Manipulasi Ekspresi Gen

TUJUAN KLONING GENMemperoleh produk gen target (protein)Slide 5DNA sisipan replikasi, transkripsi, translasi PROTEINKloning ke dalam VEKTOR EKSPRESI VEKTOR Slide 3Slide 6

Vektor Kloning

KLONING GENSlide 4

KLONING GEN (lanjutan)Slide 2

Slide 2

Keberhasilan ekspresi gen ?Kebutuhan komersial ?Dipengaruhi oleh bbrp faktor Slide 2Diperlukan manipulasi ekspresi genSlide 7

ORGANISASI GEN PROKARIOTKOMPONEN:TRANSKRIPSI : promotor, terminator, situs inisiasi transkripsiTRANSLASI : RBS, kodon start, kodon stopSlide 11

VEKTORSecara garis besar, vektor terbagi atas:Vektor kloningVektor ekspresi : komponen vektor kloning + promotor + RBSVektor shuttle : vektor yang bisa tumbuh di dua jenis sel inang, memp.dua ori yang dikenali sel inangnya, cth : bakteri & ragiSlide 9

Vektor Ekspresi

Vektor kloningVektor ekspresiSlide 10

KOMPONEN LAIN VEKTOR EKSPRESIMULTIPLE CLONING SITE (MCS)MARKA SELEKSIURUTAN NUKLEOTIDA PENGKODE UNTUK MEMPERMUDAH PEMURNIAN PROTEIN REKOMBINANSlide 23Slide 2

KOMPONEN REGULASI

PromotorTerminator HARUS DIKENALI OLEH SEL INANGRBS

Untuk tujuan ekspresi : promotor, RBS, Terminator KUATSlide 12

PROMOTOR, TERMINATOR & RBS Kekuatan promotor : efisiensi inisiasi transkripsiPromotor kuat : frekuensi transkripsi tinggiKekuatan terminator : efisiensi terminasi transkripsiTerminator kuat : transkripsi segera berhenti ketika mencapai terminatorKekuatan RBS : efisiensi translasiRBS kuat : efisiensi translasi tinggi

Slide 13

ORF HARUS TETAP DIPERTAHANKANMalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TTA GTT GCT GAT C--- Ile Glu Gly Arg Phe Leu Val Ala Asp

MalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TAG TTG CTG ATC --- Ile Glu Gly Arg Phe StopSlide 14

Slide 15

REGULASI DNA SISIPAN Penggunaan promotor kuat Protein rekombinan yang dihasilkan dapat toksik terhadap sel Ekspresi gen perlu diregulasi Penggunaan promotor yang diregulasi Slide 17Slide 29

CONTOH PROMOTOR YANG DIGUNAKAN PADA VEKTOR EKSPRESISlide 18

REPRESOR & INDUCERSlide 16

VEKTOR EKSPRESISenyawa penginduksi : IPTG (analog laktosa)Slide 19Slide 23

Regulasi operon lac pada plasmid pETSlide 20Slide 33

Lac Operon (Negative Regulation)Catabolic EnzymeRepressorInducerOperon

PEMILIHAN SISTEM EKSPRESI Sifat protein Tujuan penggunaan proteinSlide 22

SIFAT VEKTOR EKSPRESISlide 10

MARKA SELEKSIAMPR, TETRNEOR, Dihidrofolat reduktasePROMOTORTrp-lac; t7; nirB-aktin; CMV IE; SV40 earlyKEUNGGULANTingkat ekspresi Manipulasi mudahmurahTingkat ekspresi Modifikasi; sekresi folding; aktivitasKETERBATASANMasalah sekresiModifikasi sangat terbatasLambatmahalPROKARIOTEUKARIOT

TUJUAN PROTEIN FUSI Mempermudah proses pemurnian Direkayasa pada tingkat DNA Slide 24 OVERPRODUKSI Hasil transkripsi dan translasi adalah protein fusi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas Slide 26

PROTEIN FUSI NCHisHisHisHisHisHis(His-Tag)Ssisi restriksi Faktor XaProtein targetHis-Tag : untuk pemurnian dengan kolom afinitas Ni2+Sisi restriksi Faktor Xa : sisi pemotongan yang dikenali oleh Faktor Xa yang akan memotong setelah arginin dari Gly-Arg dengan tujuan untuk mendapatkan protein target murni tanpa His-Tag Protein target : hasil ekspresi dari gen yang diklon ke dalam vektor ekspresi yang digunakanPada plasmid pET 16b :Slide 18

OVERPRODUKSIOD600nm = 0,6-0,7370C, 150 rpm1%NI Glukosa 0,2%NI I I 370C,150rpmonPanen sel7000rpm,10,40CpeletResuspensi dlm PBS, 7000rpm, 10, 40CpeletHasil sonikasi10000rpm, 15Ekstrak proteinSDS PAGESTARTERSlide 23

PEMURNIAN MENGGUNAKAN KOLOM AFINITAS KOLOM Ni2+Slide 27

RECOVERY FUSION PROTEINSlide 28

Keterangan :Marker proteinNon induksiInduksi 0,3 mMInduksi 0,5 mMInduksi 0,8 mMInduksi 1,0 mMHasil : optimal pada induksi 0,5 mM IPTGOptimasi Overproduksi Menggunakan Variasi Konsentrasi IPTGSlide 19

MASALAH PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN PADA E.coliProblem yang berasal dari urutan gen asing Slide 30Problem yang disebabkan oleh E. coli Slide 32Slide 21

PROBLEM YANG BERASAL DARI URUTAN GEN ASING Gen asing tersebut kemungkinan mangandung intron Gen asing tersebut kemungkinan mampunyai urutan yang dikenali sebagai signal terminasi bagi E.coli Codon usage gen asing tersebut mungkin saja tidak sama dengan transalasi pada E. coliSlide 31

Slide 29

PROBLEM YANG DISEBABKAN OLEH E.coli E.Coli mungkin saja tidak memproses protein rekombinan dengan benar Folding protein rekombinan pada E.coli mungkin saja tidak benar E. Coli dapat mendegradasi protein rekombinan

Slide 21