Manual de Laboratorio de Bioquímica Tec

ndice

1Introduccin

2Encuadre del Sistema de Prcticas

2Introduccin

3Competencias a las que contribuye

3Niveles de Desempeo

4Ubicacin dentro del mapa curricular

5Programa del Sistema de Prcticas

61.BIOMOLECULAS

71.1.Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert.

111.2.Determinacin del contenido de protena soluble.

151.3.Determinacin del punto isoelctrico de una protena.

191.4.Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin.

241.5.Determinacin de parmetros de cintica enzimtica.

291.6.Determinacin de carbohidratos totales.

331.7.Aislamiento y cuantificacin de glucgeno.

371.8.Extraccin y cuantificacin de lpidos.

411.9.Determinacin de fosfoglicridos.

471.10.Extraccin y determinacin de pigmentos fotosintticos.

512.METABOLISMO

522.1.Oxidacin biolgica y transporte de electrones.

572.2.Actividad oxidativa de la lactato deshidrogenasa

622.3.Capacidad metablica celular y actividad de citocromo oxidasa

67Anexos

67Normas Generales de Seguridad e Higiene

69Medidas Generales en Caso de Accidente

IntroduccinEste manual est estructurado como material didctico de apoyo para actividades de laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Bioqumica, de la carrera de Oceanologa de la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad Autnoma de Baja California. El contenido del manual tambin podr ser utilizado por estudiantes en carreras afines y en cursos de bioqumica general con las adecuaciones que cada actividad de aprendizaje requiera para coadyuvar en su formacin disciplinaria. Encuadre del Sistema de PrcticasIntroduccinSe estima que el desarrollo de la asignatura de Bioqumica seria extraordinariamente rido y de difcil comprensin si no se acompaara de actividades complementarias de carcter prctico, las cuales permitan ilustrar y complementar conceptos o mecanismos moleculares complejos de la qumica de los seres vivos que se asocian a la estructura y a la dinmica del funcionamiento celular y de tejidos.

Con frecuencia se tiene la concepcin que el desarrollo de las prcticas de bioqumica conlleva un tiempo prolongado, mtodos complejos y una diversidad de recursos materiales, por lo cual puede parecer complicado el adecuar las actividades del laboratorio con el tiempo curricular disponible, la habilidad y destreza de los estudiantes en la etapa que cursan la asignatura y los recursos disponibles de la unidad acadmica. De aqu que la serie de experiencias prcticas que se desarrollan se estima que coadyuvan en forma adecuada para alcanzar las competencias establecidas en el programa de la unidad de aprendizaje, lo cual deber ser una premisa indispensable en el proceso de enseanza-aprendizaje del estudiante, lo cual se reflejara en que este adquiera los conocimientos y habilidades en bioqumica requeridos para las etapas disciplinaria y terminal de su formacin profesional. El manual de Bioqumica se ha preparado con prcticas dirigidas a mostrar algunas de propiedades de las biomolculas y de la dinmica metablica celular mediante procedimientos analticos sencillos que no requieren de equipamientos complejos y de alto costo..

Competencias a las que contribuye

Niveles de Desempeo

Los conocimientos, unidos a las habilidades y a los valores, permiten que se construyan competencias. Para ello es necesario que el conocimiento se aplique de manera prctica en la construccin o desempeo de algo, por lo cual el alumno deber estar capacitado al finalizar una etapa para desempear o producir lo establecido en su programa de estudio.

El trabajo que se desarrolla en el Laboratorio de Bioqumica contribuye al desarrollo de las competencias del programa de la unidad de aprendizaje: Diferenciar la estructura y propiedades de las biomolculas y sus funciones metablicas, reconocer los principios de los cambios de energa en procesos biolgicos y distinguir los fundamentos de la regulacin de procesos metablicos para diferenciar vas metablicas centrales en organismos y ambientes acuticos, mediante un trabajo individual y en equipo el cual promueva el desarrollo del pensamiento crtico y la asertividad en el estudiante.

El nivel de desempeo del alumno estar asociado al desarrollo ptimo de actividades como: La realizacin de las prcticas en forma y tiempo, lo cual le requerir de un amplio dominio de diferentes habilidades y conocimientos; la elaboracin sistemtica y estructurada de informes por prctica, mediante disciplina y laboriosidad, as como el uso eficiente de herramientas computacionales. El trabajo en el laboratorio deber ser realizado en equipo, lo cual requiere de una participacin armnica en el trabajo de conjunto. El pensamiento crtico deber ser utilizado en forma ptima para realizar los diversos pasos de la actividad prctica. El reporte de la prctica se deber de entregar de acuerdo a un formato elaboracin preestablecido, de manera individual.Ubicacin dentro del mapa curricular

HC= Horas Clase; HL= Horas Laboratorio; HT= Horas Taller; HPC= Horas Practicas Campo; HE= Horas Ejercicios; CR=CrditosPrograma del Sistema de Prcticas

TemaPrctica o prcticas programadasmbito de desarrolloDuracin*

INTRODUCCINRevisin de reglas para el trabajo en el laboratorio.

Descripcin del protocolo para elaborar un reporte escrito de una prctica de laboratorioLaboratorio3 horas

Semana 1

UNIDAD I: BIOMOLCULAS1.1. Practica 1: Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert.Laboratorio3 horas

Semana 2

1.2. Prctica 2: Determinacin del contenido de protena soluble.Laboratorio3 horas Semana 3

1.3. Prctica 3: Determinacin del punto isoelctrico de una protena.Laboratorio3 horas Semana 4

1.4. Prctica 4: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.Laboratorio3 horas Semana 5

1.5. Prctica 5: Determinacin de parmetros de cintica enzimtica.Laboratorio3 horas Semana 6

1.6. Prctica 6: Determinacin de carbohidratos totales. Laboratorio3 horas Semana 7

1.7. Prctica 7: Aislamiento y cuantificacin de glucgeno. Laboratorio3 horas Semana 8

1.8. Prctica 8: Extraccin y cuantificacin de lpidos.Laboratorio3 horas Semana 9

1. 1.9. Prctica 9: Determinacin de fosfoglicridos. Laboratorio6 horas Semana 10 y 11

2. 1.10. Prctica 10: Extraccin y determinacin de pigmentos algales.Laboratorio3 horas Semana 12

UNIDAD II: METABOLISMO1.11. Prctica 11: Oxidacin biolgica y transporte de electrones.Laboratorio3 horas Semana 13

1.12. Prctica 12: Actividad oxidativa de la lactato deshidrogenasa.Laboratorio3 horas Semana 14

1.11. Prctica 13: Capacidad metablica celular y actividad de citocromo-oxidasa. Laboratorio6 horas Semana 15 y 16

* Duracin en horas para cada prctica, y semana del semestre en la que se realizar.

1. BIOMOLECULAS

1.1. Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert.1.1.1. Introduccin.Los mtodos pticos de anlisis pueden utilizares para determinar en forma precisa la concentracin de sustancias disueltas, dentro de estos la espectrofotometra es una de las tcnicas ms comunes en anlisis bioqumicos. Un espectrofotmetro mide cuanta luz absorbe una solucin, dicha absorcin se puede usar para medir la concentracin de los solutos. La mayora de los solutos absorben luz a una determinada longitud de onda, y entre ms concentrado es el soluto mas es la luz que se absorbe. El fenmeno es de naturaleza exponencial y depende de la concentracin del material absorbente de la luz, del espesor de la capa de solucin interpuesta en el trayecto del haz luminoso y de la longitud de onda de la luz empleada en la determinacin. Generalmente la longitud de onda de la luz y el espesor de la capa que atraviesa, se mantienen constantes y la intensidad de luz transmitida (I), se compara con la que transmite el solvente puro (Io). La ley que relaciona la cantidad de luz transmitida por una solucin con la concentracin del soluto que absorbe luz es la ley de Beer-Lambert la cual se expresa de la siguiente forma:

A = log Io/I =- log T= ( b C

Donde:

A: Absorbencia, magnitud adimensional,

Io: Intensidad de la luz incidente,

I: Intensidad de la luz trasmitida,

T: Transmitancia, I/Io,

(: Coeficiente de extincin molar, en M-1 cm-1,

b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm,

C: Concentracin del soluto, en moles/litro (M).

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbencia es proporcional a la concentracin de las especies absorbentes. Dicha ley se cumple en un intervalo definido de concentraciones ( 0.01 M), en el cual es vlido obtener una regresin lineal significativa de absorbencia vs concentracin, denominada curva de calibracin. Para determinar la concentracin desconocida de una solucin se mide su absorbancia y luego se calcula la concentracin correspondiente mediante el uso de la ecuacin de la curva de calibracin. Las desviaciones aparentes de esta ley en soluciones ms concentradas pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solucin. Conforme una solucin se vuelve ms concentrada, las molculas de soluto interactan entre s debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la grfica de absorbencia en funcin de la concentracin pierde su linealidad.

Hay tres aplicaciones fundamentales de esta tcnica en determinaciones bioqumicas:

1) Si se conoce el coeficiente de extincin molar de un compuesto a una longitud de onda especfica, es factible el determinar la concentracin de dicho compuesto mediante la medicin de su absorbencia, como puede ser la cuantificacin de bajas concentraciones de compuestos como nucletidos (2-4 mg).

2) El curso de una reaccin puede ser determinada mediante la medicin o aparicin de compuestos que absorban luz. El dinucletido NADH absorbe fuertemente a 340 nm en tanto que su forma oxidada (NAD+) no presenta absorbencia a esta longitud de onda, lo cual permite dar seguimiento a su produccin o gasto en una reaccin.

