manual NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina # ...LIBRARY PREPARATION NEB #E7760S/L, #E7765S/L be 24/96 reactions 英語版マニュアルVersion 3.1 5/20 に対応 NEBNext®

LIBRARY PREPARATION

NEB #E7760S/L, #E7765S/L 24/96 reactions 英語版マニュアル Version 3.1 5/20に対応

NEBNext® Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®

日本語マニュアル

be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

本日本語版マニュアルは、オリジナル英語マニュアル Version 3.1_5/20に基づいて作成しています。製品のご使用にあたり、必ずウェブサイト製品ページより最新の英語マニュアルをご確認ください（https://www.nebj.jp/products/detail/2037）。

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目次：キットの他に別途準備が必要なもの . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

RNA-seqライブラリー調製方法の選択方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

NEBNext Ultra II Directional RNA製品の選択ガイド . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

プロトコール　Section 1 　NEBNext Poly（A） mRNA Magnetic Isolation Moduleを併用したプロトコール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

　Section 2 　NEBNext rRNA Depletion Kit（Human/Mouse/Rat）を併用したプロトコール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

　Section 3 　 FFPE RNAサンプルでの NEBNext rRNA Depletion Kit（Human/Mouse/Rat）を併用したプロトコール . . . . . . 25

　Section 4 　精製済mRNAまたは rRNA除去済サンプルからのプロトコール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

　Section 5 　rRNA除去済 FFPE RNAサンプルからのプロトコール . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

　Section 6 　Appendix A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

　Section 7 　トラブルシューティングガイド . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

キットの構成品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57改定履歴 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina

本日本語版マニュアルは、オリジナル英語マニュアル Version 3.1_5/20に基づいて作成しています。製品のご使用にあたり、必ずウェブサイト製品ページより最新の英語マニュアルをご確認ください（https://www.nebj.jp/products/detail/2037）。

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ライブラリーキットの内容：キットには最大 24反応（NEB #E7760S/#E7765S）および 96反応（NEB #E7760L/#E7765L）の調製に十分な液量の試薬が含まれている。

Package 1：–20℃で保存

•（藤色）NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer •（藤色）Random Primers •（藤色）NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix •（茶色）NEBNext Strand Specificity Reagent •（橙色）NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix •（橙色）NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP Mix(10X) •（緑色）NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix •（緑色）NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer •（赤色）NEBNext Ultra II Ligation Master Mix •（赤色）NEBNext Ligation Enhancer •（青色）NEBNext USER ™ Enzyme •（青色）NEBNext Ultra II Q5 Master Mix NEBNext Adaptor Dilution Buffer

（0.1X）TE Buffer

ヌクレアーゼフリー水

Package 2：室温保存。凍結しないこと。NEBNext Sample Purification Beads

この製品は、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads（NEB#E7765）にのみ含まれる。

キットの他に別途準備が必要なもの：• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E7335、#E7500、#E7710、#E7730、#E6609、#E7600、#E7780、#E6440、#E6442、

#E6444、#E6446）

• マグネットラック／スタンド（参考製品：NEB #S1515S）

• 80％エタノール（用事調製）

• サーマルサイクラー• 0.2 ml PCRチューブ（サーマルサイクラー推奨のものを使用）

• Agilent® Bioanalyzer®や TapeStationなどの DNA/RNA定性解析装置およびチップ

NEB #E7760キットのみ必要なもの：• SPRIselect® Reagent Kit（Beckman Coulter, Inc. #B23317）または AMPure® XP Beads（Beckman Coulter, Inc. #A63881） ※ NEB #E7765キットには、Sample Purification Beads（NEB #E7767）が含まれる。

NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB#E7490）との併用時に必要なもの：• 96-well 0.2 ml PCRプレートおよびMicroseal® 'B' Adhesive Sealer（BioRad MSB-1001）、または

0.2 ml RNase-freeチューブ• 1.5 ml遠心チューブおよびマグネットスタンド（参考製品 NEB #S1506、ビーズの洗浄で使用）

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RNA-seqライブラリー調製方法の選択方法：RNAライブラリー調製方法は、シーケンスの目的と RNAサンプルの品質に基づいて選択する。細胞内トータルRNAの大部分はリボソーム RNA（rRNA）であり、多くの場合、rRNAはシーケンス対象外であるため、これを除去する必要がある。一般的に 2つの rRNA除去方法がある。1つ目の方法は真核生物のmRNAのポリ Aテールに結合するオリゴ dTビーズを使用してポリ A-mRNAを濃縮する方法、もう一つは、rRNA特異的プローブを使用してrRNAを除去する方法である。NEBでは、1つ目の方法のために NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module （NEB #E7490）を、2つ目の方法のために NEBNext rRNA Depletion Kit（Human/Mouse/Rat）（NEB #E6310）*を提供している。

オリゴ dT法では、ポリ Aテールを持つmRNAのみが濃縮される。ノンコーディング RNAや欠損mRNAなど、ポリ A テールのない RNAはビーズに結合しない。また、一部の生物（例：原核生物）または分解した RNA（例：FFPE RNA）由来のmRNAには、ポリ Aテールがないので、オリゴ dTビーズに補足されず、除去される。一方、プローブベースの rRNA depletion kitは、ターゲットのリボソーム RNAだけを除去、分解が進んだmRNAや非ポリ A-mRNAは保持されることに加えて、ノンコーディング RNAやmRNAなどの生物学的に関連する他の細胞内 RNAも保持される。

ライブラリー調製プロトコールを決定する際は、rRNA除去方法（前処理方法）に加えて、RNAサンプルの品質も考慮する必要がある。RNAの分解によりmRNA分子からポリ Aテールが失われるため、NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Moduleを使用する場合は、高品質の RNAサンプル（RIN >7）でのみ使用する。部分的に分解したサンプルまたは著しく分解したサンプル（RIN ≤ 7、FFPE RNAなど）の場合、NEBNext rRNA Depletion Kitを使用する。トータル RNAからmRNA濃縮または rRNAの除去を行わないライブラリー調製において、高品質 RNA（RIN >7）の場合は Section 4を参照、分解または FFPE RNA（RIN

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NEBNext Ultra II Directional RNA製品の選択ガイド：ライブラリー調製キット・製品は、プロジェクトの目標と RNAサンプルの品質に基づいて選択する必要がある。細胞内トータル RNAは主に rRNAで構成されており、多くの場合、rRNAは重要なものではない。rRNAは、2つの一般的な方法のいずれかにより、細胞内トータル RNAから除去できる。

1）真核生物のmRNAのポリ（A）テールに結合するオリゴ dTビーズを使用して、ポリ A-mRNAを精製する方法。NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB #E7490）を使用する。

2） rRNA特異的プローブを使用して rRNAを除去する方法。NEBNext rRNA Depletion Kit（ヒト／マウス／ラット用：NEB #E6310、E7400、E7750E、バクテリア用：E7850）を使用する。

図 1：NEBNext Ultra II Directional RNA製品の選択ガイド

NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB #E7490)

NEBNext rRNA Depletion Kit

(NEB #E6310)**

Total RNA


(NEB #E6310)**

FFPE RNAPoly(A)-enrichedor rRNA-depleted

RNA

rRNA-depletedFFPE RNA*

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7760)

Choose from one of the following:• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) (12 indices – NEB #E7335)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 2) (12 indices – NEB #E7500)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 3) (12 indices – NEB #E7710)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 4) (12 indices – NEB #E7730)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Index Primers) (NEB #E6609)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1) (NEB #E7600)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 2) (NEB #E7780)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) (NEB#E6440)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 2) (NEB#E6442)• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 3)（NEB#E6444）• NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 4)（NEB#E6446）

