COMPONENTE: MICROBIOLOGA PARASITOLOGIA E INMUNOLOGIA CLINICA Primer ao ACTIVIDAD: PRCTICA MARCO LEGAL: APROBADO EN SESIN ORDINARIAEL 12 DE SEPTIEMBRE2013 POR EL COMIT ACADEMICO DE CARRERAMxico D.F. 2013. CARRERADEMDI COCI RUJANO CI ENCI ASB I OMDI CAS MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA CARRERA DE MEDICO CIRUJANO MANUAL DE PRCTICA DE LABORATORIO AREA DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA PRIMER AO REALIZADO POR: JOSE FERNANDO ARELLANO COBIAN YOLANDA GARCIA MENDEZ ACTUALIZACION, TRANSCRIPCION. DIEGO ULISES ARELLANO GARCIA COORDINACION, REVISION. DOLORES PATRICIA DELGADO JACOBO MISIN DE LA CARRERA Formarmdicosgeneralesposeedoresdeconocimiento cientficoyculturauniversalparaunaprctica responsable,competente,ticayhumansticaqueles permitacontribuiralaprevencinysolucindela problemticadesaluddelpas,dotadosdeunaactitud crtico-creativa,comprometidosconsuactualizacin profesionalydispuestosacontinuarconestudiosde posgrado. VISIN DE LA CARRERA: Ser una carrera con reconocimiento por sus innovaciones en laformacindemdicosgeneralesqueparticipen activamenteenelejerciciodelaprofesindentrodela sociedad de la informacin y el conocimiento. Esto a travs demejorascurriculares,lapromocindelaformacin docente y la optimizacin de los recursos disponibles. DIRECTORIO FES ZARAGOZA Dr. Vctor Manuel Mendoza Nez Director Dr. Vicente J. Hernndez Abad Secretario General Dra. Rosalinda Escalante Pliego Secretaria de Integracin, Promocin y Desarrollo Acadmico M. en C. Faustino Lpez Barrera Secretario de Planeacin Lic. Sergio Silva Salgado Secretario Administrativo Dr. Omar Viveros Talavera Jefe de la Divisin de Ciencias de la Salud y el Comportamiento Dr. Edelmiro Santiago Osorio Jefe de la Divisin de Posgrado e Investigacin DIRECTORIO CARRERA MDICO CIRUJANO Dr. No Contreras Gonzales Jefe de Carrera M.C. Mara Luisa Ponce Lpez Secretaria Tcnica de la Carrera M.C. Dolores Patricia Delgado Jacobo Coordinadora rea Ciencias Biomdicas M.C. Irma Araceli Aburto Lpez Coordinadora del rea de Ciencia de la Salud Pblica M.C. Mara del Carmen Garca Ros Coordinadora del rea Terminal del Internado y Servicio Social M.C. Rocio Paniagua Hernndez Coordinadora de Ciencias Clnicas ELABORADO POR: Jos Fernando Arellano Cobin Yolanda Garca Mndez COORDINADO POR: Patricia Dolores Delgado Jacobo DESCRIPCINY USO DEL MICROSCOPIO Objetivos: Antecedentes histricos del microscopio. Conocimiento de las partes fundamentales del microscopio Cuidados que se deben tener con el microscopio. Factores que daan al microscopio. Principales aplicacionesde otro tipo de microscopios. Introduccin: Que divertido deba ser mirar a travs de una lente y ver lascosasdetamaomayorqueasimplevista.Comprar lentes? leeuwenhoek no sera quien hiciera tal cosa!Jams se vihombre ms desconfiado !Comprar lentes?NO, l se las fabricara!. Los descubrimientos del microscopio hacia finales del siflo XVI einicios desigloXVII, quenopuede atribuirse con seguridadaunsabiodeterminado,selaeliniciodela biologa moderna. Los grandes microscopista del siglo XVII, leeuwenhoek,hooke,Swammerdam,etc,impulsaron prodigiosamente nuestrosconocimientos y revelaron alos ojosmaravilladosdesuscontemporneoseluniverosdel los infinitamente pequeo. Eldescubrimientodeanimliculosydelasbacteriasse debe,sobretodoalgenialleeuwenhoek,abrialas investigacionesun campo de accin nuevoe insospechado; hizo retroceder las fronterasdel mundo viviente hasta los lmitesextremosdelapequeezypusotambinde manifiesto el infinito poderde expansinde la vida. Del conocimientode los animalculos al de sus estructurassolo haba un paso, y este se dio. Los descubrimientos de la organizacin de la universalidad de la clula fueron sus consecuencias lgicas y fecundas. Eldescubrimientodelmicroscopionohadirigidoalas investigaciones mdico-biolgicasen un solo sentido; por lo contrario, la ha diversificadoy le ha dado accesos a un mundo de seres vivos que nuestros sentidos, abandonados asusposibilidadesnaturales,sonincapacesde manifestarnos. Conocimiento de las partes fundamentales del microscopio. Unmicroscopiosimpleesunalentedeaumentoordinario, conlacualsepuedenobservarmltipleobjetos microscpicos. El microscopio compuesto( de micros-pequeo y scopein-observar), digiere del microscopiosimple , en quetiene2sistemasdelentes,unoconocidocomo objetivoy el otrocomo ocular , montados en un tubo o cuerpodel microscopio , la imagenque ve el ojo , tiene unaumentoigualalproductodelamultiplicacindelos aumentosde los 2 sistemas de lentes. Lasdiferentespartesdelmicroscopiopuedenclasificarse en cuatrosistemas: a) Sistema de soporte b)Sistema de aumento c)Sistema de iluminacin d) Sistema de ajuste El sistema de soporte corresponde: a) El pie b)El brazo c)El revlver(porta objetivos) d) La platina e)El carro (no todos o microscopios lo poseen) El sistema de aumento: se constituye por una combinacin de lentes: el tubo, ocular y los objetivos. Los lentes del microscopioestn fijados en dos conjuntos, cada uno de la extremidad de un tubo largo. El primer conjunto de lentes abajo del tubo y arriba de la preparacin a examinares el lente objetivo. Elsegundoconjuntodelentesestaenloaltodeltubo, donde se colocan los ojos denominados oculares. Objetivos A) El aumentoEstaindicadoparacadalente,porunnumeroquese encuentra grabado en el tubo. El objetivo 5 aumenta 5 veces Elobjetivo10aumenta10vecespresentandoenla circunferencia del tubo , cercanos a la lentes una banda de color amarillo. El objetivos de 40 aumenta40 vecespresentandobanda color azul. El objetico 100 aumenta 100 veces, presentando una banda de color blanco. Es el objetivo que se utiliza en inmersin de aceite de cedro. B) Distancia frontal til de un objetivo. Esladistanciafrontalqueseparaalobjetivodela preparacin aexaminar cuando tenemos ina imagen ntida. Entre mas largo es la lente objetiva, la distancia frontal disminuye: Objetivo 5 distancia frontal de 20-25mm. Objetivo 10 distancia frontal de 5-6mm.Objetivo 40 distancia frontalde 0.5-1.5mm. Objetivo 100distancia frontal de0.15-0.20mm. C) Poder de resolucinElpoderderesolucindeojohumanoesde0.25mm.el poder de resolucin deun microscopio es de alrededor 0.25 micras. Por lo tantoloentendemos comolacapacidad de observar lo ms pequeo. Mientraselpoderderesolucindelobjetivoseamayor, msntida se ver laimagen; por lo tantopueden verse dos puntos separados por distancias mnimas. LENTES OCULARES Elaumentoestindicadosobrelaslentesoculares.Un aumentode 10x aumenta 10 veces la imagen producida por el lente objetivo. Paraconocerelaumentodelobjetoobservado,basta multiplicarelaumentodelalenteobjetivaporel aumentode la lenteocular.los microscopiosutilizados en el laboratorio medico generalmente aumentade 50 a 100 veces imgenes. Hoyendiatambinselespuedenombrasalosobjetivocomosigue;alde5xlupa,alde10xsecodbil,al objetivo de 40x seco fuerte, y al de 100x inmersin. ocularobjetivoAmplificacin Dimetrode campo Seco dbil 10x10x1001500 micras Seco fuerte 40x40x400900 miras Inmersin de aceite 10x100x1000120 micras

Los microscopios binoculares(dos oculares)permiten exmenesprolongadossinfatigarlavista.unailuminacinelctrica es muy indispensablepara utilizarel objetivo de inmersin. D)Sistema de iluminacin La fuente luminosa de preferenciailuminacinelctricapara permitirun manejo ms fcil. Est compuesta por una lmpara integrada al microscopiodebajode la platina. El condensador; sirve para concentrar los rayos luminosos y dirigirloshacialapreparacinaexaminar.El condensadorest situadoentre l fuenteluminosay la platina. Puede aumentarse la luminosidad mxima obajarse a luminosidad mnima. Eldiafragma:sirveparadisminuiroaumentarla cantidad de luz que pasa en el condensador. Es un obturadorcuya apertura tiene un dimetro variable. Esta colocado en el condensador. E) Sistema de ajuste. Esta integrado porTornillo macrometrico :tornillo de enfoquerpido: es el tornillo ms grande y se utiliza primero. Tornillomicromtrico:tornillodeenfoquefino. Cuentaconundesplazamientomuchomuylento. Permiteenfocardespusdelajusteaproximado obtenido con eltornillo de enfoque rpido. Tornillosdecarromvil:sirvenparadesplazarlalaminillasobrelaplatina.Untornillopara desplazarde adelante hacia atrs y un tornillo para desplazarde izquierda a derecha. MANEJO DEL MICROSCOPIO El esfuerzoexcesivo y la fatiga deben evitarse en la observacin microscpica. Este se consigueatendiendo a los siguientes hbitos. Elbancoylamesadebeestaraunaalturaque permitaalobservadorelusodelmicroscopioen posicin vertical, de una manera confortable. Encender la fuente de iluminacin. Montar la preparacin que se va a observar. Separalosbinoculartes.Enlosmicroscopios binocularesseajustaalaseparacininterpupilar(distanciaentrelosdosojos)yse adapta a cada confortacin. Enfoqueentreelojoderechoeizquierdo.Losdos tubos porta ocularesson susceptiblesde ajustarse. Estose logra tratandode enfocarla imagen con el tronillomacrometricoymicromtricoconellente objetivo de menor aumento, si la imagenno es clarasubirobajarenocularmedianteelmovimientodel tornillosque rodea el tubo portaocular, hastaque se ve a ntido y el microscopioquede ajustadoa su propiavisin binocular. Si la imagen no es clara es necesario enfocar. Enfoque de imgenes Para enfocar con cualquier, pero especialmente con el de seco fuerte 40x y con el de inmersin 100xdeber acercarse el objetivos a la preparacin observadade lado paracontrolarel descenso hasta que la lente frontaldedichoobjetivoquededentrodela distancia focal. Solo entoncesse debermirar por elocular alejandolentamenteel objetivo hasta el enfoquecorrecto,queseafinaraconmovimientoscuidadososdel tronillo de enfoque lento.Enfoque con el objetivo de aceite de inmersin 100x Colocarlalaminillaperfectamenteseca,agregaruna gota de aceite de inmersin, sobrela parte a examinar. Bajarel objetivo 100xpara que quedeen contactoconelaceite,lomscercaposiblesin llegararomperlaobservacindeladopara controlarsedescenso.Observarenelocular,mover lentamenteel tornillo micromtrico hasta que se vea la imagen. Cambiodeobjetivos.Losmicroscopiosmodernosson fabricadosde tal maneraque se puedespasar de un objetivoaotroparamoverelmismoobjetoms grande.Elenfoqueparalanitidezdelaimagenqueda casi hecho Alterminarsusobservacioneslosalumnosdeber limpiarnuevamentelosobjetivosyalas preparaciones. OBSERVACIN CON EL MICROSCOPIOa) Asegresede las caractersticas del preparadoque vaaobservar,esdecirquergano,tejido,o bacterias se encuentran montados en lalaminilla. b) Limpielapreparacin,concuidadonoejerciendo mucha fuerza sobre ella, con un trapo o franela. Si es necesariousarxilolparaquitareaceitedeuna observacinanterior,olagrasadelosdedos,en estepuntoesimportanteelasesoramientoporel profesor de laboratorio. c) Antes de colocarsu preparacinsobre la platinade microscopio,vasecontralaluzasimplevista. Existendosmotivosparaello,enprimerlugarel cubreobjetospuedeestarllenodepolvo,sucioo cubierto de aceite de endurecido: en segundo lugar, a medida que usted prenda, cada vez ms fcilmente podr simplementeconsiderandoelpreparado,deducircual es el origendel mismo. d)El ocular y las lentes objetivas deben estar limpias. La limpiezade las mimasse har usandosolo papel paraestepropsito(lenscleaningpaperkodak). Limpie con un fragmentode este papella lente del ocular, no extraer el ocular, limpie la lente de los objetivos. e) Seleccione un campoocamposapropiados y previa observacina 5x, 10x obsrvelos a 40x. f) Para hacer una observacina inmersines necesario centrarprimero el campoque se desea observar. IMGENES VISTAS AL MICROSCOPIO Recordemos que el disco luminoso visto en el microscopio a travs de los oculares se le llama campo microscpico. Como se sitan los objetos en el campo?Se pueden situarlos objetoscon relacin a las manecillas del reloj, por ejemplo los estreptococos se encuentran a las 3 horas y los diplococosalas8horas.Inversindeimgenes,las imgenesvistasen el microscopio son invertidas, debido a las lentes. Los objetosseven abajodel campo cuando estn situados arriba. Los objetos se ven a la derecha del campo cuando estna la izquierda. Desplazamiento de objetos. Sisedesplazalalaminillaaladerechaelobjeto examinadova hacia a la izquierda. Sisedesplazaalalaminillahaciadelante,elobjetoexaminado se dirigehacia atrs. CUIDADOS QUE SE DEBEN TENER CON EL MICROSCOPIO El microscopioes un instrumentodelicado y de posicin , construidopara realizarun trabajo preciso , que si nose le trata con el debido cuidado , puede daarse y darnos un rendimiento limitado, en cambiosi se le trata como es debido , su rendimiento es mayor. Tambinesimportantetomarencuentaqueesun instrumentodealtocosto,difcildereemplazar,porlo tantorequierede cuidaos como los siguientes. 