Manual Micro Clinica2014 Practica2 y3

7/23/2019 Manual Micro Clinica2014 Practica2 y3

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICA E INGENIERIA

MANUAL DE PRCTICASLABORATORIO

MICROBIOLOGIA CLINICA7818

MSP LILIA ANGELICA HURTADO AYALAMSP LUIS ALBERTO ALCANTARA JURADO


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ASPECTOS GENERALES PARA LA COLECCIN DE LAS MUESTRAS CLINICAS

PARA ANALISIS MIROBIOLOGICO:

o La muestra clnica debe ser representativa del proceso infeccioso.

o Evitar la contaminacin cruzada con microorganismos saprofitos del rea.

o Establecer el momento ptimo para la recoleccin de muestras.

o Obtener una cantidad suficiente de la muestra a procesar.

o Debe usarse dispositivos de recoleccin correctos, envases y medios de

transporte apropiados para asegurar una recuperacin ptima de los

microorganismos, evitar derrame del espcimen y mantener las medidas de

bioseguridad apropiadas.

o

De ser posible, debe obtenerse las muestras antes de la administracin de

antibiticos a los pacientes.

o Identificar cada muestra con una etiqueta legible, con Nombre del pacientes,

cdigo de identificacin, Procedencia, Tipo de muestra, Fecha / hora de

coleccin

o Anotar diagnostico presuntivo o microorganismo presuntivo.

TRANSPORTE DE MUESTRAS

o El transporte debe ser a la brevedad posible para evitar un deterioro de las

misma, se recomienda un lmite de 2 horas entre la recoleccin y la llegada

de las muestras al laboratorio.

o Mantener las muestras a la temperatura y condiciones adecuadas, en caso de

no enviarlas en el lmite de 2 hrs al laboratorio.

1. MUESTRAS QUE SE DEBEN MANTENER A 4 C :

Tejido de autopsia, lavado bronquial, catter i.v , Biopsia de pulmn ,

Lquido pericrdico, esputo, orina., quemaduras, odo externo.


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2.

MUESTRAS QUE SE DEBEN MANTANER A TEMPERATURA AMBIENTE

Muestras de LCR, Lquido sinovial, abdominal y amnitico, bilis, aspirado

de pulmn, lesin, placenta, nasal, aspirado transtraqueal, orina

suprapbica, raspado corneal, sangre, humor vtreo, mdula sea, crvix,

conjuntiva, genitales, heces, nasofarngeo, tracto respiratorio superior.,

heridas, cultivos por anaerobios, ocular, genital, odo interno.

3. MUESTRAS QUE SE DEBEN MANTENER CONGELADAS

Para la bsqueda de virus, sin embargo, los virus permanecen estables

por 2 a 3 das en medios de transporte apropiados.

o Microorganismos sensitivos a las condiciones ambientales, como:

N. meningitidis, N. gonorrhoeae y H. influenzae se recomienda sembrar

directamente en medio de cultivo en el sitio de coleccin de la muestra.

o Si habr demora en el envo de la muestra, se recomienda utilizar medios de

transporte adecuados como Stuart, Amies o Cary-Blair.

o

Tenga en cuenta que los medios de transporte estn formulados paramantener la viabilidad de los microorganismos, sin embargo, algunos

podran no sobrevivir en un medio pobre en elementos nutricionales

especficos.

o Siempre que sea posible, las muestras deben ser enviadas directamente y en

forma inmediata al laboratorio de microbiologa, sin utilizar las reas de

recibo central u otros departamentos del laboratorio.

NO SE DEBE GUARDAR UNA MUESTRA POR MAS DE 24 Hrs. BAJO NINGUNA

CONDICION.


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CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS CLINICAS:

o Muestras no rotuladas o sin identificacin.

o Discrepancia en la identificacin del paciente y la muestra.

o Envase inapropiado o medio de transporte inadecuado.

o Demora prolongada en enviar la muestra al laboratorio.

o Duplicacin de muestra del mismo paciente dentro de 24 hrs.

o No indicar tipo de muestra o procedencia.

o No indicar tipo de examen en la orden

o Muestra derramada o rotura del envase.

o Hisopos secos.

o

Volumen inadecuado.

o Contaminacin obvia de la muestra.

PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS:

Todas las muestras deben ser procesadas lo ms rpidamente posible al llegar al

laboratorio. Sin embargo, su manejo puede ser clasificado de la siguiente manera,

independientemente de su orden.

Muestras Urgentes

Sangre

LCR

Aspirado transtraqueal

Liquido pericrdico

Liquido amnitico

Tracto respiratorio inferior

Liquido articular (Artritis sptica).