3) Se pueden identificar ciertos compuestos mediante la determinacin del espectro de absorcin en que presentan en el intervalo visible o ultravioleta, como es el caso de pigmentos como las clorofilas.1.1.2. Competencia. Evaluar la absorbencia de protena en solucin con base al fundamento de la ley de Beer-Lambert, para elaborar una curva de calibracin precisa, con organizacin y disciplina. 1.1.3. Material.1.1.3.1. Materiales.Tubos de ensayo, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado, termmetro, celdas para espectrofotmetro, gradilla, piseta.

1.1.3.2. Instrumental.Agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotmetro.

1.1.3.3. Reactivos.Solucin estndar de albumina (10 mg/mL), reactivo de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua destilada), solucin problema.1.1.4. Desarrollo.1. Medir 1 mL de la solucin de albmina y colocar en un tubo de ensayo.

2. Adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y mezclar.

3. Calentar la solucin en bao de agua a 37C por 10 minutos.

5. Medir la absorbencia en funcin de la longitud de onda entre 400 y 600 nm cada 20 nm.

6. Determinar la longitud de onda ptima para efectuar la cuantificacin de la protena a partir de los valores de absorbencia vs longitud de onda.

7. Elaborar una curva de calibracin mediante cinco distintas concentraciones de albmina, obtenidas por medio de diluciones sucesivas de la solucin de estndar de albumina. Ajustar la absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga nicamente agua y solucin de Biuret.

8. Medir la absorbencia de una solucin de concentracin desconocida.1.1.5. Resultados a reportar. Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la regresin lineal de los valores de absorbencia vs. concentracin de las soluciones de albmina analizadas. Contenido de protena soluble en solucin de concentracin desconocida.

1.1.6. Mtodo de Evaluacin.Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.1.1.7. Bibliografa.Holtzhauer, M., 2006. Basic Methods for the Biochemical Lab. 5th edition. Chapter 1: Quantitative Methods. Springer-Verlag, Berlin, p. 1-21.

Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at practical classes for students of pharmacy: a student-centered approach. Biochemistry and Molecular Biology Education 28, 327-329.

Prats, M., 1989. Tools in spectrophotometry and differential spectrophotometry. Biochemical Education 17(3), 151-153.

Roca, P., Oliver, J., Rodrguez, A.M., 2003. Bioqumica Tcnicas y Mtodos. Ed. Hlice, Madrid, pp. 70-84.

1.2. Determinacin del contenido de protena soluble. 1.2.1. Introduccin.La cuantificacin de protenas es una de las determinaciones ms comunes que se efectan en estudios bioqumicos, es un paso importante para el manejo de muestras en las cuales se requiere el aislamiento y la caracterizacin de protenas. El determinar el contenido proteico de una muestra es un requisito comn previo al uso de mtodos de separacin, anlisis cromatogrficos, electroforesis, inmunoqumica, entre otros. Cuando se requiere determinar la concentracin de protenas de una muestra una de las primeras cuestiones a considerar es la seleccin de un mtodo analtico adecuado. La eleccin entre los ensayos de protenas disponibles por lo general se hace en base a considerar la compatibilidad del procedimiento con las muestras a evaluar. El objetivo es seleccionar un mtodo que requiera menos manipulacin o tratamiento previo de las muestras y evitar la presencia de sustancias que puedan interferir en la determinacin.

Todas las protenas estn conformadas por aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos los cuales se originan por la interaccin entre los grupos amino terminal y el carboxilo contiguos. En general se presentan 20 aminocidos formando parte de las protenas. Una reaccin del enlace peptdico de tripptidos, polipptidos y protenas con iones de Cu+2 en un medio alcalino y en presencia de tartrato de sodio da como producto un complejo de quelacin colorido el cual absorbe a 540 nm, mediante esta reaccin denominada de biuret se pueden cuantificar pptidos y protenas. El ion cprico forma un complejo coordinado con los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de 4 enlaces peptdicos, la intensidad del color es proporcional al total de enlaces peptdicos que participan en la reaccin.La reaccin de biuret es la base de un mtodo colorimtrico simple y rpido para determinar cuantitativamente el contenido de protena soluble de una muestra. El mtodo es aplicable para determinar protena en el intervalo de 1 a 160 mg/mL. Compuestos como lpidos, hemoglobina, EDTA y sales de amonio pueden interferir en el desarrollo de la reaccin.

Complejo de biuret1.2.2. Competencia.Analizar el contenido de protena soluble en tejidos de un organismo acutico mediante un mtodo espectrofotomtrico, para contrastar la funcin tisular con el nivel de protena, con disciplina y disposicin.

1.2.3. Materiales y reactivos.1.2.3.1. Materiales. Estuche de diseccin, tubos de ensaye, esptula, homogeneizador manual, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado, termmetro, celdas para espectrofotmetro, gradilla, piseta.1.2.3.2. Instrumental. Centrifuga, agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotmetro.1.2.3.3. Reactivos.Buffer salino (NaCl 0.15M, citrato de sodio 0.015M, pH 7), reactivo de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en 250 mL de agua destilada).1.2.4. Metodologa.1. Realizar la diseccin del organismo de estudio, separar 2 tejidos y colocar cada muestra en un vaso de precipitado en hielo.

2. Cortar cada tejido en trozos pequeos y pesar en una proporcin de 0.2 g por mL de buffer salino que se utilizar para su homogeneizacin.

3. Homogeneizar cada uno de los tejidos mediante el uso de un homogeneizador manual de tubo con embolo en un bao de hielo.

4. Centrifugar el homogenado a 3000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante.

5. Por duplicado, mezclar 0.2 mL del sobrenadante por tejido con 0.8 mL de agua destilada, adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y agitar.

6. Calentar la solucin en bao de agua a 37 C por 10 minutos.

7. Enfriar la solucin y leer la absorbencia a 540 nm.

8. Determinar el contenido de protena soluble a partir de los valores de absorbencia y la ecuacin de la curva de calibracin de albumina elaborada en la prctica No 1.

1.2.5. Resultados a reportar.

Nombre comn y cientfico de los organismos analizados.

Contenidos de protena soluble en mg por g de tejido analizado.

1.2.6. Mtodo de evaluacin.

Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.

1.2.7. Bibliografa.

Krohn, R.I., 2001. The colorimetric detection and quantitation of total protein. Current Protocols in Food Analytical Chemistry B1.1.10-B1.1.13.

Janairo, G., Sy, M.L., Yap, L., Llanos-Lazaro, N., Robles, J. 2011. Determination of the sensitivity range of Biuret test for undergraduate biochemistry experiments. e-Journal of Science & Technology 5, 77-83.

Roca, P., Oliver, J., Rodrguez, A.M., 2003. Bioqumica Tcnicas y Mtodos. Ed. Hlice, Madrid, pp. 156-157.1.3. Determinacin del punto isoelctrico de una protena.

1.3.1. Introduccin.Aun cuando en la formacin de la unin peptdica de los grupos carboxlicos y aminos de los aminocidos no generan en enlace con carga, es comn que queden libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptdicas, o en las cadenas laterales de los aminocidos cidos y bsicos. La disociacin de los grupos ionizables que estn presentes en las protenas, as como la de los grupos ionizables de los aminocidos individuales, est determinada por el pH del medio en el cual se encuentra la protena. A pH de 7.0 o en valores cercanos a este, los cuales son comunes en la mayora de las clulas, los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico se encuentran en sus formas bsicas con carga negativa, mientras que los aminocidos lisina y arginina estn presentes en su formas cidas con carga positiva. La contribucin de los grupos sulfhidrilo de la cistena, y fenlico de la tirosina es mnima; por ejemplo la tirosina presenta solo una disociacin del 0.1% del grupo fenlico. La carga total de la protena depende del pH de la solucin y del nmero relativo de cada aminocido en la molcula. Cuando el pH de la solucin es tal que la carga de neta de la molcula proteica es cero, la cual se presenta cuando el nmero total de cargas positivas y negativas son iguales, se le denomina punto isoelctrico o pH isoelctrico de la protena (pI). Los valores de pI de la mayora de las protenas son menores a 7, aunque se presentan valores desde 1.1 para la pepsina hasta 12 en protaminas. Una protena cida con pI bajo tendr carga negativa a pH neutro, mientras que una protena bsica con un pI alto tendr carga positiva a pH de 7. En general el punto isoelctrico de una protena es tambin el pH en el cual es menos soluble y ms fcilmente precipita, esto se atribuye a que probable atraccin entre grupos de carga opuesta de molculas vecinas, ya que el nmero de cargas opuestas ser el mximo en el punto isoelctrico. La capacidad de variar la carga de una molcula proteica mediante el cambio del pH del medio en el cual se encuentra puede utilizarse para purificar y caracterizar protenas mediante mtodos como electroforesis o cromatografa de intercambio inico.

Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/1.3.2. Competencia.Evaluar el punto isoelctrico de una protena mediante variacin del pH del medio en el cual esta disuelta, para relacionar este parmetro con las propiedades inicas de la estructura, con compromiso y disciplina. 1.3.3. Materiales y reactivos.1.3.3.1. Materiales.

Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL, pipetero, vaso precipitado, gradilla, piseta.

