MANIPULACIÓN Y MANEJO DE MODELO ANIMAL RATÓN (Mus

musculus) Y OBSERVACIÓN DE MACRÓFAGOS Y ESPLENOCITOS

Salazar, L.,Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Departamento de Ciencias de la Vida. Carrera de

Ingeniería en Biotecnología. Inmunología. Sangolquí – Ecuador. Julio 02, 2014.

RESUMEN

La experimentación con animales de laboratorio, principalmente con ratones, ha sido fundamental para los

avances en el campo de la biomedicina y la Inmunología. Se han llevado a cabo varios estudios a nivel de

laboratorio para la obtención de macrófagos y esplenocitos a partir de ratones, con la finalidad de estudiar la

actividad inmunitaria de éstas células que constituyen la primera línea de defensa con agentes extraños. En el

presente trabajo se han desarrollado técnicas de manipulación, vías de administración y necropsia en ratones de

laboratorio machos de nueve semanas de vida, cuyo peso promedio fue 20,49g. Posteriormente se obtuvo

macrófagos del líquido peritoneal con medio RPMI 1640 y condiciones de incubación de 37°C y al 5% de CO2

durante cuatro horas. Se observó los macrófagos en el microscopio invertido. Posteriormente se obtuvo

esplenocitos del bazo y se realizó la observación en microscopio invertido y el conteo celular en cámara de

Neubaer. El conteo de esplenocitos dio como resultado 0 células viables.

Palabras claves: Ratón, Mus musculus, obtención de macrófagos, obtención de esplenocitos, cámara de

Neubaer.

ABSTRACT

Experiments with laboratory animals, mainly mice, has been fundamental to advances in biomedicine and

Immunology. There have been several studies conducted at the laboratory for obtaining macrophages and

splenocytes from mice, in order to study the immune activity of these cells that are the first line of defense with

foreign agents. In the present study we have developed handling techniques, routes of administration and

necropsy in male laboratory mice, nine weeks old, whose average weight was 20.49 g. Peritoneal fluid

macrophages later with RPMI 1640 medium and incubation conditions of 37 ° C and 5% CO2 for four hours was

obtained. Macrophages were observed in an inverted microscope. Subsequently splenocytes spleen was

obtained and observation was performed on an inverted microscope and cell counting in Neubauer chamber.

Counting 0 splenocytes resulted viable cells.

Keywords: mouse, Mus musculus, obtaining macrophages, obtaining splenocytes, Neubauer chamber.

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1. INTRODUCCIÓN

La experimentación con modelos animales inició

antes de los años 1600 y se utilizó para estudios de

anatomía, fisiología e histología. Actualmente, la

investigación con animales sigue siendo de gran

importancia en diversas áreas de estudio, como:

investigación en cáncer y enfermedades infecciosas,

sanidad humana y animal, desarrollo de procesos

biotecnológicos, investigación genómica,

neurociencias, farmacéutica y ensayos

inmunológicos (Granados-Zúñiga, 2010). A pesar

de la dificultad que representa extrapolar los

resultados obtenidos a humanos, la experimentación

con animales representa varias ventajas, como: fácil

manipulación, alta fecundidad, bajo costo y

reproducibilidad (Salguero et al., 2007).

1.1. Mus musculus como modelo experimental

La especie más utilizada en la investigación

científica es el ratón (Mus musculus). Posee un

pequeño tamaño, peso adulto de 25-30 g. El olfato

es muy desarrollado y tiene un sentido muy agudo

de la audición y el tacto. Las funciones de la cola

son termorregulación y equilibrio. Son animales de

hábitos nocturnos La determinación del sexo se

realiza observando la distancia ano-genital, que en

los machos suele ser aproximadamente el doble que

en las hembras (Santos, s.f.).

MANEJO Y SUJECIÓN: El ratón se sujeta con

firmeza por la base de la cola y se coloca una

superficie rugosa donde pueda agarrarse. Se pinza la

piel del cuello con el pulgar y el índice de la otra

mano. A continuación se levanta al animal y se

atrapa la cola entre el dedo anular y meñique. El

ratón se debe sujetar firmemente, con la finalidad de

que no muerda al investigador (Zúñiga et al., 2001;

Hedrich, 2004).

VÍAS DE ADMINISTRACIÓN: Las vías más

comunes para la administración de sustancias son:

subcutánea, intravenosa e intraperitonial. La vía de

administración peritoneal se aplica en el cuadrante

inferior derecho o izquierdo del abdomen. La

jeringa se introduce con el bisel hacia arriba,

paralelamente a la columna vertebral, para evitar

penetración en las vísceras, con 10º respecto al

abdomen. Se recomienda introducir un volumen de

hasta 3 ml (Hedrich, 2004).