Biopsia de Pulmn


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PRACTICA No. 1

COPROCULTIVO

Competencia general:El alumno identificara las posibles especies patgenas de microorganismos

presentes en las vas gastrointestinales a travs de la tcnica de coprocultivo y el

anlisis bioqumico de los microorganismos, para el apoyo al diagnstico de

padecimientos gastrointestinales con apego a la normatividad vigente y

salvaguardando la integridad del paciente.

ANLISIS MICROBIOLGICO DE HECES

IntroduccinLa incidencia de las infecciones gastrointestinales agudas es muy variable y pueden

estar causadas por una gran variedad de patgenos bacterianos, vricos o

protozoarios. Los sntomas varan desde trastornos funcionales relativamente leves,

poco molestos y autolimitados, hasta convertirse en un proceso potencialmente

grave, en relacin con cuadros de deshidratacin y desnutricin severos e

importantes desequilibrios hidroelectrolticos que pueden tener un curso

fulminante y poner en peligro la vida del enfermo. Las diarreas clnicamentesignificativas en adultos son menos frecuentes, salvo en epidemias especficas

definidas o en brotes con un origen comn debido a alimentos o agua contaminados.

Los mismos agentes etiolgicos son, en gran medida, los causantes de diarreas

agudas en adultos y en nios. En el tratamiento de la enfermedad diarreica aguda, la

determinacin del agente etiolgico especfico tiene una importancia mucho menor

que la reposicin rpida de los electrolitos perdidos, ya que son estas prdidas las

que constituyen la causa principal de morbilidad y de mortalidad. La identificacinde la causa especfica tiene menor importancia, ya que el tratamiento

antimicrobiano slo ha demostrado eficacia en una minora de casos. Con

frecuencia, la determinacin de la epidemiologa de la enfermedad es de ms ayuda

que las tcnicas de laboratorio para identificar los casos en que hay posibilidades de

que el tratamiento antimicrobiano sea til.


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El coprocultivo es el mtodo utilizado para la investigacin de organismos

patgenos causantes de infecciones gastrointestinales, que aun siendo un anlisis de

rutina solo puede detectar al agente etiolgico en un 60 a 80%, quedando el otro

20% en sndrome diarreico inespecfico. La tcnica de coprocultivo que aqu se

describe es un mtodo de rutina para el aislamiento de Salmonella, Shigellay cepas

comensales y patgenas de Escherichia coli. El aislamiento de Yersinia enterocolitica

requiere medios selectivos (medio CIN) y/o enriquecimiento en fro. Para el

aislamiento de Campylobacter es necesario utilizar medio Campy-BAP e incubarlo

en microaerofilia a 42C.

Parte Experimental

1. TOMA DE MUESTRAS Y TRANSPORTE.

Material:

Recipiente estril de boca ancha, o hisopo estril con medio de transporte.

A. TECNICA DE MUESTREO

Para nios/as

Para bebs y nios pequeos que usan paales: Se puede cubrir el paal con un

envoltorio plstico o bolsa especial para colecta de heces en paal.

Para adultos

Se pueden recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plstico que se coloca

suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el asiento. Luego se coloca la

muestra en un recipiente limpio.

El equipo para recoleccin de la muestra trae una gasa especial que se usa para

recogerla y luego se coloca la muestra en un recipiente limpio.

B. FASE PREANALITICA EN EL LABORATORIO

Evitar contaminacin por material no estril.

Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.

Etiquetar muestra adecuadamente.


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Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

Recoger 5-10 g de heces en el recipiente estril. En algunos casos es

aceptable hacer la toma mediante una torunda o hisopo rectal

Si no puede sembrarse la muestra antes de 2 horas, debe utilizarse un medio

de transporte, como Cary-Blair o Glicerol/Tampn fosfato (50:50, pH 7).

Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato emulsionar

aproximadamente 1g de heces en 1 ml de agua peptonada, o bien, depositar

en ste el hisopo rectal.

Muestra de heces de 12 o 24 hrs. Se recogern las heces en un frasco limpio

con cierre hermtico, no es necesaria la esterilidad. El anlisis se har en las

12 horas siguientes a la deposicin, guardando la muestra a 4-10 C.

Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir un volumen igual al de

las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial.

2. FASE ANALITICA

Material:

Un tubo de caldo selenito para enriquecimiento.

Una placa de cada uno de los siguientes tipos de medios de cultivo:

o Medios moderadamente selectivos, como MacConkey o Levine (EMB).

o Medios selectivos, como SS (Salmonella-Shigella), XLD (Xilosa, Lisina y

Desoxicolato) o Hektoen.

o Medios muy selectivos, como BG (Verde Brillante) o BS (Bismuto-Sulfito)

Una placa de medio CIN (cefsulodina-irgasan-novobiocina) para Yersinia.

Una placa de medio Campy-BAP para Campylobacter.