インプットRNAの種類

* rRNA 除去が必要でない場合、トータル FFPE RNA を使用してライブラリー調製をする。** 2020 年 8 月現在、新バージョンの E7400 を販売中。またバクテリア用 rRNA 除去キットなども販売中。詳細はウェブサイト（www.nebj.jp）を参照。

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プロトコール選択ガイド：以下の表を使用して、本マニュアルで最も適切なプロトコールを決定すること。本マニュアルのすべてのセクションには、出発材料に基づいて異なるプロトコールが含まれている。詳細については、各セクションの始めに記載されている。実験を開始する前に、RNAサンプルの推奨事項とインプット量の要件を確認すること。

図 2：NEBNext Ultra II Directional RNAプロトコール選択ガイド

Chapter 1 Chapter 2

Total RNA

Chapter 3

FFPE RNA

Chapter 5Chapter 4

Poly(A)-enrichedor rRNA-depleted

RNA

rRNA-depletedFFPE RNA*

RNA断片化（サンプルによっては必要なし）

第 1鎖 cDNA合成

第 2鎖 cDNA合成

エンドリペア /dAテーリング

アダプターライゲーション

USER酵素処理（アダプターの開環と第 2鎖 cDNAの分解）

PCRライブラリー増幅

インプットRNAの種類

推奨プロトコール

NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB #E7490)

Poly(A) mRNA isolation using:


(NEB #E6310)**

rRNA depletion using:


(NEB #E6310)**

rRNA depletionusing:

* rRNA 除去が必要でない場合、トータル FFPE RNA を使用してライブラリー調製をする。** 2020 年 8 月現在、新バージョンの E7400 を販売中。またバクテリア用 rRNA 除去キットなども販売中。詳細はウェブサイト（www.nebj.jp）を参照。

概要：NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kitには、イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリーを調製するために必要な酵素とバッファーが含まれている。様々なインプット量の RNAから高品質なディレクショナル（鎖特異的）ライブラリーを調製できる。また、迅速かつユーザーフレンドリーなワークフローによりハンズオン時間が最小限に短縮されており、poly（A）mRNAの濃縮法および rRNA除去法と互換性がある。

キットの各構成品は厳格な品質管理基準に適合していることが必要であり、各ロットについてはそれぞれ、試薬セット全体の機能的なバリデーションとして、ライブラリー調製およびイルミナシーケンスプラットフォーム上でのシーケンスが行われている。

より大容量の試薬が必要な場合には、カスタム包装およびバルク包装の製品を NEBの OEM/Bulks部門から購入できる（問い合わせ先：[email protected]）。

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Section 1 NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB #E7490）を併用したプロトコール記号

! プロトコール中で本記号が付いたステップでは、複数の方法から 1つを選択する。選択すべき方法はインプット RNA量などにより異なる。

SAFESTOPSAFESTOP プロトコールの一時停止可能なポイント。

• 行頭記号の色は、反応に使用する試薬のキャップの色を示す。本プロトコールは、Universal Human Reference Total RNAを使用して最適化されている。

RNAサンプルについてRNAの品質RNAサンプルを Agilent Bioanalyzer® RNA 6000 Nano/Picoチップで泳動して、インプット RNAの品質を評価する。PolyA mRNA精製では、RIN値が 7を超える高品質 RNAが必要である。

RNAサンプル調製のポイントRNAサンプルには、塩類（Mg2+、グアニジニウム塩、2価のカチオンキレート剤（EDTA、EGTAなど）、有機物（フェノール、エタノールなど）を含まないようにする。また、RNAサンプルには DNAを含まないようにする。DNAが夾雑していてもそこからライブラリーが調製されることはほとんどないが、吸光度計で RNA定量をした際にDNA濃度が加算して測定されるため、PCRサイクル数が正しく設定できず、ライブラリー調製効率の低下を招くためである。特にゲノム DNA（gDNA）は、RNA抽出時に夾雑することが多い。有機溶媒抽出での中間層を採取した場合、または固相式のシリカマトリックスでの RNA抽出時にオーバーロードした場合に、gDNAが夾雑する可能性がある。トータル RNAサンプルに gDNAが含まれている可能性がある場合は、サンプルを DNase I（別途準備、#M0303など）で処理して gDNAを除去する。この際、DNase Iが残存していた場合、mRNA精製に使用するオリゴ dTを分解する恐れがあるので、DNase I処理後はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿などで除去・精製をする。

インプット RNA量1本鎖 RNA特異的な定量機器（Qubit®フルオロメーターなど）で定量するとよい。また Bioanalyzerで RIN >7であることを確認する。さらに DNAフリーであることを確認して、10 ng～ 1 µgのトータル RNAを用いる。なお本セクションでは RNAを約 200 basesに断片化してライブラリー調製を行うプロトコールを記載している。さらに長いインサートサイズのライブラリーを調製する場合は、断片化時間とサイズセレクション条件を変更する。変更条件については Appendix A（Section 6）を参照すること。特に明記が無い場合、すべてのバッファーを氷上に置いておくこと。

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1.1. ! First Strand Reaction Bufferと Random Primer Mixの調製1.1.1. 以下の手順で、ヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに First Strand Reaction Bufferと Random

Primer Mix（2X）を入れて調製する。

試薬 1サンプルあたりの液量

•（藤色）NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer 8 µl

•（藤色）Random Primers 2 µl

ヌクレアーゼフリー水 10 µl

全液量 20 µl

本ミックスは mRNA精製後に使用する。プロトコールの後半でも調製できるが、ステップ 1.2.36.の溶出前に準備しておくことが重要である。

1.1.2. 10回ピペッティングして完全に混合する。注意：mRNA精製後の使用時まで、本ミックスを氷上で保管すること。ステップ 1.2.36.および 1.2.39.で

使用する。

1.2. トータル RNAからのmRNA精製、断片化およびプライミング1.2.1. トータル RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈し、0.2 mlのヌクレアーゼフリー PCRチューブ内で最終

容量を 50 µlとし、氷上で保管する。1.2.2. 1.5 ml容のヌクレアーゼフリーチューブ中、以下試薬でオリゴ dTビーズを洗浄する。複数のライブラ

リーを調製する場合、最大 10サンプル用のビーズを 1本の 1.5 mlチューブに加えてまとめて洗浄できる（1.5 mlのチューブには専用のマグネットスタンド：NEB #S1506など、を使用する）。本ステップでビーズのバッファーを Storage Bufferから Binding Bufferに置換する。2X Binding Bufferを事前に希釈する必要はない。

試薬 1サンプルあたりの液量

Oligo dT Beads d（T）25 20 µl

RNA Binding Buffer（2X） 100 µl

全液量 120 µl

1.2.3. ピペッティングを 6回行ってビーズを洗浄する。1.2.4. チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明になるまで室温でインキュベーションする（約

2分間）。

1.2.5. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。1.2.6. チューブをマグネットスタンドから取り出す。1.2.7. RNA Binding Buffer（2X）100 µlをビーズに添加し、ピペッティングを 6回行って洗浄する。複数のライ

ブラリーを調製する場合には、1サンプルあたり RNA Binding Buffer（2X）100 µlを添加する。Binding Bufferを希釈する必要はない。

1.2.8. チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明になるまで室温でインキュベーションする（約2分間）。

1.2.9. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。1.2.10. RNA Binding Buffer（2X）50 µlをビーズに添加し、ビーズが均一になるまでピペッティングを行って混合

する。複数のライブラリーを調製する場合には、1サンプルあたり RNA Binding Buffer（2X）50 µlを添加する。続く 1回目の結合・洗浄ステップで、ノンターゲット RNAの大半が除去される。