1)Debe ser guardadosen un lugarseco y cubierto del polvoyaqueesteademsdedificultarla observacinrayaloslentesobjetivosyoculares cuando son frotadoso para su limpieza 2) Altrasladarlodeunlugaraotro,porabajodel soporte o plataforma,3) Antesdeusarsedebecerciorarsedequelolentes accesibleestnlimpios,denoserashayque limpiarlos. El vidrio de la lente es blando y se raya con facilidad por lo tanto la limpieza de los mismos seharusandosolopapelmanufacturadoparaeste propsito,laslentesaccesiblessonoculares, objetivos y condensador. No deben quitarse las lentes de su lugar porque podra permitir que se introdujera polvo al interior del microscopio que muchas veces no puede ser quitado sino mediante desmonte o desarme de las lentes y solo puede hacerlo personal especializado para ello. 4) Cuando se usa aceite de inmersin, una vez terminada la observacin hay que quitar el aceite que ha quedado enlalenteylalaminillayaquesisedeja,se resecay se adhiere a la lente y laminilla y despus esmsdifcilquitarlo,paraquitarelexcesode aceiteseempleapapellimpialentes;enocasiones cuandoesdifcilquitarelexcedentedeaceite debernquitarseconxilol.Humedeciendoelpapel limpia lentes en este solventeya queel cemento que mantienefijaslaslentesessolubleenlyestas puedenzafarsedesusitio sisemoja enexceso, es importanteestarasesoradoporsuprofesorde laboratorio. 5) Se prescindir de desarmar el microscopioya que pude desajustar o daar sus partes; las lentes no deben ser desarmadas porel observador. 6)La lente deben ser limpiadas con agua destilada y las de inmersin con xilol. No emplearen exceso xilo por que la lentesvienen montadas con blsamo de Canad , el cual es disuelto por xilol,de lo antes dicho solo seefectuaraconasesoramientodelprofesordel laboratorio. 7) Laspartesdelsoportedelmicroscopiosu superficie, deben limpiarse con un trapo de algodn, y se les da brillo con aceite mineral, la cremallera detornillomicromtricodebeserlimpiada ocasionalmenteconunapequeacantidaddeaceiteo grasa delgada,eltornillo micromtrico nonecesita aceite. 8)Cuando no se usa el microscopio, se guardara en una cajaositioquetengadestinado,cubiertoconsu funda de platico. 9) Procurar que las preparacionesestn siempre limpias,sepierdevisibilidadcuandoestnsuciaspor huellas digitales, aceite de cedro o polvo. 10)En caso de alguna duda, falla mecnica u ptica delmicroscopiodeberdarseavisoinmediatoasu profesorde laboratorio. Factores que daan al microscopio a) Nunca lavar los lentes oculares y de los objetivos con alcohol. b)Nunca utilizar papel ordinario o algodn para limpiar los lentes. c) Nunca poner los dedos en lo objetivos. d) Nunca limpiar el soporte y la platina con xilol. e) Nunca limpiar los lentes interiores de los ocularesy objetivoscontelaopapel(solopinceldepelos finos). f) Nunca dejar el microscopio si sus oculares. g) Nunca guarde el microscopiocon aceite de inmersin en los objetivosde 100x. h) Nunca transporte el microscopio con una sola mano. Material por equipos Microscopio ptico Frotis preparado de bacterias. Frotis preparado de hongos. Frotis preparado de sangre. Preparacin de letras. Papel seda. Desarrollo Las preparaciones que se les proporciono enfocarlas con los diferentesobjetivos,(lupa,secodbil,secofuertee inmersin). Conocimientodeloscuatrosistemasenquesecomponeel microscopio, asi como su manejo adecuado. Efectuaresquemasdelsdiferentestiposdemicroscopios queexisten,comotambindelaspreparacionesquesele proporciono en los diferentes objetivos. Cuestionario Mencionetresmicroscopistasimportantesenlaevolucin de microscopioy su obra. Cul es la aplicacin clnica del microscopio? Mencione 5 factores que daan al microscopio y 5 cuidados. Mencione 5 tipos de microscopioy su funcionamiento Qu significa microscopio simple y compuesto? Quespoderderesolucinycualeldelmicroscopio ptico, electrnico y cual para el ojo humano? Defina distancia frontal mnima o til TINCIONES SIMPLES Objetivo:conocerdiversastcnicasdecoloracin. Observacin de preparaciones. INTRODUCCIN Loscolorantessecombinannicamenteconelprotoplasma bacteriano; si la clula no ha muerto, el proceso mismo de la tincin la mata. El mtodo por consiguiente, es bastante severo y puede producir artefactos. Los colorantes ms usados son sales. Losbsicosconsistenenuncatincoloreadounidoaun anion incoloro, (ejemplo, clorhidrato de azul de metileno). Loscidosconstituyenexactamenteloscontrario.(ejemplo eosinato de sodio) Las clulas bacterianas son ricas en cidos nucleicos, los cuales portan cargan negativas en forma de grupos fosfato, estossecombinanconloscolorantesbsicoscargados positivamentelocualleshaceserdelosmsusadosen citologabacteriana.Loscolorantescidosnotienla clula bacterianay, por lo tanto,pueden ser usados para impartir al fondo un color de contraste. Loscolorantesbsicostienlasclulasbacterianasuniformemente,amenosquepreviamenteseadestruidoel RNAdelcitoplasma.Sinembargosepuedenusartcnicas especialesparadiferenciarflagelos,capsula,perded celular,membranacelular,grnulos,ncleosyesporas, como se observar en prcticas ms adelante. Para observar los microorganismos al microscopio empleamos tcnicasdecoloracinparaobservarlosmejorohacer estudios ms detallados de los mismos. Lastcnicasdecoloracinlaspodemosdividirdeuna manera generalen dos grupos principales: a) Tcnicas de coloracin simple b)Tcnicas de coloracin especial o diferencial. Llamamos Tcnicas de coloracin simple a aquellasen donde seempleaunsolocoloranteparateir,ejemploazulde metileno, safranina, verde de malaquita etc. LlamamosTcnicasdecoloracinespecialocompuestaen dondeseusancombinacionesdedosomscolorantes, ejemplo gran, Ziehl-Neelson, Giemsa., etc. Material Portaobjetos Mechero Asa con portasa Microscopio Colorantes:azuldemetileno,KOHal10%yverdede malaquita Cultivosde:saccharomycescerevisae,bacillussubtilis, staphilococcus aureus, streptococcus mutans. Procedimiento: Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos limpio con el asa se toma se muestra una muestra del cultivo de una de la cepas. Estamuestrasecolocasobreelportaobjetos,emulsionar sobre la gota de agua. Fijar al calor. Secar al aire. La coloracin se efecta agregando unas gotas de colorante dejar 2 o 3 minutos. Lavar con aguachorro leve y no directo sobre la muestra. Secar y con aceite de inmersin observar al microscopio. Efectuar una tincin para cada una de las bacterias. Reportar las diferentes morfologas, observadas y efectuar esquemas. Elasabacteriolgica,deberseresterilizada,alcalor antes y despus de cada paso. Cuestionario Definir colorante Enuncie tinciones simples y especiales y diferencias entre las dos Cul es el tamao promedio de las bacterias? Quventajassetienenenunapreparacinentreportay cubre objetos y que desventajas? Enqu consiste un colorante bsico y uno acido? Cul es la importancia de las tcnicas de coloracin? Enuncie tres bacilos patgenos para el hombre Efectuunesquemadeunabacteriatipoenunciandolos componentes de toda su estructura. TINCION DE GRAM Y ZIEHL-NEELSEN OBJETIVOS: -Mencionar los pasos de la preparacin de una tincin de Gram y describir el aspecto de las bacterias grampositivas y gramnegativas despus de cada paso. -Comparar la tincin de Gram y la tincin de acido-alcohol resistente. -Reconocer la importancia bacteriolgica y medica de las tinciones Gram y Ziehl-Neelsen. INTRODUCCIN: En la naturaleza existen dos tipos de clulas: procariotas y eucariotas. Las bacterias, no se pueden observar claramente bajo el microscopio ptico. Para observarlas y estudiarlas detalladamente necesitan de una tincin, ya sea simple (un colorante) o diferencial (mas de un colorante). Las bacterias poseen un tamao entre 2 y 10 um. Estn constituidas por un citoplasma con ribosomas; material gentico (ADN), nucletidos sin membrana. La memebrana citoplasmtica esta rodeada por la pared celular, dura, elstica y de peptidoglucano, que le da forma a la clula. Las bacterias se clasifican en dos grupos en base a la estructura de la pared celular. Las gram (+), solo poseen peptidoglicano; las gram (-), tienen una membrana rica en lipopolisacaraidos por encima del peptidoglicano. Las tcnicas utilizadas para el diagnostico etiolgico de las infecciones dependen de las caractersticas biolgicas. La mayora se pueden realizar a travs del microscopio, ya sea en fresco o por tinciones, como la de Gram y la de Ziehl-Neelsen. TincinHans Cristian Joachim Gram, en 1884, utilizo un mtodo de tincin diferencial para las bacterias. Actualmente conserva su nombre y sirve para dividir a las bacterias en dos clases: grampositivas y gramnegativas. El primer paso para efectuar una tincin bacteriana es la preparacin de un frotis o extensin de material a observar sobre un portaobjetos de vidrio, mediante una asa bacteriolgica, para obtener una pelcula homognea. En la primera parte de la tincin se baa con violeta de genciana (denominando colorante primario), quedando todas las bacterias teidas de color morado intenso. Despus de un breve lapso, se lava y se le cubre con yodo, un mordiente. CuandoSe lava el yodo, tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas Aparecen de color violeta obscuro o prpura. Al cubrirse posteriormente con una mezcla de alcohol y acetona (solucin decolorante), algunas bacterias conservan dicha coloracin, mientras que otras se decoloran y la pierden totalmente. En la segunda parte de la tincin se hace actuar un colorante bsico de contraste, la safranina, para teir a las bacterias gramnegativas que se vern de color rosa. Las que conservan la coloracin morada se denominan grampositivas, y las que la pierden gramnegativas. Tincion de Ziehl-Neelsen Existen bacterias atpicas, como las micobacterias, que constituyen un grupo de importancia medica. El diagnostico se ve influido por dos caractersticas: la lentitud de su crecimiento y el alto contenido de lpidos en su pared. Se hallan dos especies patgenas de genero Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch) y