EXAMEN MACROSCOPICO DE LA MUESTRA1.

Olor

2. Consistencia

3. Presencia de mucus

4.

Sangre


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5.

Restos de alimentos sin digerir.

EXAMEN EN FRESCO.

Observacin en el microscopio: lugol- fresco:

1.

Realizar una dilucin en un tubo de ensayo con una pequea cantidad de

heces y un poco de agua destilada, agitar.

2.

Colocar una gota de esta dilucion en un portaobjetos y aadir una gota de

Lugol, tapar con un cubreobjetos. Observar a 40X.

PRUEBA DE PARASITOLOGA:

Cuando se sospecha de la presencia en heces de parsitos.

1.

En otro vaso para muestra colocar una gasa en la boca y una muestra de

heces, agregar 50 ml de solucin salina fisiolgica (0.9%).

2.

Al lquido resultante del filtrado de le coloca en un tubo de centrifuga y se

centrifuga 5 min. a 3000 r.p.m. se desecha el sobrenadante y obtenemos el

sedimento que observaremos con una gota de lugol a 10 y 40X

TECNICA DE COPROCULTIVO

1. Inocular directamente las heces con asa estril, o el hisopo empleado para tomarla muestra.

2. IncubaR a 37C en aerobiosis durante 48 horas,

3. Para el aislamiento de Salmonella puede hacerse adems un enriquecimiento en

medio de selenito.

4. Inoclese con la muestra de heces un tubo de 10 ml de caldo selenito, e incbese a

37 C.

5. Si no se ha aislado Salmonella, se har un subcultivo a partir del tubo de caldoselenito en medio selectivo para Salmonella.

6. Para la bsqueda de Yersinia conviene incubar tambin una placa de MacConkey a

30 C, si no se utiliza medio selectivo CIN.

7. Las placas de medio Campy-BAP para Campylobacter se incuban a 42C en

microaerofilia.


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3. EXAMEN MORFOLOGIA MACROSCOPICA EN CULTIVOS.

Las placas se examinarn en busca de colonias sospechosas de pertenecer a alguno

de los patgenos intestinales. Para ello se tendr en cuenta las caractersticas de

crecimiento en los distintos medios, como se expone a continuacin:

Agar MacConkey

Caractersticas: Es un medio moderadamente selectivo. Las sales biliares y el

cristal violeta inhiben a la mayora de las bacterias Gram-positivas y algunas

Gram-negativas. La fermentacin de lactosa hace virar el indicador a rojo.

Aspecto de las colonias: Los fermentadores tpicos de lactosa (E. coli,

Klebsiella y Enterobacter) dan colonias rosas o rojas rodeadas de un halo de

sales biliares precipitadas. Los fermentadores dbiles o lentos de lactosa

(Citrobacter, Serratia) pueden dar colonias incoloras a las 24 h y rosadas a las

48 h. Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia dan colonias incoloras.

Enterococcus forma pequeas colonias.

Agar Levine o EMB

Caractersticas: Es un medio ligeramente ms selectivo que el MacConkey. La

eosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de bacterias Gram-

positivas y algunas Gram-negativas. La fermentacin de lactosa precipita

ambos colorantes al acidificar el medio.

Aspecto de las colonias: E. coli forma colonias oscuras con brillo metlico

verdoso. Los fermentadores no tan fuertes de lactosa (Klebsiella,

Enterobacter y Serratia) forman colonias moradas en 24 a 48 h. Los no

fermentadores de lactosa (Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia) dancolonias transparentes.


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Agar Salmonella-Shigella (SS)

Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta

concentracin de sales biliares y citrato inhibe todas las bacterias Gram-

positivas y muchas Gram-negativas, incluidos los coliformes. La fermentacin

de lactosa hace virar el rojo neutro a rojo. El SH2 formado a partir de

tiosulfato da un precipitado negro al reaccionar con hierro.

Aspecto de las colonias: Los fermentadores de lactosa estn bastante

nhibidos y dan colonias rojas. Las colonias de Salmonella aparecen sin

inhibir, transparentes, con el centro negro. Las especies de Shigellason ms o

menos inhibidas y dan colonias transparentes sin centro negro. Las colonias

de Proteus son similares a las de Salmonella.

Agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato)

Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. El

desoxicolato inhibe a las bacterias Gram-positivas y frena la invasin por

Proteus. Lleva citrato y tiosulfato para completar el efecto selectivo, los

azcares lactosa, xilosa y sacarosa, y rojo de fenol como indicador de pH. No

se esteriliza.

