“Malattia esostosante: dalla caratterizzazione genotipo ... · genotipo fenotipo al registro di malattia, per ... • Bassa statura • Trasformazione maligna ... Laboratorio di

“Malattia esostosante: dalla caratterizzazione genotipo fenotipo al registro di malattia, perarrivare alla valutazione dei meccanismi molecolari”

“Malattia esostosante: dalla caratterizzazione genotipo fenotipo al registro di malattia, perarrivare alla valutazione dei meccanismi molecolari”

S.S.D. di Genetica Medica e Malattie Rare Ortopediche

Istituto Ortopedico Rizzoli - BOLOGNA

Dott. Luca Sangiorgi

S.S.D. di Genetica Medica e Malattie Rare Ortopediche

Istituto Ortopedico Rizzoli - BOLOGNA

Dott. Luca Sangiorgi

V° Incontro-Convegno A.C.A.R. "EME - Ollier/Maffucci: presente e futuro"

- San Giovanni Rotondo (FG), 12-14 Aprile 2013 -

• Aumento del numero e volume delle lesioni fino alla maturità scheletrica

• Grande variabilità di numero, sedi interessate ed evoluzione a livello intra- ed inter-familiare

Complicazioni

• Deformità scheletriche e limitazioni funzionali

• Compressione strutture adiacenti

• Dolori articolari

• Bassa statura

• Trasformazione maligna

• Aumento del numero e volume delle lesioni fino alla maturità scheletrica

• Grande variabilità di numero, sedi interessate ed evoluzione a livello intra- ed inter-familiare

Complicazioni

• Deformità scheletriche e limitazioni funzionali

• Compressione strutture adiacenti

• Dolori articolari

• Bassa statura

• Trasformazione maligna

aspetti clinici

VARIABILITA’ CLINICAVARIABILITA’ CLINICA

V INCONTRO-CONVEGNO A.C.A.R. – San Giovanni Rotondo, 12-14 Aprile 2013V INCONTRO-CONVEGNO A.C.A.R. – San Giovanni Rotondo, 12-14 Aprile 2013

Identificati 2 geni principali:

EXT1 (8q24.1-q24.13)

EXT2 (11p11-p12)

Identificati 2 geni principali:

EXT1 (8q24.1-q24.13)

EXT2 (11p11-p12)

Glicoproteine ad attività glicosil-transferasica coinvolte nella biosintesi delle catene glicosidiche dei proteoglicani eparan-solfati (HSPG)Glicoproteine ad attività glicosil-transferasica coinvolte nella biosintesi delle catene glicosidiche dei proteoglicani eparan-solfati (HSPG)

aspetti molecolari

HME ampio spettro di mutazioni intersperse nell’intera lunghezza di EXT1 ed EXT2 HME ampio spettro di mutazioni intersperse nell’intera lunghezza di EXT1 ed EXT2

ETEROGENEITA’ ALLELICAETEROGENEITA’ ALLELICA


Cause della variabilità clinica in pazienti affetti da HME

Meccanismi alla base della trasformazione maligna

Insorgenza della patologia in pazienti privi di mutazioni a carico di EXT1/2 (10% dei casi)

Mancanza di marcatori diagnostici e approcci terapeutici alternativi alla chirurgia

Basi molecolari di formazione delle esostosi poco chiare

Cause della variabilità clinica in pazienti affetti da HME

Meccanismi alla base della trasformazione maligna

Insorgenza della patologia in pazienti privi di mutazioni a carico di EXT1/2 (10% dei casi)

Mancanza di marcatori diagnostici e approcci terapeutici alternativi alla chirurgia

Basi molecolari di formazione delle esostosi poco chiare

Questioni aperte sulla malattia esostosanteQuestioni aperte sulla malattia esostosante


Percorso di studioPercorso di studio

1) Impostazione AMBULATORIO clinico-genetico (da marzo 2003)

2) Messa a punto di un PROTOCOLLO DIAGNOSTICO

3) Integrazione dati genetici/clinici progettazione e realizzazione di un DATABASE e REGISTRO di patologia

7) Studi preliminari: CORRELAZIONE genotipo-fenotipo

5) Linee di RICERCA

1) Impostazione AMBULATORIO clinico-genetico (da marzo 2003)




5) Linee di RICERCA


SSD di Genetica Medica e Malattie Rare OrtopedicheSSD di Genetica Medica e Malattie Rare Ortopediche

