1

BAB 1PENDAHULUAN

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan. Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan elektrokimia.

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.HPLC singkatan dari High Perfomance Liquid Chromatography atau High Pressure Liquid Chromatography, kadang-kadang HPLC diistilahkan LC (Liquid Chromatography) atau di Indonesia diistilahkan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).Dari sistem peralatannya, HPLC termasuk kromatografi kolom karena dipakai fase diam yang diisikan atau terpacking didalam kolom. Tetapi bila ditinjau dari pemisahannya, HPLC termasuk kromatografi adsorpsi atau kromatografi partisi atau asas lainnya tergantung jenis kolom yang dipakai dan analit yang ditentukan. Jadi tergantung pada butiran-butiran fasa diam yang ada didalam kolom apakah sebagai fasa padat murni atau disebut cairan.Perkembangan HPLC berawal dari proses pemisahan yang berazaskan absorpsi dari partisi ke arah yang lebih luas yaitu proses pemisahan yang berazaskan afinitas, filtrasi gel dan ion yang berpasangan, akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan didalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi.

Kromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998). Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner atau diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 1986). Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa. (Bassett et. all., 1994). Dengan kelebihan dari kromatografi cair bertekanan tinggi ini, maka disebut sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatografi). Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).Maksud dan tujuan analisis dengan HPLC hanya ada dua hal yaitu : didapatkannya pemisahan yang baik dan proses analisis barlangsung dalam waktu relatif singkat. Untuk tercapainya maksud dan tujuantersebut, maka diperlukan penataan yang betul-betul sudah dipersiapkan dan diperhitungkan antara lain: Dipilih pelarut pengembang atau pengembang campuran yangse suai untuk komponen yang dipisahkan. Berkaitan dengan pemilihan pelarut pengembang fasa mobil maka kolom yang dipakai juga harus diperhatikan.Detektor yang memadai Pengetahuan dasar HPLC yang baik serta pengalaman dan keterampilan kerja yang baik.Kalau analisa dengan HPLC dapat dilaksanakan dengan baik, maka dapat dikatakan derajatnya sama dengan GLC (Kromatografi Gas Cair) yang memakai kolom kapiler.HPLC memiliki beberapa keuntungan seperti : Dapat dilakukan pada suhu kamar. Kolom dan pelarut pengembang dapat digunakan berkali-kali Detector HPLC dapat divariasi dan banyak jenisnya Waktu analisis pada umumnya singkat Ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi Mudah dioperasikan secara otomatisRuang lingkup Penggunaan HPLC sering tumpang tindih dengan penggunaan Kromatografi Gas. Secara umum, biaya yang digunakan untuk keperluan HPLC lebih besar dari pada kromatografi gas, sehingga seolah-olah kromatografi gas akan lebih banyak dari pada HPLC. Biaya tersebut meliputi alat instrumentasi HPLC, kolom dan fasa geraknya, Namun masih banyak senyawa organik yang tidak stabil atau tidak dapat menguap bila dianalisa dengan kromatografi gas tanpa suatu modifikasi kimiawi sehingga HPLC merupakan pilihan pertama untuk senyawa organik yang tidak stabil atau tidak menguap seperti bahan-bahan farmasi, makanan/minuman, biokimia, kosmetik, serta bahan yang berhubungan dengan lingkungan akan lebih sesuai dipisahkan menggunakan HPLC.

BAB 2DASAR TEORI

2.1. Teori Umum Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam dan fase gerak. Teknik kromatografi telah berkembang dan telah digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik komponen organik maupun komponen anorganik. Berdasarkan jenis fasa gerak yang digunakan, ada 2 (dua) klasifikasi dalam kromatografi, yaitu ; kromatografi gas dan kromatografi cairan. Pada kromatografi gas fasa geraknya berupa gas, sedangkan pada kromatografi cairan, fasa geraknya berbentuk cairan. Pada kromatografi gas, fasa diam ditempatkan di dalam sebuah kolom. Fasa diam ini dapat berupa suatu padatan atau suatu cairan yang didukung oleh butir-butir halus zat pendukung. Berdasarkan fasa diam yang berbeda, teknik ini dikenal sebagai kromatografi gas padat (Gas Solid Chromatography/GSC) dan kromatografi gas-cair ( Gas Liquid Chromatography/GLC).HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. Teknik kromatografi cairan dengan fasa diam di dalam kolom dikenal sebagai kromatografi cair-padat (Liquid Solid Chromatography/LSC) dan kromatografi cair-cair (Liquid Liquid Chromatography/LLC), tergantung dari fasa diamnya, suatu padatan atau cairan. Berdasarkan interaksi kromatografi dikenal kromatografi adsorpsi, partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi permeasi gel.Adapun klasifikasi teknik kromatografi dapat dilihat pada tabel berikut :

