Makalah Tekhnik Laboratorium Kelompok

Embed Size (px)

Citation preview

MAKALAH TEKHNIK LABORATORIUMTeknik Kuantisasi DNA dan Protein (Analisis Spektrofotometri)

Disusun oleh Andang Mulya Sari Suhendra 108095000061 108095000045

Swa Abdas Ria Rahayu 108095000040

Dosen Pembimbing S. Hermanto M.Si Eddy Yusuf MS

PRODI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2010

BAB I Tinjauan Pustaka2.1. Protein 2.1. Terminologi Protein Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomermonomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof). Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jns Jakob Berzelius pada tahun 1838. Biosintesis protein alami sama dengan ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang berperan sebagai cetakan bagi translasi yang dilakukan ribosom.Sampai tahap ini, protein masih "mentah", hanya tersusun dari asam amino proteinogenik.Melalui mekanisme pascatranslasi, terbentuklah protein yang memiliki fungsi penuh secara biologi.

Gambar 1. Protein

2.2.Struktur protein Struktur protein dapat dilihat sebagai hirarki, yaitu berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier (tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat):1.

Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Frederick Sanger merupakan ilmuwan yang berjasa dengan temuan metode penentuan deret asam amino pada protein, dengan penggunaan beberapa enzim protease yang mengiris ikatan antara asam amino tertentu, menjadi fragmen peptida yang lebih pendek untuk dipisahkan lebih lanjut dengan bantuan kertas kromatografik. Urutan asam amino menentukan fungsi protein, pada tahun 1957, Vernon Ingram menemukan bahwa translokasi asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu mutasi genetik.

2.

Struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut:o

alpha helix (-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asamasam amino berbentuk seperti spiral; beta-sheet (-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H); beta-turn, (-turn, "lekukan-beta"); dan gamma-turn, (-turn, "lekukan-gamma").

o

o o

3.

Struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener. contoh struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin.

Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan spektrometri massa. Struktur sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red (FTIR).[6] Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah. Struktur protein lainnya yang juga dikenal adalah domain. Struktur ini terdiri dari 40-350 asam amino. Protein sederhana umumnya hanya memiliki satu domain. Pada protein yang lebih kompleks, ada beberapa domain yang terlibat di dalamnya. Hubungan rantai polipeptida yang berperan di dalamnya akan menimbulkan sebuah fungsi baru berbeda dengan komponen penyusunnya. Bila struktur domain pada struktur kompleks ini berpisah, maka fungsi biologis masing-masing komponen domain penyusunnya tidak hilang. Inilah yang membedakan struktur domain dengan struktur kuartener. Pada struktur kuartener, setelah struktur kompleksnya berpisah, protein tersebut tidak fun 2.3.Manfaat Protein

Sumber energi Pembetukan dan perbaikan sel dan jaringan Sebagai sintesis hormon,enzim, dan antibodi Pengatur keseimbangan kadar asam basa dalam sel

2.2. DNA (Deoksiribosa Nukleotid Acid)2.2.1. Pengertian DNA Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris:

deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.

Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).

Gambar 2. DNA 2.2.2.Fungsi DNA DNA biasanya terjadi sebagai linier kromosom pada eukariota, dan kromosom melingkar di prokariota. Himpunan kromosom dalam sel yang disebut genom , sedangkan genom manusia memiliki 3 miliar pasang basa DNA sekitar disusun menjadi 46 kromosom.[66]

Informasi yang dibawa oleh DNA diadakan di urutan potongan DNA yang disebut gen . Transmisi dari informasi genetik dalam gen dicapai melalui basis pelengkap pasangan. For example, in transcription, when a cell uses the information in a gene, the DNA sequence is copied into a complementary RNA sequence through the attraction between the DNA and the correct RNA nucleotides. Misalnya, dalam transkripsi, ketika sel menggunakan informasi dalam gen, urutan DNA disalin ke dalam urutan RNA komplementer melalui komplementer antara DNA dan RNA nukleutida. Biasanya, salinan RNA ini kemudian digunakan untuk membuat pencocokan sekuens protein dalam proses yang disebut translasi , yang tergantung pada interaksi sama antara nukleotida RNA. Dalam mode alternatif, sel mungkin hanya menyalin informasi genetik dalam sebuah proses yang disebut replikasi DNA. 2.2.3.Sejarah DNA DNA pertama kali diisolasi oleh Swiss dokter Friedrich Miescher yang, pada tahun 1869, menemukan suatu zat mikroskopis dalam nanah dari perban bedah dibuang. Seperti berada dalam inti sel, ia menyebutnya "nuclein". Pada tahun 1919, Phoebus Levene mengidentifikasi dasar, gula dan unit nukleotida fosfat. Levene menyarankan bahwa DNA