Mycobacterium leprae ( bacilo Hansen). Aunque estructuralmente pueden ser consideradas como bacterias grampositivas, no se tien por este mtodo. Son resistentes a los cidos y a los lcalis, por lo que se tien con dificultad pero, una vez teidas resisten a la accin decolorante de los cidos (acidorresistentes). La tincin diferencial utilizada es la de Ziehl-Neelsen. Tambin se utiliza para identificar las cepas patgenas del generoNorcadia. Para la incion de Ziehl-Neelsen se prepara un frotis. En la primera parte se baa con rojo carbolfucsina, se calienta suavemente el portaobjetos durante algunos minutos. Los elementos de la preparacin quedan teidos de color rojo de las bacterias no acido-alcohol-resistentes y las micobacterias conservan elcolor rojo. En la segunda parte se hace actuar el azul de metileno, que contrasta los elementos no acodo-alcohol-resistentes. Las bacterias se observan teidas de rojo intenso contra un fondo azul. MATERIAL: Porta objetos Asa bacteriolgica Mechero de bunsen Tripie con lamina de asbesto Aceite de inmersin Microscopio Cristal de violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Fucsina de Ziehl Azul de metileno Alcohol acido Cepas: Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Serratia marcensens Mycobacterium sp. MTODO Tincin de Gram Preparar un frotis con cada una de las cepas. Cubrir la preparacin con Cristal de Violeta durante un minuto. Lavar con agua, suavemente. Decolorar con alcohol-acetona hasta que la preparacin no desprenda colorante, aproximadamente 30 segundos. Lavar con agua, suavemente. Cubrir con safranina durante 30 segundos. Lavar y secar al aire. Observar al microscopio (10X, 40X, Y 100X inmersin).Tincion de Ziehl-Neelsen Preparar un frotis con la cepa de Mycobacterium sp. Secar a temperatura ambiente. Cubrir con fucsina funicada de Ziehl. Dejar reposar durante 30 segundos. Calentar hasta emisin de vapores durante 4 a 6 minutos. Cuidar que el colorante no se seque y no hierva, agergando mas colorante. Repetir el calentamiento dos veces mas. Dejar enfriar y lavar con agua. Decolorar con alcohol acido, durante dos minutos. Lavar con agua. Cubrir la preparacin con azul de metileno durante un minuto. Lavar con agua y secar. Observar al microscopio (10X,40X, 100X inmersin). Realizar una tabla de resultados que contenga el nombre del microrganismo, morfologa, color y tipo Gram. Realizar dibujos de lo observado para su reporte. CUESTIONARIO 1. Investigue la estructura qumica de la pared celular de una bacteria gramposiitiva y una gramnegativa. 2. Qu es un mordiente? Cul se utilizo en la prctica? 3. Qu papel desempea el colorante secundario en la tincin de Gram? 4. Explique los factores que pueden variar los resultados en la tincin Gram. 5. Qu otras tinciones existen para observar a las micobacterias? 6. Por qu es til la reaccin de Gram para recetar un tratamiento antibitico? 7. Qu enfermedades pueden diagnosticarse mediante la tincin de microrganismos acido-alcohol-resistentes. MEDIOS DE CULTIVO Y TCNICAS DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS OBJETIVOS: -Distinguir entre los medios de cultivo qumicamente definidos y complejos. -Conocer y realizar diferentes tcnicas de aislamiento de bacterias en diferentes tipos de medios de cultivo. INTRODUCCIN: Medios de cultivo es un material nutritivo preparado para el crecimiento de microrganismos. La introduccin de medios solidos por koch, constituy un avance muy importante. Frau Hesse, utiliz por primera vez al agar, que se empleaba para esperar las sopas. El agar es un agente solidifcante comn para los medios de cultivo. El agar es un polisacrido cido derivado de ciertas algas marinas, galactosa y sulfato. No es txico y proporciona una superficie suficientemente hmeda para facilitar el crecimiento y lo bastante seca para mantener separadas colonias. Muchas bacterias se multiplican abundantemente en medios de cultivo, incubados a 37C. Pueden crecer bacterias, hongos, levaduras y protozoarios. Algunas bacterias no pueden visualizarse o cultivarse como los microplasmas, treponemas, clamidias, rickettsias, as como los virus, su diagnstico se realiza por pruebas serolgicas. Medios de cultivo Los medios de cultivo deben contener elementos nutritivos necesarios para permitir la multiplicacin de las bacterias. Requerimientos fsicos como pH y presin osmticas apropiados; requerimientos qumicos como fuentes de carbono, nitrgeno, azufre, fosforo, oligoelementos, oxigeno y factores de crecimiento orgnicos (vitaminas, cofactores, coenzimas). La cantidad y variedad de medios de cultivo no tiene limite, excepto el que impone la imaginacin para su elaboracin. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a su consistencia en: Lquidos (caldos). Los medios lquidos son una infusin de protenas, peptonas, glucosa, cloruro de sodio. Permiten la multiplicacin de las bacterias en masa celular. La interpretacin positiva es la observacin de cambios en su color o turbidez, a simple vista. La siembra es mediante agitacin del asa dentro del medio. Solidos (agares). Los medios slidos, consta del medio liquido ms agar en polvo que se por ebullicin y al enfriarse se solidifica. Pueden prepararse en tubos o cajas. Permiten el aislamiento, la identificacin entre microrganismos, a travs de la morfologa colonial. En cuanto a su composicin se dividen en: Simple. Contienen las sustancias nutritivas nutritivas mnimas para el crecimiento de bacterias no exigentes, como Escherichia coli y los estafilococos. Pueden ser lquidos o solidos. Tambin son utilizados como base para la preparacin de otros medios. Enriquecidos. Son medios simples a los que se les aade suero, carbohidratos, sangre, casena digerida, extracto de levadura, vitaminas o cofactores. Permute el crecimiento de bacterias exigentes en requerimientos nutritivos, por ejemplo estreptococos, neumococos, gonococos, bacterias hemoflicas. En los medios con sangre puede observarse la hemolisis que producen algunas bacterias. Tambin, por su finalidad o funcin, pueden ser de: Aislamiento. Deben ser solidos, simples. Con la finalidad de aislar bacterias por la tcnica de agotamiento. Selectivos. Permiten aislar especficamente un solo tipo de bacterias que esta en escasa cantidad a partir de una mezcla. Inhibiendo el resto de las existentes en la muestra. La funcin se cumple al aadir cloruro de sodio a concentracin elevada, el citrato sdico, el cristal violeta, las sales biliares, antibiticos y antispticos. Medios de enriquecimiento. Son medios lquidos que cumplen la misma funcin que los selectivos. Las muestras se siembran previamente. Y luego de la incubacin, deben resembrase en un medio selectivo slido. Selectivo- diferencial. En los medios selectivos se aaden sustancias que confieren un color diferente a las colonias segn la distinta actividad metablica de las bacterias que las forman, convirtindose en medios selectivos- diferenciales. Se utilizan azucares como el manitol la lactosa, el sorbitol, junto con unindicador de pH (rojo neutro, azul de bromotimol, etc.). Tambin se pueden preparar mediosdiferenciales basndose en reacciones metablicas diferentes de la fermentacin de los azucares, como la descarboxilacin de la lisina, la produccin de cido sulfhdrico, que producen cambios de color en las colonias o los medios. Tcnicas de aislamiento de bacterias El cultivo puede realizar a partir de la muestra clnica obtenida del foco de infeccin (pus, orina, liquido cefalorraqudeo, exudados, etctera) o de una cepa pura. Existen procedimientos que permiten aislar las bacterias causantes de la infeccin. El asa bacteriolgica constituye un instrumento bsico en la bacteriologa. Tiene la propiedad de calentarse y enfriar rpidamente en pocos segundos. Permite tomar una muestra de microrganismos, efectuar un frotis o las siembras en medios de cultivo y esterilizar, para utilizarse nuevamente. La siembra se efecta con un asa sobre la superficie del agar contenido en una caja de Petri, por la tcnica de agotamiento, que permitir separar las diferentes bacterias de la mezcla. La siembra por agotamiento consiste en reseguir en zigzag la superficie del medio con el asa previamente cargada con el material a sembrar. Las clulas bacterianas se van depositando sobre la superficie del agar a lo largo del recorrido del asa, al final del cual quedan pocas bacterias, por lo que se depositan muy separadas unas de otras. Al sembrar una muestra clnica en un medio de cultivo, las bacterias empiezan a multiplicarse, se duplican cada 20 a 30 minutos. Las cajs se incuban entre 18 y 24 horas. Las bacterias se multiplican dando lugar a unos agregados de millones de bacterias que forman colonias, cuyo tamao es de vatios milmetros, y son visibles a simple vista. Cada colonia aislada contiene bacterias del mismo tipo, idnticas a las que origin. Para realizar la lectura de la morfologa colonial en las siguiente sesin. Su aislamiento permite su identificacin y el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos. Incubacin Cada tipo de bacteria requiere para su multiplicacin una temperatura ptima de 35 a 37C, en una estufa, cuya atmsfera es la del ambiente. MATERIAL Mechero Asa bacteriolgica Lpiz graso o marcador Gradilla Hisopos estriles Caldo nutritivo (en tubo) Agar simple inclinado ( en tubo) Medio de SIM (en tubo) Agar nutritivo (en caja de Petri) Agar sangre (en caja de Petri) Agar S-110 (en caja de Petri) Cepas Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Pseudomona sp. MTODO A). Tcnica de transferencia asptica. -Calentar el asa al rojo vivo para esterelizar. -Sostener el tubo del cultivo que contienen la cepa a inocular con la mano izquierda. -Quitar el tapn, flamear la boca del tubo y tomar una asada de la cepa a inocular o sembrar. Flamear nuevamente el tubo que contiene la cepa y tapar. -Demostracin por parte del profesor. B). Siembra en Agar Simple Inclinado -Realizar la tcnica de transferencia asptica. -Ahora tomar el tubo de agar simple inclinado, destapar y flamear la boca del tubo. -Sembrar por estra superficial, con movimientos en forma de zigzag, la cepade Staphylococcus aureus. -Retirar el asa, flamear la boca del tubo y tapar el medio. -Esterilizar nuevamente el asa. C). Siembra en caldo nutritivo -Realizar la tcnica de transferencia asptica. -Sembrar por agitacin con el asa dentro del tubo de caldo nutritivo, la cepa de Staphylococcus aureus. -Retirar el asa, flamear la boca del tubo y tapar el medio. -Esterilizar nuevamente el asa D). Siembra de medio de SIM. -Para llevar acabo esta siembra el asa bacteriolgica deber estar completamente recta. -Realizar la tcnica de transferencia asptica, utilizando la cepa de Klebsiella Pseudomoniae. -La siembra se realizar por picadura, lo importante es tratar de introducir y retirar el asa por el mismo sitio de inoculacin. E). Siembra en los medios slidos en caja: Agar nutritivo (Pseudomona sp.) y Agar S-110 (Staphylococcus aureus). -El profesor har una demostracin del cmo abrir y cerrar los medios de cultivo en cajas de Petri. -Dividir las cajas en tres cuadrantes, por atrs del medio de cultivo y con la ayuda de un lpiz graso. -Realizar la tcnica de transferencia asptica, para cada una de las cepas. -Sembrar por estra cruzada. Sobre la superficie del cuadrante nmero dos. Trazar un zigzag ms abierto, arrastrando inoculo del primer cuadrante. -Esterilizar nuevamente el asa, repetir el paso anterior, arrastrando inoculo del cuadrante dos. F). Siembra en Agar Sangre -Dividir el medio en tres cuadrantes con el lpiz graso. -Realizar un exudado farngeo, la muestra se tomar con un hisotopo estril y se depositar en el cuadrante uno. -Sembrar por estra cruzada de aislamiento, como el procedimiento anterior. -Etiquetar los tubos y cajas con le nmero de grupo y equipo. -Incubar a 37C durante 24 horas. -Es importante guardar los medios slidos en cajas de Petri para la siguiente prctica. CUESTIONARIO 1. Qu bacterias esperara encontrar de la muestra tomada de la cavidad oral, si en ese momento no existe alguna patologa? 