1.2.11. ステップ 1.2.1で調製した各 RNAサンプルにビーズ 50 µlを添加する。ピペッティングを 6回行って、ビーズを十分に混合する。

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1.2.12. チューブをサーマルサイクラーにセットし、蓋を閉める。RNAを変性させmRNAがビーズに結合しやすくするために、Heat lidを 75℃以上に設定してサンプルを 65℃で 5分間インキュベートした後、4℃に冷却する。

1.2.13. 温度が 4℃に達したら、チューブをサーマルサイクラーから取り出す。1.2.14. ピペッティングを 6回行って、ビーズを十分に混合する。チューブを実験台に置き、mRNAがビーズに

結合できるように室温で 5分間インキュベーションする。1.2.15. 溶液が透明になるまでマグネットスタンドにチューブを静置する（約 2分間）。1.2.16. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。1.2.17. チューブをマグネットスタンドから取り出す。1.2.18. チューブにWash Buffer 200 µlを添加、6回ピペッティングして十分に混合する。ここでビーズを洗浄し、

ビーズに結合していない RNAを除去する。1.2.19. 溶液が透明になるまでマグネットスタンドにチューブを静置する（約 2分間）。1.2.20. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。1.2.21. チューブをマグネットスタンドから取り出す。1.2.22. ステップ 1.2.18.～ 1.2.21.を繰り返す。1.2.23. 各チューブに 50 µlの Tris Buffer（NEB #E7490に付属）を添加する。静かに 6回ピペッティングし、ビーズ

を十分に混合する。1.2.24. チューブをサーマルサイクラーにセットする。蓋を閉め、Heat lidを 90℃以上に設定し、サンプルを

80℃で 2分間インキュベートした後、25℃に冷却する。この工程でビーズからのmRNAが溶出される（1回目）。

1.2.25. 温度が 25℃に下がったら、チューブをサーマルサイクラーから取り出す。1.2.26. サンプルに RNA Binding Buffer（2X）50 µlを加え、mRNAをビーズに再結合させる。ピペッティングを

穏やかに 6回行って、ビーズを十分に混合する。1.2.27. チューブを室温で 5分間インキュベーションする。1.2.28. 溶液が透明になるまでマグネットスタンドにチューブを静置する（約 2分間）。1.2.29. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。1.2.30. チューブをマグネットラックから取り出す。1.2.31. Wash Buffer 200 µlを加えてビーズを洗浄する。穏やかに 6回ピペッティングし、十分に混合する。1.2.32. チューブをスピンダウンする。注意：Wash Bufferを後のステップに持ち越さないように、チューブをスピンダウンすることが重要で

ある。

1.2.33. 溶液が透明になるまでマグネットスタンドにチューブを静置する（約 2分間）。1.2.34. 上清を廃棄する。ビーズには触れないように注意する。注意：後のステップでmRNAの断片化を成功させるためには、上清を完全に破棄することが重要である。

チューブをスピンダウン、マグネットラックに設置し、10 µlのピペットチップを使用して上清の洗浄バッファーを完全に除去する（注意：mRNAを含むビーズには触れないように注意する）。この間、ビーズが乾燥しないようにすること。

1.2.35. チューブをマグネットスタンドから取り出す。 ! 注意：以降には 200 ntの RNA断片化方法を記す。200 ntより大きい RNAインサートを調製したい場合、

Section 6（Appendix A）にあるステップ 1.2.37.の推奨断片化時間を参照する。

1.2.36. ステップ 1.1.2.で調製した First Strand Synthesis Reaction Bufferと Random Primerのミックス（2X）を11.5 µl添加し、6回ピペッティングしてビーズを再懸濁する。ここでビーズから mRNAが最終溶出される。

9

1.2.37. サーマルサイクラーの Heat lidを 105℃に設定、以下の条件でインキュベーションする。　94℃、15分間

　4℃、保持 * 　* チューブが取り扱える温度（約 65℃）になり次第、チューブを氷上に移して 1分間静置する。

1.2.38. チューブをスピンダウン、すぐにマグネットスタンドに置き、溶液が透明になるまで静置する（約 1～2分間）。

1.2.39. 上清 10 µlを 0.2 mlのヌクレアーゼフリー PCRチューブに移す。これが断片化 RNAである。注意 1：回収した上清の容量が 10 µl未満である場合には、10 µlになるようにステップ 1.1.2.で調製し

た First Strand Synthesis Reaction Bufferと Random Primerの混合液（2X）を添加し、実験を続ける。注意 2：磁気ビーズを持ち込まないこと。

1.2.40. チューブを氷上に置き、第 1鎖 cDNA合成に進む。

1.3. 第 1鎖 cDNA合成

1.3.1. ステップ 1.2.40.で断片化とプライミングした RNAに以下の試薬を氷上で添加する。

第 1鎖 cDNA合成反応 1サンプルあたりの液量

断片化、プライミング済 RNA（ステップ 1.2.40.） 10 µl

•（茶色）NEBNext Strand Specificity Reagent 8 µl

•（藤色）NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix 2 µl全液量 20 µl

1.3.2. 10回以上ピペッティングして十分に混合する。 !1.3.3. サーマルサイクラーの Heat lidを 80℃以上に設定、以下の条件でインキュベーションする。注意：200 nt以上の RNAライブラリー調製を行う場合（Appendix Aの推奨事項に従っている場合）、以下

のステップ 2にある 42℃でのインキュベーション時間を 15分間から 50分間に延長する。

　ステップ 1：25℃、10分間　ステップ 2：42℃、15分間　ステップ 3：70℃、15分間　ステップ 4：4℃、保持1.3.4. すぐに第 2鎖 cDNA合成に進む。


1.4.1. ステップ 1.3.4.で調製した第 1鎖 cDNA合成産物に以下の試薬を氷上で添加し、第 2鎖 cDNA合成反応を行う。


第 1鎖 cDNA合成産物（ステップ 1.3.4.） 20 µl

•（橙色） NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP Mix (10X)

8 µl

•（橙色）NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix 4 µlヌクレアーゼフリー水 48 µl

全液量 80 µl

10

1.4.2. チューブを氷上に置いたままで、10回以上ピペッティングして十分に混合する。1.4.3. サーマルサイクラーの Heat lidを 40℃以下（またはオフ）に設定し、16℃、1時間インキュベーションする。

1.5. 2本鎖 cDNAの精製1.5.1. SPRIselect Beadsまたは NEBNext Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁する。1.5.2. 再懸濁したビーズ 144 µl（1.8X）を第 2鎖 cDNA合成反応産物（約 80 µl）に添加する。ボルテックスミキ

サーまたはピペッティング（10回以上）で十分に混合する。1.5.3. 5分間以上、室温でインキュベーションする。1.5.4. チューブをスピンダウンした後、マグネットスタンド上に設置する。溶液が透明（約 5分間）になったら、

上清を注意深く破棄する。ビーズには cDNAが結合しているため、触れないように注意する（注意：ビーズは捨てないこと）。

1.5.5. マグネットスタンド内にチューブを設置したまま、80％エタノール 200 µl（用時調製）を添加する。室温で 30秒間インキュベーションし、上清を注意深く破棄する。

1.5.6. ステップ 1.5.5.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。1.5.7. チューブをスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置する。必要に応じて、p10ピペットチップ

で微量のエタノールを除去する。マグネットスタンド上に設置した状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。

注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット DNAの回収率が低下する可能性がある。目に見える液体はすべて蒸発しているが、ビーズが暗褐色で光沢を有する時点でサンプルを溶出させる。ビーズが淡褐色に変化し亀裂が生じ始めると過乾燥である。

1.5.8. チューブをマグネットスタンドから取り出す。ビーズに53 µlの0.1 X TE（キットに付属）を添加して、ターゲット DNAを溶出する。ボルテックスミキサーまたはピペッティング（10回以上）で十分に混合する。チューブをスピンダウンし、室温で 2分間インキュベーションする。チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明（約 5分間）になるまで静置しておく。

1.5.9. ビーズに触れないよう上清の 50 µlを新しいヌクレアーゼフリー PCRチューブに移す。 SAFESTOPSAFESTOP

注意：一時中断可能。サンプルは –20℃で保存する。

1.6. cDNAライブラリーのエンドプレップ（末端処理）1.6.1. 滅菌済みヌクレアーゼフリーチューブに以下の構成品を添加する。

エンドプレップ反応 1サンプルあたりの液量


•（緑色）NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 7 µl

•（緑色）NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 3 µl全液量 60 µl

1.6.2. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 50 µlにセットし、10回以上ピペッティングして完全に混合する。スピンダウンして全溶液をチューブの底に落とす。

注意：十分に混合することが重要である。少量の気泡が存在しても反応には影響しない。

1.6.3. Heat lidを75℃以上に設定したサーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下のプログラムを実行する。　20℃、30分間

　65℃、30分間

　4℃、保持

1.6.4. すぐにアダプターライゲーションに進む。

11

1.7. アダプターライゲーション !