Laboratorio di Genetica MolecolareScreening diagnostico / Ricerca

Laboratorio di Genetica MolecolareScreening diagnostico / Ricerca

CLIBI - Clinical Bioinformatic

Sviluppo di strumenti informatici per la ricerca biomedica e l’assistenza

CLIBI - Clinical Bioinformatic

Sviluppo di strumenti informatici per la ricerca biomedica e l’assistenza

Day Clinic Genetico Counseling, diagnosi e assistenza di pazienti affetti da patologie muscolo-scheletriche rare

Hub & SpokeNetwork regionale per la diasnosi e il trattamento di displasie scheletriche

Day Clinic Genetico Counseling, diagnosi e assistenza di pazienti affetti da patologie muscolo-scheletriche rare

Hub & SpokeNetwork regionale per la diasnosi e il trattamento di displasie scheletriche



2009.0 2010.0 2011.0 2012.00

50

100

150

200

250

300

350

Prime visite

Controlli

Diagnosi

• Il grafico riassume l’attività clinica e diagnostica della Genetica medica.

• Dal 2009 al 2012 il trend è stato sempre positivo con un incremento medio pari a circa il 20%

• Si ipotizza un mantenimento dell’attività per il prossimo biennio 2013-2014

• Il grafico riassume l’attività clinica e diagnostica della Genetica medica.

• Dal 2009 al 2012 il trend è stato sempre positivo con un incremento medio pari a circa il 20%

• Si ipotizza un mantenimento dell’attività per il prossimo biennio 2013-2014

ESOSTOSI MULTIPLA 261

NARCOLESSIA 210

ATROFIA OTTICA DI LEBER 92

SINDROME DI TURNER 86

IPERPLASIA ADRENALICA CONGENITA 76

TALASSEMIE 73

PUBERTA' PRECOCE IDIOPATICA 71

CONNETTIVITI INDIFFERENZIATE 64

SINDROME DA PSEUDO-OSTRUZIONE INTESTINALE 52

SINDROME DI MARFAN 44

MALATTIA DI BEHCET 35

OSTEOGENESI IMPERFETTA 35

NEUROFIBROMATOSI 29


Pazienti Regione Emilia RomagnaPazienti Regione Emilia Romagna

• Si riporta l’attività intra-regionale suddivisa per Aree Vaste

• L’area Centro risulta essere la più numerosa con la città di Bologna

• Nell’Area Nord l’attività proviene principalmente dalle provincie di Modena e Reggio Emilia

• L’Area Vasta Romagna è caratterizzata da provenienza quasi esclusiva della provincia di Ravenna

• Si riporta l’attività intra-regionale suddivisa per Aree Vaste

• L’area Centro risulta essere la più numerosa con la città di Bologna

• Nell’Area Nord l’attività proviene principalmente dalle provincie di Modena e Reggio Emilia

• L’Area Vasta Romagna è caratterizzata da provenienza quasi esclusiva della provincia di Ravenna


Pazienti extra RegionePazienti extra Regione

L’attività Extra-Regione risulta essere prevalenteLe Regioni principalmente coinvolte sono:

● Lombardia● Lazio● Toscana● Veneto● Sicilia

L’attività Extra-Regione risulta essere prevalenteLe Regioni principalmente coinvolte sono:

● Lombardia● Lazio● Toscana● Veneto● Sicilia

Classificazione clinicaClassificazione clinica


Per comprendere meglio la patologia e per uniformare le informazioni tra i vari centri di assistenza abbiamo realizzato

una nuova classificazione partendo da un dataset di 300 pazienti e l’abbiamo testata statisticamente mediante reti

neurali

Per comprendere meglio la patologia e per uniformare le informazioni tra i vari centri di assistenza abbiamo realizzato

una nuova classificazione partendo da un dataset di 300 pazienti e l’abbiamo testata statisticamente mediante reti

neurali

Class Subclass

INo deformities – No functional limitationsIA ≤ 5 sites with EsIB > 5 sites with Es

IIDeformities – No functional limitationsIIA ≤ 5 sites with deformitiesIIB > 5 sites with deformities

IIIDeformities – Functional limitationsIIIA 1 site with functional limitationIIIB > 1 site with functional limitations