1.3.3.2. Instrumental.

Potencimetro

1.3.3.3. Reactivos.Solucin de casena 5% en acetato de sodio 0.1N, cido actico 0.01, 0.1 y 1N, solucin buffer pH 4 y 7. 1.3.4. Metodologa.1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVO (mL)TUBO

123456789

Casena 5% en acetato de sodio 0.1N 111111111

Agua destilada8.47.88.88.58.07.05.01.07.4

CH3-COOH 0.01N0.61.2-------

CH3-COOH 0.1N--0.20.51.02.04.08.0-

CH3-COOH 1.0N--------1.6

2) Agitar los tubos y observar la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla despus de 15 y 30 minutos.

4) Tabular los resultados e indicar el grado de precipitacin con los siguientes valores:

0 = ningn cambio.

1+ = turbidez.

2+ = notable turbidez.

3+ = precipitacin.

4+ = marcada precipitacin.

5+ = abundante precipitacin.

5) Determinar el pH de cada tubo mediante el uso de un potencimetro.

7) Elaborar una grfica con el grado de precipitacin en las ordenadas y el pH en las abscisas. El punto isoelctrico aproximado corresponde al pH del tubo donde se present la mxima precipitacin1.3.5. Resultados a reportar.

pH experimental en cada tubo de reaccin

pH terico en cada tubo de reaccin de acuerdo a la ecuacin de Hendersson- Hasselbach.

Punto isoelctrico de la protena analizada. 1.3.6. Mtodo de evaluacin.


1.3.7. Bibliografa.Ayala-Lopera, S.A., 2007. Manual de Laboratorio de Bioqumica. Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Escuela de Produccin Pecuaria. Medelln, Colombia, pp. 11-12. Instituto Politcnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioqumica Mdica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formacin Bsica Disciplinaria. Academia de Bioqumica Mdica I. Propiedades de protenas: Determinacin del punto isoelctrico de la casena. Mxico, p. 18. Harris, D.C., 2007. Anlisis Qumico Cuantitativo. 6 ed., Editorial Revert, Barcelona, p. 217-219.Morris, J., G. 1975. Fisicoqumica para Bilogos. 2 ed., Editorial Revert, Barcelona, pp. 163-165.

1.4. Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin. 1.4.1. Introduccin.La actividad enzimtica es afectada por la temperatura del medio en el cual ocurre. Los puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Walls, que participan en la estabilizacin de las estructuras terciaria y cuaternaria de las protenas, son muy sensibles a incrementos en la temperatura, ya que aumenta el movimiento de las cadenas de aminocidos y de los grupos laterales y, por lo tanto la fuerza y las colisiones entre las enzimas y la molculas que las rodean. El aumento de las colisiones entre las molculas de la enzima y el sustrato favorece, por el contacto, las reacciones que estas catalizan. Sin embargo a temperaturas muy elevadas, las colisiones son capaces de romper los puentes de hidrgeno y las fuerzas de van der Walls que son relativamente dbiles, a medida que esto ocurre el rearreglo tridimensional de la enzima se modifica y se pierde su estructura funcional. Los cambios caractersticos que se producen con el incremento de temperatura en la actividad enzimtica se muestran en siguiente la figura:

La temperatura en la cual la actividad cataltica es mxima se le denomina temperatura ptima. Por encima de esta temperatura se presenta la prdida de actividad cataltica debida a desnaturalizacin trmica, lo cual da como resultado una disminucin de la actividad enzimtica hasta cesar. Es comn que entre los 0 C y 40 C se observe un aumento de la actividad enzimtica, intervalo en el cual ocurren cambios mnimos en la estructura de la enzima. Se postula que en una reaccin qumica por cada incremento de 10 C aumenta la velocidad reaccin al doble, lo cual en la reaccin enzimtica tiene un efecto de la frecuencia de los choques entre las molculas del sustrato y de la enzima. Si la temperatura aumenta por encima de los 40 C las colisiones se incrementan y se inicia el rompimiento de enlaces. A los 55 C la actividad enzimtica empieza a disminuir, hasta que cerca de los 70 C su actividad es cercana a cero como resultado de que desnaturaliza la protena. La mayora de la enzimas presentan una actividad ptima entre los 40 y 50 C; sin embargo, algunos organismos poseen enzimas cuya actividad se da a temperaturas bajas, como es el caso de la lactato-deshidrogenasa de pez del antrtico Trematomus bernacchii cuya actividad mxima se observa a temperaturas muy por debajo de las enzimas homologas, de organismos que viven en ambientes ms clidos. As mismo, organismos extremfilos como la bacteria termfila Thermus aquaticus presenta la enzima la ADN polimerasa con una temperatura ptima de funcionamiento alrededor de los 75 C.1.4.2. Competencia.Analizar el efecto de la temperatura en una reaccin enzimtica a travs de la velocidad de hidrlisis del sustrato, para evaluar el funcionamiento ptimo de la enzima bajo estudio, con organizacin y disciplina. 1.4.3. Materiales y reactivos.1.4.3.1. Materiales.

Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 mL, pipetero, vasos de precipitado 125 mL, gradilla, piseta.1.4.3.2. Instrumental.

Planchas de calentamiento.1.4.3.3. Reactivos.Amilasa (0.02%), almidn (8 mg/mL), glucosa (0.02 M), buffer de fosfatos pH 7, reactivo de cido 3,5-dinitrosaliclico (disolver 1 g en 20 mL de NaOH 2 M, mezclar con 50 mL de NaKC4H4O6.4H2O 2.13M y aforar con agua destilada a 100 mL). 1.4.4. Metodologa.I) Ensayo enzimtico.

1) Preparar y correr una serie de tubos de acuerdo a lo establecido en la siguiente tabla, mezclar perfectamente al aadir cada reactivo.

2) El tubo 1 ser el testigo negativo por lo que antes de aadir la enzima, se adicionara 1 mL de cido 3,5-dinitrosaliclico como inhibidor enzimtico.

3) Al trmino del calentamiento en el bao de agua a ebullicin, enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo 1 como blanco para ajustar el cero.

4) En caso de que las lecturas presenten valores altos de absorbencia se puede diluir la mezcla final de reaccin, en una proporcin de 1 mL de solucin con 5 mL de agua destilada, para proceder a leer los valores por tubo. El contenido de glucosa liberada en cada tubo de reaccin se determinar mediante el uso de una curva de calibracin de glucosa.II) Curva de calibracin de glucosa.

1) Preparar una serie de 11 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

2) Calentar los tubos en bao de agua a ebullicin por 10 minutos.

3) Enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo del blanco para ajustar el cero. 1.4.5. Resultados a reportar.

Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la curva de calibracin de glucosa.

Grafica de concentracin de glucosa generada en funcin de la temperatura enzimtica de reaccin.

Temperatura optima de la enzima bajo estudio. 1.4.6. Mtodo de evaluacin.


1.4.7. Bibliografa.Daniel, R.M., Danson, M.J., Eisenthal, R., Lee, C.K., Peterson, M.E., 2008. The effect of temperature on enzyme activity: new insights and their implications. Extremophiles 12 (1), 51-59.Daniel, R.M., Peterson, M.E, Danson, M.J., Price, N.C., Kelly, S.M., Monk, C.R., Weinberg, C.S., Oudshoorn, M.L., Lee,C.K., 2010. The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity. Biochemical Journal 425, 353360.Instituto Politcnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioqumica Mdica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formacin Bsica Disciplinaria. Academia de Bioqumica Mdica I. Cintica enzimtica. Mxico, pp. 30-31, 56.Somero, G.N., 2004. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic strategies. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 139, 321333.1.5. Determinacin de parmetros de cintica enzimtica.

1.5.1. Introduccin.El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros. Se evala la influencia de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en una reaccin y el papel que juegan en la reaccin enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de reaccin. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la actividad enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cmo las diferencias en actividad estn relacionadas con la funcin y/o la fisiologa del organismo del que proceden. El modelo clsico de Michaelis-Menten para explicar la cintica enzimtica considera la unin de una enzima (E) con un sustrato (S) para formar un complejo enzima-sustrato (ES), el cual puede generar el producto (P) ms la enzima (E) o disociarse para dar la enzima y el sustrato.

Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una dependencia hiperblica de la velocidad respecto a la concentracin de sustrato, distinguindose 3 componentes en la curva. En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentracin de sustrato, se duplica la velocidad (reaccin de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que en la primera parte con el incremento de la concentracin, iniciando alrededor de la de la Vmax. La ltima parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato (reaccin de orden cero), as la velocidad alcanzada es cercana a la mxima.

Figura 5.1. Representacin de la cintica de Michaelis-Menten.

La ecuacin de Michaelis- Menten expresa la relacin matemtica de la hiprbola cuadrtica que existe entre las variables:

En la ecuacin de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica mxima de la reaccin catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, y se conocen como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reaccin, la enzima es una protena cuya estructura y carga elctrica se modifican cuando los componentes de la solucin cambian.

Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato. Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta, por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera para obtener los valores de Km y Vmax es la de utilizar expresiones matemticas que producen una lnea recta como la de Lineaweaver-Burk, tambin denominada de dobles recprocos, la cual se utiliza frecuentemente:

Figura 5.2. Representacin de Lineaweaver-Burk de la cintica de Michaelis-Menten.1.5.2. Competencia.Investigar la cintica enzimtica de una hidrolasa mediante el modelo de Michaelis-Menten, para evaluar sus parmetros cinticos y contrastar con los establecidos en la literatura, con un enfoque propositivo y compromiso. 1.5.3. Materiales y reactivos.1.5.3.1. Materiales.

Matraces Erlenmeyer 50 mL, pipetas graduadas de 1, 10 y 5 mL, pipeteros, vasos de precipitado 500 mL, bureta 25 mL, pinzas para bureta, soporte universal, piseta.1.5.3.2. Instrumental.