1.7.1. ライゲーション反応を実施する前に •（赤色）NEBNext Adaptor*を氷冷した Adaptor Dilution Bufferで希釈する。希釈した NEBNext Adaptorは氷上に置いておく。

トータル RNAインプット量希釈率

1,000 ng～ 250 ng Adaptor Dilution Bufferで 5倍希釈

249 ng～ 100 ng Adaptor Dilution Bufferで 25倍希釈


* NEBNextアダプターは、別売の NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E7335、#E7500、#E7710、#E7730、#E6609、#E7600、#E7780、#E6440、#E6442、#E6444、#E6446）に含まれる。

1.7.2. 氷上にて、以下の試薬をエンドプレップ反応液に追添加する。アダプターは最後に添加すること。アダプターライゲーション反応 1サンプルあたりの液量

エンドプレップ反応液（ステップ 1.6.4.） 60 µl

希釈アダプター（ステップ 1.7.1.） 2.5 µl

•（赤色）NEBNext Ligation Enhancer 1 µl

•（赤色）NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µl全液量 93.5 µl

Ligation Master Mixおよび Ligation Enhancerは事前に混合しておくことが可能であり、混合物は 4℃で 8時間以上安定である。アダプターの事前混合は避け、必ず最後に添加する。

1.7.3. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 80 µlにセットし、10回以上ピペッティングして完全に混合する。スピンダウンによりチューブ内の側面から全液体を回収する。

! 注意：NEBNext Ultra II Ligation Master Mixは粘性が非常に高い。ライゲーション反応溶液の混合が不完

全であるとライゲーション効率が低下するため、十分に混合すること。少量の気泡が存在しても性能には影響しない。

1.7.4. Heat lidをオフにして、サーマルサイクラー内で 20℃で 15分間、インキュベーションする。

1.7.5. ライゲーション反応液に、•（青色）USER Enzyme 3 µlを追添加する。Total volumeは 96.5 µlになる。1.7.6 よく混合し、Heat lidを 45℃以上に設定したサーマルサイクラー内で、37℃で 15分間、インキュベーショ

ンする。1.7.7. すぐにアダプターライゲーション産物のクリーンアップに進む。

1.8. アダプターライゲーション産物のクリーンアップ ! 注意：200 nt以上のインサートを有するライブラリーのサイズセレクションを行う場合は、Appendix A

の Section 6. 1のサイズセレクションの推奨方法に従う。

1.8.1. 再懸濁した SPRIselect Beadsまたは NEBNext Sample Purification Beads 87 µl（0.9X）をライゲーション反応物に添加し、10回以上ピペッティングして十分に混合する。

1.8.2. サンプルを静置して、10分間、室温でインキュベーションする。

12

1.8.3. チューブを遠心機でスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置し、ビーズを上清から分離する。 5分後（または溶液が透明になったら）上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズにはターゲット DNAが結合しているため、触れないように注意する（注意：ビーズを廃棄しないこと）。なお、上清には目的サイズより小さい DNA（アダプターを含む）が残っている。

1.8.4. マグネットスタンド内にチューブを設置したまま、80％エタノール 200 µl（用時調製）を添加する。室温で 30秒間インキュベーションし、上清を注意深く除去し廃棄する。

1.8.5. ステップ 1.8.4.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。1.8.6. チューブをスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置する。1.8.7. 必要に応じて、p10ピペットチップで微量のエタノールを除去する。マグネットスタンド上に設置した

状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット DNAの回収率が低下する可能性がある。

目に見える液体はすべて蒸発しているが、ビーズが暗褐色で光沢を有する時点でサンプルを溶出させる。ビーズが淡褐色に変化し亀裂が生じ始めると過乾燥である。


1.8.9. ビーズに触れないよう上清の 15 µlを新しい PCRチューブに移し、PCR増幅に進む。 SAFESTOPSAFESTOP

注意：サンプルは –20℃で保存可能。

1.9. アダプター付加 DNAの PCR増幅 ! 注意：10 µMのプライマーを使用する。

! option A：NEBプライマー（Forward/Reverseプライマーが個別のチューブに含まれる）を使用する場合

は、ステップ 1.9.1A.に従う。 option B：NEBプレミックスプライマー（Forward/Reverseプライマーミックスが 1つのウェルに入って

いる）を使用する場合は、ステップ 1.9.1B.に従う。

1.9.1. 使用する index primerのタイプ（Separateまたは Combined）に基づいて PCR反応のセットアップを行う。1.9.1A. Forward/Reverseプライマーが個別のチューブに含まれている場合

PCR 1サンプルあたりの液量

アダプター付加 DNA（ステップ 1.8.9.） 15 µl

•（青色）NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlIndex（X）Primer/i7 Primer*, ** 5 µl

Universal PCR Primer/i5 Primer*, ** 5 µl

全液量 50 µl

* プライマーは、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E7335、#E7500、#E7710、#E7730、#E7600、#E7780）に含まれる。 Dual Index Primers（NEB#E7600、 #E7780）を使用する場合、製品マニュアルに有効なバーコードの組み合わせと PCR反応の設定が記載されている。

** 1反応あたり 1つの i7プライマーのみを使用する。 1反応あたり 1つの i5プライマーのみを使用する（Single index kit使用の場合は、キット付属の universal primerを使用）。

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1.9.1B. Forward/Reverseプライマーが 1つのチューブに含まれている場合（プレミックス）



•（青色）NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlIndex Primer Mix* 10 µl

全液量 50 µl

* プライマーは、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E6609、#E6440、#E6442、#E6444、#E6446）に含まれる。低プレックス時の有効なバーコードの組み合わせは、各製品マニュアルを参照する。

1.9.2. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 40 µlにセットし、10回以上ピペッティングして完全に混合して、スピンダウンする。

1.9.3. サーマルサイクラーにチューブをセットし、Heat lidを 105℃の設定で以下のサイクル条件を用いて PCRを行う（表 1.9.3Aおよび表 1.9.3Bを参照）。

表 1.9.3A：

サイクルステップ温度時間サイクル数

初期変性 98℃ 30秒間 1

変性 98℃ 10秒間8～ 16*, **

アニーリング／伸長 65℃ 75秒間

最終伸長 65℃ 5分間 1

保持 4℃ ∞

* PCRサイクル数は、インプット RNAの量に基づいて決定する（表 1.9.3B参照）。 ** 過剰増幅を避けるために PCRサイクル数を制限することが重要である。過剰増幅が生じた場合、Bioanalyzerの泳動で、1,000 bpくらいにセカンド