Aspecto de las colonias: Salmonellacomienza por acidificar el medio por

fermentacin de xilosa, pero sta se agota rpidamente y el medio se

alcaliniza por descarboxilacin de la lisina. Las colonias de Salmonella

aparecen rojas con el centro negro por la produccin de SH2. Las colonias de

Proteus pueden ser semejantes. Los coliformes mantienen el medio cido por

fermentacin de lactosa y sacarosa, que se hallan en exceso, y forman

colonias amarillas. Las colonias de Shigella aparecen rojas al no fermentar

ninguno de los azcares.

Agar entrico Hektoen

Caractersticas: Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella. La alta

concentracin de sales biliares inhibe todas las bacterias Gram-positivas y


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retrasa el de muchos coliformes. La fermentacin de los azcares hace

reaccionar la fuchsina con el azul timol, dando color amarillo a pH cido.

Aspecto de las colonias: E. coli y otros fermentadores rpidos de lactosa son

moderadamente inhibidos y dan colonias naranjas o rosadas. Las colonias de

Salmonella aparecen azul-verdosas con el centro negro por la produccin de

SH2. Las colonias de Shigella son ms verdosas y sin centro negro. Las

colonias de Proteus estn inhibidas y son pequeas y transparentes.

Agar BS (Sulfito de Bismuto)

Caractersticas: Es un medio altamente selectivo para Salmonella. El sulfito

de bismuto y el verde brillante inhiben a la mayora de los coliformes y a

otras bacterias. La produccin de SH2 se detecta como en los medios

anteriores. No lleva azcares ni indicador de pH. No se esteriliza.

Aspecto de las colonias: E. coli y otros coliformes estn fuertemente

inhibidos, y si crecen dan colonias pequeas, color verde o pardo. Las

colonias de Salmonella aparecen con el centro negro por la produccin de

SH2, el borde ms claro y un halo oscuro en el medio de cultivo que tiene

reflejos metlicos, debido a la reduccin del bismuto a metal. Las colonias de

Proteus estn inhibidas y son pequeas y negras, por la produccin de SH2.

Agar con Verde Brillante

Caractersticas: Es un medio altamente selectivo para Salmonella, a

excepcin de Salmonella typhi. El efecto inhibitorio se debe al colorante

verde brillante. La fermentacin de lactosa o sacarosa hace virar el indicador,

rojo de fenol, dando coloracin amarilla.

Aspecto de las colonias: Las colonias de Salmonella aparecen de color rosablanquecina. Algunas cepas de S. typhi y Proteus pueden crecer dando

colonias

rojas. Los fermentadores de azcares, como E. coli, forman colonias

marilloverdosas, muy inhibidas.


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Agar CIN (para Yersinia)

Caractersticas: Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad se debe a

la presencia de sales biliares, cristal violeta e Irgasan, que inhiben el

crecimiento de Gram-positivos y cierto nmero de Gram-negativos. La

cefsulodina y la novobiocina son dos antimicrobianos que inhiben los

organismos entricos normales. La propiedad diferencial se basa en la

fermentacin de manitol con produccin de cido que hace virar el rojo

neutro a rojo y que produce una precipitacin de sales biliares alrededor de

las colonias.

Aspecto de las colonias: Las colonias de Yersinia enterocolitica son

translcidas con centro rojo debido al indicador de acidez rojo neutro que

indica la fermentacin del manitol y pueden estar rodeadas por una zona de

bilis precipitada. Adems de esta especie bacteriana, pueden crecer en los

medios otros microorganismos: Enterobacter, Serratia, Citrobacter,

Aeromonas y Pseudomonas aeruginosa.

Agar Campy-BAP (para Campylobacter)

Caractersticas: Es un medio nutricionalmente rico que permite el

crecimiento de especies de Campylobacter. Suplementado con agentes

antimicrobianos (cefalotina, trimetoprm, vancomicina, polimixina B y

anfotericina B) proporciona un menor crecimiento de bacterias entricas a la

vez que permite la recuperacin de Campylobacter de muestras fecales.

Aspecto de las colonias: Las colonias de Campylobacter aparecen no

hemolticas, de color gris con bordes irregulares o elevadas y con aspecto

mucoide. Se puede observar un rastro o cola tras la colonia si la superficie delmedio est hmeda.


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4. EXAMEN MICROSCPICO DE COLONIAS

Tincin azul de metileno:

1.

Realizar un frotis de la manera correcta.

2.

Teir con azul de metileno cubrindola entera. (5 min.)

3. Se lava con agua se deja secar y observar en el microscopio con aceite de

inmersin y en el objetivo de 100x.

Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos.

Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal.

Se trata por tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.

Ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la

infeccin puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de

toxinas (Vibrio cholerae).

Tincin de Gram:

1.

Realizar un frotis de la manera correcta

2. Teir con Cristal violeta por 1 minuto, lavar

3. Teir con Lugol por 1 minuto, lavar

4.

Deolorar con alcohol-cetona por 10 segundos, lavar

5.

