LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Perbenihan dan Sterilisasi

Oleh:

UMI MALINDA

2011210250

C/8

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PANCASILA

JAKARTA

2012

1 | M i k r o b i o l o g i

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Setiap makhluk hidup akan membutuhkan tempat tinggal dan

membutuhkan sumber makanan untuk bertahan hidup dan berkembang biak.

Mikroba merupakan jasad hidup atau jasad renik yang tidak dapat dilihat dengan

keadaan kasap mata karena ukurannya sangat kecil. Bukan hanya ukurannya saja

yang kecil, mikroba juga memiliki keanekaragaman bentuk dan jenisnya.

Keanekargaman inilah yang menuntut mikroba melakukan metabolisme untuk

memenuhi nutrisi yang dibutuhkan selama masa hidupnya. Lingkungan salah

satunya yang sangat mempengaruhi pemenuhan kebutuhan nutrisi mikroba yang

sangat beraneka ragam. Kumpulan bahan organik maupun anorganik yang

diperlukan sebagai nutrisi untuk tumbuh kembangnya mikroba merupakan salah

satu media pertumbuhan (perbenihan) mikroba. Pembuakan, isolasi, identifikasi,

produksi sel biasanya dilakukan untuk menganalisis suatu mikroba.

Sterilisasi ialah suatu tindakan yang dilakukan untuk membebaskan alat

atau media dari mikroba. Dalam pengujian atau penelitian mikrobilogi, kontaminasi

dapat terjadi apabila semua alat yang digunakan tidak steril. Semua alat dan

bahan perbenihan dapat dikatakan steril jika telah terbebas dari segala mikroba.

Terbebas dari segala mikroba disini adalah terbebas dari mikroba baik dalam

bentuk sel vegetatif maupun spora.

B. Tujuan Praktikum

1. Memilih dan menemukan jenis pertumbuhan yang sesuai untuk suatu uji.

2. Membuat beberapa perbenihan dasar yang digunakan dalam praktek

mikrobiologi.

3. Melakukan sterilisasi alat dan media dengan sterilisasi panas lembab

menggunakan autoklaf dan panas kering menggunakan oven.

4. Melakukan uji sterilitas terhadap media-media yang telah disterilkan untuk

memastikan bahwa media-media tersebut telah steril.

C. Manfaat Praktikum

2 | M i k r o b i o l o g i

Diharapkan dari hasil praktikum, mahasiswa dapat mengetahui dan

memilah serta memilih jenis pertumbuhan yang sesuai untuk suatu uji mikroba.

Membuat beberapa perbenihan dasar yang digunakan dalam praktek mikrobiologi,

dapat melakukan sterilisasi alat dan media dengan sterilisasi panas lembab

menggunakan autoklaf dan panas kering menggunakan oven. Serta diharapkan

mahasiswa dapat mealkukan uji sterilitas terahadap media-media yang telah

disterilkan untuk memastikan bahwa media-media tersebut telah steril.

3 | M i k r o b i o l o g i

BAB II

STUDI PUSTAKA

A. Perbenihan

Media atau perbenihan yaitu campuran bahan-bahan tertentu dengan

aquadest yang dapat menumbuhkan bakteri, virus, jamur atau parasit. Pada

derajat keasaman dan inkubasi tertentu (Soemarno, 1998).

Media merupakan suatu kumpulan zat-zat organik dan anoganik yang

dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba dengan syarat-syarat tertentu tertentu

seperti mengandung unsur-unsur makanan yang sesaui, tidak mengandung

zat inhibitor serta memiliki PH dan tekanan osmosis yang sesuai dengan

kondisi optimal yang dibutuhkan mikroba. Organisme hidup memerlukan nutrisi

untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan anorganik diperoleh dari

lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrient diambil dari lingkungan

kemudian ditransformasikan mealui membran plasma menuju sel. Di sel

beberapa nutrisi diolah menghasilakan energi yang digunakan dalam proses

seluler. (Lim, 1998)

Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya .

bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan media

cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen

(yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok

dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka

terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan

proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bajteri

membentuk dinding sel baru. (Volk, 1993).

Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan

adalah memahami kebutuhan dasarnya, kemudian memformulasikan suatu

medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme

bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk

masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan

air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang

tinggi. Pada medium yang mengandung kaldu pepton, air dengan air kualitas

4 | M i k r o b i o l o g i

air sadah sudah dapat menyebabkan terbentunya endapan fosfat dan

magnesiumfosfat (Hadioetomo, 1993).