ピークが現れる（56ページ、図 7.2参照）。

表 1.9.3B：インプット RNA量に基づく推奨 PCRサイクル数

トータル RNAのインプット量推奨 PCRサイクル数

1,000 ng 8～ 9

100 ng 12～ 13

10 ng 15～ 16

注意：上記の PCRサイクル数は、高品質の Universal Human Reference Total RNAを用いた場合のサイクル数になるので、過剰増幅をさけるために、サンプルの品質に応じて PCRサイクル数の最適化が必要な場合がある。

1.10. PCR増幅産物のクリーンアップ1.10.1. SPRIselectまたは NEBNext Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁する。1.10.2. 再懸濁したビーズ 45 µl（0.9 X）を PCR反応産物（～ 50 µl）に添加する。ボルテックスミキサーでの撹拌

（3～ 5秒間）または 10回以上のピペッティングで十分に混合する。1.10.3. 5分間以上、室温でインキュベーションする。1.10.4. チューブをスピンダウンした後、マグネットスタンド上に設置し、ビーズを上清から分離する。溶液が

透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズにはターゲット DNAが結合しているため、触れないように注意する。

1.10.5. マグネットスタンド内にチューブまたはプレートを設置したまま、80％エタノール 200 µl（用時調製）を添加する。室温で 30秒間インキュベーションし、上清を注意深く除去し廃棄する。

1.10.6. ステップ 1.10.5.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。

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1.10.7. マグネットスタンド上に設置した状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット DNAの回収率が低下する可能性がある。


1.10.8. チューブまたはプレートをマグネットスタンドから取り出す。ビーズに 23 µlの 0.1 X TE（キットに付属）を添加して、ターゲット DNAを溶出する。ボルテックスミキサーで撹拌または 10回のピペッティングで十分に混合する。チューブをスピンダウンし、室温で 2分間インキュベーションする。チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明（約 5分間）になるまで静置しておく。

1.10.9. 上清の 20 µlを新しい PCRチューブに移し、–20℃で保存する。

1.11. Agilent Bioanalyzer DNA Chipでのライブラリー品質評価1.11.1. DNA 1000 chipを用いてライブラリー 1 µlを泳動する。ライブラリーの収量が非常に少ない場合は、DNA

High Sensitivity chipを用いて泳動する。その場合は、必要に応じてライブラリーを希釈してから泳動する。1.11.2. 電気泳動図でライブラリーが約 300 bpのピークサイズを示していることを確認する。注意：～ 80 bp（プライマー）または 128 bp（アダプターダイマー）のピークが Bioanalyzerトレース

に表示される場合は、0.1X TEバッファーでサンプル（ステップ 1.10.9.）を 50 µlにし、SPRIselect Beadまたは NEBNext Sample Purification Beadで再度精製を繰り返す（Section 1.10.参照）。

図 1.11.1：Bioanalyzerでの RNAライブラリーサイズ分布の例

15

Section 2 NEBNext rRNA Depletion Kit（Human/Mouse/Rat）（NEB #E6310）を併用したプロトコール記号




RNAサンプルについてRNAの品質RNAサンプルを Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Picoチップで泳動して、インプット RNAの品質を評価する。本 Section 2では、分解していない RNAサンプル（RIN> 7）または部分的に分解された RNAサンプル（RIN = 2～ 7）を対象とする。特に RIN = 2～ 7の場合、表 2.5.1を参照して断片化時間を決定する。分解が進んだ RNAサンプル（RIN = 1～ 2）（例：FFPE）の場合、断片化の必要はない。Section 3に従う。

RNAサンプル調製のポイントRNAサンプルには、塩類（Mg2+、グアニジニウム塩、2価のカチオンキレート剤（EDTA、EGTAなど）、有機物（フェノール、エタノールなど）を含まないようにする。また、RNAサンプルには DNAを含まないようにする。DNAが夾雑していてもそこからライブラリーが調製されることはほとんどないが、吸光度計で RNA定量をした際にDNA濃度が加算して測定されるため、PCRサイクル数が正しく設定できず、ライブラリー調製効率の低下を招くためである。特にゲノム DNA（gDNA）は、RNA抽出時に夾雑することが多い。有機溶媒抽出での中間層を採取した場合、または固相式のシリカマトリックスでの RNA抽出時にオーバーロードした場合に、gDNAが夾雑する可能性がある。トータル RNAサンプルに gDNAが含まれている可能性がある場合は、サンプル DNase I（別途準備、#M0303 など）で処理して gDNAを除去する。この際、DNase Iが残存していた場合、mRNA精製に使用するオリゴ dTを分解する恐れがあるので、DNase I処理後はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿などで除去・精製をする。

インプット RNA量1本鎖 RNA特異的な定量機器（Qubitフルオロメーターなど）で定量するとよい。また Bioanalyzerで RIN >7あるいは 2～ 7であることを確認する。さらに DNAフリーであることを確認して、5 ng～ 1 µgのトータル RNAを用いる。なお本セクションでは RNAを約 200 basesに断片化してライブラリー調製を行うプロトコールを記載している。さらに長いインサートサイズのライブラリーを調製する場合は、断片化時間とサイズセレクション条件を変更する。変更条件については Appendix A（Section 6）を参照すること。特に明記が無い場合、すべてのバッファーを氷上に置いておくこと。

16

2.1. RNAへのプローブハイブリダイゼーション2.1.1. トータル RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈し、PCRチューブ中の最終容量を 12 µlとする。希釈した

RNAは、氷上に置いておく。2.1.2. 以下の手順で RNA/Probeマスターミックスを調製する。

RNA/Probeマスターミックス 1サンプルあたりの液量

NEBNext rRNA Depletion Solution 1 µl

Probe Hybridization Buffer 2 µl

全液量 3 µl

2.1.3. 上記のマスターミックス 3 µlを 12 µlのトータル RNA（ステップ 2.1.1.で調製）に添加し、全容量 15 µlとする。

2.1.4. 10回以上ピペッティングして十分に混合する。2.1.5. チューブをスピンダウンする。2.1.6. Heat lidを 105℃に設定したサーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下のプログラムを実行する。

プログラム完了までの時間は 15～ 20分間である。温度時間

95℃ 2分間

Ramp down to 22℃ 0.1℃／秒

22℃で保持 5分間

2.1.7. チューブをスピンダウンして氷上に設置、すぐに RNase Hによる分解ステップに進む。

2.2. RNase Hによる分解2.2.1. 以下の手順に従って、氷上で RNase Hマスターミックスを調製する。 RNase Hマスターミックス 1サンプルあたりの液量

NEBNext RNase H 2 µl

NEBNext RNase H Reaction Buffer 2 µl


全液量 5 µl

2.2.2. 10回以上ピペッティングして十分に混合する。2.2.3. チューブをスピンダウンする。2.2.4. RNase Hマスターミックス5 µlをステップ2.1.7.で調製したRNAサンプルに添加し、全容量を20 µlとする。2.2.5. 10回以上ピペッティングして十分に混合する。2.2.6. Heat lidを 40℃（またはオン）に設定したサーマルサイクラー内でチューブを設置し、37℃で 30分間イン

キュベーションする。2.2.7. チューブをスピンダウンし、氷上に置く。RNAの非特異的分解を防ぐために、すぐにDNase I分解ステップ

に進む。

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2.3. DNase Iによる分解2.3.1. 氷上でヌクレアーゼフリーチューブを用いて DNase Iマスターミックスを調製する。 DNase Iマスターミックス 1サンプルあたりの液量

DNase I Reaction Buffer 5 µl

DNase I（RNase-free） 2.5 µl

ヌクレアーゼフリー水 22.5 µl

全液量 30 µl

2.3.2. 10回以上ピペッティングして十分に混合する。2.3.3. チューブをスピンダウンする。2.3.4. DNase Iマスターミックス 30 µlをステップ 2.2.7.で調製した 20 µlの RNAサンプルに添加し、全容量を