Teir con Safranina por 1 minuto, lavar y secar, observar en el microscopio

con aceite de inmersin y en el objetivo de 100x.

5. PRUEBAS BIOQUIMICAS (VER ANEXOS)

6. INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los medios menos selectivos (MacConkey o Levine) permiten apreciar la

composicin de la microbiota normal aerobia facultativa. En un sujeto sano debe

predominar E. coli, con pequeos porcentajes de otras enterobacterias: Klebsiella,

Enterobacter y Proteus. En MacConkey suelen detectarse tambin enterococos


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(como pequeas colonias incoloras) que son inhibidos en el medio Levine. Los

medios selectivos se examinarn en busca de colonias tpicas de Salmonella o

Shigella. En ellos pueden aparecer otras enterobacterias; las colonias de Proteus

suelen prestarse a confusin, mientras que las de enterobacterias lactosa-positivas

estn mucho ms inhibidas y se diferencian claramente.

En caso de no detectar Salmonella se sembraran nuevas placas a partir del

enriquecimiento en Caldo selenito, y si se sospecha de una gastroenteritis por E. coli

debe determinarse si se ha aislado una cepa patgena, mediante serologa u otras

tcnicas.

En el medio CIN selectivo para Yersinia enterocolitica, las colonias tpicas debern

ser analizadas como el resto de las enterobacterias, bien sembrando las pruebas

tradicionales o utilizando mtodos comerciales (ANEXOS)

7. INFORME.

Se comunicar el aislamiento del patgeno identificado, o se informar del hallazgo

de microbiota normal o alterada. Como el tratamiento antimicrobiano no suele estar

indicado, slo se practicar el antibiograma cuando el caso lo aconseje.

Detalle del informe

NOMBRE DEL LABORATORIO FICTICIO

DIRECCION

NOMBRE DEL PACIENTE

EDAD

SEXO

OBSERVACION MICROSCOPICA

FRESCO____

FROTIS_____ GRAM_____ BAAR_________TINTA CHINA______ WRIGHT_____


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MEDIOS DE CULTIVO: ANEXAR CARACTERISTICA MORFOLOGIA MACRO Y

MICROSCOPICA

ENRIQUECIMIENTO SI______ NO:_____

RESULTADO DEL ENRIQUECIMIENTO

PRUEBAS BIOQUIMICAS

ANTIBIOGRAMA

DIAGNOSTICO PRESUNTIVO

CONCLUSIONES

(Todo en una cuartilla)


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PRACTICA No. 2

UROCULTIVO

Competencia general:El alumno aplicar sus conocimientos de microbiologa para la bsqueda,

aislamiento, identificacin y susceptibilidad antibitica de microorganismos

patgenos en orina, involucrados en procesos patolgicos urinarios y renales para

el apoyo al diagnstico de enfermedades del tracto genitourinario.

Introduccin

La infeccin urinaria (IU) es una de las infecciones ms frecuentes, que puede

afectar tanto a pacientes internados, como ambulatorios. Esta patologa se presenta

en nios y adultos, alcanzando su mayor prevalencia en las mujeres, aunque

aumenta su incidencia en hombres mayores de 45 aos y en cualquier enfermo con

factores urolgicos predisponentes. En pediatra, la IU tiene una connotacin muy

especial, puesto que es un factor desencadenante de cicatrices renales que pueden

conducir a insuficiencia renal. El riesgo de formacin de dichas cicatrices en nios

con tracto urinario estructuralmente normal tiene que ver con:a). el primer episodio de pielonefritis antes de los 3 aos;

b). reflujo vesicoureteral de grados IV o V, conjuntamente con bacteriuria y

c). retardo en la instauracin de la antibioticoterapia despus de establecida la

pielonefritis.

Por lo tanto, el subdiagnstico o la demora en el diagnstico de una IU en un nio

puede ser determinante del futuro de su funcin renal. Por otra parte, el

sobrediagnstico induce a la utilizacin de procedimientos diagnsticos invasivos,

como la cistouretrografa. Dentro de este contexto, el microbilogo debe evitar

pasar por alto la documentacin de una IU, sin que esto signifique "fabricar" esta

patologa mediante la interpretacin errnea de un cultivo contaminado. En efecto,

como se detallar ms adelante, el procesamiento del urocultivo exige el

conocimiento previo de ciertos datos concernientes a la muestra y al paciente. Por


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otra parte, el informe final de un resultado correcto no puede llevarse a cabo sin un

anlisis exhaustivo, el cual demanda la transferencia e integracin de conceptos

clnicos, epidemiolgicos y microbiolgicos previamente adquiridos y debidamente

actualizados. En este sentido, vale la pena recordar la clasificacin de las situaciones

fisiopatolgicas ms frecuentes de la IU .