Bao de temperatura controlada.

1.5.3.3. Reactivos.Urea 0.01 M, solucin de ureasa (2.5 mg/mL), CuCl2 2%, HCl 0.01M, solucin de fenolftalena 1%.1.5.4. Metodologa.1) Preparar una serie de matraces de acuerdo a lo establecido en la siguiente tabla:MatrazUrea 0.01M

(ml)Agua

(ml)

1024

2519

31014

412.511.5

5159

617.56.5

7204

822.51.5

9240

2) Colocar los matraces en un bao de agua a 40 (C y esperar que alcancen la temperatura del mismo.

3) Aadir 1 ml de la solucin de ureasa a cada matraz y esperar que transcurra la reaccin enzimtica durante 20 minutos.

4) Adicionar 1 ml de CuCl2 2% a cada matraz y agitar vigorosamente para suspender la actividad de la enzima.

5) Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.01N y fenolftalena como indicador, hasta el vire de rosa a incoloro. 1.5.5. Resultados a reportar. Velocidad de reaccin enzimtica en mEq de NH3/minuto.

Grfica de Michaelis-Menten.

Grfica de Lineweaver-Burk.

Valores de Km y Vmax de la enzima.1.5.6. Mtodo de evaluacin.


1.5.7. Bibliografa.Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 5: Enzyme Kinetics, p. 81-122.Grunwald, P., 1984. Imparting some biochemical fundamentals in the course of basic education of chemistry students with the system urease/urea as an example. Biochemical Education 12(4), 170-173.Minch, M.J., 1989. Experiments in Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey, pp. 164-167, 182-184.Sorensen, R., Novak, N., 1996. The use of Michaelis-Menten kinetics in cell biology and physiology teaching laboratories. Biochemical Education 24(1), 26-28.Tayyab, S., Qamar, S., 1992 A look into enzyme kinetics: some introductory experiments. Biochemical Education 20(2), 116-118.Bezerra, R.M.F., Dias, A.A., 2007. Utilization of integrated Michaelis-Menten equation to determine kinetic constants. Biochemistry and Molecular Biology Education 35 (2), 145150.1.6. Determinacin de carbohidratos totales.

1.6.1. Introduccin.Los carbohidratos o sacridos son compuestos de gran importancia para los seres vivos, los cuales son muy abundantes en la naturaleza. Las unidades bsicas de los carbohidratos son los monosacridos, los cuales no hidrolizables en unidades ms pequeas. La glucosa es el monosacrido, aldohexosa, es el combustible principal para la mayora de los organismos. Los oligosacridos contienen de dos a diez unidades de monosacridos unidas covalentemente. Por su parte, los polisacridos estn constituidos por gran nmero de unidades de monosacridos unidos covalentemente, los cuales pueden alcanzar pesos moleculares de hasta 106 daltons. Los polisacridos desempean dos funciones biolgicas principales: almacenar energa metablica y aportar elementos estructurales a la clula. Monosacridos como la glucosa y sus derivados, son piezas fundamentales en muchas rutas metablicas esenciales para la obtencin de energa. La glucosa acta en el organismo como combustible energtico de uso inmediato, mientras polisacridos y grasas son biomolculas de reserva que deben ser catabolizadas antes de su aprovechamiento como fuentes de energa. Los carbohidratos estn ampliamente en organismos vegetales y animales con funciones metablicas y estructurales. En los vegetales la glucosa es sintetizada por fotosntesis a partir de CO2 y agua, y es almacenada como almidn o convertida en celulosa para formar parte de la pared celular. Los animales obtienen sus carbohidratos principalmente de fuentes vegetales, una forma de acumularlos es como glucgeno, pero en casos de deficiencia pueden sintetizar algunos como la glucosa a partir de fuentes de carbono derivadas de lpidos y protenas.

Es frecuente que durante la transformacin o el aislamiento de los carbohidratos se requiere el cuantificar la cantidad total del producto obtenido. Un mtodo para cuantificar el contenido de carbohidratos totales, el cual incluye a los reductores y no reductores, es mediante su reaccin con un cido fuerte y a alta temperatura, bajo estas condiciones ocurre una deshidratacin simple y la catlisis cida da como productos como furfural e hidroximetilfurfural que se reaccionan con compuestos como el fenol para producir compuestos coloridos.

El mtodo es simple, rpido, sensible a bajas concentraciones de carbohidratos (10 g/mL) y genera resultados con una buena precisin ( 2%). Los reactivos son de bajo costo, el color producido es estable y la determinacin no presenta interferencia con protenas. Ya que la intensidad del color que se genera como producto final de la reaccin vara de acuerdo al tipo carbohidrato, se debe seleccionar el estndar adecuado para una cuantificacin precisa. La proporcin de cido sulfrico, como fuente de calor, deber ser la apropiada para favorecer que la reaccin se complete.1.6.2. Competencia.Evaluar el contenido de carbohidratos totales en una muestra biolgica, para evaluar sus parmetros cinticos y contrastar con los establecidos en la literatura, con un enfoque propositivo y compromiso.1.6.3. Materiales y reactivos.1.6.3.1. Materiales.

Tubos de ensayo con tapn, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipetero, gradilla, piseta, celdas para espectrofotmetro, termmetro, vaso de precipitado 125 mL.1.6.3.2. Instrumental.

Bao de temperatura controlada, espectrofotmetro.1.6.3.3. Reactivos.Fenol acuoso 5%, cido sulfrico concentrado.1.6.4. Metodologa.1) Preparar una solucin acuosa de la muestra, el contenido de los carbohidratos deber estar en el intervalo de sensibilidad del mtodo (10-100g/mL).

2) En tubos de ensaye etiquetados colocar 0.5 mL de la solucin de la muestra.

3) Adicionar a cada tubo 0.5 mL de solucin de fenol al 5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de cido sulfrico concentrado y homogeneizar.

4) Calentar los tubos en bao de agua a 90 (C por 15 minutos.

5) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia a 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua.

6) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrn preparada con el carbohidrato de inters en el intervalo del mtodo (10-100 g de glucosa/mL), tratada de la misma manera que el problema.

1.6.5. Resultados a reportar. Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la curva de calibracin de glucosa.

Contenido de carbohidratos totales en la muestra analizada.1.6.6. Mtodo de evaluacin.


1.6.7. Bibliografa.Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356.

Fournier, E., 2001. Colorimetric quantification of carbohydrates. Current Protocols in Food Analytical Chemistry E1.1.1-E1.1.3.Kochert, G., 1978. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric acid method. En: Hellebust. J.A., Craigie, J.S., (eds.), Handbook of Phycological Methods. Physiological & Biochemical Methods. Cambridge University Press, New York, pp. 95-97.Masuoka, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S.I., Lee, Y.C., 2005. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry 339, 69-72.

1.7. Aislamiento y cuantificacin de glucgeno.

1.7.1. Introduccin.Los seres vivos almacenan glcidos en forma de polisacridos, que sirven como materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como almidn, en los animales se presentan en forma de glucgeno. El glucgeno es una biomolcula que est conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces glucosdicos (1-4) con ramificaciones mediante enlaces (1-6).

El glicgeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales. El depsito principal de glicgeno son el hgado (de 2 a 5%) y los msculos (de 0.5 a 2%), en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el organismo. En situacin de inanicin, el glucgeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del glucgeno est asociado al nivel de la glucosa sangunea, durante una buena alimentacin se presenta su sntesis o glucogenognesis, en condiciones de ayuno ocurre su degradacin o glucogenlisis El glucgeno del msculo esqueltico tiene como finalidad suministrar glucosa para que sea degradada oxidativamente y se pueda obtener ATP para la actividad muscular. En contraste, el glucgeno heptico sirve como fuente de glucosa para los tejidos extrahepticos, incluido el msculo esqueltico, ante un descenso de la glucemia. Una vez agotado el suministro de glucosa va glucogenlisis y para cubrir requerimientos tejidos del organismo la ruta para sntesis de glucosa es a travs de la gluconeognesis, la cual procede a partir de sustancias distintas a los carbohidratos, tales como aminocidos y lactato glicerol. La extraccin del glucgeno de tejidos, como el hgado, se realiza mediante un proceso de homogenizacin y ruptura celular, as como la extraccin y la eliminacin de las protenas para evitar interferencias en el anlisis posterior del polisacrido.1.7.2. Competencia.Determinar el contenido de glucgeno en tejidos de un animal acutico, para estimar su capacidad de almacenamiento y relacionar con su funcin metablica, con organizacin y compromiso.

1.7.3. Materiales y reactivos.1.7.3.1. Materiales.

Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, tubos de ensaye, pipetas volumtricas de 1 y 5 mL, pipeteros, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotmetro.1.7.3.2. Instrumental.

Balanza analtica, bao de temperatura controlada, centrifuga, espectrofotmetro.1.7.3.3. Reactivos.KOH acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4 concentrado.1.7.4. Metodologa.1) A partir de peces recin sacrificados obtener muestras de hgado y musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hgado y 2 g de msculo. 2) Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de KOH al 30%.

3) Calentar los homogenizados en un bao de agua a ebullicin por 15 minutos, agitar ocasionalmente.

4) Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye.

5) Tomar 0.1 ml del sobrenadante y aadir 3 mL de etanol y 0.1 ml de K2SO4 al 10%, agitar.

6) Reposar los tubos con la mezcla en bao de hielo por 5 minutos.

7) Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y separar el glucgeno precipitado.

8) Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua.