Classe IClasse IIClasse III

INGRAVESCENZA


1) Impostazione AMBULATORIO clinico-genetico




5) Linee di RICERCA


Protocollo diagnosticoProtocollo diagnostico

Grandi delezioni/inserzioni

Grandi delezioni/inserzioni

DHPLC

SEQUENZIAMENTODIRETTO

Mutazioni puntiformi, piccole inserzioni/delezioni

Mutazioni puntiformi, piccole inserzioni/delezioni

++ MLPA

Real-Time PCR






5) Linee di RICERCA


INFORMAZIONI CLINICHEINFORMAZIONI CLINICHE

Campioni biologiciCampioni biologici

Alberi genealogiciAlberi genealogici

Informazioni anagraficheInformazioni anagrafiche

Immagini radiograficheImmagini radiografiche

DATI GENETICIDATI GENETICIV INCONTRO-CONVEGNO A.C.A.R. – San Giovanni Rotondo, 12-14 Aprile 2013V INCONTRO-CONVEGNO A.C.A.R. – San Giovanni Rotondo, 12-14 Aprile 2013


Registro di Patologia della Malattia Esostosante

►Scopo

Indagare la storia naturale della Malattia Esostosante al fine di incrementare le conoscenze e la comprensione dei processi sottostanti le manifestazioni cliniche, in un contesto in cui le informazioni sono scarne e disaggregate

►Finalità

↘ Aumentare la consapevolezza sulla Malattia delle Esostosi Multiple ↘ Facilitare la diagnosi della patologia

↘ Rispondere ai quesiti epidemiologici ancora irrisolti↘ Identificare gruppi di pazienti omogenei in cui effettuare correlazioni genotipo-fenotipo

↘ Aumentare la qualità della gestione dei pazienti↘ Favorire studi di ricerca su eziopatogenesi e definizione di nuove strategie terapeutiche

Ricadute• approfondimento del dato epidemiologico

• individuazione di un percorso assistenziale mirato

• l’individuazione di nuove indicazioni terapeutiche

• risparmio per il sistema sanitario

• migliore qualità di vita per il paziente






5) Linee di RICERCA


Studio di correlazione genotipo-fenotipo Studio di correlazione genotipo-fenotipo

Assenza di una correlazione definita tra background genetico e manifestazione clinica

Assenza di una correlazione genetica con la degenerazione maligna

Fattori di rischio (sviluppo di una forma clinicamente severa): - sesso maschile - mutazioni germinali a carico di EXT1 - numero di sedi scheletriche colpite > 20

Fattori protettivi (sviluppo di una forma clinicamente lieve): - sesso femminile - assenza di mutazioni germinali a carico di EXT1/EXT2 - mutazioni germinali a carico di EXT2 - numero di sedi scheletriche colpite < 5

Individuazione di gruppi clinicamente e geneticamente omogenei di pazienti

Assenza di una correlazione definita tra background genetico e manifestazione clinica

Assenza di una correlazione genetica con la degenerazione maligna

Fattori di rischio (sviluppo di una forma clinicamente severa): - sesso maschile - mutazioni germinali a carico di EXT1 - numero di sedi scheletriche colpite > 20

Fattori protettivi (sviluppo di una forma clinicamente lieve): - sesso femminile - assenza di mutazioni germinali a carico di EXT1/EXT2 - mutazioni germinali a carico di EXT2 - numero di sedi scheletriche colpite < 5

Individuazione di gruppi clinicamente e geneticamente omogenei di pazienti







5) Linee di RICERCA


Progetti di RicercaProgetti di Ricerca

1) Screening mutazionale somatico in tessuti HME e CS

2) microRNA profiling in tessuti HME

3) SNP/CNV genotyping

7) Studio del promotore di EXT1

5) Analisi del profilo biochimico









?

Screening tissutaleScreening tissutale

L’ inattivazione biallelica di EXT1/2 è necessaria per formazione/trasformazione esostosi?

Screening mutazioni puntiformi e copy number EXT1/2 in tessuti esostosi e condrosarcomi

Possibili meccanismi alternativi:

Regolazione post-trascrizionale

Sequenze regolative

Geni alternativi

Lymphocyte (HE) Femural osteochondroma (HE)

Peripheral chondrosarcoma (HO)

Mutation: EXT1, c.218delA









microRNA profilingmicroRNA profiling

• Piccoli RNA non codificanti che regolano l’

espressione genica a livello trascrizionale

e/o traduzionale

• Dati recenti in letteratura sull’ espressione di

microRNA in tessuti cartilaginei normali e

patologici

Possibile ruolo di microRNA in tumori benigni della cartilagine?


1. Microarray profiling

2. Taqman Real-time PCR

3. In silico pathways analysis

• Selezionati 8 miRNAs già associati alla fisiopatologia della cartilagine

miRNAs signature in grado di distinguere controlli sani da campioni HME


• Primo studio sull’ espressione di miRNA in tessuti di osteocondroma e cartilagine di accrescimento

• miRNAs differenzialmente espressi potrebbero alterare il signaling molecolare responsabile della proliferazione e differenziamento dei condrociti nella piastra di accrescimento

Possibile ruolo nella patogenesi e variabilità clinica dell’ HME

Ruolo dei miRNA nella trasformazione maligna?