2.2. Cara Kerja HPLC Proses pemisahan dalam kromatografi didasarkan pada perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Untuk mencapai tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detektor yang memadai. Pelarut yang digunakan dialirkan terus menerus secara kontinyu ke dalam pompa. Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada beberapa faktor, antara lain waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, dan resolusi. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. (Ahmad dan Suherman, 1995). Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detektor sebagai koordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel (Ahmad dan Suherman, 1991).

Gambar 2 : Bagan kerja HPLC

2.3. Wadah Fase Gerak pada HPLC Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi. Adanya pengotor dapat mengganggu sistem kromatografi. (Gandjar dan Rohman, 2007)

2.4. Fase Gerak pada HPLC Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk sampel normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. (Gandjar dann Rohman, 2007)

2.5. Pompa pada HPLC Persyaratan untuk pompa kromatografi cair meliputi generasi tekanan sampai 6000 psi (lb / in') atau 414 bar, bebas pulsa output, tingkat aliran berkisar dari 0,1 sampai 10 Mumin, reprodusibilitas aliran relatif baik, dan resistensi terhadap korosi oleh berbagai pelarut. Tingginya tekanan dihasilkan oleh pompa kromatografi cair tidak menimbulkan suatu ledakan. Dua jenis utama dari pompa digunakan dalam LC, yaitu displacement pump dan reciprocating pump. Pompa reciprocating digunakan dalam hampir semua modern kromatogram komersial. (Skoog, 1998) Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang harus inert terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. (Gandjar dan Rohman, 2007)

2.6. Penyuntikan Sampel pada HPLC Ketepatan pengukuran kromatografi cair ditunjukkan dengan reprodusibilitas pengepakan kolom. Terlebih lagi dengan adanya pengaruh injeksi sampel. Dengan demikian, volume sampel harus sangat kecil. Selanjutnya, akan lebih mudah untuk mampu mengukur sampel tanpa adanya penurunan tekanan. Metode yang paling banyak digunakan pengenalan sampel di LC berdasarkan sampling loop. Perangkat ini seringkali merupakan bagian integral dari kromatografi cair dan menyediakan loop untuk saling bertukar antara ukuran sampel dari 1 flL sampai 100 flL atau lebih. Loop sampling jenis ini memungkinkan penilaian sampel pada tekanan sampai 7000 psi dengan standar relatif deviasi persepuluh persen. Kebanyakan kromatograf saat ini dijual dengan autoinjectors. (Skoog, 1998) Pada saat pengisian sampel, sampel digelontorkan melalui keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontorkan sampel ke kolom. Presisi penyuntikan ditentukan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT. (Gandjar dan Rohman, 2007)