terdiri dari serangkaian unit nukleotida dihubungkan bersama melalui gugus fosfat. Namun, Levene pikir rantai pendek dan dasar diulang dalam urutan yang tetap. Pada tahun 1937 William Astbury menghasilkan pertama -difraksi sinar X pola yang menunjukkan bahwa DNA memiliki struktur yang teratur. Pada tahun 1928, Frederick Griffith menemukan bahwa ciri-ciri dari bentuk "lunak" dari Pneumococcus bisa ditransfer ke bentuk "kasar" dari bakteri yang sama dengan mencampur bakteri "halus" yang mati dengan bakteri "kasar" hidup. Sistem ini memberikan saran yang jelas pertama bahwa DNA membawa genetik informasi (Percobaan the AveryMacLeod-McCarty) saat Oswald Avery , bersama dengan rekan kerja Colin MacLeod dan Maclyn McCarty , DNA diidentifikasi sebagai prinsip transformasi pada tahun 1943. Peran DNA dalam keturunan dikonfirmasi pada tahun 1952, ketika Alfred Hershey dan Martha Chase dalam percobaan Hershey-Chase menunjukkan bahwa DNA adalah bahan genetik dari fag T2 . Pada 1953, James D. Watson dan Francis Crick mengusulkan apa yang sekarang diterima sebagai model yang benar heliks ganda pertama dari struktur DNA dalam jurnal Nature, model molekul DNA mereka yaitu double-helix, berdasarkan satu X difraksi sinargambar diambil oleh Rosalind Franklin dan Raymond Gosling Mei 1952, serta informasi bahwa dasar DNA dipasangkan - juga diperoleh melalui komunikasi pribadi dari Erwin Chargaff di tahun-tahun sebelumnya . Dasar teori Chargaff memainkan peran yang sangat penting dalam membangun konfigurasi double-helix untuk B-DNA serta DNA-A. Eksperimental yang mendukung Watson dan model Crick diterbitkan dalam serangkaian lima artikel dalam edisi yang sama Nature. Dari jumlah tersebut, terdapat penelitian dan Franklin dan Gosling adalah publikasi pertama difraksi sinar X, data dan metode analisis asli yang sebagian mendukung model DNA Watson dan Crick model, isu ini juga berisi artikel tentang struktur DNA oleh Maurice Wilkins dan dua rekannya, yang analisis dan in vivo-ray pola B-DNA X juga mendukung kehadiran secara in vivo dari heliks DNA konfigurasi-ganda seperti yang diusulkan oleh Crick dan Watson untuk model double-helix molekul DNA di halaman sebelumnya dua Nature. Pada tahun 1962, setelah kematian Franklin, Watson, Crick, dan Wilkins bersama-sama menerima Nobel hadiah dalam Fisiologi atau Kedokteran . Dalam sebuah presentasi berpengaruh pada tahun 1957, Crick meletakkan keluar dogma sentral dari biologi molekuler , yang menubuatkan hubungan antara DNA, RNA, dan protein, dan diartikulasikan dengan "hipotesis adaptor". Konfirmasi terakhir mengenai mekanisme replikasi yang tersirat oleh the-struktur heliks ganda diikuti pada tahun 1958 melalui eksperimen-Stahl Meselson .Pekerjaan lebih lanjut oleh Crick dan rekan kerja

menunjukkan bahwa kode genetik didasarkan pada non-overlapping kembar tiga dari basa, yang disebut kodon, yang memungkinkan Har Gobind Khorana , Robert W. Holley dan Marshall Warren Nirenberg untuk memecahkan kode genetik.Temuan ini merupakan kelahiran biologi molekuler .