9) Colocar en dos tubos de ensaye alcuotas de 0.5 mL de la solucin de glucgeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solucin de fenol al 5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de cido sulfrico concentrado y homogeneizar.

10) Calentar los tubos en bao de agua a 90 (C por 15 minutos11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua destilada.

12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrn preparada con glucgeno en el intervalo de sensibilidad del mtodo colorimtrico.1.7.5. Resultados a reportar. Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la curva de calibracin de glucgeno.

Contenido de glucgeno (mg/g) en los tejidos analizados.1.7.6. Mtodo de evaluacin.


1.7.7. Bibliografa.Dalrymple, R. H., Hamm, R., 1973. A method for the extraction of glycogen and metabolites from a single muscle sample. International Journal of Food Science & Technology 8 (4), 439444.Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356.Moraes, G., Choudhuri, J. V., Souza, R. H. S., Neto, C. S., 2004. Metabolic effects of exercise in the golden fish Salminus maxillosus "dourado" (Valenciennes, 1849). Brazilian Journal of Biology 64(3B), 655-660. Ojea, J., Martnez, D., Novoa, S., Pazos, A. J., Abad, M., 2002. Contenido y distribucin de glucgeno en relacin con el ciclo gametognico de Ruditapes decussatus (L., 1758) en una poblacin natural de las lagunas de Baldaio (Galicia, noroeste de Espaa). Boletn Instituto Espaol de Oceanografa 18 (1-4), 307-313.

1.8. Extraccin y cuantificacin de lpidos.

1.8.1. Introduccin.

A diferencia de otras biomolculas los lpidos son un grupo heterogneo que no poseen un grupo funcional caracterstico. Los lpidos son sustancias presentes en tejidos animales y vegetales que comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgnicos no polares, como benceno, hexano y cloroformo, ter, con escasa o nula solubilidad en agua. Como consecuencia de ello, el trmino lpido abarca a un gran nmero de compuestos orgnicos con estructuras muy diversas; no obstante, poseen algo en comn, la parte principal de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y sta es la razn de su carcter hidrfobo.

En general los lpidos pueden ser clasificados de acuerdo a sus propiedades en dos grupos: No polares o lpidos neutros, los cuales comprenden triacilglicridos, diacilglicridos, ceras, esteroles, terpenos; polares integrados por fosfolpidos y glucolpidos. Los lpidos son una fuente muy importante de energa metablica los cuales aportan 9.5 kcal/g, en contraste con carbohidratos y protenas, que generan 4.1 y 5.6 kcal/g, respectivamente. Los triacilglicridos son los lpidos ms abundantes en la naturaleza, en tanto que los fosfolpidos son constituyentes principales de membranas celulares.

Triacilglicrido FosfolpidoR1, R2, R3: cidos grasos; X: hidrgeno o radical (p.ej. etanolamina, colina, serina, glicerol, mio-inositol)Los lpidos pueden ser utilizados por los organismos animales como una fuente de energa, a travs del metabolismo oxidativo de cidos grasos, de igual forma pueden aportar cidos grasos esenciales. Por presentar un estado de oxidacin ms reducido con relacin a carbohidratos o protenas proporcionan mayor energa al oxidarse. Los lpidos son componentes de reserva y estructurales de las clulas, aportan cidos grasos insaturados para el mantenimiento e integridad de membranas celulares, participan el transporte de lipdico (v. gr. fosfolpidos, actan como agentes emulsificantes) y son precursores de hormonas (p. ej. el cido araquidnico, 20:4n-6, es precursor de prostaglandinas).

En animales marinos los lpidos muestran importancia en la boyancia, debido a su baja densidad y al volumen que ocupan sin requerir osmoregulacin, mantenimiento de estructura corporal (v. gr. la presencia de cidos grasos de la serie n-3 permite retener la fluidez de la membrana celular a bajas temperaturas) y en osmoregulacin (integran un espacio osmticamente inactivo que no requiere gasto de energa). Los lpidos son requeridos como fuente de energa y en el aporte de lpidos polares necesarios en la formacin de membranas celulares. Este carcter dual es reflejado en la compartamentalizacin de los lpidos corporales en tejido adiposo, integrado fundamentalmente por triglicridos, y lpidos de membranas celulares compuestos por lpidos polares y colesterol.

Un procedimiento para la determinacin de lpidos a partir de muestras animales o vegetales se basa en la digestin de la muestra en cido concentrado que hidroliza y disuelve componentes proteicos, en tanto que los lpidos que se separan puede ser extrados mediante el uso de solventes orgnicos no polares, como una mezcla de ter etlico-ter de petrleo.1.8.2. Competencia.

Extraer y cuantificar el contenido de lpidos en tejidos de un organismo acutico, para evaluar su relacin con la funcin metablica tisular, con compromiso y disciplina. 1.8.3. Materiales y reactivos.

1.8.3.1. Materiales.

Estuche de diseccin, esptula, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, termmetro, pipetas Pasteur, vaso de precipitado de 5 mL, desecador.1.8.3.2. Instrumental.

Balanza analtica, bao de temperatura controlada, centrifuga, plancha de calentamiento, estufa de conveccin.

1.8.3.3. Reactivos.

HCl 6M, metanol, ter de petrleo, NaCl 30%. 1.8.4. Metodologa.

1) Pesar 1 g de una muestra picada de un tejido o alimento y colocarla en un tubo de ensayo con tapn, adicionar 5 mL HCl 6M y 5 mL de metanol, mezclar y tapar los tubos. Efectuar la determinacin por triplicado.

2) Calentar en bao de agua a 70 (C por 30 minutos.

3) Enfriar el digerido a temperatura ambiente y adicionar 10 mL de ter de petrleo, agitar, aadir 5 ml de NaCl 30%, reposar y centrifugar la mezcla (3000 rpm, 10 min.) para separar la capa orgnica con el extracto lipdico.

4) Remover con pipeta Pasteur la capa de ter con el extracto lipdico y colocarla en un tubo de ensayo limpio y seco.

5) Medir un volumen conocido (5 mL) de la solucin del extracto y colocarlo en un vaso de precipitado o vial de 10 mL a peso constante, evaporar el solvente a 60 (C en la campana de extraccin. Colocar el recipiente + extracto de lpidos en estufa de conveccin a 60 (C hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar los lpidos.

% Lpidos = (Peso del extracto /peso de muestra*) x 100* Peso de muestra correspondiente al volumen evaporado del extracto.1.8.5. Resultados a reportar.

Contenido de lpidos (g/100 g) en los tejidos analizados.

Contenido de lpidos que se reportan en la literatura para el tipo de muestra analizada.1.8.6. Mtodo de evaluacin.Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.

1.8.7. Bibliografa.

AOAC, 1990. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. Chapter 35: Fish and Other Marine Products. 948.15 Fat (crude) in seafood. Acid hydrolysis method. 15th edition. Arlington, Virginia, p. 871.Aveldao, M.I., Horrocks, L.A., 1983. Quantitative release of fatty acids from lipids by a simple hydrolysis procedure. Journal of Lipid Research 24, 1101-1105. Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Alimentos y Bebidas no Alcohlicas con Modificaciones en su Composicin. Especificaciones Nutrimentales. Secretara de Salud, Mxico. Diario Oficial de la Federacin 26 de junio de 1996. Apndice Normativo C. Determinacin de grasa. 1.1.3.1. Por hidrlisis cida.Robinson, J.E., Singh, R., Kays, S.E., 2008. Evaluation of an automated hydrolysis and extraction method for quantification of total fat, lipid classes and trans fat in cereal products. Food Chemistry 107, 11441150.Serwata, R.D., 2007. Nutritional evaluation of rendered animal by- products and blends as suitable partial alternatives for fish meal in diets for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Thesis MPhil, University of Stirling, Stirling, Scotland. Chapter 2: General materials and methods. 2.9.1. Determination of total lipid, p. 59.1.9. Determinacin de fosfoglicridos.

1.9.1. Introduccin.

La principal clase de fosfolpidos que existe en la naturaleza son los fosfoglicridos, se le encuentra como componentes esenciales de las membranas biolgicas. Estos son lpidos con grupos de cabeza que contienen fosfato. Se encuentran conformados por glicerol, polialcohol de tres carbonos, con dos enlaces acilo de cidos grasos unidos en la posiciones 1 y 2 del glicerol y un grupo fosfato esterificado en el tercer hidroxilo el cul a su vez se encuentra unido a grupo sustituyente, el cual dependiendo de su naturaleza que da nombre al tipo de fosfoglicrido.

Estructura general de un fosfoglicridoLos diferentes fosfoglicridos difieren en el tamao, forma y carga elctrica de los grupos (X) de la cabeza polar. A su vez, cada tipo de fosfoglicrido puede presentarse en especies qumicas distintas que se diferencian en los grupos acilos asociados a los cidos grasos (parte apolar). Comnmente hay un grupo acilo saturado y otro insaturado, se presenta una cabeza polar (grupo X) y una cola apolar (cadena hidrocarbonada), lo cual les confiere a las molculas una naturaleza anfiptica con un extremo hidroflico y otro hidrfobo. Esta caracterstica estructural posee una gran importancia en la estructura celular ya que los fosfoglicridos pueden agruparse al interaccionar las partes apolares, dando lugar a estructuras ms complejas como las membranas biolgicas celulares.

Tipos de fosfoglicridos:

Fosfatidilcolina (PC)

Fosfatidiletanolamina (PE)

Fosfatidilserina (PS)

Fosfatidilinositol (PI)

Fosfatidilglicerol (PG)

Fosfatidildiglicerol (DPG)Los fosfoglicridos ms abundantes en las membranas de las clulas de animales y de plantas superiores son la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilcolina, mientras que el fosfatidilglicerol y el difosfatidilglicerol son ms frecuentes en membranas bacterianas.