2. Por qu despus de efectuar las diferentes tcnicas de aislamiento el material debe ser incubado a 37C? 3. Cul es la razn de mantener a la temperaturaya sealada durante 24 horas? 4. Cul es la importancia medica de realizar tcnicas de aislamiento de bacterias en medio de cultivo? 5. Qu es inoculo? 6. Cul es la definicin de colonia? 7. Qu ejemplos hay de los medios que son tanto selectivos como diferenciales? 8. Una colonia formada como resultado de una siembra por estra en placa, siempre proviene de una nica bacteria? MORFOLOGIA BACTERIANA Y COLONIAL OBJETIVO: Conocer diversas tcnicas de coloracin. Reconocerpormediodetincionesdiferentes estructuras bacterianas. Conocerlosparmetrosempleadosparaestudiarla morfologa colonial. Saber la importancia de la curva del crecimiento. INTRODUCCION: Elmtodomscomnparaexaminarbacteriaseshacer primerounapelculadelgadadelosorganismosobreun portaobjetos limpio y despus aplicar colorantes al frotis seco. Los colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano, si la clula no ha muerto, el proceso mismo de la tincin la mata. Elmtodo,porconsiguiente,esbastanteseveroypuede producirartefactos.Loscolorantesmscomnmenteusados sonsales.LosBASICOSconsistenenuncatincoloreado unido a un anin incoloro (ejemplo, clorhidrato de azul de metileno), mientras que los ACIDOS, constituyen exactamente lo contrario (ejemplo eosinato de sodio). Las clulas bacterianas son ricas en cidos nuclecos, los cuales portan cargas negativas en forma de grupos fosfato, stossecombinanconloscolorantesbsicoscargados positivamente, lo cual, los hace ser de los ms usados en citologa bacteriana. Los colorantes cidos no tien a la clula bacteriana y por lo tanto, pueden ser usados para impartir al fondo un color de contraste (coloraciones negativas). Loscolorantesbsicostienlasclulasbacterianas uniformemente, a menos que previamente sea destruido el RNA delcitoplasma.Sinembargo,sepuedenusartcnicas especialesparadiferenciarflagelos,cpsula,paredes celulares,membranascelulares,grnulos,ncleosy esporas. Slo algunos de los muchos compuestos orgnicos que actan comocolorantesseusanparateirmicroorganismos.Se trata de modificaciones de las primeras anilinas obtenidas deproductos de alquitran, introducidas alrededorde1880 por Koch, Weigert y Ehrlich. Laestructuraqumicadeloscolorantesseencuentra dividida en dos grupos principales: A) Grupo cromforo B) Grupo auxcromo Grupo cromforo: Grupo qumico que confiere a la molcula la propiedad de proporcionar color. Grupoauxcromo:Grupoqumicoquesuministralas propiedades de formar sales y de transferir el color de un colorante a una sustancia sobre la que acta. Losmsampliamenteusadosenmicrobiologasonlosdel grupoauxcromoysedivideendosclases,colorantes bsicosycolorantescidos,deestoslosmsusadosson los de naturaleza bsica. LA CURVA DE CRECIMIENTO Dado que dos nuevas clulas producidas por el crecimiento y divisindeunasolaclulasoncapacesdecrecerala mismavelocidadquelaclulaprogenitora,elnmerode clulas en un cultivo aumenta con el tiempo de progresin geomtrica, es decir exponencialmente. Lavelocidaddecrecimientodeuncultivoenunmomento dadoesdirectamenteproporcionalalnmerodeclulas presentes en ese momento. Siseinoculaunmediolquidoconclulasmicrobianas tomadas de un cultivo que previamente ha crecido hasta la saturacin, en el cual peridicamente se ha determinado el nmerodeclulasviablespormililitroytrazadoun grficodel,generalmenteseobtieneunacurvacomola quesemuestraenlafiguranmero1.Ademssepuede describirlacurvaentrminosde6fasesquese representan por las letras A a la F. Figura 2. Figura 1. Figura 2 Seccindela curva FaseVelocidadde crecimiento ARezagoCero BAceleracinCreciente CExponencialConstante DDe retardoDecreciente EEstacionaria mximaCero FDeclinacinNegativa (muerte) MORFOLOGIA COLONIAL Ademsdelasdiferenciasestructuralesdeunacolonia, debidas a las mltiples especies, las bacterias de una sola especie pueden formar varios tipos diferentes de colonias. Estasdiferenciasenlaformadelacoloniason importantes, porque son la expresin visible de diferencias morfolgicasyfisiolgicasimportantesrelacionadascon cada microorganismo en particular. Comoquaparaladescripcindelamorfologacolonial, emplear la siguiente terminologa: FORMA ELEVACION BORDE Color: Blanca, verde, azulada, amarilla, etc. Luz: Brillante, opaca (mate), transparente, etc. Tamao: Estudiar el dimetro en milmetros. Consistencia: Dura, blanda, mucosa, hilante. Superficie: Lisa, rugosa, radiada, serebiforme. MATERIAL Colorantes: Rojo congo Colorante de Albert Verde malaquita Mordiente de Knaysi Mordiente de cpsula Fucsina Lugol Safranina Portaobjetos Cubreobjetos Mechero Microscopio Asa y porta-asa Aceite de inmersin Cajasdepetriconcrecimientodediferentescolonias bacterianas. Cepas: Klebsiella pneumoniae Bacillus megaterium Corynebacterium sp. Bacillus subtilis DESARROLLO: DEMOSTRACION DE CAPSULA METODO DE ROJO CONGO -Colocarunagotadecoloranterojocongoenun portaobjetos limpio. -HacerunasuspensinconlacepadeKlebsiella pneumoniae. -Dejar secar al aire y fijar al calor. -Agregar mordiente de cpsula y dejar por 3 minutos. -Lavar con agua corriente. -Secar y observar a 10X, 40X y 100X. RESULTADO:Lascpsulasaparecencomozonasclaras;las clulas y el fondo de color rojo. DEMOSTRACION DE PARED CELULAR METODO TECNICA KNAYSI -Emplear la cepa de Bacillus megaterium, preparar frotis. -Fijar al calor. -Colocar mordiente de Knaysi por 10 min. -Lavar con aguacorriente (sin que pegue directamente en la muestra). -Colocar una gota de Fucsina y colocar un cubreobjetos. -Observar al microscopio a 10X, 40X y 100X. DEMOSTTRACION DE GRANULOS METACROMATICOS METODO CON TECNICA DE ALBERT -Emplear la cepa de Corynebacterium sp. -Preparar frotis. -Fijar al calor. -Cubrir el frotis con colorante de Albert por 5 minutos. -Calentar un poco el portaobjetos, con pases sobre la flama del mechero, cuidar que no se seque por medio minuto. -Lavar con agua y secar. -Aplicar lugol durante 1 minuto. -Lavar con agua y dejar secar. -Observar a 10X,40X y 100X. RESULTADOS:Losgrnulosmetacromticosaparecendecolor azul obscuro y el citoplasma verde plido. DEMOSTRACION DE ENDOSPORAS METODO TECNICA DE SHAFFER-FULTON -Emplear la cepa de Bacillus subtilis. -Preparar un frotis. -Dejar secar y fijar al calor. -Cubrir la preparacin con verde de malaquita. -Calentar con pases sobre la flama del mechero, hasta que se formen vapores, durante un minuto. -Lavar con agua corriente. -Agregar Safranina durante medio minuto. -Lavar -Dejar secar al aire. -Observar a 10X,40X y 100X. RESULTADOS:Lasesporassetiendecolorverdeyel citoplasma de rojo. Enlas cajas de petri con crecimiento bacteriano, efectuar todoslosparmetrossealadosparaleermorfologa colonial, efectuando su lectura y anotar el tipo de medio de cultivo de la colonia estudiada (AS, AN, S100, ACH, BHI, AST, VB, etc.) Efectuaresquemasdecadatincin,indicandolabacteria empleada,elobjetivodelmicroscopioqueseusparala observacin, caractersticas del color, as como la tcnica y estructura observada. CUESTIONARIO 1. Defina colonia bacteriana. 2. Cmo podemos saber si dos colonias de un mismo medio pertenecen a un mismo organismo? 3. Qu aspectos se toman para leer morfologa colonial? 4. Cmopuedeserlasuperficieylaelevacindeuna colonia? 5. Porqualgunosmicroorganismorequierendegelosa sangre para desarrollarse? 6. Describirelprocedimientoparaprepararyfijarun buen frotis. 7. Qu otro nombre reciben los grnulos metacromticos? 8. Qubacteriasposeengrnulosmetacromticosensu citoplasma? 9. Mencioneelnombrede3microorganismoscapacesde formar esporas. 10.Escriba el nombre de 3 microorganismos que posean cpsula. 11.Cul es la funcin de la cpsula? 12.Culeslafuncindelaparedcelular bacteriana? ANALISIS BACTERIOLOGICO DE AGUAS PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES Elaguacomoaguavitaltienequereuniralgunas caractersticas,muyimportantesparapodeserutilizada por el hombre. Dentro de esta caractersticas se encuentran las referentes a la potabilidad, que para llevarla a cabo existen varios mtodos, de los cuales algunos son muy accesibles y otros son muy complejos, pero de lo que se trata finalmente es de eliminar a cualquier tipo de microorganismo patgeno que se encuentraenelagua,parapoderdemostrardichos microorganismosseempleamediosdelaboratorio.Sin embargo,nohaydudaqueexistenunaflorabacteriana normal y caracterstica de las aguas naturales.Los tipos de bacterias que caracterizan esta poblacin son:1. Bacteriassuperiores,frecuentementelasformas encapsuladasqueincluyenbacteriasdelazufre,del hierro y formas similares. 2. Prostecadosobacteriasconapndicesquese encuentranenlagosyotrascoleccionesdeagua, adheridas a algn objeto inanimada. 3. Las formas espirales que se encuentran en gran numero enelagua,algunaspudensermuygrandes(20a30 micrmetros),encomparacindelosespirilos parasitarios. 4. Gran variedad de bacilos INCLUYENDO:a) FormaspigmentadascomoSerratinamarcensensy Chromobacterium violaceum. b) Diversas formas no pigmentadas como: Lasbacteriasfluorescentes,pseudomonas fluorescens. Algunas de las bacterias azufrosas Termfilas Bacilos aerobios, formadores de esporas. Bacilos anaerobios formadores de esporas. 5. Formas de cocos: a) Pigmentadasgeneralmenteamarillas,congran frecuencia Sarcina lutea. b) Cocos no pigmentados. 6. Bacteriasfijadorasdenitrgeno,delafamilia Azotobacteriae. 