50 µlとする。2.3.5. 10回ピペッティングして十分に混合する。2.3.6. Heat lidを 40℃（またはオン）に設定したサーマルサイクラー内でチューブを設置し、37℃で 30分間イン

キュベーションする。2.3.7. チューブをスピンダウンし、氷上に置く。すぐに RNA精製に進む。

2.4. rRNA除去 RNAの精製2.4.1. Agencourt RNAClean XP Beadsまたは NEBNext RNA Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁

する。2.4.2. ビーズ 110 µl（2.2X）をステップ 2.3.7.で調製した RNAサンプルに添加し、10回以上ピペッティングして

十分に混合する。2.4.3. サンプルを氷上で 15分間インキュベーションして RNAをビーズに結合させる。2.4.4. チューブをスピンダウンし、全溶液をチューブの底に落とす。チューブをマグネットスタンド上に設置

し、ビーズを上清から分離する。溶液が透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズには RNAが結合しているため、触れないように注意する。

2.4.5. マグネットスタンド内にチューブを設置したまま、80％エタノール 200 µl（用時調製）を添加する。室温で 30秒間インキュベーションし、上清を注意深く除去し廃棄する。ビーズにはRNAが結合しているため、触れないように注意する。



注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット RNAの回収率が低下する可能性がある。目に見える液体はすべて蒸発しているが、ビーズが暗褐色で光沢を有する時点でサンプルを溶出させる。ビーズが淡褐色に変化し亀裂が生じ始めると過乾燥である。

2.4.8. チューブをマグネットスタンドから取り出す。ビーズに 7 µlのヌクレアーゼフリー水を添加して、ターゲット RNAを溶出する。ピペッティング（10回以上）で十分に混合し、チューブをスピンダウンする。

2.4.9. 室温で 2分間インキュベーションする。チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明（約 2分間）になるまで静置しておく。

2.4.10. ビーズに触れないよう RNAを含む上清 5 µlを回収し、新しいヌクレアーゼフリーチューブに移す。2.4.11. サンプルを氷上に置き、RNA断片化およびプライミングに進む。

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2.5. RNAの断片化およびプライミング ! RNAの断片化は、分解していない RNAサンプルまたは部分的に分解された RNAサンプルの場合にのみ

必要である。推奨の断片化時間を表 2.5.1に示す。

2.5.1. 以下の構成品を氷上で添加し、断片化およびプライミング反応を行う。

断片化およびプライミング反応 1サンプルあたりの液量

Ribosomal RNA Depleted Sample（ステップ 2.4.11.） 5 µl


•（藤色）Random Primers 1 µl全液量 10 µl

2.5.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。2.5.3. サーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下の表 2.5.1の推奨条件に従って 94℃でインキュベーショ

ンする（インサートサイズが 200 bpのライブラリーの場合）。

表 2.5.1：インプット RNAの RIN値に基づく推奨断片化時間

RNA Type RIN 断片化時間

分解していない RNA > 7 94℃、15分間

部分的に分解した RNA 2～ 6 94℃、7～ 8分間

注意：より大きいインサート（200 bp以上）サイズを持つライブラリーを調製する場合の断片化条件については、Appendix A（Section 6）を参照のこと。Appendix Aの条件は、分解していない RNAにのみ適用される。

2.5.4. すぐにチューブを氷上に移し、第 1鎖 cDNA合成に進む。


2.6.1. ステップ 2.5.4.で断片化しプライミングした RNAに以下の構成品を氷上で添加する。


断片化、プライミング済 RNA（ステップ 2.5.4.） 10 µl



2.6.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。 !2.6.3. Heat lidを 80℃以上に設定し、サンプルをサーマルサイクラー内で以下の条件でインキュベーション

する。注意：さらに長いRNA断片（200 bp以上）に関するAppendix A（Section 6）の推奨事項に従っている場合には、

以下のステップ 2にある 42℃でのインキュベーション時間を 15分間から 50分間に延長する。　ステップ 1：25℃、10分間　ステップ 2：42℃、15分間　ステップ 3：70℃、15分間　ステップ 4：4℃、保持

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2.6.4. すぐに第 2鎖 cDNA合成に進む。


2.7.1. ステップ 2.6.4.で調製した第 1鎖 cDNA合成産物に以下の構成品を氷上で添加する。



•（橙色） NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP Mix（10X）

8 µl


全液量 80 µl

2.7.2. チューブを氷上に置いたままで、10回以上ピペッティングして十分に混合する。2.7.3. Heat lidを 40℃以下（またはオフ）に設定し、サーマルサイクラー内で 16℃、1時間インキュベーション

する。

2.8. 2本鎖 cDNAの精製2.8.1. SPRIselect Beadsまたは NEBNext Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁する。2.8.2. 再懸濁したビーズ 144 µl（1.8X）を Second Strand cDNA合成反応産物（約 80 µl）に添加する。ボルテッ

クスミキサーまたはピペッティング（10回以上）で十分に混合する。2.8.3. 5分間、室温でインキュベーションする。2.8.4. チューブをスピンダウンし、全溶液をチューブの底に落とす。チューブをマグネットスタンド上に設置

し、ビーズを上清から分離する。溶液が透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズには cDNAが結合しているため、触れないように注意する（注意：ビーズは捨てないこと）。








20

2.9. cDNAライブラリーのエンドプレップ（末端処理）2.9.1. ステップ 2.8.9.で調製した第 2鎖 cDNA合成産物に以下の構成品を氷上で添加する。





マスターミックスを調製している場合は、第 2鎖 cDNA 50 µlに 10 µlのマスターミックスを添加する。2.9.2. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 50 µlにセットし、10回以上ピペッティングして完全に混合する。

スピンダウンしてチューブ内の側面から全液体を回収する。注意：十分に混合することが重要である。少量の気泡が存在しても反応には影響しない。

2.9.3. Heat lidを75℃以上に設定したサーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下のプログラムを実行する。　20℃、30分間

　65℃、30分間

　4℃、保持

2.9.4. すぐにアダプターライゲーションに進む。

2.10. アダプターライゲーション !

2.10.1. ライゲーション反応を実施する前に •（赤色）NEBNext Adaptor*を氷冷した Adaptor Dilution Bufferで希釈する。希釈した NEBNext Adaptorは氷中に置いておく。

トータル RNAインプット量希釈率

1,000 ng～ 101 ng Adaptor Dilution Bufferで 5倍希釈


5 ng Adaptor Dilution Bufferで 100倍希釈

* NEBNextアダプターは、別売の NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E7335、#E7500、#E7710、#E7730、#E6609、#E7600、#E7780、#E6440、#E6442、#E6444、#E6446）に含まれる。

2.10.2. 氷上にて、以下の試薬をエンドプレップ反応液に追添加する。アダプターは最後に添加すること。アダプターライゲーション反応 1サンプルあたりの液量

エンドプレップ反応液（ステップ 2.9.4.） 60 µl

希釈アダプター（ステップ 2.10.1.） 2.5 µl

•（赤色）NEBNext Ligation Enhancer 1 µl

•（赤色）NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 30 µl全液量 93.5 µl

Ligation Master Mixおよび Ligation Enhancerは事前に混合しておくことが可能であり、混合物は 4℃で 8時間以上安定である。アダプターの事前混合は避け、必ず最後に添加する。

21

2.10.3. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 80 µlにセットし、10回以上ピペッティングして完全に混合する。スピンダウンによりチューブ内の側面から全液体を回収する。

注意：NEBNext Ultra II Ligation Master Mixは粘性が非常に高い。ライゲーション反応溶液の混合が不完全であるとライゲーション効率が低下するため、十分に混合すること。少量の気泡が存在しても性能には影響しない。