Un mtodo utilizado con frecuencia para el anlisis de fosfolpidos es la cromatografa de capa fina, en la cual es posible separarlos mediante la participacin de estos entre la fase estacionaria polar y la fase mvil de baja polaridad del solvente. El tipo de sistema de solventes utilizado determina el patrn de separacin de los lpidos bajo estudio. 1.9.2. Competencia.

Determinar los tipos principales de fosfoglicridos presentes en tejidos de un organismo acutico, para evaluar su relacin con caractersticas tisulares estructurales, con compromiso y disciplina.1.9.3. Materiales y reactivos.


Estuche de diseccin, esptula, mortero, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, tubos de ensaye con tapn, pipetas Pasteur, placa de vidrio, micropipetas, cuba cromatogrfica, regla.1.9.3.2. Instrumental.

Balanza analtica, centrifuga, estufa de conveccin.

1.9.3.3. Reactivos.

Mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v), HCl 1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo:metanol: cido actico:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v, cristales de yodo. 1.9.4. Metodologa.

1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de hgado. 2) Homogeneizar 2 g de hgado, en un mortero con 10 mL con una mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v) por 10 minutos.

3) Adicionar 3 mL de HCl 1N y mezclar, centrifugar 2000 rpm por 10 minutos.4) Descartar la fase metanlica (superior), con el uso de una pipeta Pasteur remover la fase clorofrmica inferior y transferirla a un tubo de ensaye.5) Adicionar 0.5 mL de la fase clorofrmica en un tubo de ensaye y agregar 0.5 mL de cloroformo. 6) Mediante una micropipeta aplicar una 1 gota de la dilucin en 3 puntos equidistantes en una placa de silica gel previamente preparada (suspensin de 25 g silicagel/50 mL de agua destilada, secado al aire, activacin a 100 (C por 30 min.), a 2 cm de altura de la base. Evaporar el cloroformo en la campana de extraccin.7) Colocar la placa en una cuba cromatogrfica saturada que contenga como fase mvil el sistema de solventes cloroformo:metanol: cido actico:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v).8) Desarrollar el cromatograma hasta que el solvente alcance 1 cm antes del borde superior de la placa, remover esta de la cubeta y secar a temperatura ambiente en la campana de extraccin.9) Revelado: Colocar las placas en un recipiente que contenga cristales de yodo, tapar y dejarlas hasta observar marchas color marrn-amarillas bien definidas. El yodo forma complejos moleculares reversibles por adicin a los dobles enlaces C=C de los cidos grasos componentes de los lpidos, lo cual permite su visualizacin.10) Retirar la placa y marcar con lpiz las manchas observadas ya que el yodo se evapora y la mancha desaparece. Calcular los Rf para cada mancha y compararlos con los Rf esperados para el sistema de solventes utilizado.

1.9.5. Resultados a reportar.

Valores de Rf de los compuestos separados mediante la cromatografa.

Tipos de fosfolpidos identificados en la muestra de lpidos del tejido analizado.1.9.6. Mtodo de evaluacin.Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.

1.9.7. Bibliografa.Fried, B., 2003. Lipids. En: Sherma, J. Fried, B. (eds.), Handbook of Thin-Layer Chromatography. 3rd edition. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 826-875. Holub, B., Skeaff, C.M., 1987. Nutritional regulation of cellular phosphatidylinositol. En: Conn, P.M., Means, A.R. (eds.), Methods in Enzymology, Volume 141. Academic Press, Orlando, pp. 234-244. Mucio Hidalgo, C. A., Smano Njera, J.B., 2008. Manual de prcticas de bioqumica metablica. Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Facultad de Qumica. Prctica No 2: Separacin de fosfolpidos por cromatografa en capa fina. Mxico, pp. 17-19.Parker, F., Peterson, N. F., 1965. Quantitative analysis of phospholipids and phospholipid fatty acids from silica gel thin-layer chromatograms. Journal of Lipid Research 65, 455-460.Peterson, B.L., Cummings, B.S., 2006. A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples. Biomedical Chromatography 20, 227243.1.10. Extraccin y determinacin de pigmentos fotosintticos.

1.10.1. Introduccin.

Los pigmentos fotosintticos (clorofilas, carotenoides, etc.) son fundamentales para transformar la energa lumnica en energa qumica, por medio de la fotosntesis. En plantas superiores se encuentra, en su mayora, la clorofila a (PM=893.4) y en menor proporcin la clorofila b (PM=907.4). La relacin entre ambas depende de las condiciones ambientales y de crecimiento. Una relacin (a/b) de 3-4 se espera en plantas que han crecido bajo altas intensidades de luz y una relacin de 2.5-3 se espera en plantas que han crecido con poca luz (sombra). La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se conocen al menos siete tipos) se encuentran en los sustituyentes que presentan; la clorofila a (verde azulada) presenta un grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la clorofila b (verde amarillenta) contiene un grupo aldehdo (-CHO) en la misma posicin.

Estructura de la clorofila a y bLos carotenoides, por su parte, pueden dividirse en dos grupos: (a) Carotenoides sin oxgeno como los (-carotenos; (b) Carotenoides que contienen oxgeno, denominados xantofilas. Entre las xantofilas se encuentran la violaxantina, anteraxantina, zeaxantina, entre otras.

Los pigmentos vegetales en base a su solubilidad pueden dividirse en dos grandes grupos: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo vacuolar; b) Solubles en solventes orgnicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo, naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y tilacoides de los cloroplastos. Son los responsables de la captacin de la energa luminosa en el proceso de la fotosntesis. Las clorofilas poseen unas estructura porfirnica, formada por cuatro anillos pirrlicos con un tomo de magnesio en su centro, un anillo de ciclopentanona y un ster de fitol unido a uno de los anillos de pirrol que provee a la molcula de una cola lipfila.

Existen plantas que contienen solamente clorofila a, como las algas azules, las diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas contienen en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e), fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus respectivos colores a las algas. Las clorofilas tienen tpicamente dos picos de absorcin en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media del espectro, correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta caracterstica origina que las clorofilas presenten un color verde, el cual se asocia con organismos o tejidos que contienen cloroplastos activos en sus clulas.

Espectro de absorcin de la clorofila a y b1.10.2. Competencia.

Analizar el tipo y contenido de pigmentos fotosintticos presentes en un vegetal acutico, para estimar la relacin con funciones metablicas del organismo de estudio, con organizacin y compromiso.1.10.3. Materiales y reactivos.


Estuche de diseccin, esptula, mortero, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, tubos de ensaye con tapn, pipetas Pasteur, placa de vidrio, micropipetas, cuba cromatogrfica, regla.1.10.3.2. Instrumental.

Balanza analtica, centrifuga, estufa de conveccin.

1.10.3.3. Reactivos.

Mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v), HCl 1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo-metanol-cido actico-H2O (50:37.5:3.5:2 v/v), cristales de yodo. 1.10.4. Metodologa.

1) Pesar 1 gramo de un vegetal fresco y macerar en un mortero con arena calcinada hasta obtener una pasta homognea.

2) Aadir 15 mL de acetona y mezclar al abrigo de la luz durante 5 minutos, enseguida filtrar a travs de papel filtro para remover slidos de la solucin con pigmentos.

3) Centrifugar el filtrado a 3000 rpm durante 5 min para separar los restos de arena y partculas en suspensin.

4) Medir el volumen del sobrenadante, tomar 1 mL en un tubo de ensayo y diluir con 4 mL de acetona.

5) Medir el espectro de absorbancia de la solucin en el intervalo de 380 a 700 nm.

6) Estimar el contenido de clorofila a en el tejido midiendo la absorbencia (A) a 663 nm y mediante el uso de la siguiente ecuacin:

Clorofila a (mg/g peso fresco) = A x 11.9 mg/L x (volumen total del extracto/g de muestra)1.10.5. Resultados a reportar.

Espectro de absorcin del extracto con pigmentos del vegetal.

Tipo de pigmentos identificados en la muestra analizada.

Contenido de clorofila a por g de peso fresco del vegetal.1.10.6. Mtodo de evaluacin.Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.

1.10.7. Bibliografa.Dawes, C.J., 1991. Botnica Marina. Editorial Limusa, Mexico, D.F., pp. 421-429.Dunn, J.L., Turnbull, J.D., Robinson, S.A., 2004. Comparison of solvent regimes for the extraction of photosynthetic pigments from leaves of higher plants. Functional Plant Biology 31, 195-202.Hagerthey, S.E., Louda, J.W., Mongkronsri, P., 2006. Evaluation of pigment extraction methods and a recommended protocol for periphyton chlorophyll a determination and chemotaxonomic assessment. Journal of Phycology 42, 1125-1136.Schagerl, M., Knzl ,G., 2007. Chlorophyll a extraction from freshwater algae a reevaluation. Biologia 62(3), 270-275.Vicente, E., De Hoyos, C., Snchez, P., Cambra, J., 2005. Protocolos para el muestreo y anlisis para fitoplancton. Ministerio de Medio Ambiente, Confederacin Hidrogrfica del Ebro, Zaragoza, pp. 25-27.