7. Bacteria nitrificante, nitrosomas y nitrobacter. Estas bacterias del agua se encuentran en el agua dulce de pantanos, arroyos y lagos. Algunasperonotodas,lasbacteriasdelaguapueden cultivarse en medios de laboratorio, pero ninguno es bueno para todas. Adems los grupos naturales del agua pueden cultivarse en medo de laboratorio, pero es bueno para todas.Ademsdelasbacteriasnaturalesdelagua,estapuedey suelecontenerunadiversidaddebacteriasquela contaminan desde fuentes externas:AireSuelo ExcrecionesElnmerodebacteriasenelaireestrelacionado ntimamente con la cantidad de partculas grandes o polvo que tiene suspendidas. Claro est que los microorganismos que se encuentran en el aire y ene suelo tienen acceso relativamente fcil a cursos ydepsitosdeagua,ylacontaminacinpuedesermso menos continua, por lo que contribuyen considerablemente a la flora bacteriana del agua. La cantidad de bacterias que pueden encontrarse en el agua depende principalmente del tipo de agua. Diversos factores ambientales influyen en el contenido de bacterias del agua; entrelosprincipalesestnlacantidaddematerial orgnico que contenga y la temperatura. Puede deducirse, que en anlisisbacteriolgico del agua, que ciertas bacterias permiten conocer la calidad de agua. Delasbacteriaasociadasalasheces.Losbacilos coliformesconstituyenunmayornumero,portanto, cualquieradeestosmicroorganismos,podranusarsecomo indicador de la contaminacin. Elexamenbacteriolgicodelaguaparabuscarbacilos coliformesseapoyaenelhechodequeestos microorganismos fermentan la lactosa. Los medios con los cuales se juzga la calidad sanitaria del agua pueden resumirse:1. Anlisis bacteriolgico, incluyendo-Presencia o ausencia de bacterias coliformes. -Nmero y tipode bacterias existentes. -Tipo de agua, sea superficialprofunda. -Condicin local -Anlisis qumico Existennormasbasadasenelrecuentodecoliformes, determinado por la formacin de acido y gas, por lo que las aguas lo dividen en clases segn las siguientes bases:ClaseI.Altamentesatisfactoria,contienemenosdeun coliforme por 100 ml.ClaseII.Consideradasatisfactoria,contienede1a2 coliformes por 100ml.Clase III.Agua considerada sospechosa, contiene de 3 a 10 coliformes por 100 ml.ClaseIV.Aguanosatisfactoria,contienemasde10 coliformes por 100ml. Cuando por examen bacteriolgico o de otra manera se sabe que un agua es peligrosa para el consumo: 1. Mtodos mecnicosa) Almacenamientob) Filtracin -Filtracin lenta por arena -Coagulacin y filtracin rpida por arena 2. Mtodos qumicos a) En gran escala -Hipocloritos y cloro liquidob) En escala menor c) hipoclorito d) Luz ultravioleta e) Ozono, etc. Elmtodomssimpleysencilloparatratarelagua familiaroindividualessimplementehervirla.La ebullicindurante5min.Destruyeabacilosyformas similares patgenas.MATERIAL MecheroAsa bacteriolgica 3 tubos de caldo lactosado, rojo metilo con campana3 placas de agar EMB Muestra de sangrePROCEDIMIENTO: Tomarvariasmuestrasdeaguaaestudiarconelasa, previamente agitar en el agua y agitar en el tubo con caldo lactosado,emplearotrasdosmutrasdeaguadediferente origenparalosdosrestantestubos,efectuarlamisma tcnica.Tomar nuevamente las asadas de las muestras y sembrar por estras cruzada en la caja de EMB. Es importante que cada una de las muestras se siembre en el tubo de caldo lactosado y en EMB. Etiquetar de acuerdo al tiempo de la muestra. Incubar a 37C 48 horas.Efectuar lectura de resultados. Observar formacin de acido y gas en el tubo y crecimiento de coliformes. CUESTIONARIO:1. Describa tres aspectos importantes del anlisis del agua. 2. Enqueconsistelatcnicaporfiltracincon Millipore y con qu fin se emplea?3. Culeselconceptodeuncoliforme?Mencione tres.4. Enumerealgunatcnicapara la obtencindeagua con menos carga bacteriana?5. Queselaguapotable?Qucaractersticas presenta? 6. Enumere tres enfermedades transmitidas por el agua7. AdemsdelaguaEMBQuotromediodiferencial puede usarse?8. Culessonlosprocesosutilizadosenla purificacinydesinfeccinartificialesenlos suministros del agua potable? MICROCULTIVO DE HONGOS OBJETIVO: -Conocimientodelatcnicaparalaobtencinde hongos en el laboratorio (microcultivo) -Conocimientodelascaractersticasgeneralesde loshongos(crecimiento,estructuras,importancia, etc,)-Observacin de la morfologa colonialINTRODUCCION:Loshongossonlacausamsfrecuentedeenfermedadesen las plantas, pero solamente alrededor de 50 de los millares deespeciesconocidasdehongos,provocanprocesos patolgicos en el hombre.Por lo general los hongos patgenos no producen toxina. Con pocas excepciones, la mayora de los hongos patgenos para el hombre se clasifican como fangi imperfecti, denominados as, debido a producen solo esporas asexuales y no tienen desarrollo esporular asexuales algn conocido que da lugar a las estructuras tan especializadas que se encuentran en otras especies de hongos.ESTRUCTURAS D ELOS HONGOS:Cuandocrecenenmedios adecuados,muchos hongos producen lagosfilamentosramificados,cadafilamentoesllamado HIFA.Puedenestardivididasportabiquestransversos constituyendo una cadena de clulas, a estas se les da el nombredehifasreptadasotabicadas.Amedidaquelas hifas continan creciendo y se ramifican se desarrolla un conjunto de filamentos que se denominan MICELIO. La parte del crecimiento que se proyecta por sobre la superficie del substrato se le llama MICELIO AEREO; en tanto que la parte que penetra en el substrato y absorbe los alimentos se le conoce como MICELIO VEGETATIVO.Loshongossereproducenporesporasddiversostipos, muchasdelascualesseoriginanenelemicelioareo, entonces denominado micelio reproductivo. Las esporas son denominadas asexuales cuando no se verifica una fusin de ncleos para su formacin; cuando se lleva a cabo tal fusin se le conoce como sexual. En la mayora de loshongosdeimportancianohasidoidentificadala capacidad de formar esporas sexuales.CLASES DE HONGOS: Loshongosincluyen4clases,loshongosinferiores integran la clase llamada:PHYCOMYCETES.Larazdeestapalabra,PHYCOsignifica alga,ylosficomocetosreciebenaveceselnombrede hongosalgaceosdelosqueunossonacuticosyotros terrestres.Losficomicetosdifierendeloshongossuperioresenque poseenesporasasexualesendgenasqueseformanen estructurassacciformesllamadosespongiarius,quesus micelios no son tabicados.Los hongos superiores se caracterizan por esporas asexuales exgenasllamadasconidios,queseformanfueradelas hifasyporlapresenciadelosmiceliostabicadoscon poros que permiten los pasos de ncleos y citoplasma de una parte del micelio a otra.ASCOMYCETES.La palabra ASCA significa bolsa o estructura enformadesaco, ylos ascomicetos se denominanas por contener sus esporas asexuales en un asca.BASIDIOMYCETES.Hongossuperioresqueproducenesporas sexuales sobreuna base o basidio. Lamayor parte delos hongos de importancia medica pertenecen a la clase de losDEUTEROMYCETES.Hongosinespecficos,estoshongono puedenclasificarsetomandocomobasesureproduccin sexual, ya que sus etapas sexuales son desconocidas.MATERIAL: Equipo para microcultivo estril Glicerol al 100%Caja de Petri PDA Mango y hoja de bisturMarcador y reglaMechero y microscopioPinzas de diseccin sin dientes Cepas-Aspergillus sp.-Pencillum sp. Preparaciones fijas de diferentes clase de hongos PROCEDIMIENTO:-En la caja que contiene el medio de PDA, efectuar en su base una cuadricula de 1cm. Por lado con el marcador. -Con el bistur previamente flameado cortar el agar siguiendolaslneasdelplumnmarcadoenel vidrio. -Con el mismo bistur, colocar uncuadrito de agar dePDAenelcentrodeportaobjetosdentrodela caja,previamente colocarlo en la varilla doblada. -Mediante el asa doblada en ngulo recto, coloca un pequeofragmentodelacoloniadelhongo proporcionadaeinocularaunladodelcuadrodel agar.-Efectuarelpasoanteriorenlostreslados restantes. -Conlaspinzasflameadascolocarelcubreobjetos sobre el agar.-Con elmango del asa, presionar ligeramente sobre el cubre objetos, con el fin de que se adhiera el agar. -Colocar el glicerol al 10% (5 10 ml) en la caja de Petri, procurando no mojar el microcultivo.-Cultivaratemperaturaambiente,previamentebien etiquetado, por 5 das. -Observarsucrecimiento,observndolocada24 horas. -Observacinalmicroscopiodelaspreparaciones fijas de hongos. RESULTADOS: -Efectuardibujosdelasestructurasdeloshongos observados. -Efectuarlalecturacolonialdeloshongos proporcionados, y el de su caja de microcultivo. -Describaeltipodecrecimientoysus caractersticasenlacajademicrocultivo,ylos cambiosquepresentoencadaunadesuslecturas, (esquemas) macroscpicamente. CUESTONARIO: 1. Cmo define usted a un hongo?2. Cmo se clasifican los hongos?3. Mencione hongos clasificados como Fungi imperfecti 4. Qu es un microcultivo?5. Qu importancia tienen los microcultivo? 6. Enuncieenfermedadesproducidasporhongosenel hombre y que tipo de hongo las produce.7. Qudiferenciasteraputicasencuentraentreuna patologa producida porhongosy otra por bacterias? 8. Cmo es la reproduccin de los hongos?, defina hifa, micelio, espora.9. Culeslaraznparaagregarglicerolal microcultivo? 10.Mencione 5 caractersticas del hongo Aspergillus.11.Mencione 5 caractersticas del hongo Penciillum.

REQUERIMIENTO GASEOSO Y TEMPERATURAS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO OBJETIVO: conocer las necesidades de oxigeno y efectos de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano, para poder cultivarlos en condiciones optimas. INTRODUCCIN:Para los microorganismos presentes en un desarrollo normal, ascomosureproduccin,existenfactorescomola temperatura,pH,presinosmtica,concentracinde sustancias nutritivas, etc. que regulan esos mecanismos. EFECTOS DE LA TEMPERATURA: Temperaturasdecrecimientoptimo.Paracadaespeciede bacterias hay una temperatura en la que el crecimiento y la multiplicacinseproducenconmayorrapidez;sellama temperaturadecrecimientoptimo.Estacorrespondeala temperatura ordinaria del hbitat natural de las especies y a ala temperatura en que las enzimas bacterianas esenciales funcionan mejor. Paralagranmayoradelosorganismossaprofitosque habitanenelsueloyotrolugaresfueradeloscuerpos vivos, la temperatura de crecimiento optimo es de 25 a 30 C,queesprecisamenteunpocomaselevadaquela temperatura ambiente normal. Hayalgunasespeciesqueseencuentranenelsuelo,en fuentes de aguas termales y en el contenido intestinal de animales, cuya temperatura ptima puede ser de 60 a 90 C, o ms elevada. Se llaman bacterias TERMOFILAS (amantes del calor).Enelextremoopuestoencontramosunaspocasespecies excepcionales que crecen mejor atemperaturas prximas al puntodecongelacin,(alrededorde10C).Sonllamadas bacterias PSICROFILAS (amantes del fro).Los organismosque crecen bien a temperaturas intermedias de25a27CsedicequesonMESOFILOS(amantesdela moderacin). CLASES DE BACTERIAS SEGN LAS RELACIONES DE TEMPERATURA. CLASE MINIMAPTIMAMAXIMA Psicrfila 0c10C- 15C30C Mesfila15- 25C25- 37C40- 55C Termfila 25- 45C50- 60C60- 90C TEMPERATURAS APROXIMADAS DE CRECIMIENTO Latemperaturaptimaparalasbacteriasparsitasdel hombre y otros animales de sangre caliente es de 37C, la temperatura normal del cuerpo. Las incubadoras de laboratorio en que se cultivan grmenes patgenosprocedentesdelcuerpohumanodebenregularse, paramantenerconstantelatemperaturaentre35y37C. Lasbacteriasparsitasenelcuerpodelasavesse desarrollan mejor a temperaturas elevadas de 41C a 45C, debido a que es la temperatura normal de estos animales. TEMPERATURAS MINIMAS Y MAXIMAS DE CRECIEMIENTO Atemperaturapordebajooporencimadelaptima,los grmenessemuestranmenosactivosycrecenyse multiplican ms lentamente.Paracadaespeciehayunlmitemsomenosdefinidoen ambossentidos,masalldecualnoserealizael crecimiento.Paralamayoradelosmicroorganismosque vivenenelcuerpohumano,latemperaturamnimase encuentra alrededor de los 20C, y la mxima es de 42 a 45C aproximadamente. Algunos grmenes patgenos se adaptan tan exactamente a la temperatura del cuerpo humano (de 36 a 37C), que apenas se multiplican fuera de estos valores; la mayora de ellos, sinembargo,crecenatemperaturasentrelos34ylos 42C. RELACION CON EL OXIGENO ATMOSFERICO. Todoslosseresvivosnecesitanoxigenoenalgunaforma, aunquelasbacteriasdifierenporsucapacidadpara utilizareloxigenodelaire.Lamayorautiliza directamente el oxigeno atmosfrico, de la misma manera que los hacenelhombrey losanimales; son lasAEROBIAS que contienen enzimas citocromas. Sinembargo,paraungrupoimportantedebacterias,el oxigenolibreenelaireesrealmenteuntoxico.Estos grmenesextraordinariosnopuedenutilizareloxigeno atmosfrico