Parte Experimental

1. TOMA DE MUESTRAS Y TRANSPORTE.

Material:

Recipiente estril de boca ancha, o bolsa recolectora de orina, conservar en

regrigeracin. (ver seccion de transporte de muestras)

A. TECNICA DE MUESTREO

Recoleccin de la muestra

Nios y adultos que controlan esfnteres.

La muestra de eleccin es el chorro medio miccional. El tiempo de retencin

deseado es de, por lo menos, 3 horas.

Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabn, de adelante

hacia atrs, secar con toalla limpia, y se debe colocar un tapn vaginal


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(torunda de gasa o algodn.) Se elimina el primer chorro (10 ml) y se

recolecta en frasco estril la fraccin siguiente (10-20 ml). Se recomienda

orinar separando los labios mayores.

Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco

balanoprepucial con agua y jabn, y secar con toalla limpia. Se elimina el

primer chorro (10 ml) y se recolecta en frasco estril la fraccin siguiente

(10-20 ml). Se desaconseja el uso de antispticos, ya que pueden afectar el

resultado del urocultivo, provocando un descenso en el recuento de colonias.

Nios y adultos que no controlan esfnteres.

Nunca utilizar bolsas colectoras para el estudio de urocultivo. Existen, al

menos, tres alternativas. Recordar que la mayora de estas muestras no

cumplen con el tiempo de retencin deseado. Se recomienda alguno de los

siguientes procedimientos:

o Al acecho: el mtodo se aplica con los lactantes y es similar al descrito

para los pacientes que controlan esfnteres. La dificultad estriba en

que se desconoce cual ser el momento en que se va a producir la

miccin. El operador deber esperar entonces a que la misma se

produzca y recoger en un frasco estril lo que seguramente ser la

porcin media del chorro miccional.

o Puncin suprapbica: este procedimiento deber ser efectuado por

mdicos entrenados. En principio, se reserva para casos especiales,

como neonatos graves, pacientes cuyos urocultivos previos presenten

resultados conflictivos, sospecha de microorganismos de difcil

desarrollo, etc. Primeramente se verifica que el paciente presente

globo vesical palpable, se desinfecta zona pubiana con alcohol yodadoy se deja actuar 1 min., se limpia con alcohol 70% y se punza con aguja

adecuada en la zona ubicada 1 o 2 cm encima del pubis. Se aspira la

orina y se vuelca en frasco estril.


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o Cateterizacin: se utiliza en pacientes en los que habitualmente se

practica el cateterismo intermitente (enfermos con vejiga

neurognica). En algunos centros lo utilizan para lactantes en lugar de

la toma al acecho, ya que presenta la ventaja de ser una toma ms

rpida y confiable cuando se realiza por personal entrenado. Sin

embargo, presenta el riesgo de producir el ascenso de los

microorganismos desde la uretra a la vejiga y generar as una IU

iatrognica. Para efectuar este mtodo se desinfecta la zona perineal,

se introduce la sonda por la uretra y se recoge la porcin media del

chorro de orina que sale por la sonda. Del mismo modo pueden

obtenerse muestras a partir de ureterostomas, nefrostomas o

vesicostomas. La diferencia puede radicar en que los catteres a

utilizar podran ser de menor dimetro. En estos casos, se deja fluir la

orina retenida en la boca del conducto, se limpia la misma con un

hisopo humedecido en alcohol, se introduce el catter en el conducto y

se permite el drenaje de la orina al exterior. La parte media del chorro

se recoge en un recipiente estril.

Enfermos sondadosNunca tomar la orina que fluye del extremo distal de una sonda que no es nueva

(recin colocada).

a- Puncin de la sonda: este procedimiento se utiliza en aquellos enfermos con

sonda permanente en los que no es posible retirar o reemplazar la sonda. Se obtura

la sonda con una pinza "ad hoc". Se espera unos minutos, se desinfecta la parte

externa de la sonda en la zona proximal con alcohol yodado y se punza la sonda con

aguja y jeringa estril. Se vuelca el contenido en forma asptica en un frasco estril.b- Recoleccin a travs de una sonda estril recin colocada: se recoge directamente

la orina que fluye por el extremo distal de la sonda nueva en un frasco estril. Si se

trata de un recambio de sonda, es importante considerar la posibilidad que se

produzca la resuspensin de bacterias de la zona uretral en la orina vesical. Esto

puede resultar en la presencia transitoria de bacterias en la orina y dar lugar a


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cultivos falsamente positivos. En estos casos, es recomendable una nueva muestra

por puncin de la sonda al da siguiente.

B. FASE PREANALITICA

La muestra no debe durar ms de 2 horas fuera del refrigerador si no se ha

de procesar inmediatamente.

2. FASE ANALITICA

EXAMEN FISICOQUIMICO

1.

