes componentes:

92


lx

0.5M

0.5%

0.15 %

0.5 M (pH 9.0-9.3)

1%

0.2 mg/ml

2%

0_5%

10mM

2.5 mM

Mgs04/Mgc12a 10 ml del stock 2M 20 mM

Glucosab lo ml del stock 2M 20 mM

a. esterilizar por filtración 2 M de Mg++ (1 M Mgc12-H20 + 1 M Mgs04-7H20)b: esterilizar por filtraci.Ón un stock de 2 M de glucosa.

4MORTIGUADORDECARGA10XÍ500mL}

Reactivo

G'icerol

TBE 5 X

EDTA 0 5 M (pH 8)

20 % SDS

10 mg/ml deazul de bromofenol

Agua bidestilada

TE I X (1L|

Reactivo

Tris-HCI

EDTA

Agua bidestilada

Estermzarlo.

Cantidad

350 ml

25m1

20m'

5ml

Cantidad

10 ml de un stock 1 M

2 ml de un stock 0.5 M

cbp 1 L

93


35%

0.25 X

20mM

O . 2 0/o


10mM

1.0 mM



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MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS · Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Digestión con la enzima ~ofl y deteminación