Tujuan media buatan dalam mikrobiologi, yaitu:

1. Sebagai tempat lingkungan mikroba untuk tetap tumbuh di luar tubuh

inang.

2. Memberikan nutrisi bagi mikroba di luar tubuh inang atau lingkungan

normalnya.

3. Mengisolasi mikroba dengan jenis tertentu secara selektif, serta

menyuburkan / meningkatkan jumlah mikroba yang terisolasi dalam

jumlah yang kecil.

4. Mengidentifikasi jenis mikroba yang tumbuh berdasarkan sifatnya

terhadap jenis media yang menumbuhkannya.

5. Mempertahankan laju pertumbuhan mikrobia (batch culture).

(Anggraeny, R.N, 2009)

B. Klasifikasi Media

a. Media berisi bahan-bahan yang berdasarkan fungsinya dapat dibagi

menjadi 6, yaitu:

1. Nutrisi: protein / peptida / asam amino

Komponen protein yang diperlukan mikroorganisme adalah peptone,

tegantung kebutuhannya dapat berupa meat peptone maupun non meat

peptone ( casein dan soya peptone ) ataupun campuran kedduanya.

2. Energi: bahan yang diapaki adalah karbohidarat, yang paling banyak

digunakan adalah glukosa.

3. Logam dan mineral: dapat dibagi menjadi:

Komponen makro contohnya: Na, Cl, Ca, Mg, Fe.

Komponen mikro contohnya: Zn, Mn, Bi

Logam dan mineral terkandung di dalam peptone, buffer, dan agar,

sehingga seringkali tercantum di dalam komposisi media.

4. Buffer: untuk pertumbuhan mikroorganisme tertentu.

Dibutuhkan pada pH yang optimum. Contoh bahan buffer: fosfat, citrat,

asetat dan asam amino spesifik.

5. Indikator: penambahan indikator merupakan cra efektif untuk mendeteksi

fermentasi karbohidrat spesifik.

5 | M i k r o b i o l o g i

6. Bahan selektif: bahan selektif dapat berupa bahan kimia atau antibiotika

yang ditambahkan pada medium yang bertujuan untuk menekan

pertumbuhan mikroroganisme yang tidak diinginkan sehingga hanya

mikroorganisme yang diinginkan saja yang dapat tubuh.

b. Media menurut konsistensinya / kepadatannya/ sifat fisiknya, yaitu:

1. Padat (solid) : adanya penambahan karagenan atau agar, gelatin, silica

gel, ditempatkan pada plate atau tabung (miring). Bahan agar yang

utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga

genus gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 1000

derajat C dan akan cair apabila kurang lebih 43 derajat C.

Menurut Scahlegel (i993) agar merupakan media tumbuh yang ideal

yang diperkenalkan melalui metode bacteriological. (Hadioetomo,

1993).

2. Setengah padat (semisolid): penambahan agar separuh dari komposisi

ditempatkan pada tabung (tegak):

Untuk melihat pergerakan (motilitas) mikrobia. Contohnya seperti SIM

semi solid agar, Cary and Blair.

3. Cair (broth): tanpa adanya pemadat seperti agar.

Media (broth) misalnya air pepton, bouillon, nutrient broth tarozzi dan

lain-lain. Media cair pembuatannya imasukkan dalam tabung atau labu.

(Anggraeny, R.N, 2009)

C. Macam macam perbenihan

1. Berdasarkan kegunaannya, yaitu:

- Perbenihan dasar (pokok)

Perbenihan dasar digunakan sebagaiperbenihan pendahuluan, dimana

semua jasad renik umumnya apa tumbuh dalam media ini.

- Perbenihan yang diperkaya

Perbenihan yang diperkaya digunakan untuk menumbuhkan jasad

renim secara optimal terlebih dahulu sebelum ditanamkan pada media

yang lain, sehingga mudah untuk diisolasi.

- Perbenihan selektif / diferensial

Perbenihan selektif / diferensial adalah suatu perbenihan dimana koloni

dari suatu jasad renik dapat dibedakan denan koloni jasad renik

lainnya.

- Perbenihan inklusif

6 | M i k r o b i o l o g i

perbenihan ini hanya dapat menumbuhkan satu jasad renik, sedangkan

jasad renik lainnya dapat dihambat pertumbuhannyaatau tidak dapat

tumbuh sama sekali.

- Perbenihan pengangkutan / transportasi

Perbenihan ini digunakan untuk menyimpan sementara contoh untuk

dibawa ke laboratorium pemeriksaan.

- Assay media

Perbenihan ini digunakan untuk pemeriksaan terhadap antibiotika,

asam amino, dan vitamin.

D. Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang

ada. Sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak lagi ada jasad

renik yang dapt berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad

renik yang paling tahan panas, yaitu sporabakteri (Fardiaz, 1992). Sterilsasi

adalah tahap yang paling wal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi.

Sterilsasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba

hidup dan spora-sporanya.

Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu:

1. Sterilasi uap (panas lembab).

2. Sterilisasi panas kering.

3. Sterilisasi dengan penyaringan.

4. Sterilisasi dengan gas.

5. Sterilisasi dengan radiasi.

Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan

pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan

metode sterilisasi panas kering.

a. Sterilisasi uap

Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf mengguanakn uap air dalam

tekanan sebagai pensterilnya. Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan

terkoagulasi dan dirusak pada temperature yang lebih rendah

dibandingkan bila tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran

bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan

koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut.

7 | M i k r o b i o l o g i

b. Sterilisasi panas kering

Sterilisasi panas kering basanya dilakukan dengan menggunakan

oven pensteril. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh

mikroba dibanding uap air panas, maka metode ini memerlukan temperatur

yang lebih tnggi diwaktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering

biasanya ditetapkan pada temperature 160-170 derajat celcius dengan

waktu 1-2 jam.

Sterilisasi panas kering umunya digunakan untuk senyawa-

senyawa yang tidak efektif untuk di sterilakn dengan uap airpanas, karena

sifatnya yang tidak dapa ditembus atau tidak tahan dengan uap air.

Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis

minyak) dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga

efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Karena suhunya

sterlisasi yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk

alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh: alat ukur) dan

penutup karet atau plastik.

c. Sterilisasi dengan penyaringan

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilkan cairan

yang mudah rusak jika terkena panas atau mudah menguap (volatile).

Cairan yang disterilkan dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya

sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup

kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode

ini.

d. Sterilisasi gas

8 | M i k r o b i o l o g i

Steriisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh

mikroorganisme dan sporanya. Messkipun gas dengan cepat berpenetrasi

ke dalam pori dan serbuk padat. Sterilisasi adalah fenomena permukaan

dan mikroorganisme yang terkristal akan di bunuh. Sterilisasi gas biasanya

digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan panas dan

tidak tahan radiasi atau cahaya.

e. Sterilisasi dengan radiasi

Radiasi sinar gama atau partikel elektron dapat diguanakan untuk

mensterilakan jaringan yang telah diawetkan maupun jaringan segar.

9 | M i k r o b i o l o g i

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam membuat perbenihan dan sterilisasi yaitu:

tabung-tabung reaksi yang telah bersih, cawan petri bersih, gelas ukur, labu

erlenmeyer, gelas kimia, pipet volume, pembakar bunsen( lampu spiritus), rak

tabung, kapas berlemak, alumunium foil/ kertas kraft, benang kasur serta

autoklaf.

2. Bahan dan Media

Bahan-bahan yang perlu dipersiapkanuntuk dipergunakan dalam membuat

prbenihan dan sterilisasi yaitu: ar suling (aquadest), perbenihan kaldu pepton,

serta perbenhan nutrien agar (NA) untuk media dasar bakteri.

B. Cara kerja

1. Membuat perbenihan

Terlebih dahulu persiapkan semua alat dan bahan yang dibutuhkan, dan

pastikan semua alat dalam keadaan bersih. Setelah semua alat bersih dan

bahan sudah ada, tempatkan serbuk nutrient agar (NA) dan serbuk kaldu

pepton (KP) ke dalam erlenmeyer keceil dan larutkan menggunakan aquadest

sampai 50 ml. Aduk-aduk, pastikan semua serbuk tersebut larut kemudian

panaskan hingga mendidih, didihkan selama 1-2 menit. Ukur sampai batas pH

yang diperlukan tercapai, tutup dengan kapas berlemak. Sterilkan.

- Perbenihan kaldu pepton

Masukkan perbenihan cair kaldu pepton sebanyak 5 ml kedalam

tabung reaksi yang bersih, kemudian tutup tabung menggunakan kapas

berlemak. Lakukan sterilisasi akhir menggunakan autoklaf.

- Perbenihan agar tegak

Masukkan nutrient agar cair hangat (yang masih cair) masing-masing

sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi yang bersih, lalu sumbat

dengan kapas berlemak. Lakukan sterilisasi akhir dengan autoklaf.

Setelah steril, letakkan dalam tabung reaksi hingga memadat.

- Perbenihan agar miring

Masukkan nutrient agar cair hangat (yang masih cair) masing-masing

sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi yang bersih, lalu sumbat

10 | M i k r o b i o l o g i

dengan kapas berlemak. Lakukan sterilisasi akhir dengan autoklaf.