2.7. Kolom pada HPLC Kolom kromatografi cair biasanya dibangun dari yang halus atau stainless steel. Kolom HPLC kadang-kadang dibuat dari tabung gelas dan tabung polimer, seperti polyetheretherketone. Selain dilapisi baja, kolom juga dapat dilapisi stainless. Ratusan kolom dikemas berbeda dalam ukuran dan pengepakan tersedia. Biayanya berukuran standar. Kolom yang tidak spesifik berkisar dari $ 200 sampai lebih dari $ 500. Kolom khusus, seperti kolom kiral, dapat biaya lebih dari $ 1000. a. Analytical Cholumn Kolom kromatografi cair berkisar dari 5 sampai 25 cm. Umumnya digunakan kolom yang lurus. Diameter dalam kolom analitis sering antara 3-5 mm, ukuran partikel paling umum dari kemasan adalah 3 atau 5 FLM. Kolom yang paling umum memiliki adalah 10 atau panjang 15 cm, 4,6 mm diameter dalam, dan dikemas dengan 5-FLM partikel. Kolom jenis ini menghasilkan 40.000 untuk 70.000 lempeng / meter (biasanya sekitar 10.000 lempeng / kolom). Pada 1980-an, tersedia microcolumns dengan diameter dalam 1 sampai 4,6 mm dan panjang 3-7,5 cm. Kolom ini, yang dikemas dalam 3 atau 5 FLM partikel, mencapai sebanyak 100.000 lempeng / m dan memiliki keunggulan kecepatan dan membutuhkan pelarut yang minimal. Properti ini sangat penting karena pelarut dengan kemurnian tinggi diperlukan untuk LC. Selain itu, pelarut umumnya memiliki harga mahal sehingga dengan LC ini pelarut dapat digunakan kembali tanpa dibuang-buang. b. Guard Cholumn Kolom penjaga diperkenalkan sebelum kolom analitis untuk meningkatkan kerja analisis kolom karena tidak hanya menghilangkan partikel dan kontaminan dari pelarut tetapi juga komponen sampel yang terikat ireversibel pada fase diam. Susunan kemasan kolom penjaga harus serupa dengan yang ada pada kolom analitis, partikel ukuran biasanya lebih besar. Ketika kolom penjaga telah terkontaminasi, kolom ini dapat dikemas ulang atau dibuang dan diganti dengan jenis yang sama. c. Pengontrolan Suhu Kolom Diharapkan kolom memiliki suhu yang konstan. Dimensi kolom antara lain 4 cm, 0,4 cm diameter; kemasan: 3-FLM spherisorb; fase gerak: etil asetat 4,1% pada n-heksana. Senyawanya; (1) p-xilena, (2) anisol, (3) benzil asetat, (4) phthalate dioktil, (5) phthalate dipentyl, (6) ftalat dibutil, (7) dipropyl phthalate, (8) diethyiftalat. Kolom juga dilengkapi dengan jaket air untuk memberikan kontrol suhu tepat. Banyak kromatograf mempertimbangkan kontrol suhu sebagai suatu hal yang penting untuk pemisahan (280C). Silika sejauh ini merupakan kemasan yang paling umum digunakan dalam LC. (Skoog, 1998) 2.8. Fase Diam pada HPLC Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).

2.9. Detektor HPLC Tidak ada detektor untuk LC yang berlaku universal yang berlaku seperti ionisasi nyala dan detektor konduktivitas termal untuk kromatografi gas. Pada sisi lain, detektor LC dalam instrumen analisis disesuaikan dengan aliran sel untuk mengukur konsentrasi zat terlarut rendah. Tantangan utama dalam pengembangan LC telah beradaptasi dan meningkatkan perangkat tersebut. a. Karakteristik Detektor Ideal. Detektor ideal untuk LC tidak perlu responsif dalam berbagai rentang suhu. Sebuah HPLC detektor harus memiliki volume internal minimal untuk mengurangi zona yang luas dan harus kompatibel dengan aliran cairan. Jenis detektor kromatografi cair terdiri dari dua jenis. Bulk-properti detektor menanggapi fase gerak massal, seperti indeks bias, konstanta dielektrik, atau kepadatan, yang dimodulasi oleh kehadiran zat terlarut. Sebaliknya, solut-properti detektor merespon beberapa properti dari zat terlarut, seperti absorbansi UV, fluoresensi, atau difusi. Detektor DAD yang paling banyak digunakan untuk LC didasarkan pada penyerapan ultraviolet atau radiasi visibel. (Skoog, 1998)

2.10. Profil KromatogramIdealnya profil setiap kromatogram HPLC merupakan suatu garis tegak lurus bagi masing-masing analit (Gambar 3.a). Namun keadaan demikian tidak akan dijumpai pada pelaksanaan analisis dengan HPLC. Kromatogram HPLC merupakan hubungan antara waktu sebagai absis dan tanggap detektor sebagai ordinat pada sistem koordinat cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sample. Molekul-molekul sampel yang diinjeksikan menuju kolom analisis tidak akan berkumpul pada satu titik secara serempek dalam waktu yang sama. Demikian pula tiap-tiap molekul analit akan mengalami hambatan fasa diam didalam kolom dengan waktu yang berbeda. Oleh karena itu semua molekul analit tidak serempak keluar dari kolom. Molekul analit akan keluar dari kolom tersebut secara cak dan demikian pula untuk respon detector terhadap analit keluar dari kolom tidak serempak terhadap semua molekul. Sebagai akibat kenyataan tersebut, maka profil kromatogram akan melebar secara ideal membentuk kurva Gauss (Gambar 3.b)Parameter-parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram, yaitu : waktu tambat, faktor kapasitas, jarak setara plat teori, resolusi dan faktor simetri.