2.3. Spektrofotometri2.3.1. Pengertian Spektrofotometri Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

Gambar 3. Spektrofotometri 2.3.2. Bagian dari Fotometri dalam Spektrofotometri Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut : 1. Daerah jangkauan spektrum

Filter fotometer hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm). 2. Sumber sinar Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak. 3. Monokromator Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik. 4. Detektor Filter fotometer menggunakan detektor fotosel Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

2.3.3.Komponen utama dari spektrofotometer yaitu : 1. Sumber cahaya Untuk radisi kontinue : - Untuk daerah UV dan daerah tampak : Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm. Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm) Lampu gas xenon (250-600 nm)

Untuk daerah IR

Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :

Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida (38%) dan erbiumoxida (3%) Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC). Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 20 nm Spektrum radiasi garis UV atau tampak : 1. Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa) 2. Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga 3. Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp) 4. Laser2. Pengatur Intensitas

Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.3. Monokromator

Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran Macam-macam monokromator : Prisma kaca untuk daerah sinar tampak kuarsa untuk daerah UV Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR Kisi difraksi

Keuntungan menggunakan kisi : Dispersi sinar merata Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum 4. Kuvet

Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR. 5. Detektor Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur. Syarat-syarat ideal sebuah detektor : 1. Kepekan yang tinggi 2. Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi 3. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang. 4. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi. 5. Sinyal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi. Macam-macam detektor : o Detektor foto (Photo detector) o Photocell

o Phototube o Hantaran foto o Dioda foto o Detektor panas 6. Penguat (amplifier) Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator. 7. Indikator Dapat berupa : Recorder Komputer

2.3.4.Macam-Macam Spektrofotometri 2.3.3.1.Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

Gambar 4. Spektofotomeri Visible (Spektro Vis)2.3.3.2.Spektrofotometri UV (Ultraviolet)

Berbeda

dengan

spektrofotometri

visible,

pada

spektrofotometri

UV

berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

Gambar 5. Spektrofotometri UV (Ultraviolet)2.3.3.3.Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.

Gambar 6. Spektrofotometri UV-Vis2.3.3.4.Spektrofotometri IR (infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Tabel 1. Pengukuran penandaan Spektofotometri IR Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat. Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease akan menghasilakan asam amino karboksilat. Disisi lain protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulkan perubahan sifat fisika, kimia dan biologi bila Protein apabila dipanaskan dapat mengakibatkan gelombang elektromagnetik tertentu contohnya bisa, kokain kuman-kuman dan lain-lain. Metode Spektrofotokopi dengan untraviolet yang yang diserap bukan cahaya tampak cahaya ultra ungu ( Ultraviolet ). Dalam Spektrofotokopi ultra ungu energi cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse electron. Karena energi Cahaya Ultraviolet dapat menyebabkan transfuse electron ( Hendayana, 1997 ) Pengukuran kadar protein dengan metode Lowry adalah dasar penggunaan Spektrofotometer. Metode ini dapat menggunakan kadar protein sampai dengan 5 Mikrogram. Warna biru yang terjadi oleh pereaksi folin ciacalteu disebabkan reaksi antara protein dengan Cu dalam larutan alkakis dan terjadi reaksi garam fosfotungstat dan garam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptopan. Kurva yang menunjukkan standart merupakan kurva alibrasi dari sederet larutan standar larutan-larutan itu. Larutan ittu sebaiknya mempunyai komposisi yang sama dengan komposisi cuplikan. Jarang sekali digunakan satu larutan standar untuk menentukan absorbtivitas molar, hasil tidak pernah didasarkan pada literatur absobtivitas molar. Protein dengan garam fostotungstat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konsentrasi protein yang tertera.Pada. konsentrasi protein diukur berdasarkan atas opticial dencinty pada panjang gelombang tertentu untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan.

Gambar 7. Spektrofotometri IR2.4. Prinsip Kerja Spektofotometri

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A=

log ( Io / It )

= abc

Keterangan : Io = Intensitas sinar datang It = Intensitas sinar yang diteruskan a = Absorptivitas b = Panjang sel/kuvet c = konsentrasi (g/l) A = Absorban 2.5. Kuantisasi Protein Beberapa metode terbaru memungkinkan untuk kuantisasi protein dengan spektrometri massa ( proteomik kuantitatif ). Biasanya, stabil (misalnya non-radioaktif) lebih berat isotop dari karbon (C13) atau nitrogen (N14) yang dimasukkan ke dalam satu sampel sementara yang lain diberi label dengan isotop cahaya yang sesuai (misalnya12

C dan

14

N).Kedua sampel

dicampur sebelum analisis. Peptida yang berasal dari sampel yang berbeda dapat dibedakan karena perbedaan masa mereka. Rasio intensitas puncak mereka sesuai dengan rasio kelimpahan relatif dari peptida (dan protein). Metode yang paling populer untuk label isotop

yaitu SILAC (isotop stabil pelabelan oleh asam amino pada kultur sel), tripsin-katalis pelabelan O, ICAT (isotop penandaan dikodekan berdasarkan afinitas), iTRAQ (tag isobarik untuk dan absolut kuantisasi relatif). "Semi-kuantitatif" spektrometri massa dapat dilakukan tanpa pelabelan sampel. Biasanya, ini dilakukan dengan analisis MALDI (dalam mode linier). Intensitas puncak, atau daerah puncak, dari molekul individu (biasanya protein) ada di sini berkorelasi dengan jumlah protein dalam sampel.. Namun, sinyal individu tergantung pada struktur primer protein, di kompleksitas sampel, dan pada pengaturan instrumen. Jenis lain dari label-bebas "kuantitatif spektrometri massa", menggunakan jumlah spektral (atau peptida jumlah) protein dicerna sebagai alat untuk menentukan jumlah protein yang relatif.

3.1. Analisa Protein dengan Spektrofotometri 3.1.1. Analisa Protein dengan Spektrofotometri UV-Vis Metode ini tepat digunakan untuk sampel yang mengandung protein terlarut, seperti pada produk-produk hasil ternak (telur dan daging) serta biji-bijian yang belum mengalami perubahan akibat pemanasan/pengolahan. Ada dua jenis sinar yang digunakan dalam metode ini, yaitu menggunakan sinar UV atau sinar tampak (visibel). Adanya gugus aromatik pada asam-asam amino seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan dapat menangkap sinar UV. Adapun jika menggunakan sinar tampak, maka terlebih dahulu diperlukan penambahan pereaksi, seperti tiga (3) macam reaksi berikut : Metode Biuret Reaksi antara ikatan peptida dalam protein dengan logam Cu pada suasana basa menghasilkan komplek warna biru yang dapat diukur secara spektrofotometri pada 540 560 nm. Metode ini tepat untuk produk tepung-tepungan, gandum, darah, dan anggur. Metode Folin Ciocalteu Metode ini didasarkan pada reduksi pereaksi Folin (asam fosmolibdat dan asam fosfotungsat) oleh gugus fenol pada tirosin dan triptofan menghasilkan molibdenum warna biru yang dapat diukur secara kolorimetri/ spektrofotometri. Cara ini relatif lebih cepat dan lebih peka, namun warna yang dihasilkan kurang stabil Metode Lowry

Metode ini merupakan pengembangan dan penggabungan dari metode Biuret dan metode Folin yang dilakukan oleh Lowry kurang lebih 45 tahun yang lalu. Adanya inti aromatis pada asam amino tirosin, triptofan, dan fenilalanin akan mereduksi kedua macam perekasi Lowry A (asam fosfomolibdat : asam fosfotungsat 1:1) menjadi molibdenum yang berwarna biru yang selanjutnya ditambahkan perekasi Lowry B (CuSO4 + Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N + K Na-tatrat 2%) sehingga menghasilkan warna yang lebih stabil dan dapat diukur absorbansinya pada 600 nm. Metode ini lebih senditif daripada metode Biuret.

3.1.2. Analisa Protein dengan Spektrofotometri UV Asam amino tirosin dan triptofan dapat berfluorosensi pada eksitasi 280 nm dan emisi 348 nm. Keuntungan metode ini ialah lebih sensitif daripada menggunakan spektrofotometri UV karena dalam kadar yang lebih kecil mampu membrikan respon yang lebih tajam, serta lebih selektif karena tidak semua senyawa dapat berfluorosensi. 3.1.3. Analisa Protein dengan Metode Bradford (BSA)

Pengujian kadar protein dengan metode Bradford adalah suatu metode dengan pewarnaan protein yang didasarkan pada pengukuran absorbansi. Perubahan warna yang dilakukan oleh dye commassie (komponen reagen Bradford) dari pewarna merah commasie ke pewarna biru commasie disebabkan oleh pengikatan protein. Selama pembentukan kompleks pengikatan protein ini, terjadi pelepasan elektron bebas dari pewarna merah commasie yang mempengaruhi lapisan hidrofobik protein. Lapisan hidrofobik ini mengikat wilayah non-polar dari pewarna melalui gaya van der walls sehingga posisi amina positif tertarik pada muatan negatif dari pewarna tersebut. Pengikatan protein ini diperkuat oleh interaksi ionik antar kedua muatan. Pengikatan protein menyebabkan zat pewarna biru commasie pada reagen Bradford menjadi stabil. Hal ini disebabkan oleh penstabilan anion dari pewarna biru commasie oleh kation dari pewarna merah commasie. Jumlah protein yang mengompleks ini adalah ukuran untuk menentukan konsentrasi protein dengan membaca absorbansinya (Bradford.1976) Uji ini didasarkan pada pengamatan bahwa absorbansi maksimum untuk larutan pewarna asam Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 nm ke 595 nm, ketika

mengikat protein (terjadi perubahan warna). Panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran protein dengan metode Bradford adalah 595 nm. Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang 595 nm absorbansi sebanding dengan pewarna yang terikat pada protein. Oleh karena itu, kadar protein pun menjadi sebanding dengan absorbansi jika diukur menggunakan kurva standar (Bradford 1976). Metode Bradford mempunyai ketelitian yang tinggi karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Uji Bradford sangat cepat dan menggunakan jumlah protein yang relatif sama dengan uji Lowry. Metode Bradford cukup akurat dan sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji ulang dalam beberapa menit. Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum, terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menilai konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Metode Bradford tidak mengukur adanya ikatan peptida tapi mendeteksi asam amino yang spesifik, seperti arginin, yang diyakini bertanggung jawab atas pengikatan pewarna untuk protein (Stoscheck ,1990). Larutan BSA adalah protein yang paling berlimpah dalam serum. Larutan ini berfungsi dalam transportasi asam lemak, menjaga cairan agar tidak bocor keluar dari sistem peredaran darah, dan peran terbatas dalam pemeliharaan pH. Larutan BSA sering digunakan untuk membantu menstabilkan larutan encer enzim di laboratorium atau untuk mencegah antigen non-spesifik mengikat antibodi. Larutan BSA dan IGg adalah larutan standar yang biasa digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992). Protein adalah fungsi dari konsentrasi garam. Fungsi dari penambahan NaCl ke dalam larutan BSA adalah untuk melarutkan protein yang akan diukur. Semakin banyak NaCl yang ditambahkan maka semakin banyak protein yang larut. Semakin banyak protein yang larut maka pengompleksan antara protein dan zat warna dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Hal ini ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang semakin rendah jika NaCl yang ditambahkan semakin banyak (Khopkar 2007). 3.2. Analisa DNA dengan Spektrofotometri Konsentrasi dari suatu RNA atau sampel DNA dapat diperiksa dengan menggunakan spektrofotometri UV. RNA dan DNA menyerap sinar UV yang sangat efisien sehingga memungkinkan untuk mendeteksi dan mengukur pada konsentrasi yang sangat rendah yaitu 2,5