Setelah steril, letakkan dalam tabung reaksi dalam keadaan miring

hingga memadat.

- Perbenihan agar lempeng

Secara aseptik, pindahkan sebanyak 15-20 ml media agar (NA) yang

masih dalam keadaan cair dan telah steril (sterilisasi di awal)

dituangkan kedalam cawan petri yang juga steril. Tutup kembali cawan

petri, biarkan hingga memadat.

2. Sterilisasi dengan Autoklaf

- Media yang telah dibuat dalam wadah (kecuali agar lempeng, di

sterilisasi diawal) di bungkus, pastikan tertutup rapat, tempatkan pada

keranjang untuk di sterilkan. Tabung yang beris media cair serta media

agar (agar tegak, agar miring) ditutup dengan kapas berlemak, dillapisi

dengan kertas kraft dan diikat dengan benang kasur, tempatkan pada

rak tabung atau bejana yang sesuai.

- Alat-alat gelas non volumetrik yang etalh di cuci bersih seperti cawan

petri, tabung reaksi yang telah diberi sumbat kapas berlemak

dibungkus dengan kertas krep / koran dan diikat dengan benang kasur.

Kemudian tempatkan dalam keranjang untuk di sterilkan menggunakan

autoklaf bersama dengan media-media.

- Masukkan keranjang yang berisi media-media dan alat-alat gelas

dalam autoklaf. Nyalakan autoklaf, sterilkan selama 15-20 menit pada

suhu kurang lebih 120 derajat celcius dengan tekanan 15 ib/inci.

3. Sterilisasi menggunakan oven

- Alat-alat gelas volumetrik yang telah dibersihkab seperti pipet volume

dan gelas ukur dibungkus dengan alumunium foil/ kertas krep/koran

dan ikat dengan benang kasur.

- Masukkan alat-alat yang telah dibungkus tersebut dalam oven.

- Sterilisasi selama 1,5 jam pada suhu 160-170 derajat celcius.

11 | M i k r o b i o l o g i

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil pengamatan beberapa media dan sterilisasi

Nama media Bentuk Sifat fisik Hasil uji media

Kaldu pepton Perbenihan cair Jernih, tidak

berwarna

-

Nutrien agar Agar tegak Jernih, tidak

berwarna

-

Agar miring Jernih, tidak

berwarna

-

Agar lempeng Jernih, tidak

berwarna

-

B. Pembahasan

Dihasilkan dari pengamatan membuat beberapa media yaitu media kaldu

pepton dan nutrien agar dengan hasil uji sterilisasi media (-). Ini menunjukkan

bahwa tidak terjadi pertumbuhan mikroba dalam media , dengan tidak ada tanda-

tanda terbentuknya kekeruhan ataupun partikel partikel yang mengapung/

mengendap pada media cair kaldu pepton, dan tidak adanya koloni-koloni mikroba

pada permukaaan nutrien agar, baik agar miring, agar tegak maupun agar

lempeng.

Dapat dikatakan uji perbenihan mikroba ini berhasil karena tidak terjadi

kontaminasi. Pngerjaan uji sterilisasi yang teliti dan bersih yang membuat tidak

terjadinya kontaminasi.

12 | M i k r o b i o l o g i

BAB V

KESIMPULAN

1. Dari uji perbenihan dan sterilisasi didapat hasil uji yang bernilai (-) yang berarti uji

coba dapat dilakukan secara baik, karena tidak terjadi pertumbuhan bakteri. Ini di

karenakan pengerjaan uji coba yang baik , teliti , bersih dan rapih sehingga tidak

terjadi kontaminasi.

2. Dibuat beberapa perbenihan dasar yaitu dengan media kaldu pepton dan nutrient

agar (tegak, miring, lempeng).

3. Dilakukan sterilisasi alat seperti cawan petri dan pipet volume serta sterilisasi

media kaldu pepton dan nutrien agar menggunakan autoklaf pada panas lembab

dan dengan menggunakan oven pada panas kering.

4. Dilakukan uji akhir sterilisasi terhadap media kaldu pepton dan agar nutrien untuk

memastikan bahwa memdia-media tersebut telah steril dan tidak terkontaminasi.

13 | M i k r o b i o l o g i

DAFTAR PUSTAKA

- Radji, Maksum.2010. Buku Ajar Mikrobiologi: panduan mahasiswa

farmasi. Jakarta: EGC.

- Staf pengajar FKUI. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta .

14 | M i k r o b i o l o g i