2. METABOLISMO

2.1. Oxidacin biolgica y transporte de electrones.2.1.1. Introduccin.Los organismos animales son hetertrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia energa, como lo hacen las plantas en la fotosntesis, sino que deben ingerir esa energa en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante su oxidacin mediante una serie de reacciones bioqumicas. La oxidacin de los compuestos orgnicos se asocia a la ganancia de oxgeno, perdida de hidrgeno o perdida de electrones; en tanto que la reduccin implica prdida de oxgeno, ganancia de electrones o ganancia de hidrgeno.

Las principales fuentes de energa para los animales son los carbohidratos, lpidos y protenas, el metabolismo energtico de estos compuestos incluye reacciones como la gluclisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las clulas oxidan los compuestos orgnicos para generar ATP, necesario para su trabajo til. Es en la mitocondria donde se llevan a cabo las reacciones oxidativas para la obtencin de energa. En la mitocondria se halla un conjunto de enzimas que hacen posible la oxidacin de los metabolitos en el ciclo de Krebs del cual se derivan electrones hacia la cadena respiratoria, la cual se efecta en la membrana interna de la mitocondria donde ocurre un transporte de electrones para formar como producto final H2O.

Reacciones de la cadena respiratoriaLa generacin de ATP en la mitocondria a travs de la fosforilacin oxidativa es el resultado de la transferencia de electrones desde el NADH o el FADH2 al oxgeno. Los pares de electrones derivados de los intermediarios del ciclo de Krebs fluyen a lo largo de una cadena de varios eslabones, constituidos por enzimas de transporte electrnico, con niveles de energa sucesivamente inferiores hasta reducir al oxgeno molecular, que es el ltimo aceptor electrnico, en la respiracin. Durante este proceso se conserva gran parte de la energa libre de estos electrones en forma de energa del enlace fosfato del ATP; el proceso se le denomina fosforilacin oxidativa.

Una forma de estudiar la produccin de energa por parte de la mitocondria, la cual implica el transporte de electrones a lo largo de una cadena de reacciones, es mediante la oxidacin de un sustrato como el succinato y el uso de un compuesto qumico colorido aceptor de electrones, con el cual pueda estimarse la velocidad de transferencia de dichos electrones con la perdida de color del compuesto. Un aceptor artificial de electrones es el ferrocianuro de potasio, esta sustancia es de color amarillo y a medida que capta electrones se decolora y adquiere una tonalidad ms plida. El proceso de cambio de color en una solucin de ferrocianuro por efecto de la cantidad de electrones aceptados como resultado de la oxidacin del succinato se puede evaluar mediante uso de espectrofotometra en el intervalo del espectro visible.2.1.2. Competencia.Analizar la oxidacin de un sustrato orgnico y el transporte de electrones presentes en el tejido de un animal acutico, para estimar la capacidad biolgica para producir energa, con disciplina y dedicacin.2.1.3. Materiales y reactivos.2.1.3.1. Materiales.Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 1 y 25 mL, embudo de vidrio, tubos de ensaye con tapn, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipeteros, gradilla, pipetas Pasteur, vasos de precipitado 250 mL, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotmetro, papel filtro.2.1.3.2. Instrumental. Balanza analtica, plancha de calentamiento, centrifuga, espectrofotmetro. 2.1.3.3. Reactivos.Buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), succinato de sodio 0.01M (en buffer de fosfatos), malonato de sodio 0.01M (en buffer de fosfatos), cianuro de potasio 0.01M, ferrocianuro de potasio 0.01M, cido tricloroactico 10%.2.1.4. Desarrollo

1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de corazn. 2) Picar finamente las muestras y pesar 1 g de tejido y colocarlo en 19 mL de buffer de fosfatos fro.3. Homogeneizar la muestra mediante un homogeneizador manual de tubo con embolo en un bao de hielo durante un 1 minuto.

4. Filtrar a travs de una capa de gasa fina o papel filtro de poro abierto y separar el filtrado, colocar este en un bao de agua con hielo.

5. Numerar 3 series tubos de ensayo por triplicado y proceder de acuerdo a la siguiente tabla: Solucin Serie 1Serie 2Serie 3

Buffer de fosfatos pH 7.43 mL2 mL1.9 mL

Succinato de sodio 0.01M1 mL1 mL

Malonato de sodio 0.01M0.1 mL

Extracto del tejido 1 mL1 mL1 mL

Cianuro de potasio1 gota (0.06 mL)1 gota (0.06 mL)1 gota (0.06 mL)

6. Colocar los tubos en un bao de agua a 37( C por 5 minutos.

7. Aadir a cada tubo 1 mL de ferrocianuro de potasio 0.01 M y reposar por 10 minutos. 8. Adicionar 5 mL de cido tricloroactico a cada tubo y mezclar en forma homognea. 9. Centrifugar los tubos a 2000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante obtenido.

10. Leer la absorbencia de las soluciones a 420 nm. Ajustar la absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga nicamente solucin buffer.11. Calculo del contenido de micromoles de ferrocianuro contenidas en cada serie de reaccin:(M Ferrocianuro = A/E*L= A/(1x10-3 mol-1 cm-1)*1 cmA: absorbencia; E: coeficiente de extincin molar del ferrocianuro; L: longitud de la celda de lectura.

2.1.5. Resultados a reportar. Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos sin succinato.Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos con succinato.Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de tubos con malonato.

Micromoles de succinato oxidadas.2.1.6. Mtodo de Evaluacin

Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.2.1.7. Bibliografa

Devlin, T.M., 2004. Bioqumica. 4 edicin. Editorial Revert, S.A., Barcelona, pp. 566-575.

Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 10: Electron Transport and Oxidative Phosphorylation, p. 223-238.Hatefi, Y., 1985. The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annual Review of Biochemistry 54, 1015-1069.Martnez Montes, J.M., 2011. Practica de bioqumica para veterinaria No 10. Oxidacin mitocondrial del succinato [en lnea, fecha de consulta: 18 julio 2013]. Disponible en: http://practicasdebioqumica.blogspot.mx/2010/11/practica-de-bioquimica-para-veterinaria.htmlQuaciliariello, E. & Palmieri, P., 1968. Control of succinate oxidation by succinate-uptake by rat-liver mitochondria. European Journal of Biochemistry 4, 20-27.2.2. Actividad oxidativa de lactato deshidrogenasa.2.2.1. IntroduccinLa lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima citoplasmtica que se encuentra en forma soluble o ligada a membrana, se presenta ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos, la cual cataliza la siguiente reaccin:Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+La LDH es una enzima que abunda en hgado, msculo esqueltico y eritrocitos; tambin se encuentra en menor cantidad en corazn, rin y en mucho menor concentracin en pncreas y pulmn. A pH 7.3 7.8 el equilibrio de la reaccin est desplazado hacia el lactato, pero a pH ms alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato; la reaccin puede ocurrir en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la concentracin de los sustratos que se encuentren presentes. Presenta un papel importante en el metabolismo de carbohidratos, interviniendo en el ltimo paso de la glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeognesis a partir de lactato. Adems, aporta combustible al ciclo de Krebs en tejidos consumidores de lactato como el msculo cardiaco. La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre otros -ceto o -hidroxicidos estructuralmente similares al pirvico, como el -cetobutrico. De igual forma, puede utilizar tambin el NADPH, como coenzima, aunque las velocidad de reaccin es mucho menor con relacin al NADH. Su peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un tetrmero dispuesto tetradricamente, en el que las subunidades van unidas por enlaces hidrfobos, puentes de hidrgeno y fuerzas electrostticas. Existen dos tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles dan lugar a cinco formas moleculares (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5) con actividad lactato deshidrognica y con caractersticas cinticas y fisicoqumicas diferentes, que se han denominado isoenzimas. En mamferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporcin que utiliza cada rgano como fuente de combustible es variable. Durante una actividad fsica el requerimiento energtico del msculo esqueltico y el corazn aumenta considerablemente. En los dos primeros minutos de esta actividad el miocardio obtiene esa energa a partir de glucosa tanto sangunea como de sus propias reservas de glucgeno, y aunque el consumo de oxgeno aumenta unas cuatro veces, un 50% del piruvato formado se convierte en lactato (participacin de la LDH1 y LDH2), Este cambio metablico temporal le permite al corazn obtener la energa necesaria hasta que adapte su metabolismo para lograr un incremento en el consumo de cidos grasos. El msculo esqueltico utiliza (en los primeros segundos) la energa almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la degradacin del glucgeno muscular para aportar glucosa como fuente de energa. Aunque en este tejido durante una actividad intensa el consumo de oxgeno aumenta unas veinte veces, gran parte del piruvato formado se convierte en lactato (participacin de la LDH5 y LDH4). Este cambio metablico le permite a este rgano obtener energa extra utilizando la gluclisis anaerbica. El cambio de piruvato a lactato es una va de recuperacin de NAD+ para que la gluclisis contine. La mayor parte del lactato formado en esta etapa es recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en el hgado mediante un proceso que requiere el aporte de energa (Ciclo de Cori). Aqu la oxidacin de lactato a piruvato es favorecida por la baja relacin NADH/NAD+ y la escasa presencia de piruvato intracelular. La LDH es una enzima cercana al equilibrio, regulada por la razn NADH/NAD+ y por presentar formas isoenzimticas con caractersticas distintas tanto cinticas como de inhibicin por sustrato. La inhibicin por exceso de sustrato tiene lugar por la formacin de un complejo NAD-piruvato que compite con el NADH por el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibicin por intermediarios de ciclo tricarboxlico: oxalacetato y citrato.