EUTANASIA: Según Zúñiga et al. (2001) la

eutanasia es el acto de sacrificar animales mediante

métodos que induzcan una inconsciencia rápida y

muerte con mínimo dolor y estrés. Un método de

eutanasia es la dislocación cervical, la cual produce

inconsciencia inmediata y muerte. En ratones se

sitúan pulgar e índice a cada lado del cuello junto a

la base del cráneo o, de modo alternativo, se

presiona una varilla junto a la base del cráneo,

paralelamente con la otra mano, se tira rápidamente

de la base de la cola, produciendo la separación de

las vértebras cervicales y el cráneo (Banister et al.,

s.f.)

1.2. Macrófagos

Según Strauss-Ayali et al. (2007) citado por

Larocca (2010), los macrófagos son células del

sistema inmune que poseen capacidad fagocítica y

microbicida; por lo tanto, desempeñan un rol

importante en la inmunidad anti-infecciosa. Se

derivan de los monocitos de la sangre, después de su

migración a través del torrente circulatorio. Son

células especializadas que se encuentran en la

mayoría de tejidos conjuntivos y en órganos, como:

hígado (células de Kupffer), sistema nervioso

central (células microgliales) y pulmones

(macrófagos alveolares). Además de ingerir

microbios, los macrófagos ingieren células muertas

del anfitrión, secretan citocinas, actúan como

células presentadoras de antígenos (CPA) y

promueven la angiogenia y fibrosis (Abbas,

Lichtman & Pillai, 2012).

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1.3. Esplenocitos

Según García (1994) los esplenocitos son células

del sistema inmune que se encuentran

principalmente en el seno del bazo. Se encargan de

reconocer y fagocitar células sanguíneas

envejecidas o malformadas y microorganismos.

1.4. Cámara de Neubauer

La cámara de Neubauer se emplea para el conteo de

células en un medio líquido. Está adaptada al

microscopio de campo claro o de contraste de fases.

Está formada por un portaobjetos de cristal en cuyo

tercio central se encuentran tres plataformas de las

cuales la central, que está situada 0,1 mm por

debajo de las laterales, presenta una cuadrícula

subdividida en 9 cuadrados de 1 x 1 mm cada uno

(1 mm2). Para facilitar el conteo celular, cada

cuadrado se divide nuevamente en 16. En la cámara

de Neubauer mejorada el cuadrado central se divide

en 25 cuadrados terciarios (Fuentes, Castiñeiras &

Queraltó, 1998; Ramos & Martínez, 2008).

El objetivo del presente trabajo es aprender técnicas

de manipulación, vías de administración de

sustancias y necropsia en ratones de laboratorio,

para posteriormente obtener macrófagos de líquido

peritoneal y esplenocitos del bazo y realizar el

conteo celular en cámaras de Neubaer.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Modelo animal

Se empleó ratones de laboratorio machos de

aproximadamente nueve semanas de vida, cuyo

peso promedio inicial fue de 20.49g. Durante el

período de experimentación los animales de

mantuvieron bajo condiciones controladas.

2.2. Manipulación

Para la manipulación de los ratones se empleó la

técnica de restricción a mano descrita en Zúñiga et

al., 2001 y Hedrich, 2004. En la figura 1 se observa

el método de sujeción de los ratones utilizado en los

ensayos.

Figura 1. Restricción a mano.- Se sujetó el ratón

por la base de su cola y se colocó en una superficie

donde pueda sostenerse. Se agarró un pliegue de

piel en la parte posterior del cuello (cerca de las

orejas). Se fijó la piel floja a lo largo de la espalda y

la cola del ratón. Se colocó al ratón con el lado

ventral hacia arriba y se atrapó la cola entre el dedo

anular y meñique.

2.3. Control de peso

Se pesó cada ratón dos veces por semana por un

periodo de dos semanas. En la siguiente figura se

puede observar el procedimiento empleado para

determinar el peso de los ratones.

2.4. Inmunización

Mediante la vía de administración intraperitoneal se

inyectó aproximadamente 0,3 ml de una solución

tampón denominada PBS (Phosphate Buffered

Saline). Posteriormente, se administró 0,2 ml de

tioglicolato fluido de concentración 30 mg L-1

mediante vía intraperitoneal, con la finalidad de

estimular los macrófagos del ratón. En la figura 2 se

observa la administración de tioglicolato.