Gambar 3Setelah mengetahui profil kromatogram dari pemisahan suatu analit, maka harus dapat diketahui kualitas pemisahannya yaitu faktor-faktor apa saja yang dapat mempengaruhi kualitas pemisahan dan variabel analitik yang digunakan untuk memperbaiki kualitas tersebut. Oleh karena itu diperlukan suatu ukuran yang analit tersebut telah terpisah satu sama lain secara sempurna.2.11. Waktu TambatPada Gambar 4. terdapat tiga macam puncak, dua buah puncak yang berukuran besar adalah puncak-puncak yang dihasilkan oleh analit yang tertahan pada fasa diamnya pada sistem kesetimbangan distribusi yang tegas (dinamis). Di samping itu terdapat puncak kecil yang dihasilkan oleh analit yang tidak tertahan oleh fasa diam, namun bersama fasa gerak keluar dari kolom dengan kecepatan yang sama dengan kecepatan fasa geraknya.

Gambar 4 : Perhitungan waktu tambat kromatogramSelang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya secara maksimal ditangkap oleh detektor disebut sebagai waktu tambat atau waktu retensi (retention time). Waktu tambat analit yang tertahan pada fase diam dinyatakan sebagai tR. Sedangkan waktu tambat analit yang tidak tertahan pada fase diam atau sering disebut sebagai waktu tambat pelarut pengembang dinyatakan to atau tM. Harga to akan lebih kecil dari harga tR, karena yang akan mencapai ujung kolom lebih dahulu adalah pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur. Waktu tambat analit dikurangi dengan dengan waktu tambat pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur disebut waktu tambat terkoreksi (tR), yang dinyatakan sebagai tR. tR = tR - tM ................................. (1)Waktu tambat yang dinyatakan dalam satuan waktu (menit) memberi arti yang sangat penting dalam analisis kualitatif dengan HPLC. Berikut ini akan dibahas hubungan antara tR , tM, dan Kd, telah diketahui bahwa :Kd = Cs /CmDimana Cs dan Cm masing-masing sebagai konsentrasi analit dalam fase diam dan fase bergerak. Kalau harga Kd kecil, maka analit akan lebih banyak di dalam fasa gerak (Cm > Cs) yang berarti analit akan lebih lama tinggal didalam fasa gerak.Kesetimbangan analit didalam fasa gerak dan fasa diam merupakan suatu kesetimbangan yang dinamis, artinya fraksi waktu analit berada dalam fasa gerak setara terhadap fraksi jumlah analit yang berada di dalam fasa gerak, pernyataan tersebut dapat dinyatakan sebagai berikut :(2)Dimana Vm dan Vc adalah volume fase gerak dan volume fase diam. Kalau jarak tempuh analit adalah d dan kecepatan fase gerak adalah m, maka : d = .tJika panjang kolom adalah L, maka :Dalam hal ini tM = L/ , ................... (3)Dari persamaan yang terakhir bahwa harga tM , Vs , Vm dapat diatur. Dengan demikian harga tR akan menjadi spesifik untuk tiap-tiap analit. Campuran zat yang diinjeksikan untuk dianalisis dengan HPLC tentu mempunyai harga tR yang berbeda karena tiap-tiap analit mempunyai Kd yang spesifik.2.12. Faktor KapasitasFaktor kapasitas (k) merupakan ciri khas suatu analit pada kondisi tertentu, yaitu pada komposisi fase gerak, suhu dan jenis kolom (panjang kolom, diameter kolom dan ketebalan lapisan film) tertentu. Meskipun suatu puncak kromatogram dapat diidentifikasi melalui waktu tambatnya, namun akan lebih baik bila diidentifikasi dengan menggunakan faktor kapasitas karena harga waktu tambat dapat berubah-ubah sesuai dengan panjang kolom dan kecepatan alir fasa geraknya.Faktor kapasitas dapat memberikan gambaran dimana puncak-puncak analit terelusi secara relatif terhadap puncak fasa geraknya, faktor kapasitas (k) dinyatakan sebagai berikut :---------- (4)(tR tO) adalah waktu tambat terkoreksi dan tO adalah waktu tambat fase gerak, harga faktor kapasitas (k) yang baik berkisar antara 1 dan 10. Bila harga k kecil berarti puncak-puncak analit belum saling berhimpitan (overlapping) dengan puncak fasa geraknya. Sedangkan harga k yang besar menunjukkan bahwa waktu pemisahan yang dilakukan terlalu lama. Faktor kapasitas hanya menjamin pemisahan dua puncak kromatogram pada bagian atasnya saja.2.13. ResolusiApabila dilakukan campuran dua analit dengan metode HPLC maka akan didapat dua puncak yang mempunyai waktu tambat yang berbeda. Sedangkan tujuan utama dari analisis dengan metoda HPLC adalah didapatkannya pemisahan yang lebih baik. Oleh karena itu diperlukan parameter yang dapat menggambarkan pemisahan kromatogram analit tersebut. Parameter yang diperlukan tersebut adalah: resolusi (Rs) dan faktor pemisahan atau faktor selektivitas yang dinyatakan sebagai . Faktor pemisahan () menggambarkan pemisahan antara dua puncak relatif terhadap satu sama lain, dan dinyatakan dengan persamaan berikut:......... (5)Dimana harus > 1.Resoluasi (Rs) mengukur perbedaan waktu tambat (tR) dari dua macam analit yang dibagi dengan lebar dasar puncaknya (w).................(6)Jadi dapat dikatakan bahwa faktor pemisahan () hampir sama dengan resolusi (Rs), yang membedakan antara keduanya adalah pada resolusi melibatkan waktu tambat dan lebar dasar puncak, sedangkan faktor pemisahan hanya melibatkan waktu tambat saja (pemisahan bagian atas dari kromatogram).2.14. Gangguan Pada HPLC Gangguan yang terjadi dibedakan menjadi dua yaitu : gangg uansistem garis dasar dan gangguan bentuk puncak. Gangguan sistem garis dasar (baseline) yang mungkin timbul antara lain : noise (derau), drift (melayang), spiking (berpaku), wander (menyimpang) dan shift (bergeser).