ni sobrevivir en contacto con el; son llamados ANAEROBIOS. Debenobtenereloxigenoapartirdeladescomposiciny reordenacindecompuestosquecontienenoxigenoenel medio. Los anaerobios estrictos solo crecern donde no hay aire en loabsoluto,anoserquesehallenpresentessustancias fuertementereductoras, como el tioglucolato, o bien, que seencuentrenconjuntamenteconorganismosaerobiosque absorban el oxigeno.Intermedias entre aerobios estrictos y anaerobios estrictos seencuentranmuchasespecies(facultativas)quepueden utilizar el oxigeno libre o el combinado. Cada especie de estegrangrupomuestrasinembargo,unaespecial preferencia para crecer, ya sea en presencia o en ausencia del aire. La relacin del microorganismo con el oxigeno es sutil, ya quelosprocesosdelarespiracinbacterianason complicados.Solo se necesitacomprender que las diferentes variedades de las bacterias estn delicadamente adaptadas a una forma determinada de provisin de oxgeno y se desarrollan mejor bajo presin particular del mismo oxgeno. Es conveniente hacer notar que muchas bacterias patgenas, aunquecrecenbienencondicionesaerobiasordinaria,se desarrollanmuchomejor,ensuprimeraosegunda generacin, en medios anaerobios de cultivos artificiales o almenosparcialmenteanaerobios.Enotraspalabraslos grmenes(lamayora),patgenossonclaramente MICROAROFILOS, prefieren muy poco aire. Elcrecimientodemuchosagentespatgenos,sefacilita suministrndolesuna atmosfera de contenido dedixido de carbono aumentada en un 10% aproximadamente. MATERIAL: Mechero Asa bacteriolgica 2 pipetas de 1 mL. estriles 8 tubos con caldo nutritivo. Un tubo con agar tioglicolato Un tubo con gelatina nutritiva Gradilla CEPAS: E. coli B. subtilis. Pseudomonas spp. DESARROLLO: Conunapipetaestrilyencondiciones aspticas inocular 4 tubos de caldo nutritivo con 1 mL.desuspensin de E. coli. Conunasegundapipetaestrilinocularlos otros4tubosdecaldonutritivocon1mL.del cultivo de B. subtilis. Etiquetar cada uno de los tubos IncubaruntubodecaldonutritivoconB subtilis y otro tubo con E. Coli a las siguientes temperaturas: -4C -37C -55C -Temperatura ambiente. Despusde24-48horas,efectuarlecturade los resultados. Observar turbidez e indicar a que temperatura se produjo el mximo desarrollo, as como lo que sucedi con los dems tubos. Enlostuboscontioglicolatoygelatina nutritiva, sembrar por picadura con las sepas de E. coli y Pseudomonas respectivamente. -Flamearelasaantesydespusdecada inoculacin. -Incubar a 37C por 24- 48 horas. -Lecturas de resultados. Observacincon respecto alalocalizacin de crecimiento en los tubos de tioglicolato y gelatina nutritiva. CUESTIONARIO: 1.Mencionedosejemplosdemicroorganismos patgenosqueseanaerobios,dosanaerobiosydos facultativos. 2.Esquematiceenforma de tabla los rangos de temperatura para las bacterias, mesfilas, termfilas y psicrfilas. 3.Enunciecuandomenos2bacteriasquepuedan crecer a temperaturas mayores de los de los 7C. 4.Enumerealgunosmicroorganismospsicrfilos causantesdedescomposicindealimentosen refrigeracin. 5.Quimportanciamedicatieneconocerlos rangos de temperatura de las bacterias? 6.Aqutemperaturahubomejordesarrolloy porqu? OBTENCION Y AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS OBJETIVO: Reafirmarlosprocedimientosyprecaucionesquedeben sugerirse paraefectuar las tcnicasdecultivo, (tcnica asptica). Importancia de la obtencin de cultivos puros. INTRODUCCIN. Una tcnica especial, que requiere gran cuidado y atencin a numerosos e importantes detalles, se utiliza en cada paso delapreparacinyexamendecultivosyentodolo referentealmanejodemicroorganismos.Estatcnicaes indispensableparaestudiar,encondicionesdeseguridad, microorganismos peligrosos y para evitar contaminaciones de loscultivosyotrosmaterialesutilizadosconlos microbios que se encuentran en el polvo, en los dedos, y en otras muchas partes. Latcnicamicrobiolgicaesesencialmenteunatcnica asptica,esdecirunprocedimientoporelcualel investigadorexcluyedesucultivotodoslos microorganismosquenodeseaestudiar,previenela infeccin de su propio organismo y evita la contaminacin deloquelerodea.Creaparasimismo,ensulugarde trabajo un medio asptico. Al iniciar sus actividades debe esterilizarlo todo: objetos de cristal, medios de cultivo, y cuanto se vaya a utilizar en el laboratorio. Unavezpreparadouncultivo,debemanejarsesiemprede maneraqueningnmicrobiopuedaentrarosalirdel cultivo. Enlanaturalezacasitodoslostiposdebacteriasu hongos,incluyendolasespeciespatgenas,convivenen relacin ms o menos estrecha con otro tipo de bacterias u hongos. Por esta razn casi siempre el cultivo primario de cualquierprocedenciaseruncultivodetipomixto,de organismos de tipos diferentes. Peroenellaboratoriolasdiversasespeciessepueden separar unas de otras y cultivar aisladamente. Un cultivo de una sola especie se llama CULTIVO PURO, para conocerlaspropiedadesparticularesdeunorganismose debe estudiar este en un cultivo puro. Se llama aislamiento del organismo al proceso seguido para obtener un cultivo puro, separando un tipo de bacterias u hongos de una mezcla en que hay otros tipos. MATERIAL: 3 tubos con solucin salina (9.9 mL.) 2 placas de Petri estriles Matraz con agar nutritivo 2 pipetas estriles 1 placa de Petri con agar S-110 1 placa de Petri con agar nutritivo Tubos con cultivo mixto -Staphylococcus aureus Pseudomonas sp. Mechero Asa bacteriolgica PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO POR DILUCION O VACIADO EN PLACA Se fundir el agar nutritivo a bao mara. Encondicionesestriles oaspticas setoma unaasada delcultivomixtoysesuspendeenuntuboconsolucin salina. Se realizaran a partir de este tubo diluciones en serie. Se verter el agar fundido sobre las dos placas estriles. Tambincercadelmechero,tomarunmililitrodelas2 ultimas diluciones con las pipetas utilizadas anteriormente cuidandodeflamearlaspreviamenteysevaciaraenlas placas de agar una vez. Agitar suavemente, con movimientos circulares. Dejar solidificar. Incubar a 37C por 24-48 horas. AISLAMIENTO EN CAJAS DE PETRI POR ESTRIAS. Esterilizar el asa y dejarla enfriar. Tomar una asada del cultivo mixto y sembrar en la placa de A.N.porestracruzada.Seguirlatcnicasealadaen prcticas anteriores. Incubar a 37C por 24- 48 horas. Comparar los resultados obtenidos con las placas del mtodo por dilucin. AISLAMIENTO CON MEDIO SELECTIVO. Flamear el asa y enfriar. Tomar una asada del cultivo mixto. Sembrar por estra cruzada sobre la placa de agar S-110. Incubar a 37C por 24- 48 horas. Identifique por morfologa colonial la bacteria de que se trata. CUESTIONARIO. 1.Qufactoresdebencuidarseenel cultivo de un microorganismo? 2.Qu es un cultivo puro? 3.Qutiposdenutrientesdebetenerun medio de cultivo? 4.Culseralaimportanciadeobtener cultivos puros? 5.Cmo podemos lograr cultivos puros? MECANISMO DE PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA. Objetivo:sonmuchoslosfactoresquedeterminanencada casosiunmicroorganismopuedeonoprovocarinfeccin, estudiaremos en esta prctica algunos de los factores que controlan la infeccin. Introduccin. Virulencia de los organismos: Sedebepensarsiemprequeelpoderpatgenodeun microorganismo esta en relacin con un determinado husped (hombre, animal oplanta). Para expresar estos diferentes grados de poder patgeno se usa el trmino de virulencia. Nmero (o dosis) de organismos y va de entrada. Evidentemente cuando mayor sea el nmero de microorganismos patgenosquepenetranalostejidos,mayorserla probabilidaddequeacontezcalainfeccin.Lavade entrada puede determinar si se producir o no la infeccin. Resistencia individual del husped. Determina si la infeccin seproducir ono, asicomo la gravedaddelaenfermedad.Unorganismovirulentopara algunossereshumano,nonecesariamenteproducir enfermedad en otras personas. La relacin entre los factores que acabamos de exponer se puede expresar como sigue: E es una funcin de NV/R. DondeEsignificaenfermedadNnmerodemicrobios patgenos V virulencia y R resistencia del husped. Indicaqueencualquiercasodeinfeccinelpodertotal patgenodelosorganismos(quedependedesunmeroy virulencia) equilibrado con la resistencia del individuo es lo que determina la naturaleza y gravedad de la enfermedad. En trminos ms simples, la patogenicidad y virulencia de los microbios est relacionada con su capacidad para: 1. Invadir y multiplicarse en los tejidos del cuerpo. 2. Intoxicar los tejidos. Cadavariedaddemicrobiospatgenostienensupropio conjunto de estructuras superficiales, hbitos metablicos yactividadesenzimticasquesecombinanparadarleun determinado poder patgeno. Como la produccin de toxinas, que se puede clasificar en dos categoras, las exotoxinas, y las endotoxinas, con caractersticas particulares en cada grupo. Asociado a la propiedad invasora se encuentra el poder para formar varios productos dentro de los cuales tenemos: vHemolisinasvLeucocidinas vFactores coagulasa vEstreptoquinasa vHialuronidasas Material: 3 cajas de agar sangre Hisopo estril. Solucin salina Jeringa estril LigaduraTorundas Asa bacteriolgica. Mechero Cepas1. S. aureus 2. S. pyogenes Desarrollo. En dos cajas de agar sangre, sembrar por estra cruzada S. aureus y S. pyogenes, respectivamente. Etiquetar e incubar a 37C por 24 horas. Observar el tipo de hemolisis y morfologa colonial. Enlatercercajadeagarsangreefectuarunexudado farngeo(emplearelhisopo)seguirindicacionesdel profesor para esta tcnica. Etiquetar e incubar 2 hrs. a 37CObservar tipo de hemolisis y comparar resultados. Sangrar a un compaero (5 ml aprox) Centrifugar (2500-3000 R.P.M. 3 minutos. Separar el plasma en un tubo Diluir 1:5 en solucin salina tomar muestra de S. aureus y suspenderla en el tubo que contiene plasma, incubar a 37C durante 90 minutos. Observarresultados. Cuestionario. Defina patogenicidad y virulencia. Cuantos tipos de hemolisis existen, y porque se caracteriza cada tipo. Enuncie 4 caractersticas de las endotoxinasEnuncie 4 caractersticas de las exotoxinas Numerarydescribirbrevemente3productosagresivosque pueden coadyuvar a la propiedad invasora de las bacterias. Enqucircunstanciassepuedenaumentarodisminuirla virulencia de un microorganismo. Explicarlaimportanciadelavirulenciadelos microorganismos, la va de entrada y el nmero de grmenes quepenetranalostejidos,asicomolaresistenciadel husped. FISIOLOGA O METABOLISMO BACTERIANO. Objetivo. Definir metabolismo y su importancia. Composicin qumica de las clulas bacterianas (protenas, carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos y enzimas). Nutricinbacteriana(auttrofa,hetertrofa,saprfitay parsita). Metabolismo energtico. Conoceralgunasdelasreaccionesfisiolgicasdelos microorganismosmedianteelsembradoendiferentesmedios de cultivo. Introduccin El metabolismo es el conjunto de transformaciones qumicas que los organismos vivos deben realizar para mantenerse y reproducirse. Losprocesosmetablicossedividenen:anabolismoy catabolismoAnabolismo,procesomedianteelcuallosorganismos sintetizan material celular, y catabolismo,a travs del cual las clulas descomponen los materiales nutritivos. Composicin qumica de las clulas bacterianas. La materia viva de las bacterias es esencialmente la misma que el protoplasma de otros organismos vivos.Esta formado porcompuestosdecarbono,oxigeno,hidrogeno,nitrgeno, azufreyfosforo,juntoconpequeascantidadesdeotros elementos. Un promedio elevado como