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Figura 2. Administración de tioglicolato vía

intraperitoneal. Se sostuvo al ratón mediante la

técnica de restricción a mano. Se desinfectó la

región abdominal con una torunda de algodón y

alcohol. Se introdujo la aguja con el bisel hacia

arriba, paralelamente a la columna vertebral, con

10º respecto al abdomen y se administró 0,2 ml de

Tioglicolato.

2.5. Disección del ratón

Se realizó una disección del ratón, con la finalidad

de observar los principales órganos internos. Se

extrajo el intestino y el corazón realizando cortes en

las bases de los órganos. Para abrir el cráneo se

realizó un corte a nivel del hueso occipital,

posteriormente se cortó el nervio ocular y se extrajo

el cerebro. Se midió las dimensiones de estos tres

órganos.

2.6. Obtención y observación de macrófagos

Tres días después de la inmunización, se sacrificó

cuatro ratones por la técnica de dislocación cervical,

para lo cual se agarró cada ratón de la cola y se lo

colocó en una superficie para que se sostenga,

posteriormente se aplicó una fuerte presión en las

vértebras cervicales con la ayuda de un mango de

bisturí, con la finalidad de ocasionar una muerte

instantánea. Se colocó el ratón sobre una superficie

y se llenó la cavidad peritoneal con 10 ml de medio

RPMI (contiene L-glutamina, buffer HEPES 25mM

y bicarbonato de sodio) frío. Se realizó cortes en el

pelaje para exponer el área abdominal y se recuperó

el líquido inyectado con la misma jeringuilla, a

continuación se vertió en una caja Petri y se

adicionó medio RPMI fresco. Se lleva a incubación

con 5% de CO2, a 37ºC por un período de cuatro

horas. Luego del período de incubación se observó

los macrófagos adheridos a la placa Petri en el

microscopio invertido a 40X. 24 horas después se

realizó una tinción Giemsa y se volvió a observar en

el microscopio invertido a 40X.

2.7. Obtención, conteo y observación de

esplenocitos

Siete días después de la inmunización con

tioglicolato se sacrificó cuatro ratones mediante la

técnica de dislocación cervical. Se realizó la

disección del ratón y se extrajo el bazo.

Posteriormente se colocó el bazo en una caja Petri

con medio RPMI y se trituró con el pistón de una

jeringa estéril, hasta obtener fragmentos pequeños.

A continuación se filtró el medio con una gasa en

tubos Falcon. Se llevó los tubos a centrifugación a

1500 rpm por 5 minutos a una temperatura de 4°C.

A continuación, se eliminó el sobrenadante y el

pellet fue resuspendido en 5ml de medio RPMI.

Se tomó 1 µl del medio y se diluyó en 9 µl de azul

Tripán. Para realizar el conteo se empleó una

cámara de Neubauer. Se colocó 10 µl de esta

dilución en el orificio de la cámara, para distinguir

las células vivas de las muertas. Se colocó la cámara

de Neubauer en el microscopio óptico a 40X y se

procedió a realizar el conteo de esplenocitos. En la

siguiente figura se ilustra las regiones de la cámara.

En este ensayo el conteo se realizó en el cuadrado 1.

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Figura 3. Cámara de Neubauer. El conteo de

células puede realizarse en los cuadrados 1,2 ó 3. En

cada caso se aplicará una fórmula para la

determinación de la concentración celular.

Se calculó la concentración de células mediante la

siguiente fórmula:

Donde:

C.C.= concentración celular, F.D.= factor de

dilución, Vo =volumen final.

Se colocó una concentración celular de 5x106

esplenocitos en una alícuota de 200 ul en cinco

pocillos de una P96 y posteriormente se llevó al

microscopio invertido para la observación de

esplenocitos.

3. RESULTADOS

3.1. Sobrevivencia

Se evaluó la sobrevivencia de los ratones

diariamente durante todo el período de

investigación. Cada una de las especies fue

sacrificada mediante dislocación cervical. No se

observó otras causas de mortalidad. En la siguiente

figura se representa la sobrevivencia de los ratones

durante las dos semanas de duración del ensayo.

Figura 4. Sobrevivencia. Se observa que el número

de ratones se mantiene constante durante los siete

primeros días. Al día siete se sacrificó cuatro

ratones para realizar la obtención y observación de

macrófagos. Al llegar al día 11, se sacrificó las

especies restantes para realizar el conteo de

esplenocitos, por lo que la población se reduce a

cero. No se observó otra causa de mortalidad en los

ratones, a parte de la dislocación cervical.