Gambar 5 : Gangguan sistem garis datar.Sedangkan gangguan bentuk puncak (peak shape) yang mungkin timbul yaitu :Puncak lebih kecil dari yang diharapkan, Tailing (puncak), Fronting (puncak mengandung), Puncak berubah bentuk (cigar top, round top, flat top), Puncak membelah (split), Puncak negatif.

BAB 4PEMBAHASAN

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan kolom ini melalui suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini akan diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Instrumen HPLC pada dasarnya terdiri atas wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2007). Wadah fase gerak yang diguanakan pada praktikum simulasi dengan HPLC ini adalah botol kaca. Wadah fase gerak yang digunakan harus bersih dan inert. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2007). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada penentuan kadar kafein dan parasetamol, digunakan kromatografi fase balik (fase diam kurang polar dibandingkan fase gerak. Proses elusi dilakukan dengan cara isokratik menggunakan satu jenis pelarut, yaitu metanol 70%. Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem pengahantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007). Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Pada saat pengisisan sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Sampel yang melewati keluk ini adalah 20 Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1% (Gandjar dan Rohman, 2007). Fase diam yang digunakan pada HPLC ini adalah silika yang telah dimodifikasi secara kimiawi. Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen tertentu. Reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantikannya dengan gugus fungsional C18. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi. Oktadesil silika (ODS atau C18) mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007). Detektor pada HPLC yang digunakan pada alat ini adalah detektor photodiode array (PDA). Detektor ini merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat ditampilkan. Dengan detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem HPLC yang digunakan. Dan akhirnya dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra senyawa yang sudah diketahui (Gandjar dan Rohman, 2007). Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor ini dapat ditampilkan sebagai plot tiga dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu sehingga data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada layar lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari perpustakaan data yang ada dalam sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi (Gandjar dan Rohman, 2007). Tujuan umum dari kromatografi adalah pemisahan yang cukup dari suatu campuran yang akan dipisahkan. Terdapat dua parameter yang digunakan untuk meilai kualitas pemisahan kromatografi, yakni ukuran banyaknya pelebaran puncak dari masing-masing puncak solut (efisiensi) dan tingkat pemisahan puncak-puncak yang berdekatan (resolusi) (Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk kolom kromatografi, jumlah lempeng atau plate number (N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi kolom digunakan sbeagai ukuran efisiensi. Selain dengan N, efisiensi kolom kromatografi juga berkaitan dengan waktu retensi, yakni lamanya waktu komponen atau molekul yang akan dianalisis dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007). Suatu ukuran alternatif (yang tergantung pada panjang kolom kromatografi) adalah tinggi lempeng (H) atau juga disebut HETP (Height Equivalent Theoritical Plate). HETP merupakan panjang kolom kromatografi yang diperlukan sampai terbentuknya satu kali keseimbangan molekul solut dalam fase gerak dan fase diam. Kolom yang memberikan jumlah lempeng (N) yang besar dan nilai HETP yang kecil akan mampu memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran yang lebih baik yang berarti bahwa efisiensi kolom semakin besar.Analisis kualitatif dengan metode HPLC dapat melalui pendekatan waktu retensi solut yang tidak diketahui dengan data retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama (Gandjar dan Rohman, 2007).Analisis Kualitatif HPLC merupakan teknik pemisahan yang dapat menghasilkan identifikasi kualitatif. Bagaimanapun juga seorang analis harus dapat memastikan bahwa hasil yang diperoleh adalah benar.Kromatografi gas dapat digunakan untuk analisis karena retensi bersifat karakteristik pada tiap senyawa. Identifikasi puncak dapat diperoleh dengan menggunakan inframerah atau spektrometri masa akan tetapi teknik sering tidak ada atau biaya sangat mahal.Sampel yang paling sulit dianalisis adalah sampel yang komponen-komponennya benar-benar tidak diketahui. Dalam hal ini konsultasi data retensi terkadang tidaklah cukup.Penambahan Unsur ke dalam Sampel (Spiking)Metode percobaan yang paling mudah untuk identifikasi puncak adalah dengan menambahkan komponen ke dalam sampel dan mencoba untuk mengamati perubahan sebagai respon didalam spiked sampel.1. Metode mudah2. tidak mudah jika komponen yang lain mungkin memiliki waktu retensi yang sama.3. Dapat digunakan untuk menunjukkan ketidakhadiran dari suatu unsur dengan menampakannya pada waktu retensi yang benar-benar berbeda.4. Kemurnian spike harus diketahui karena ketidakmurnian dapat memberikan petunjuk yang salah.Perbandingan Data RetensiVolume retensi suatu komponen adalah karakteristik sampel dan fase cair. Ini dapat digunakan untuk identifikasi komponen-komponen dalam sampel. Data retensi yang belum terkoreksi biasanya tidak digunakan mengingat volume retensi tergantung pada :1. Kolom2. Fase cair3. Temperatur kolom4. Kecepatan aliran5. Jenis gas pembawa6. Volume mati instrumen7. Penurunan tekanan across kolomAkan tetapi hal itu dapat digunakan pada sampel yang sudah diketahui informasinya dan tersedia standarisasinya. Kemampuan instrumen dalam menghasilkan data di perlukan dalam operasional isotermal maupun terprogram. Jika semua parameter operasional dapat konstan berulang-ulang maka perbandingan data retensi sampel dapat dibuat terhadap standar.

Gambar 18.19. Perbandingan kromatogram larutan standar (B) dengan larutan sampel (A)

Retensi Relatif a sebagai Data Retensi yang direkomendasikan untuk Indentifikasi sampel yang tidak diketahui. Retensi relatif a adalah yang direkomendasikan untuk indentifikasi puncak sebagai sesuatu yang relatif terhadap standar dan juga diperoleh dari data retensi yang disesuaikan. Ini lebih mudah diperoleh dan hanya bergantung pada jenis fase cair dan temperatur kolom.

BAB 5KESIMPULAN

Analisis Kualitatif pada HPLCMengacu pada :1. Waktu tambat atau waktu retansi puncak kromatogram analit yang dianalisis2. Pemurnian zat yang dianalisis dan melanjutkan dengan teknis yang lain3. Perbandingan dengan library yang ada perangkat lunak komputernyaKendala yang dihadapi :1. Pemakaian waktu tambat2. Analisis kualitatif pasca kolom3. Analisis dengan detector Photodiode array4. Analisis dengan teknik terpadu.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Surabaya: Airlangga University Press. Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Bandung: Universitas Padjajaran. Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Day, R.A dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga. Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press. Sari Ni Ketut,2010, Analisa Instrumentasi. Klaten:Penerbit Yayasan HumanioraSkoog, A. Douglas, dkk. 1998. Principles of Instrumental Analysis. USA: David Haris Publisher.http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/analisis-dengan-kromatografi-gas/ diupload pada 25 Maret 2013Wiryawan Adam dkk. 2007. Kimia Analitik. Jakarta : Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan