Apresentao do PowerPoint

MANIPULAO DO DNA in vitro:DNA- recombinante e PCR

CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS ENDONUCLEASES DE RESTRIO

Anlise Molecular do DNA somente possvel fragmentando o DNA em pequenos tamanhos: atravs de endonucleases de restrio (enzimas bacterianas que clivam internamente o DNA)Tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequncia especfica de 4 a 8 pares de bases, produzindo um grupo 3- OH em uma extremidade e um grupo 5- fosfato na outra.

As sequncias reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares sequncias idnticas mas invertidas: PALNDROMO. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS NOMENCLATURA DAS ENDONUCLEASES DE RESTRIO

Denominao de acordo com o organismo da qual foi isolada. Primeira letra corresponde ao gnero do microrganismo. As duas letras seguintes referem-se a espcie e um nmero final indica a ordem da descoberta da enzima no organismo. Ex:. Hae III (3 ER isolada da bactria Haemofilus aegyptius)

CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS

CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS DNA LIGASE

Enzima que promove a ligao dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. O DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Ferramenta que permite amplificar uma seqncia especfica de DNA (seq. alvo) em milhes de vezes dentro de poucas horas (Xerox)PCR citada em mais de 200.000 trabalhos cientficos (08/2005)HISTRIA

REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

1c1a2c2a3c3a4c4a5c5a6c6aPP = padro de tamanho molecular lambda Hind IIINc = controle sem DNA moldeNe = amostra com DNA molde sem resultado positivo (molde?)Gel ser refeito utilizando-se outros PCRs

Bandas visveis[Gel de agarose 1% corado com brometo de etdio e fotografado sob luz UV]PCR

CROMATOGRAFIA POR SOUTHERN BLOT

2. HIBRIDIZAO DA SONDA A FRAGMENTOS DE DNA

ANLISE DE POLIMORFISMOS DE DNA (RFLP)