ng/l . Nitrogen dalam nukleotida memiliki serapan maksimum sekitar 260 nm. Using a 1-cm light path, the extinction coefficient for nucleotides at this wavelength is 20. Dengan menggunakan serapan lampu 1-cm, batas koefisien nukleotida pada panjang gelombang 260 nm adalah 20. Berdasarkan koefisien pemadaman, absorbansi pada 260 nm dalam kuvet kuarsa 1-cm yg dari larutan 50g/ml DNA untai ganda atau larutan 40g/ml RNA beruntai tunggal adalah sama dengan 1. Perhitungan konsentrasi DNA atau RNA dalam sampel sebagai berikut: DNA konsentrasi(g/ml) = (OD 260 ) x (faktor pengenceran) x (50 g DNA/ml)/(1 OD 260 unit) RNA concentration (g/ml) = (OD 260 ) x (faktor pengenceran) x (40 g RNA/ml)/(1 OD 260 unit) Berbeda dengan asam nukleat, protein memiliki serapan maksimum 280 nm UV, terutama karena residu triptofan. Absorbansi sampel DNA pada 280 nm memberikan perkiraan kontaminasi protein sampel. Rasio absorbansi pada 260 nm / absorbansi pada 280 nm adalah ukuran dari kemurnian sampel DNA, antara 1,65 dan 1,85. Fenol memiliki absorbansi maksimum 270 tetapi spektrum absorbansi cukup tumpang tindih dengan asam nukleat. Jika ada kontaminasi fenol dalam sampel DNA, absorbansi pada 260 nm akan tinggi, memberikan ukuran palsu konsentrasi DNA Prosedur-prosedur ini khusus untuk spektrofotometer Beckman DU 640B. Prosedur untuk menggunakan untuk mengukur OD dan OD 280 2601.

Hidupkan mesin menggunakan saklar di belakang mesin (bawah sisi kanan sebagai Anda hadapi mesin, nyalakan layar monitor dan printer. Tunggu mesin untuk memulai. Buka tutup di atas mesin. Choose the small cuvette holder and place it in the holder in front of the light source. Pilih pemegang kuvet kecil dan menempatkannya di dudukan di depan sumber cahaya. Kata FRONT harus ke bagian depan mesin.

2.

3.

Klik pada tombol sinar UV untuk mengaktifkan UV. Dibutuhkan sekitar satu menit untuk pemanasan lampu UV .Keluar layar diagnostik dengan mengklik pada kata QUIT di sudut kanan atas. Menu Utama akan muncul Pilih Nukleat Asam dari menu. Bila

menu asam nukleat analisis muncul, pastikan bahwa absorbansi diukur adalah 260 dan 280. Jangan menggunakan fungsi perhitungan.4.

kertas lensa Gunakan untuk membersihkan permukaan kuvet. Bilaskuvet dengan% ETOH 70. Pastikan untuk menghapus semua ETOH setelah dicuci. Isi sebanyak 100l (nH2O, TE, sampel DNA atau RNA) sampel pada kuvet kosong tersebut.Letakkan kuvet di dudukan dan pasang tutupnya pada dudukan.

5.

Tutup tutup mesin. Klik BACA BLANK di sudut kiri bawah layar. Siapkan dilusi atau pegenceran 1:100 dari sampel yang ingin anda baca. After the machine has read the blank, remove the cuvette, remove the blanking solution from the chamber, rinse and dry the chamber and place your diluted sample in it. Setelah mesin telah membaca BLANKO, lepaskan kuvet tersebut dari tempat dudukannya/chamber, bersihkan dan keringkan tempat dudukannya , dan tempatkan pengenceran sampel yang telah dibuat.

6.7. 8.

9.

Klik BACA SAMPEL di tangan kiri atas layar. perlu untuk mencetak ini setiap kali Anda mengukur sampel. Mesin A akan mengumpulkan data untuk Anda.

10. Setelah mesin telah membaca sampel Anda, data akan muncul di layar. Anda tidak

11. Bersihkan kuvet sampel,

Setiap kali Anda tidak perlu mengganti Blanko kecuali sampel dilarutkan dalam solusi yang berbeda. Jika Anda menggunakan kuvet sampel yang berbeda, anda harus menjalankan BLANKO kosong.12. Ketika Anda selesai membaca contoh, hapus dan bersihkan kuvet dan simpan.Untuk

mencetak hasil analisis pembacaan, dengan cara klik PRINT di bagian kanan atas layar. QUIT layar data. Ini akan membawa Anda kembali ke menu utama. Matikan UV. Anda dapat mematikan mesin sementara layar Menu Utama aktif. Matikan mesin monitor dan printer.13. Hitung konsentrasi Anda RNA atau sampel DNA dan 260 OD / OD 280