del 80 al 90% pueden ser de agua, seencuentranprotenas,carbohidratos,lpidos,ycidos nucleicos, asicomo tambin aquellassustancias de mxima importancia llamadas enzimas. Protenas Estoscompuestosorgnicoscomplejosquecontienen nitrgenoestnenlasbacteriascomosimplesprotenas (albumina,oglobulina)comoprotenasparcialmente degradadas (polipptidos, peptonas) como nucleoprotenas y transprotenasconjugadasencombinacionesconlpidoso carbohidratos. Adems todas las enzimas son protenas. Las protenas se componen de aminocidos, se han aislado 21 aminocidosdistintos.Tienenunaestructurasimilarque contieneunaparteacida,conocidacomogrupocarboxilo, una parte bsica que se conoce como grupo amino y una parte orgnica llamada grupo radical. Carbohidratos. En las bacterias encontramos almidon y glucgeno asi como azucaresmassimples.Lospolisacridosyloscompestos formadosporcombinacindecarbohidratosyaminocidos, formanpartedelaestructurabsicadelasparedes celulares bacterianas. Paraladiferenciacinbacterianasonimportanteslos polisacridos que se encuentran en las paredes celulares de algunosbacilosgrannegativosyenlascapsulasde grmenes como los neumococos. Loscarbohidratosmassimples,comolaglucosayla fructosa,sonlasfuentesprincipalesdeenergaparael metabolismo bacteriano. Lpidos Los materiales grasos se encuentran principalmente en forma de grasa, ceras y fosfolipidos. En muchos microorganismos, especialmenteenbacteriasgranpositivas,seencuentran gotitasdesustancialpidateiblecomoinclusiones celulares visibles, parece que se forman principalmente de poli- B-hidroxibutiratos.Laproporcin total delpidos enlosmicroorganismosesmuydiferentesegntipode bacterias que se trate, algunos llegan a tener hasta un 42 % de su peso. cidos nucleicosEstocompuestoscomplejossepresentanenlasbacterias como dos tipos. Son componentes esenciales de las clulas vivas. Un tipo el acido desoxirribonucleico DNA transporta lainformacingenticaohereditariaquesehallaenel nucleo.Elotro,elacidoribonucleicoRNA,seencuantramuy concentrado en el citoplasma. El RNA interviene ntimamente en la sntesis de las protenas.Losdostiposdeacidosnucleicoscontienentres componentesiguales;uncompuestonitrogenadocclico, llamado base nitrogenada, un azcar y un grupo fosfato. EnzimasEl metabolismo implica muchas reacciones integradas que no pueden realizarse sin enzimas. Se puede decir en realidad que sin enzimas no hay vida.Actancomoagentescatalticosquepermitenquelas reaccionescatalticasbioqumicascomplejasserealicen rpidamente con su presencia, puesto que de otra manera se realizaraconextremadalentitudonoserealizara.Un catalizador es una sustancia que acelera la rapidez de una reaccinqumica.Lasreaccionesenzimticasdelas bacterias son necesarias para que el organismo pueda: 1. Disponerdealimentosenformasolubleparaque pueda penetrar en las clulas 2. Tenerunsuministrodeenerganecesariaparala biosntesis delprotoplasma,ypara larespiracin, reproduccin, motilidad y otros procesos vitales. 3. Utilizar estos elementos nutritivos para la sntesis del protoplasma del cuerpo. Material. Por equipo: oDos tubos caldos urea oDos tubos citrato de Simmons oDos tubos manitol rojo de metilo oDos tubos glucosa rojo de metilo oDos tubos SIM oGradilla oAsa bacteriolgica oMechero oSepas -E. coli -Proteus vulgaris. Procedimiento Sesembraranlostubosconlosdiferentesmediosde cultivo con cada una de las cepas facilitadas Ejemplo,delosdostubosdelmediodeSIM,unose sembraraconE.coliyelsegundotuboconP. vulgaris. Inoculardedosendos,enigualformalosdems tubos. Emplearlatcnicadesembradocorrespondientepara cadaunodelostipodemediodecultivo,seguir indicaciones del profesor en caso de duda. Tenercuidadodeflamearelasaantesydespusde cada procedimiento. Se incubaran los tubos previamente etiquetados a 37Cde 24-48 horas.Observar los cambios de cada uno de los tubos. Interpretar los resultados, y anotar los resultados en un cuadro, con las caractersticas de cada una de las bacterias que se emplearon en la practica. Cuestionario. -Qu se entiende por metabolismo bacteriano? -En la prueba de fermentacin de azucares indique: -Que indicador utilizo?.-Que azcar utilizo?. -Como efectu su lectura?. -Defina metabolismo energtico y cul es su funcin. -Conque fin se empleo el medio de SIM?. -En qu consiste el reactivo de Ehrlich y el de Kovacs?.-Definaa las bacterias: Auttrofas. Hetertrofas. Saprfitas. Parsitas. ACCIN DE AGENTES FSICOS Y QUMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO OBJETIVOS Enumerarlosfactoresrelacionadoscondesinfeccin eficaz Explicar la forma y eficacia de los mtodos fsicos para el control microbiano Identificar los mtodos de accin y los usos preferidos de desinfectantes qumicos Interpretarlosresultadosdelmtododedifusinen disco INTRODUCCIN EsprobablequeenlaEdaddePiedra,lossereshumanos hayan utilizado mtodos fsicos para el control microbiano con el objeto de conservar los alimentos. La desecacin y el salado (presin osmtica), fueron algunos de los mtodos fsicos practicados. Amediados deladcada de1800 Ignaz Semmeweis y Joseph Listerdesarrollaron algunas de las primerasprcticas de control microbiano en los procedimientos mdicos. Incluan ellavadodemanosconclorurodecalcioparadestruir microbiosyelempleodeasepsiaquirrgica.Enlos hospitales, las infecciones causaban el 10% de muertes en losprocedimientosquirrgicosyfallecimientodemujeres duranteelparto.Estclaroquelaprevencindela infeccinhospitalariadependeenpartedela disponibilidaddeequipo,instrumental,apsitos, dispositivos de aislamiento, limpios y cuando sea necesario estriles,yenlaeliminacinsinriesgosdelmaterial infectado. Durante el siglo pasado se desarrollaron mtodos fsicosyagentesqumicosquecontrolanelcrecimiento microbiano. Existenmuchosfactoresenelmedioambientedelos microrganismosquesonletalesopotencialmenteletales paraellos;unodelospropsitosdestaprcticaes estudiar algunos de los factores que afectan la viabilidad de los microrganismos. Losnombresdelostratamientosqueproducenlamuerte directadelosmicrobiosllevanelsufijocida,que significamuerte.Aspuedehablarsedebactericidao germicida,fungicidaomicocida,viricida.Otros tratamientos inhiben el crecimiento y la multiplicacin de lasbacterias;llevanelsufijostticoquesignifica detener o estabilizar, como un bacteriosttico. Esterilizacin Ahoraesimportantedefiniralgunosconceptosquese manejan en el control microbiano. La esterilizacin es el proceso mediante el cual se eliminan o destruyen todas las formasdevidamicrobiana.Unagentequeproduce esterilizacin se denomina esterilizante. Se dice que algo est estril cuando carece de todo germen viable (capaz de reproducirse). Se utilizan mtodos fsicos o qumicos para eliminar microrganismos de un objeto o matarlos in situ. Mtodos Fsicos Las tcnicas de esterilizacin pueden ser: Calor:alimentosenconserva,materialdevidrioe instrumentos quirrgicos. Calor hmedo: ebullicin o calor fluyente, autoclave. Pasteurizacin: leche, helado, yogurt y la cerveza. Calor seco: flameado directo, incineracin, esterilizacin por aire caliente (estufa). Elcaloreselmtodomscomnparaeliminaralos microbios, inclusive endosporas. Filtracin:enquirfanosysalasparapacientesexiste airefiltrado.Lafiltracinseutilizaparaeliminar microbios de los lquidos o los gases. Bajastemperaturas.Fro:refrigeracin,congelacin intensa, liofilizacin. Alta presin. Desecacin. Presin osmtica. Radiacin (ionizante y no ionizante), microondas. Sustancias qumicas: liquida o gaseosa. Cuandoingresanlosmicrorganismosenunaherida quirrgica, no se requiere esterilizacin, las defensas del organismo actan en ese momento. Mtodos Qumicos Losagentesqumicosseutilizanparaelcontroldel crecimientomicrobiano,tantoentejidosvivos (antispticos) y sobre objetos inanimados (desinfectante). Pocoslogranlaesterilidad,lamayorareducenlas poblaciones microbianas. DesinfeccinSon los procedimientos que eliminan o matan la mayora de losmicrorganismosviables,peronoatodos.Sepuede utilizar un desinfectante qumico que mata a las bacterias, peroquequiznoalosvirusoalasesporas.Sepuede efectuar con sustancias qumicas, luz ultravioleta, agua en ebullicinovapor.Eltrminoseaplicaalusodeuna sustanciaqumica(desinfectante)paratrataruna superficie inerte o un sistema. Listerfueelprimeroenutilizarelfenol(cido carblico) para controlar las infecciones quirrgicas en el quirfano. Se utilizaba para controlar el olor de las aguas residuales.Ahorararavezseutilizacomoantispticoo desinfectante debido a sus efectos irritantes sobre la piel y a siu olor desagradable. Losderivadosdelfenol(fenlicos)tienenmenosefectos irritantes.Unapropiedadtildelosfenlicoscomo desinfectanteesquepermanecenactivosenpresenciade compuestosorgnicos,sonestablesypersistentesdurante periodos prolongados despus de su aplicacin. Por ello son agentes adecuados para desinfectar pus, saliva y heces. Uncompuestofenlicoutilizadoactualmenteesuncresol llamadoO-fenilfenolcomponenteprincipaldeLysol,buen desinfectante de superficie. Fenol y derivados fenlicos: fenol, fenlicos, bisfenoles, biguanidas(clorhexidina),halgenos,alcoholes,metales pesados ysus compuestos, agentestensoactivos, jabones y detergentes, higienizantes, cidos aninicos. Conservadores qumicosdealimentos:cidosorgnicos,nitratosy nitritos.Aldehdos.Esterilizantesqumicosgaseosos. Peroxgenos(agentesoxidantes).Iodo,benzal,lugol, isodine, agua oxigenada. Antisepsia Consiste en el uso de antispticos para reducir el nmero degrmenesviablesenlapiel.Losantispticossonun grupodedesinfectantes.Haymodificacindela desinfeccinydelaantisepsiayelprocesode desgerminacin, que produce la eliminacin mecnica de los microbios en un rea limitada. Laeficaciadelosdesinfectantessepuedenmonitorizar mediantepruebasmicrobiolgicasdeusoprctico.Sin embargo, stas pruebas rara vez se realizan en un hospital, elusodedesinfectantesestguiadoporlas recomendaciones de los fabricantes.Evaluacin de la potencia desinfectante Durante muchos aos la prueba de referencia fue la prueba del coeficiente fenlico, que comparaba la actividad de un desinfectante dado con el fenol. El estndar actual es la prueba de utilidad de la dilucin de la American Official AnalyticalChemist.Lastresbacteriasutilizadassonla Salmonella Choleraesius, Staphylococcus Aureus y Pseudomona Aeruginosa.Loscultivossecolocanenunasolucindel desinfectantealaconcentracinrecomendadaporel fabricante y se deja all por 10 minutos a 20C. Luego se transfieren a un medio que permitir el desarrollo de las bacteriassobrevivientes.Laeficaciadeldesinfectante puededeterminarsemediantelacantidaddecultivosque crecen. Mtodo de Difusin en Disco El MDD se utiliza en laboratorios de prctica para evaluar la eficacia de un agente qumico. Un disco de papel filtro se impregna con una sustancia qumica y se coloca sobre una placa de agar previamente inoculado con el microrganismo de prueba.Silasustanciaqumicaeseficazdespusdela incubacinsepuedeobservarunhaloquerepresentala inhibicindelcrecimientoalrededordeldisco,comouna zona clara. MATERIAL 4 cajas de Petri estriles Tubos de ensaye con discos de papel filtro 2 cajas de Petri con Agar Nutritivo (AN) Mechero Asa y porta asa Maskin tape Fenol al 5% Alcohol al 70% Lugol al 5% Detergente Pinzas sin dientes Cepas Bacillus Subtilis Staphylococcus Aureus MTODO En cada una de las cajas de Petri estriles, se pondr suficiente cantidad de las soluciones. Se tomar una asada de una cepa y se inocular por la tcnicadebarridoenelagarnutritivo.Repetirlos mismos pasos para la otra cepa. Losdiscosdepapelfiltrosesumergenenlas soluciones,conayudadelaspinzas,previamente flameadas Losdiscosconcadaunodelosdesinfectantes,son colocados en los medios de cultivo, de manera separada y presionando para que queden bien fijos a la superficie del medio. Incubar a 37C por 24 horas. Leer(enmilmetros)elgradodeinhibicinyhacer conclusiones. CUESTIONARIO 1. Culeslaaccindelaluzultravioletasobreel material gentico de las bacterias? 