Volumen,

2. Densidad

3. Turbidez

4.

PH y

5. Tiras reactivas para conocer si existe presencia de sangre, de nitritos, de

cetonas, de cido ascrbico, tambin para conocer la cantidad de protenas,

leucocitos y bacterias.

Material:

Asa calibrada

Medios de cultivo CLDE MacConkey, Sangre, Chocolate

bservacin macroscpica de la muestra, para ello observaremos el volumen, ladensidad, la turbidez, mediremos el PH y utilizaremos las tiras reactivas para

conocer si existe presencia de sangre, de nitritos, de cetonas, de acido ascrbico,

tambin para conocer la cantidad de protenas y de leucocitos.

Para realizar esta prueba vamos a introducir la tira reactiva dentro del recipiente

con la ayuda de unas pinzas. Luego la tira la depositaremos sobre un papel de filtro y

procederemos rpidamente a su lectura, comparando los colores con los del bote.

EXAMEN MICROSCOPICO DEL SEDIMENTO URINARIO

Mezclar la orina con cuidado.

Traspasar una porcin de la orina a tubo cnico. Centrifugar a 1500 rpm por 5

minutos.


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Colocar 1 gota del sedimento en un portaobjetos, cubrir con cubreobjetos y observar

el sedimento a 40 x. (ver anexo de sedimento urinario)

UROCULTIVO

Siembra de acuerdo a la observacin previa del sedimento. Este procedimiento

ofrece la ventaja de cultivar el microorganismo en el medio ms apropiado, tanto

para su desarrollo, como para su caracterizacin macroscpica (aspecto de la

colonia, fermentacin de lactosa, tipo de hemlisis, etc).

ESQUEMA DE SIEMBRA DE ACUERDO AL SEDIMENTO

i. Sedimento normal y ausencia de grmenes: media placa de CLDE.

ii. Sedimento patolgico y ausencia de grmenes: placa de agar sangre o chocolate y

de CLDE, Levine o MacConkey.

iii. Presencia de bacilos, independientemente del sedimento: placa entera de CLDE,

Levine o MacConkey.

iv. Presencia de cocos, independientemente del sedimento: placa entera de agar

sangre o agar chocolate.

Segn patologa de base. Si se tiene oportunidad de conocer la patologa de base del

paciente mediante una buena comunicacin con el mdico tratante, o de la solicitud

expresa por escrito en forma rutinaria al recibir la muestra, se puede establecer

alguna discriminacin en los medios a emplear. Los urocultivos de pacientes

urpatas, con malformaciones, tumores, instrumentacin o traumatismos de las vas

urinarias merecen la utilizacin de 2 medios (CLDE y agar chocolate). Para el resto

de pacientes, alcanzara slo con la siembra de una placa de CLDE.

EXAMEN CUANTITATIVO

A.

Mtodo de conteo en placa o recuento de colonias:

Se homogeneiza la muestra mediante agitacin.


22/27

Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo

de tripticasa o de suero fisiolgico, estriles.

Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilucin al 1:100.

Se deposita 1 ml. de cada dilucin en placas de Petri esterilizadas, sobre las

cuales se vaca un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados

a 45. Mediante rotacin suave, se favorece la distribucin homognea de la

siembra.

Se incuban todas las siembras a 37 durante 24 a 48 horas.

Para calcular el nmero de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300

colonias. Contadas stas, basta multiplicar su nmero por la dilucin respectiva para

obtener la cuenta total.

B.

Mtodo del asa calibrada.

Esta estimacin cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio

de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin

centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de dimetro).

Despus de incubar las siembras a 37 durante 24 a 48 horas, se

cuenta el nmero de colonias desarrolladas y el resultado se

multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de

orina.

Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10

000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y

100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden

pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta

cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que

pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas, diuresis

acentuada, obstruccin uretral, infecciones crnicas e infecciones por cocosgrampositivos.


23/27

3. EXAMEN MORFOLOGIA MACROSCOPICA EN CULTIVOS

Cled agar:

Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient recuento e identificacin de

grmenes en las vas urinarias; E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-),

Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+), Pseudomonas aeruginosa

(verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus aereus

(amarilla L+)..

Agar MacConkey

Caractersticas: Es un medio moderadamente selectivo. Las sales biliares y el

cristal violeta inhiben a la mayora de las bacterias Gram-positivas y algunas Gram-

negativas. La fermentacin de lactosa hace virar el indicador a rojo.

Aspecto de las colonias: Los fermentadores tpicos de lactosa (E. coli,

Klebsiella y Enterobacter) dan colonias rosas o rojas rodeadas de un halo de sales

biliares precipitadas. Los fermentadores dbiles o lentos de lactosa (Citrobacter,

Serratia) pueden dar colonias incoloras a las 24 h y rosadas a las 48 h. Proteus,

Salmonella, Shigella y Yersinia dan colonias incoloras. Enterococcus forma pequeas

colonias.