3.2.1. Proses Analisis DNA dengan spektrofotometri A. Menyiapkan sampel DNA

1. Ambil standar dan sampel Anda dari freezer dan biarkan mencair di atas

es atau di lemari es. Campuran mereka dengan menekan sisi tabung dengan jari Anda. Jangan vortex untuk mencampur.2. Kuantifikasi DNA, 10/2004 dalam 1,5 ml tabung steril microcentrifuge

terpisah untuk setiap standar / sampel,3. campuran 10 l DNA dengan 990 l air DI. Vortex untuk pencampuran.

Biarkan larutan ini selama 10 menit untuk memastikan difusi lengkap seluruh DNA.Hal ini merupakan dilusi 1:100 standar DNA sampel. B. Menyiapkan spektrofotometer1. Pada spektrofotometer.Pilih "DNA / RNA", dan mengikuti isyarat yang

diberikan oleh spec untuk mengatur mesin pembacaan. Paling sering mengukur absorbansi dsDNA dengan 50 mg/ml DNA 2. Tekan "Enter" untuk memvalidasi pengaturan ini.3. Pilih "Faktor Pengenceran" dan masukkan "100" untuk menjelaskan DNA

konsentrasi sampel Anda menjadi 1:100 stok asli Anda. 4. Tekan "Enter" untuk memvalidasi pengaturan ini.5. Masukkan kuvet kosong pada spec dengan terlebih dahulu untuk memastikan

bahwa kotoran atau noda yang mungkin mengganggu pembacaan absorbansi dan kemudian memasukkan sampel pelarut identik dengan pelarut di mana Anda diencerkan sampel DNA Anda dan menekan "Baca kosong" 6. Kembali ke layar pengujian dengan menekan ">". spec ini telah diatur untuk mulai membaca standar dan sampel. Kuantifikasi DNA, 10/2004 C. Membaca standar / sampel1. Periksa kuvet untuk memastikan bahwa tidak ada kotoran atau noda yang mungkin

mengganggu pembacaan absorbansi.2. Transfer sampel kedalam berhati-hati untuk tidak ada gelembung di sepanjang

dinding kuvet tersebut. Pertama membaca standar.3. Masukkan kuvet ke dalamspec. Dan pastikan bahwa kondisi yang benar dengan

arah sinar. 4. Tutup penutup dan tekan "Baca sampel" untuk mulai membaca. 5. Pembacaan absorbansi akan muncul di layar ketika membaca lengkap (sekitar 3 detik).

6. Siapkan standar berikutnya seperti di atas, dan lanjutkan membaca sampai semua

standar telah diukur. 7. Pembacaan ini akan menyediakan beberapa bagian penting data:a. A 260 Ini adalah panjang gelombang cahaya yang diserap oleh DNA. Ini

nilai yang digunakan untuk menentukan bahwa konsentrasi DNA pada sampel Anda (A sesuai dengan faktor konversi yang Anda tetapkan sebelumnya 260)b. A 280 Serapan yang dihasilkan pada 280 nm digunakan dalam rasio(260

:280) Yang menentukan kemurnian DNA Sampel.c. kemurnian dianggap memadai jika A (260: 280)= > 1.5. d. "Conc." - Berdasarkan faktor konversi dan faktor pengenceran Anda DNA

in diprogram ke dalam spec saat start-up, ini adalah konsentrasi DNA sampel (mg/ml ) 8. Hasil pembacaan standar harus akurat ( 10%) sebelum melanjutkan dengan sampel Anda. 9. Lanjutkan membaca contoh Anda seperti di atas sampai semua sampel telah diukur. 10. Untuk mencetak hasil Anda, tekan "Print", yang pada waktu Anda akan diberikan tiga pilihan cetak. Pilih opsi "3", yang mengarahkan spektrofotometer11. Untuk mencetak semua data sampel belum dicetak. Dua opsi lainnya juga bisa

digunakan tapi periksa manual untuk menentukan apakah ini adalah pilihan terbaik. 12. Untuk keluar dari program tekan "Batal", kemudian "