2.2.2. Competencia.Evaluar la capacidad redox de la enzima lactato deshidrogenasa de musculo esqueltico e hgado de un animal acutico, para estimar su relacin con el metabolismo tisular de carbohidratos, con organizacin y disciplina.2.2.3. Materiales y reactivos. 2.2.3.1. Materiales.Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 5 y 1 mL, tubos de ensaye, micropipetas, pipeteros, gradilla, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotmetro.2.2.3.2. Instrumental.Balanza analtica, centrifuga refrigerada, espectrofotmetro. 2.2.3.3. Reactivos.Sacarosa 0.25M, buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), NADH 3.5 mM, piruvato de sodio 21 mM.2.2.4. Desarrollo.1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de hgado y msculo.

2) Homogenizar 1 g de cada muestra en 10 mL de solucin de sacarosa 0.25 M fra.3) Centrifugar a 15,800 rpm durante 20 minutos en centrfuga refrigerada. 4) Separar el sobrenadante y diluirlo en una relacin 1:50 con sacarosa 0.25 M.5) Preparar series de tubos por duplicado de acuerdo con la siguiente tabla:Solucin Serie 1Serie 2Serie 3

Buffer de fosfatos pH 7.42.8 mL2 mL2 mL

NADH 3.5 mM0.1 mL0.1 mL0.1 mL

Extracto del tejido 1 mL1 mL

6) Adicionar 0.1 mL de piruvato de sodio 21 mM a cada tubo y leer la absorbencia a 340 nm cada 30 segundos durante un intervalo de 10 minutos.

7) Calcular la actividad especfica de la enzima, en M/ min x g de tejido, con base en los valores de absorbencia (A) registrados y de acuerdo a la siguiente expresin:

A =( x c x l( = Coeficiente de extincin del NAD+ = 6.22 cm-1 mM-1; c: concentracin en moles/L; l: longitud en cm de la celda de lectura.

2.2.5. Resultados a reportar.Valores y grfica de absorbencia contra tiempo de la oxidacin del NADH.Actividad especfica de la enzima lactato deshidrogenasa en cada tejido.2.2.6. Mtodo de Evaluacin


Crabtree, B., Newsholme, E. A., 1972. The activities of phosphorylase, hexokinase, phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and the glycerol 3-phosphate dehydrogenases in muscles from vertebrates and invertebrates. Biochemical Journal 126, 49-58Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer, Heidelberg. Chapter 8: Carbohydrate Metabolism A: Glycolysis and Gluconeogenesis, pp. 163-204.ivadinovi, D., Nikevi, M., 2010. Kinetic properties of lactate dehydrogenase from trout muscle. Archives of Biological Sciences, Belgrade, 62 (2), 297-300.

Sensabaugh, G.F., Nathan, O., 1972. Liver of gadoid fish lactate dehydrogenase specific to the liver of gadoid fish. Journal of Biological Chemistry 247, 585-593.Tseng, Y.-C., Lee, J.-R., Chang, J. C.-H., Kuo, C.-H., Lee, S.-J., Hwang, P.-P., 2008. Regulation of lactate dehydrogenase in tilapia (Oreochromis mossambicus) gills during acclimation to salinity challenge. Zoological Studies 47(4), 473-480.2.3. Capacidad metablica celular y actividad de citocromo oxidasa.2.3.1. IntroduccinLa citocromo C-oxidasa es un enzima que est presente en todos los organismos aerobios, la cual en la cadena respiratoria cataliza la transferencia de electrones al oxgeno como ltimo aceptor de electrones para formar agua. La citocromo oxidasa conforma el Complejo IV dentro de los complejos de transportadores y protenas que integran la cadena respiratoria, el cual cataliza la formacin de H2O a partir de 2e-, O y 2H+. Este complejo contribuye con la generacin de un gradiente de protones para generar un ATP. La reduccin del oxgeno para generar agua permite liberar energa por flujo de electrones el cual favorece la fosforilacin de ADP a ATP, este proceso se denomina fosforilacin oxidativa y tiene lugar en la membrana interna de la mitocondria.

La citocromo oxidasa cataliza la transferencia de electrones del citocromo C al oxgeno para formar agua de acuerdo a la siguiente redaccin:

4Citocromo c (Fe+2) + 4H+ + O2 4Citocromo c (Fe+3) + 2H2O

La actividad de la citocromo oxidasa se puede determinar mediante el uso de dimetil-para-fenilendiamina, indicador de reduccin-oxidacin, compuesto que al ser oxidado y en presencia de (-naftol genera un cromforo colorido denominado azul de indofenol.

2.3.2. CompetenciaEvaluar la capacidad de oxidacin de la citocromo oxidasa de corazn e hgado de un animal acutico, para estimar su relacin con la capacidad metablica celular del tejido, con voluntad y disposicin.2.3.3. Material2.3.3.1. Materiales

Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, pipetas graduadas de 10, 2 y 1 mL, tubos de ensaye, pipeteros, gradilla, tubos de centrifuga, cronometro.2.3.3.2. InstrumentalBalanza analtica, centrifuga refrigerada, bao de temperatura controlada.

2.3.3.3. ReactivosKCl 0.15M, (-Naftol 0.15% en etanol 10%, dimetil-para-fenilendiamina 0.15%, KCN 0.01%. 2.3.4. Desarrollo

I) Separacin de fracciones.

1) Disecar peces recin sacrificados y remover el hgado y el corazn. 2) Pesar los rganos extrados y mantenerlos en bao de hielo.

3) Picar finamente las muestras y preparar un homogeneizado por tejido con 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo de tejido.

4) Centrifugar el homogeneizado en frio, a 500 rpm por 15 minutos.

5) Decantar el sobrenadante en un recipiente limpio y fro y desechar el residuo.

6) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 3000 rpm por 15 minutos.

7) Separar el sobrenadante en un recipiente limpio y frio y etiquetar como "sobrenadante de hgado" o sobrenadante de corazn segn corresponda. De igual forma, separar y pesar en frio el precipitado, mezclar en 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo y etiquetar como "suspensin de hgado" o suspensin de corazn segn corresponda.II) Actividad enzimtica.1) Preparar series de 5 tubos de sobrenadante y suspensin de cada tejido, de acuerdo a la tabla siguiente:Tubo

Reactivos 12345

(-Naftol 0.15% en etanol 10%0.50.50.50.5

Dimetil-para-fenilendiamina 0.15% 0.50.50.50.5

Agua destilada11.51.50.52

Mezclar y calentar en bao de agua a 37(C por 10 minutos

KCN 0.01%0.5

Sobrenadante o suspensin del tejido1111

2) Calentar los tubos en bao de agua a 37( C con agitacin suave.

3) Registrar los cambios de color en cada tubo al tiempo 0, 15, 30, 45 y 60 minutos despus de la adicin de los extractos de tejidos.

4) Los colores esperados se asocian a las siguientes condiciones en el medio de reaccin: Caractersticas de reaccin Color esperado

Oxidacin de la dimetil-para-fenilendiamina e interaccin con el (-naftol para formar azul de indofenol Morado

Oxidacin de la dimetil-para-fenilendiamina, ausencia de (-naftol Caf

Sustrato en forma reducida y presencia de (-naftol Violeta

Inhibicin de la reaccin de oxidacin Lila

2.3.5. Resultados a reportar.Tiempo de deteccin de la oxidacin de la dimetil-para-fenilendiamina por tipo de muestra y fraccin de extracto analizados.

Fracciones de extractos con actividad positiva de la citocromo oxidasa. 2.3.6. Mtodo de Evaluacin


Chance, B., Saronio, C., Leigh, J. S., 1975. Functional intermediates in the reaction of membrane-bound cytochrome oxidase with oxygen. Journal of Biological Chemistry 250, 9226-9237.Goolish, E. M., Adelman, I. R., 1987. Tissue-specific cytochrome oxidase activity in largemouth bass: the metabolic costs of feeding and growth. Physiological Zoology 60 (4), 454-464.Instituto Politcnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioqumica Mdica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formacin Bsica Disciplinaria. Academia de Bioqumica Mdica I. Oxidaciones biolgicas: Obtencin de la fraccin mitocondrial del tejido; Determinacin de la actividad de citocromo-oxidasa. Mxico., pp. 42-45.

Kuboyama, M., Yong, F.C., King, T.E., 1972. Studies on cytochrome oxidase . VIII. Preparation and some properties of cardiac cytochrome oxidase. Journal of Biological Chemistry 247, 6375-6383.Ludwig, B., Bender, E., Arnold, S., Httemann, M., Lee, I., Kadenbach, B., 2001. Cytochrome c oxidase and the regulation of oxidative phosphorylation. ChemBioChem 2(6), 392-403.Speers-Roesch, B., Ballantyne, J. S., 2005. Activities of antioxidant enzymes and cytochrome c oxidase in liver of Arctic and temperate teleosts. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 140(4), 487-494.AnexosNormas Generales de Seguridad e Higiene1. El uso de bata es obligatorio.

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles.

3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuacin por fuego o por cualquier otro incidente, as como conocer la localizacin exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se est en el laboratorio.

5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos qumicos o sus vapores pueden pasar detrs de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas.

6. S un producto qumico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupcin. Acta siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presin de agua de un grifo directamente al ojo porque podras lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia mdica.

7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodn) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos qumicos son inevitables.

8. 8. As mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.

9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos qumicos.

10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservacin de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.

11. Lavarse siempre las manos despus de hacer cualquier anlisis y antes de salir del laboratorio.

12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

13. Est prohibido fumar en el laboratorio por razones higinicas y de seguridad.

14. No inhales, pruebes o huelas productos qumicos si no ests debidamente informado.

15.

Documents

Manual de Laboratorio de Bioquímica Tec