Possibile uso di miRNA sierici come marcatori diagnostici/prognostici?

Potenziali target terapeutici?









1. Basi molecolari della variabilità clinica dell’ HME

2. Meccanismi della trasformazione maligna

3. Patogenesi dell’ HME in pazienti negativi

Geni modificatori ?Altri geni malattia?

SNP/CNV genotypingSNP/CNV genotyping

Illumina genotyping di 150 pazienti affetti da HME

330,000 tag SNPs40,000 markers for CNVs


10 SNPs (p-value <1e-5) associati a trasformazione maligna; solo 2 SNPs su sequenze codificanti (ME1, CLIC5)

19 SNPs (p-value <1e-5) correlati alla severità clinica (classe I vs classe III)

CNV calling: delezione in omozigosi nel cromosoma 1 (4/30 pazienti senza mutazioni in geni EXT)


Chromosome Position Strand A1 A2 N effB se_effB chi2.1df P1df Pc1dfRS4712036 6 53528462 + A C 124 -0.2639002 0.05625811 22.00438 2.720292e-06 2.720292e-06RS1180241 6 83988789 + G A 123 0.2246580 0.05234391 18.42092 1.771028e-05 1.771028e-05

RS11970621 6 169486522 + G A 124 -0.4857771 0.11405411 18.14063 2.051769e-05 2.051769e-05RS7749332 6 169488093 + A C 124 -0.4857771 0.11405411 18.14063 2.051769e-05 2.051769e-05RS1289188 5 103434579 + A G 124 -0.2248188 0.05336994 17.74483 2.526027e-05 2.526027e-05RS1289192 5 103436255 + G A 124 -0.2248188 0.05336994 17.74483 2.526027e-05 2.526027e-05RS596701 18 2818699 + G A 122 -0.2621206 0.06266370 17.49727 2.877213e-05 2.877213e-05

RS2589838 4 124812173 + C A 124 -0.2518460 0.06130557 16.87602 3.990247e-05 3.990247e-05RS10484841 6 46053905 + G A 124 -0.2352597 0.05741909 16.78736 4.181084e-05 4.181084e-05RS1950630 14 39222713 + G A 124 -0.6093252 0.15138952 16.19969 5.700346e-05 5.700346e-05








Studio del promotore di EXT1Studio del promotore di EXT1

Basi molecolari della variabilità clinica dell’ HME: polimorfismi in sequenze regolative?

rs34016643 potenziale SNP modificatore della variabilità clinica osservata nei pazienti HME









Analisi del profilo biochimicoAnalisi del profilo biochimico

Scopo: giungere alla effettiva caratterizzazione degli effetti delle mutazioni a carico dei geni EXT sui loro prodotti enzimatici

Scopo: giungere alla effettiva caratterizzazione degli effetti delle mutazioni a carico dei geni EXT sui loro prodotti enzimatici

Risultato: comprensione dell’eziopatogenesi effettiva della malattia

Risultato: comprensione dell’eziopatogenesi effettiva della malattia

Metodo: correlazione tra i differenti status mutazionali e la risultante biochimica a livello tissutale (struttura HS)

Metodo: correlazione tra i differenti status mutazionali e la risultante biochimica a livello tissutale (struttura HS)

Al momento non esiste caratterizzazione degli HS


Estrazione chirurgica di cartilagine articolare e di accrescimento

Estrazione chirurgica di cartilagine articolare e di accrescimento

Estrazione, purificazione, frazionamento GAG, isolamento HS

Estrazione, purificazione, frazionamento GAG, isolamento HS

Analisi NMR, HSQC

Analisi NMR, HSQC Depolimerizz.

HS e MS

Depolimerizz. HS e MS


Il primo passo è stato mettere a punto un protocollo per l’estrazione, l’isolamento e l’analisi degli HS da tessuto cartilagineo

Il primo passo è stato mettere a punto un protocollo per l’estrazione, l’isolamento e l’analisi degli HS da tessuto cartilagineo

XVI CONGRESSO NAZIONALE SIGU – Milano, 15 Novembre 2011XVI CONGRESSO NAZIONALE SIGU – Milano, 15 Novembre 2011

AL MOMENTO NON ESISTE UNA DESCRIZIONE COMPLETA DELLA STRUTTURA DEGLI HSs DA CARTILAGINE UMANA

AL MOMENTO NON ESISTE UNA DESCRIZIONE COMPLETA DELLA STRUTTURA DEGLI HSs DA CARTILAGINE UMANA

I risultati ottenuti saranno fondamentali per avere un parametro di riferimento per valutare la patogenesi di alcuni difetti genetici legati alla biosintesi degli HSs (tra cui le esostosi multiple ereditarie).