Agar Levine o EMB

Caractersticas: Es un medio ligeramente ms selectivo que el MacConkey. Laeosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas y

algunas Gram-negativas. La fermentacin de lactosa precipita ambos colorantes al

acidificar el medio.

Aspecto de las colonias: E. coli forma colonias oscuras con brillo metlico

verdoso. Los fermentadores no tan fuertes de lactosa (Klebsiella, Enterobacter y

Serratia) forman colonias moradas en 24 a 48 h. Los no fermentadores de lactosa

(Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia) dan colonias transparentes..

4.

EXAMEN MICROSCPICO DE COLONIAS

Tincion de Gram


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5. INTERPRETACIN

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:

No hubo desarrollo microbiano.

Menos de 10 000 colonias por ml.

Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml.

Ms de 100 000 colonias por ml.

Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con ms de 100 000 colonias por ml., la

probabilidad de infeccin es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado

se logra en tres recuentos sucesivos.

a. Cultivo monomicrobiano. Como se ha dicho, la interpretacin del cultivo debe

realizarse conjuntamente con la valoracin de otros datos. En este sentido, resulta

til recordar cuales son las posibilidades de xito al asumir la presencia de una IU

cuando se relaciona el recuento de colonias con los sntomas.

b. Cultivo polimicrobiano. Cuando se habla de cultivo polimicrobiano de orina, se

hace referencia a la presencia de 2 o ms grmenes, habitualmente dos, en

recuentos mayores de 105UFC/ml y en proporciones similares. El predominio de ungermen en una muestra en una proporcin del 90% debe asumirse como

monomicrobiano. La IU mixta, producida por 2 o ms grmenes, es extremadamente

infrecuente (


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grmenes en igual proporcin, en 2 muestras de orina correctamente recolectadas,

las cuales deberan mostrar adems un sedimento francamente patolgico.

6.- IDENTIFICACIN Y ANTIBIOGRAMA

Una vez que se ha determinado que un cultivo es significativo, y se han realizado las

pruebas bioqumicas (Ver Anexos) el microbilogo debe realizar el antibiograma.

Para tal fin, resulta suficiente en la mayora de los casos, el ensayo de difusin con

discos en agar (mtodo de Kirby-Bauer)..

Tabla 1. Antibiticos sugeridos para ensayar con fines teraputicos en infecciones urinarias

DROGA

Antibitico a ensayar (x) en :

EnterobacteriaBNNF Estafilococo Enterococo

A I

PEN penicilina x*

AMP Ampicilina x x ^ x

AMS aminopenicilina-

sulbactama x x x x

OXA oxacilina x*

CTN cefalotina; x x ^

TMS cotrimoxazol x x x

NIT nitrofurantoina x x x x

NOR norfloxacina x x x x x

CIP ciprofloxacina ^ ^ ^ ^ ^

CTX cefotaxima o

ceftriaxonax

CAZ ceftacidima x x

IMI imipenem x x


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GEN gentamicina x x x

AMK amicacina x x

PIP piperacilina x x

VAN vancomicina x xA, ambulatorio; I, internado, BNNF, principalmente Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii

La tabla 1 muestra una lista de antibiticos sugeridos para ensayar slo con fines

teraputicos. Por lo tanto, la tabla no incluye ciertas drogas tiles para la vigilancia

de algunos mecanismos de resistencia de importancia clnica, ni para la bsqueda de

resistencia asociada, ni para la sospecha de determinadas especies por el

antibitico. El microbilogo debe recordar que lo importante es ensayar e informar

los antibiticos de eleccin para el tratamiento de la IU y los que sean apropiados

para las distintas especies.

7. INFORME.

Se comunicar la cuantificacin y el aislamiento del patgeno identificado, o se

informar del hallazgo de microbiota normal o alterada.

Detalle del informe

NOMBRE DEL LABORATORIO FICTICIO

DIRECCION

NOMBRE DEL PACIENTE

EDAD

SEXO

OBSERVACION MICROSCOPICA

FRESCO____

FROTIS_____ GRAM_____ BAAR_________TINTA CHINA______ WRIGHT_____


27/27

MEDIOS DE CULTIVO: ANEXAR CARACTERISTICA MORFOLOGIA MACRO Y

MICROSCOPICA

ENRIQUECIMIENTO SI______ NO:_____

RESULTADO DEL ENRIQUECIMIENTO

PRUEBAS BIOQUIMICAS

ANTIBIOGRAMA

DIAGNOSTICO PRESUNTIVO

CONCLUSIONES

(Todo en una cuartilla)

Documents

Manual Micro Clinica2014 Practica2 y3