3.2. Peso promedio

En la siguiente figura se observa el peso promedio

de los ratones durante las dos semanas de

experimentación.

Figura 5. Peso promedio de los ratones vs.

Tiempo. Se muestra el peso promedio de los

ratones durante el período de experimentación. Se

observa el mismo patrón de crecimiento que en el

análisis del peso individual.

0

2

4

6

8

10

0 5 10

Nú

me

ro d

e r

ato

rne

s vi

vos

Días

SOBREVIVENCIA

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3.3. Órganos internos

En la Tabla 2 se presenta la medida de los órganos

(cerebro, bazo e intestino) de los ratones 5, 6,7 y 8

que fueron sacrificados el cuarto día para realizar el

cultivo de macrófagos.

Tabla 2. Medición de órganos de los ratones 5,

6,7 y 8.

# DE

RATÓN

Cerebro (cm) Bazo (cm) Intestino

(cm)

Largo Ancho Largo Ancho Largo

5

1,25

1 1,3 0,5 34

6 1,2 0,8 1,5 0,4 30

7 1,5 0,9 1,5 0,4 45

8 1,5 1 1,4 4 31

3.4. Obtención y observación de macrófagos

Se observó los macrófagos adheridos en la caja Petri

y teñidos mediante tinción Giemsa. Además se

observó restos celulares en la mayoría de cultivos de

macrófagos. No fue posible realizar conteo celular

porque no se obtuvo un número considerable de

macrófagos. En la siguiente figura se muestra la

observación de macrófagos en el microscopio

invertido.

Figura 6. Observación de macrófagos (circulo),

eritrocitos (flecha negra) y desechos celulares

(flecha roja) de rató teñidos con Giemsa en

microscopio invertido 40X, luego de 24 horas de la

incubación.

3.3 Conteo de esplenocitos

En la Tabla 3 se presenta los resultados del conteo

de esplenocitos teñidos con azul Tripán de los

ratones 1, 2, 3 y 4.

Tabla 3. Número de esplenocitos en un volumen

de 5ml de suspensión celular. Se observa que el

número promedio de esplenocitos obtenidos a partir

de los ratones 1, 2, 3 y 4 es de 1,1172x107. No se

observó esplenocitos en la suspensión celular

obtenida a partir del ratón 2.

# DE RATÓN # DE

ESPLENOCITOS

1 11.562x106

2 0

3 23.125 x106

4 10.0 x106

PROMEDIO 11.172 x106

En la siguiente figura se muestra los esplenocitos

observados al microscopio invertido.

Figura 7. Observación de esplenocitos de ratón en

placa 96P con microscopio invertido 40X (Sánchez,

2014)

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4. DISCUSIÓN

Según Soriguer & López (1986) citado por

Medarde (2013) el comportamiento social de los

ratones varia notablemente dependiendo de la

disponibilidad de recursos alimenticios. Cuando la

disponibilidad de alimento es abundante, los ratones

tienden a formar grandes grupos donde el

comportamiento agresivo no es frecuente. Además,

existen diferencias de comportamiento entre machos

y hembras, siendo los machos más territoriales y

agresivos. En el presente ensayo todos los ratones

fueron sacrificados por dislocación cervical; por lo

tanto, no se observó muertes ocasionadas por

comportamiento violento, a pesar de que todos los

ratones eran machos. Probablemente, no

presentaron conductas violentas debido a que la

disponibilidad de alimento y espacio fue adecuada

para cada una de las especies.

El peso aproximado de un ratón de 9 semanas de

vida es de 20-25g (Pierce, 2009). El peso promedio

inicial de los ratones fue de 20.49g (Figura 5), lo

cual está dentro del intervalo establecido por la

bibliografía. Sin embargo, si se analiza el peso

inicial de cada ratón por separado se observa gran

variación, desde 15.82 g hasta 27.26g. Durante la

segunda medición, se determinó que el peso

promedio aumentó a 22.44g y posteriormente, se

inoculó los ratones con tioglicolato vía

intraperitoneal. Al realizar la tercera medición, se

observó que el peso disminuyó a 22.19g, mientras

que en la cuarta medición aumentó a 23.4 g (Datos

no mostrados). Según Roitt (2008), el tioglicolato es

un estímulo no inmunológico que induce la

activación de los macrófagos y la respuesta inmune

en el ratón. Por lo tanto, la disminución de peso

observada en la tercera medición está asociada con

el estrés ocasionado en los ratones debido a la

inoculación de tioglicolato. Además, Jonas (1976)

citado por Fuentes (s.f.) define que otros factores

como: edad, sexo, constitución genética, nutrición,

exposición al ambiente y manejo sanitario,

producen cambios en el estado fisiológico de los

ratones de laboratorio, que conducen a un

incremento o pérdida de peso.