I risultati ottenuti saranno fondamentali per avere un parametro di riferimento per valutare la patogenesi di alcuni difetti genetici legati alla biosintesi degli HSs (tra cui le esostosi multiple ereditarie).

Studi in corso:

1) Estensione della casistica di riferimento

2) Analisi su cartilagine di accrescimento fetale

3) Prime analisi su cartilagine proveniente da pazienti affetti da malattia esostosante

Studi in corso:

1) Estensione della casistica di riferimento

2) Analisi su cartilagine di accrescimento fetale

3) Prime analisi su cartilagine proveniente da pazienti affetti da malattia esostosante

XVI CONGRESSO NAZIONALE SIGU – Milano, 15 Novembre 2011XVI CONGRESSO NAZIONALE SIGU – Milano, 15 Novembre 2011

Progetti Europeiin fase di Valutazione

E-RARE

• TheTaMO: Identification of molecular therapeutic targets and diagnostic/prognostic biomarkers for Multiple osteochondromas treatment and assistance.

• Partners: Svizzera, Germania e Francia

• Progetto triennale con un budget di circa 700.000 euro

TRANSCAN

• Identification of molecular therapeutic targets and diagnostic/prognostic biomarkers for Malignant Transformation of Osteochondromas

• Partners: Israele, Germania, Francia, Olanda e Belgio

• Progetto Triennale con un budget di circa 1 milione di euro


Morbo di Ollier e Sindrome di MaffucciMorbo di Ollier e Sindrome di Maffucci

Pazienti con aumentata incidenza di gliomi e tumori della granulosa giovanili

Gliomi associati a mutazioni in IDH1 e IDH2

Tumori della granulosa giovanili associati a

mutazioni in GNAS

Pazienti con aumentata incidenza di gliomi e tumori della granulosa giovanili

Gliomi associati a mutazioni in IDH1 e IDH2

Tumori della granulosa giovanili associati a

mutazioni in GNAS

I geni causativi delle patologienon sono noti

I geni causativi delle patologienon sono noti

Ricerca di mutazioni di IDH1, IDH2 o GNASin pazienti con Morbo di Ollier e Sindrome di Maffucci

Ricerca di mutazioni di IDH1, IDH2 o GNASin pazienti con Morbo di Ollier e Sindrome di Maffucci


• 35 su 43 (81%) pazienti affetti da morbo di Ollier (materiale proveniente da encondromi)

• 10 su 13 (77%) pazienti affetti da Sindrome di Maffucci (materiale proveniente da emangiomi a cellule fusiformi)

• 35 su 43 (81%) pazienti affetti da morbo di Ollier (materiale proveniente da encondromi)

• 10 su 13 (77%) pazienti affetti da Sindrome di Maffucci (materiale proveniente da emangiomi a cellule fusiformi)

Mutazioni somatiche del gene IDH1 o IDH2

Mutazioni somatiche del gene IDH1 o IDH2

• La presenza di mutazioni in IDH1 nei tumori cartilaginei è risultata associata a ipermetilazione e downregolazione di diversi geni

• La presenza di mutazioni in IDH1 nei tumori cartilaginei è risultata associata a ipermetilazione e downregolazione di diversi geni

Frequenza delle mutazioni somatichenei tumori provenienti da pazienti affettida Ollier e Maffucci paragonati a differenti sottotipi di tumori cartilaginei solitari e angiosarcomi

Ulteriori studi di tipo funzionale sono necessari per stabilire il ruolo biologico di tali deregolazioni

RingraziamentiRingraziamenti

Centro Nazionale Malattie Rare, Istituto Superiore di Sanità (Roma)

Armando MagrelliDomenica Taruscio Marco Salvatore

S.S.D. di Genetica Medica e Malattie Rare Ortopediche Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna

Genetica Medica, IRCCS Garofalo (Trieste)

Pio D’AdamoPaolo Gasparini

University Hospital of Antwerp (Belgium)

Wim WuytsIvy Jennes

Istituto di Ricerche chimiche e biochimiche “G. Ronzoni”, Milano

Antonella BisioGiangiacomo TorriNoemi Veraldi

V° Incontro-Convegno A.C.A.R. "EME - Ollier/Maffucci: presente e futuro"

- San Giovanni Rotondo (FG), 12-14 Aprile 2013 -

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