2. Cules son los riesgos del uso de la luz ultravioleta? 3. Cules son los principales agentes qumicos utilizados en los hospitales? 4. Silapasteurizacinnologralaesterilizacin,Por qu los alimentos se tratan por pasteurizacin? 5. Mencione cinco factores que deban considerarse antes de seleccionar un desinfectante. 6. Indiqueelmecanismodeaccinyalmenosunuso habitualdecadaunodelossiguientestiposde desinfectantes: a) Yodo b) Cloro c) Alcohol d) Derivados fenlicos 7. Cmo es el mecanismo de accin de los detergentes? ANTIBIOGRAMA Objetivo: Estudiar la accin de los antibiticos in vitro para conocer la sensibilidad bacteriana. Conocer pruebas para una mejor seleccin de antibiticos. Tcnica e interpretacin de un antibiograma. Introduccin: Los antibiticos difieren de los desinfectantes corrientes, porque muestran una toxicidad selectiva para los microrganismos patgenos, sin causar graves daos a la mayora de las clulas de los tejidos. Algunos antibiticos son efectivos contra un nmero mas o menos importante de organismos patgenos; mientras que otros conocidos como antibiticos de amplio espectro, actan sobre una gama extensa de diferentes microrganismos patgenos. Cuando el mdico reconoce por primera vez a un paciente con enfermedad infecciosa, puede prescribir de momento un antibitico, escogiendo el que parece ms indicado para el cuadro clnico. Es de desear, por lo tanto, que se obtengan muestras adecuadas del paciente antes de administrar el medicamento y enviar a l laboratorio de bacteriologa para identificar el microrganismo responsable. Una vez aislado ste, debe comprobarse la sensibilidad a todos los antibiticos comunes y otros agentes antimicrobianos. El resultado final orienta al mdico respecto al tratamiento adecuado. En pacientes con infecciones subagudas o crnicas que requieren una terapia antimicrobiana continuada, es importante que las pruebas de sensibilidad se realicen sobre las bacterias del paciente, aisladas a intervalos frecuentes durante el curso de la enfermedad, para poder descubrir la aparicin de cepas que se hubieran vuelto resistentes a los antibiticos utilizados, en cuyo caso se debern sustituir por un antibitico diferente o una combinacin de antibiticos. En base a lo sealado anteriormente podemos decir que un antibitico es una sustancia qumica derivada de un origen vivo, que es capaz de inhibir, o incluso destruir el crecimiento de microrganismos. La seleccin racional de las drogas antimicrobianas depende de; a) Diagnstico b) Pruebas de sensibilidad c) Titulacin de la actividad bactericida en suero Las pruebas de laboratorio para determinar la sensibilidad a los antibiticos se encuentran indicadas en las siguientes circunstancias; 1) Cuando el microrganismo aislado es frecuentemente resistente a las drogas antimicrobianas (por ejemplo bacterias entricas gram negativas) 2) Cuando un proceso infeccioso es grave y parece ser mortal a menos que sea tratado especficamente (por ejemplo, meningitis, septicemia) 3) En ciertas infecciones en que la erradicacinde los organismos infecciosos requiere de drogas que sean rpidamente bactericidas y no solamente bacteriostticas (por ejemplo endocarditis bacteriana, osteomielitis aguda) Existen dos mtodos ms empleados para efectuar esta prueba y son: I) De dilucin en tubo II)De los discos de papel filtro En esta prctica emplearemos el segundo. Hoy en da el antibiograma es una prueba que podemos decir de rutina, en los lugares de atencin medica, por lo que es importante enfatizar que las condiciones bajo las cuales los grmenes se enfrentan a los antibiticos in vitro, son muy diferentes a las que existen en el paciente. Material: CEPAS. E. coli Staphylococcus aureus 2 cajas de agar nutritivo Equipos de unidiscos (para gram + y gram -) 6 discos de papel filtro conteniendo diferentes tipos de antibiticos Pinzas de diseccin Mechero Asa bacteriolgica Desarrollo: -En cada una de las cajas de agar nutritivo sembrar una con E. coli y la otra con S. aureus, abundantemente, por la tcnica de estra cerrada (barrido). Prxima a la flama del mechero. -Colocar con las pinzas los discos conteniendo los diferentes tipos de antibiticos, previamente flameadas, sobre las cajas sembradas. -Procurar que los discos queden bien separados unos de otros y de las paredes de las cojas de cultivo. Cualquier duda consultar con su profesor de mesa. -Hacer lo mismo en la otra caja -Incubar 24 horas a 37C Resultados: Con una regla graduada en milmetros, medir el dimetro de las zonas claras que rodean a los discos, en la ase de cada caja anotar con el marcador que tipo de antibitico tiene cada uno de los discos, para obtener una buena lectura. Y por lo tanto saber a que es ms sensible la bacteria empleada en la prctica, as como los antibiticos de segunda eleccin. Cuestionario: -Defina antibitico -Defina antibiograma -Enuncie 5 antibiticos para grmenes gram positivos -Enuncie 5 antibiticos para grmenes gram negativos -Enuncie cuales son las indicaciones para efectuar un antibiograma -En cada una de sus cajas que antibitico es el de primera eleccin, para E. coli y S. aureus -Cuales son los peligros de uso indiscriminado de antibiticos -Esta indicado el uso de combinaciones de antibiticos, fundamente su respuesta -Explicar las limitaciones actuales de la terapia antibitica MICROORGANISMOS PATGENOS Y ENFERMEDAD Larelacinetiolgicaentremicroorganismosyenfermedad infecciosafuesospechadaantesdesudescubrimientopor Leeuwenhoek,yporotrosautoresseconfirmporejemplo por Jenner por medio de la vacunacin. Fue solo a mediados del siglo XIX cuando esta idea empez a cristalizar en conocimientos gracias al desarrollo paralelo de los estudios como la transmisin del carbunco por sangre infectada, lograda por Brauell, y el reconocimientode la similitudentreelprocesofermentativoylasepsis,que brindolabasedelacirugaantispticadeLister culminandoenlademostracinporKochdeetiologa microbianadelcarbunco.Explotandosustcnicasde cultivospurosyaplicndolaadiversasenfermedades,la etiologa de muchas de ellas vino a aclararse desplazando ladoctrinahipocrticadeldesequilibriodeloscuatro humoresorgnicos,descritosas;SANGRE,FLEMAS,BILIS AMARILLA Y BILIS NEGRA, como la base de las enfermedades. Una cosa es sospechar, o incluso comprobar la capacidad de losmicroorganismosparaproducirenfermedad,yotraes obtenerlapruebaseguradeunarelacinetiolgica especficaentremicroorganismoyunaenfermedad determinada. POSTULADO DE KOCH Lapruebaaloquesesealanteriormentefuebrindada experimentalmente por Koch, en forma de una cadena de datos experimentalesgeneralmenteconocidoscomopostuladosde Koch (aunque no se ha comprobado que as los formulara el propio Koch). Cuatro de tales postulados fueron antes que el quinto que fuesugeridountiempodespus,aunquenotodoresulte aplicable. Losinvestigadoresqueencontraronnuevosmicroorganismos en casos de infeccin humana no siempre pudieron seguir con rigor los postulados enunciados por Koch para demostrar la relacin de los microbios que estudiaban con la causa de la enfermedad. Primer postulado: El germen que produce la enfermedad debe descubrirseentodosloscasosobservadosdeuna enfermedaddeterminada,enrelacinpatolgicaconsus sntomas y lesiones. Segundo postulado: El germen debe aislarse de las vctimas delaenfermedadencultivopuroparaelestudiode laboratorio. Tercerpostulado:Cuandoelcultivopuroseinoculaaun animalsusceptibleposiblementeelhombredebereproducir laenfermedadocomomodificacinposterior,originar anticuerpos especficos en el nuevo husped. Cuartopostulado:Elorganismodebepoderseaislaren cultivopurodetalesinfeccionescausadas experimentalmente. Quinto postulado: Obtener exotoxinas bacterianas inoculadas enanimalesenexperimentacinyestudiodelcuadro clnico. La aparicin de enfermedades infecciosas es un fenmeno muy complejoqueinvolucraalgomsquelanaturalezaylas propiedades de los microbios, pero es muy posible que las discrepancias observadas hasta ahora sean en parte debidas a una simplificacin exagerada de su etiologa microbiana. MATERIAL Ratones Jeringas estriles Mechero Colorantes de Gram Asa y porta-asa bacteriolgica Solucin salina estril CEPAS E. Coli enteropatgena o Salmonella typhy MEDIOS DE CULTIVO Citrato de Simons Caldo de urea Manitol rojo de fenol EMB Gelosa simple Verde Brillante TSI o Kliger LIA SIM DESARROLLO: Limpiar el rea abdominal de un ratn, e inocular por va intraperitoneal1mLdeunasuspensindelmicroorganismo proporcionado. Sepuedetenerunratndecontrol,inoculandoporva intraperitoneal 1mL de agua destilada estril. Realizarlaobservacinmicroscpicadelacepa proporcionada teida por la tcnica de Gram. Si se efecta el de control, marcarlos y guardarlos en las cajas correspondientes. Sedebenrealizardiariamenteobservacionesanotandolas anomalas que se presentan en el transcurso de la semana, posterior a la inoculacin. AislarlacepadelosmediosEMB,GelosasimpleyVB, ademssembrarenlaspruebasbioqumicasproporcionadas. Incubar e interpretar los resultados (24-48 h/37C). PARTE2:AISLAMIENTODELMICROORGANISMOINOCULADOALOS RATONES Anestesiar al animal, limpiar bien el rea abdominal, y por puncin aspirar 2 mL de lquido peritoneal, y colocarlos en un tubo conteniendo solucin salina estril, homogenizar y hacer un frotis, teirlo por la tcnica de Gram (se puede inocularalratnprimeramentelasolucinsalinay posteriormente aspirar, para despus efectuar el frotis). Hacer un aislamiento en los medios de cultivo e inocular a 37C por 24-48 horas.Observacindelascaractersticascolonialesy microscpicasdelosmicroorganismosrecuperadosdelos animales inoculados. Anotarlamorfologacolonialobtenidaenlosdiferentes mediosdecultivoylosresultadosdelaspruebas bioqumicas, compara los resultados de las dos sesiones. Realizar laobservacin delamorfologa microscpica por medio de la tincin de Gram. Anote sus resultados. CUESTIONARIO 1. Qu importancia tienen los postulados de Koch? 2. Culessonlascaractersticasbioqumicasms importantes del germen empleado en la prctica? 3. Qu otros factores determinan las caractersticas de las enfermedades infecciosas? 4. Defina etiologa microbiana. REACCIONES DE PRECIPITACION EN GEL (OUCHTERLONY) Objetivo Efectuar una reaccin de precipitacin por medio de pruebas inmunolgicas de laboratorio. Introduccin Uno de los principales retos de la ciencia mdica moderna eslatraduccindelosadelantosbsicosdela inmunoquimicaylainmunobiologiaenprocedimientode diagnsticoyteraputicaqueserndeutilidadenla prctica de lamedicina clnica. Laspruebasinmunolgicasdelaboratorio(delasque efectuaremos en algunas prcticas posteriores) son de gran utilidadparaeldiagnsticoyeltratamientodelos trastorno clnicos, as como del mejor entendimiento de la patogeniadelasenfermedadescomolainvestigacin cientfica bsica en inmunologa.La inte