Se observó que los órganos internos de los ratones

estaban en buenas condiciones y no presentaron

lesiones. Se determinó las dimensiones del bazo,

intestinos y cerebro, ya que según Zúñiga et al.

(2001) son los órganos de mayor interés en las

investigaciones biomédicas. Las medidas del bazo

fueron semejantes en los cuatro ratones analizados;

al igual que las medidas del cerebro. Se observó

mayor variación en la longitud del intestino, desde

30 cm hasta 45 cm de largo (Tabla 2).

La incubación de macrófagos debe realizarse a

37°C, al 5% de CO2 por un periodo de 4-5 horas

(Porras et al., 2003). En el presente ensayo, se

aplicó las condiciones mencionadas en la

bibliografía; sin embargo, 24 horas después de la

incubación se realizó una tinción Giemsa para

visualizar de manera más precisa las células. No se

obtuvo resultados favorables y se observó gran

cantidad de lisis celular y unos pocos macrófagos,

por lo que no se realizó conteo celular.

El colorante azul Tripán se empleó para observar la

viabilidad celular de esplenocitos. De tal manera,

que cuando se realizó el conteo de células en la

cámara de Neubauer no se observó esplenocitos

viables. Probablemente una de las causas que

influenció en estos resultados desfavorables es que

no se empleó condiciones totalmente estériles

durante el procedimiento (Porras et al., 2003).

Además debido a la falta de práctica de los

estudiantes, el tiempo de preparación de la cámara

de Neubauer con la suspensión celular, para llevarla

al microscopio óptico fue muy largo, pudiendo

ocurrir lisis celular.

5. CONCLUSIONES

El ratón (Mus musculus) es el modelo animal más

empleado en la investigación biomédica. La

aplicación correcta de técnicas de manipulación,

vías de administración y necropsia, asegura en gran

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parte la fiabilidad de los procedimientos y

resultados.

Los ratones se encontraban en buen estado al

empezar el experimento, pues su peso promedio fue

de 20.49g, el cual está dentro del rango aceptable

según bibliografía. Los ratones se mantuvieron bajo

condiciones controladas y no presentaron

comportamientos agresivos, por lo que no se

observó otras causas de muerte, a parte de la

dislocación cervical. Este patrón se observa en la

figura 4, pues la sobrevivencia se mantiene

constante hasta los días donde se sacrificaron los

ratones. El comportamiento no agresivo de los

ratones se explica en gran parte a que no tenían que

competir entre ellos por conseguir alimento, pues

diariamente se les suministró la cantidad adecuada.

Los animales no presentaron ninguna anomalía en

sus órganos internos.

Los macrófagos son células que se adhieren a la

superficie donde se cultivan. Se pudo observar

macrófagos en el microscopio invertido; sin

embargo, no fue posible realizar conteo celular,

debido a que la tinción Giemsa se efectuó 24 horas

después de la incubación, período en el cual ocurrió

lisis celular.

Al realizar el conteo de esplenocitos en la cámara de

Neubauer, no se observó células viables. Los

resultados desfavorables se atribuyen a falta de

experiencia en los estudiantes y a que no se realizó

el procedimiento bajo condiciones estériles.

6. RECOMENDACIONES

Los ratones de experimentación deben mantenerse

en un bioterio bajo condiciones estériles y

controladas. El investigador debe tomar las medidas

de bioseguridad pertinentes al manipular ratones,

como el uso de guantes y mandil. Las técnicas de

manipulación deben ser empleadas con precisión

para evitar mordeduras o comportamientos

violentos del ratón. El trato hacia los animales de

laboratorio debe ser respetuoso aplicando los

principios de Bioética, por ejemplo: la técnica de

dislocación cervical debe ser rápida para provocar

una muerte con el mínimo sufrimiento a la especie.

Es muy importante conocer la cepa de los ratones

con los cuales se está trabajando y su procedencia.

Los procedimientos detallados en el presente ensayo

deben ser realizados en una cámara de flujo laminar,

con la finalidad de tener un medio aséptico y de que

no haya interferencias que podrían afectar los

resultados. Así también, para proteger la salud del

investigador.

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