2.10.4. サーマルサイクラー内で 20℃、15分間、インキュベーションする。

2.10.5. ライゲーション反応液に、•（青色）USER Enzyme 3 µlを追添加する。Total volumeは 96.5 µlになる。2.10.6. よく混合し、Heat lidを 45℃以上に設定したサーマルサイクラー内で、37℃で 15分間、インキュベーショ

ンする。2.10.7. すぐにアダプターライゲーション産物のクリーンアップに進む。

2.11. アダプターライゲーション産物のクリーンアップ ! 注意：200 nt以上のインサートを有するライブラリーのサイズセレクションを行う場合は、Section 6の

Appendix Aサイズセレクションの推奨方法に従う。

2.11.1. 再懸濁した SPRIselect Beadsまたは NEBNext Sample Purification Beads 87 µl（0.9X）をライゲーション反応物に添加し、10回以上ピペッティングして十分に混合する。

2.11.2. サンプルを静置して、10分間、室温でインキュベーションする。2.11.3. チューブを遠心機でスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置し、ビーズを上清から分離する。

5分後（または溶液が透明になったら）、不要なフラグメントサイズ DNAを含む上清を廃棄する（注意：ビーズは廃棄しない）。


2.11.5. ステップ 2.11.4.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。2.11.6. チューブをスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置する。2.11.7. エタノールを完全に除去する。必要に応じてスピンダウンして、マグネットスタンド上に戻し、p10ピ

ペットチップで微量のエタノールを除去する。マグネットスタンド上に設置した状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。



2.11.9. ビーズに触れないよう上清の 15 µlを新しい PCRチューブに移し、PCR増幅に進む。注意：一時中断可能。サンプルは –20℃で保存する。

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2.12. アダプター付加 DNAの PCR増幅 ! 注意：10 µMのプライマーを使用する。

! option A：NEBプライマー（Forward/Reverseプライマーが個別のチューブに含まれる）を使用する場合

は、ステップ 2.12.1A.に従う。 option B：NEBプレミックスプライマー（Forward/Reverseプライマーミックスが 1つのウェルに入って

いる）を使用する場合は、ステップ 2.12.1B.に従う。

2.12.1. 使用する index primerのタイプ（Separateまたは Combined）に基づいて PCR反応のセットアップを行う。2.12.1A. Forward/Reverseプライマーが個別のチューブに含まれている場合



•（青色）NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlIndex（X）Primer/i7 Primer*, ** 5 µl

Universal PCR Primer/i5 Primer*, ** 5 µl

全液量 50 µl

* プライマーは、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E7335、#E7500、#E7710、#E7730、#E7600、#E7780）に含まれる。 Dual Index Primers（NEB#E7600、#E7780）を使用する場合、製品マニュアルに有効なバーコードの組み合わせと PCR反応の設定が記載されている。

** 1反応あたり 1つの i7プライマーのみを使用する。 1反応あたり 1つの i5プライマーのみを使用する（Single index kit使用の場合は、キット付属の universal primerを使用）。

2.12.1B. Forward/Reverseプライマーが 1つのチューブに含まれている場合（プレミックス）



•（青色）NEBNext Ultra II Q5 Master Mix 25 µlIndex Primer Mix* 10 µl

全液量 50 µl

* プライマーは、NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB #E6609、#E6440、#E6442、#E6444、#E6446）に含まれる。低プレックス時の有効なバーコードの組み合わせは、各製品マニュアルを参照する。

2.12.2. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 40 µlにセットし、10回ピペッティングして完全に混合する。その後、チューブをスピンダウンする。

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2.12.3. サーマルサイクラーにチューブをセットし、Heat lidを 105℃の設定で以下のサイクル条件を用いて PCRを行う（表 2.12.3Aおよび表 2.12.3Bを参照）。

表 2.12.3A：

サイクルステップ温度時間サイクル数

初期変性 98℃ 30秒間 1

変性 98℃ 10秒間7～ 16*, **

アニーリング／伸長 65℃ 75秒間

最終伸長 65℃ 5分間 1

保持 4℃ ∞

* PCRサイクル数は、インプット RNAの量に基づいて決定する（表 2.12.3B参照）。 ** 過剰増幅を避けるために PCRサイクル数を制限することが重要である。過剰増幅が生じた場合、Bioanalyzerの泳動で、1,000 bpくらいにセカンド

ピークが現れる（56ページ、図 7.2参照）。

表 2.12.3B：インプット RNA量に基づく推奨 PCRサイクル数

トータル RNAのインプット量推奨 PCRサイクル数

1,000 ng 7～ 8

100 ng 11～ 12

10 ng 14～ 15

5 ng 15～ 16

注意：上記の PCRサイクル数は、高品質の Universal Human Reference Total RNAを用いた場合のサイクル数になるので、過剰増幅を避けるために、サンプルの品質に応じて PCRサイクル数の最適化が必要な場合がある。

2.13. PCR増幅産物のクリーンアップ2.13.1. SPRIselectまたは NEBNext Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁する。2.13.2. 再懸濁したビーズ 45 µl（0.9 X）を PCR反応産物（～ 50 µl）に添加する。ボルテックスミキサーでの撹

拌（3～ 5秒間）または 10回以上のピペッティングで十分に混合する。2.13.3. 5分間、室温でインキュベーションする。2.13.4. チューブをスピンダウンした後、マグネットスタンド上に設置し、ビーズを上清から分離する。溶液が

透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズにはターゲット DNAが結合しているため、触れないように注意する（注意：ビーズは捨てない）。

2.13.5. マグネットスタンド内にチューブまたはプレートを設置したまま、80％エタノール 200 µl（用時調製）を添加する。室温で 30秒間インキュベーションし、上清を注意深く除去し廃棄する。

2.13.6. ステップ 2.13.5.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。2.13.7. マグネットスタンド上に設置した状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット DNAの回収率が低下する可能性がある。


2.13.8. チューブまたはプレートをマグネットスタンドから取り出す。ビーズに 23 µlの 0.1 X TE（キットに付属）を添加して、ターゲット DNAを溶出する。ボルテックスミキサーで撹拌または 10回のピペッティングで十分に混合する。チューブをスピンダウンし、室温で 2分間インキュベーションする。チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明（約 5分間）になるまで静置しておく。

2.13.9. 上清の 20 µlを新しい PCRチューブに移し、–20℃で保存する。

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2.14. Agilent Bioanalyzer DNA Chipでのライブラリー品質評価2.14.1. DNA 1000 Chipを用いてライブラリー 1 µlを泳動する。ライブラリーの収量が非常に少ない場合は、DNA

High Sensitivity chipを用いて泳動する。その場合は、必要に応じてライブラリーを希釈してから泳動する。2.14.2. 電気泳動図でライブラリーが約 300 bpのピークサイズを示していることを確認する。注意：～ 80 bp（プライマー）または 128 bp（アダプターダイマー）のピークが Bioanalyzerトレース

に表示される場合は、0.1X TEバッファーでサンプル（ステップ 2.13.9.）を 50 µlにし、SPRIselect Beadまたは NEBNext Sample Purification Beadで再度精製を繰り返す（Section 2.13.参照）。

図 2.14.1：Bioanalyzerでの RNAライブラリーサイズ分布の例

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Section 3 FFPE RNAサンプルでのNEBNext rRNA Depletion Kit（Human/Mouse/Rat）（NEB #E6310）を併用したプロトコール記号




RNAサンプルについてRNAの品質RNAサンプルを Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Picoチップで泳動して、インプット RNAの品質を評価する。本 Section 3では、分解が進んだ RNAサンプル（RIN = 1～ 2）（例：FFPE）を対象とする。断片化の必要はない。分解していない RNAサンプル（RIN> 7）または部分的に分解された RNAサンプル（RIN = 2～ 7）の場合、Section 2に従う。

RNAサンプル調製のポイントRNAサンプルには、塩類（Mg2+、グアニジニウム塩、2価のカチオンキレート剤（EDTA、EGTAなど）、有機物（フェノール、エタノールなど）を含まないようにする。また、RNAサンプルには DNAを含まないようにする。DNAが夾雑していてもそこからライブラリーが調製されることはほとんどないが、吸光度計で RNA定量をした際に DNA濃度が加算して測定されるため、PCRサイクル数が正しく設定できず、ライブラリー調製効率の低下を招くためである。特にゲノム DNA（gDNA）は、RNA抽出時に夾雑することが多い。有機溶媒抽出での中間層を採取した場合、または固相式のシリカマトリックスでの RNA抽出時にオーバーロードした場合に、gDNAが夾雑する可能性がある。トータル RNAサンプルに gDNAが含まれている可能性がある場合は、サンプルを DNase I（別途準備、#M0303 など）で処理して gDNAを除去する。この際、DNase Iが残存していた場合、mRNA精製に使用するオリゴ dTを分解する恐れがあるので、DNase I処理後はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿などで除去・精製をする。

インプット RNA量1本鎖 RNA特異的な定量機器（Qubitフルオロメーターなど）で定量するとよい。DNAフリーであることを確認して、10 ng～ 100 ngの FFPE RNAを用いる。なお本セクションでは RNAを約 200 basesに断片化してライブラリー調製を行うプロトコールを記載している。特に明記が無い場合、すべてのバッファーを氷上に置いておくこと。

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3.1. RNAへのプローブハイブリダイゼーション3.1.1. トータル RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈し、PCRチューブ中の最終容量を 12 µlとする。希釈した

RNAは、氷上に置いておく。3.1.2. 以下の手順で RNA/Probeマスターミックスを調製する。

RNA/Probeマスターミックス 1サンプルあたりの液量

NEBNext rRNA Depletion Solution 1 µl

Probe Hybridization Buffer 2 µl

全液量 3 µl

3.1.3. 上記のマスターミックス 3 µlを 12 µlのトータル RNA（ステップ 3.1.1.で調製）に添加し、全容量 15 µlとする。

3.1.4. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.1.5. チューブをスピンダウンする。3.1.6. Heat lidを 105℃に設定したサーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下のプログラムを実行する。

プログラム完了までの時間は 15～ 20分間である。温度時間

95℃ 2分間

Ramp down to 22℃ 0.1℃／秒

22℃で保持 5分間

3.1.7. チューブをスピンダウンして氷上に設置、すぐに RNase Hによる分解ステップに進む。

3.2. RNase Hによる分解3.2.1. 以下の手順に従って、氷上で RNase Hマスターミックスを調製する。 RNase Hマスターミックス 1サンプルあたりの液量

NEBNext RNase H 2 µl

NEBNext RNase H Reaction Buffer 2 µl


全液量 5 µl

3.2.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.2.3. チューブをスピンダウンする。3.2.4. RNase Hマスターミックス5 µlをステップ3.1.7.で調製したRNAサンプルに添加し、全容量を20 µlとする。3.2.5. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.2.6. Heat lidを 40℃（またはオン）に設定したサーマルサイクラー内でチューブを設置し、37℃で 30分間

インキュベーションする。3.2.7. チューブをスピンダウンし、氷上に置く。RNAの非特異的分解を防ぐために、すぐにDNase I分解ステップ

に進む。

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3.3. DNase Iによる分解3.3.1. 氷上でヌクレアーゼフリーチューブを用いて DNase Iマスターミックスを調製する。 DNase Iマスターミックス 1サンプルあたりの液量

DNase I Reaction Buffer 5 µl

DNase I（RNase-free） 2.5 µl

ヌクレアーゼフリー水 22.5 µl

全液量 30 µl

3.3.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.3.3. チューブをスピンダウンする。3.3.4. DNase Iマスターミックス 30 µlをステップ 3.2.7.で調製した 20 µlの RNAサンプルに添加し、全容量を

50 µlとする。3.3.5. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.3.6. Heat lidを 40℃（またはオン）に設定したサーマルサイクラー内でチューブを設置し、37℃で 30分間

インキュベーションする。3.3.7. チューブをスピンダウンし、氷上に置く。すぐに RNA精製に進む。

3.4. rRNA除去 RNAの精製3.4.1. Agencourt RNAClean XP Beadsまたは NEBNext RNA Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁

する。3.4.2. ビーズ 110 µl（2.2X）をステップ 3.3.7.で調製した RNAサンプルに添加し、10回以上ピペッティングして

十分に混合する。3.4.3. サンプルを氷上で 15分間インキュベーションして RNAをビーズに結合させる。3.4.4. チューブをスピンダウンし、全溶液をチューブの底に落とす。チューブをマグネットスタンド上に設置

し、ビーズを上清から分離する。溶液が透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズには RNAが結合しているため、触れないように注意する。




注意：ビーズを過乾燥させないこと。過乾燥により、ターゲット RNAの回収率が低下する可能性がある。目に見える液体はすべて蒸発しているが、ビーズが暗褐色で光沢を有する時点でサンプルを溶出させる。ビーズが淡褐色に変化し亀裂が生じ始めると過乾燥である。

3.4.8. チューブをマグネットスタンドから取り出す。ビーズに 7 µlのヌクレアーゼフリー水を添加して、ターゲット RNAを溶出する。ピペッティング（10回以上）で十分に混合し、チューブをスピンダウンする。

3.4.9. 室温で 2分間インキュベーションする。チューブをマグネットスタンド上に設置し、溶液が透明（約 2分間）になるまで静置しておく。

3.4.10. ビーズに触れないよう RNAを含む上清 5 µlを回収し、新しいヌクレアーゼフリーチューブに移す。3.4.11. サンプルを氷上に置き、次の工程の分解した RNAへのプライミングに進む。

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3.5. RIN値が 2以下の分解が進んだ RNA（FFPE）のプライミング（断片化の必要なし）3.5.1. 以下の構成品を氷上で添加し、プライミング反応を行う。プライミング反応 1サンプルあたりの液量

rRNA Depleted Sample（ステップ 3.4.11.） 5 µl

•（藤色）Random Primers 1 µl全液量 6 µl

3.5.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。3.5.3. チューブをスピンダウンする。3.5.4. Heat lidを 105℃に設定したサーマルサイクラー内にチューブを設置し、以下のプログラムを実行する。　65℃、5分間　4℃、保持

3.5.5. チューブを氷上に移し、第 1鎖 cDNA合成反応に進む。


3.6.1. ステップ 3.5.5.でプライミングした RNAに以下の構成品を氷上で添加する。


プライミング済 RNA（ステップ 3.5.5.） 6 µl




3.6.2. 10回ピペッティングして十分に混合する。 !3.6.3. Heat lidを 80℃以上に設定し、サンプルをサーマルサイクラー内で以下の条件でインキュベーションする。注意：さらに長い RNA断片（200 bp以上）に関する Appendix A（Section 6）の推奨事項に従っている

場合には、以下のステップ 2にある 42℃でのインキュベーション時間を 15分間から 50分間に延長する。

　ステップ 1：25℃、10分間　ステップ 2：42℃、15分間　ステップ 3：70℃、15分間　ステップ 4：4℃、保持

3.6.4. すぐに第 2鎖 cDNA合成に進む。

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3.7.1. ステップ 3.6.4.で調製した第 1鎖 cDNA合成産物に以下の構成品を氷上で添加する。



•（橙色） NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP Mix（10X）

8 µl


全液量 80 µl

3.7.2. チューブを氷上に置いたままで、10回ピペッティングして十分に混合する。3.7.3. Heat lidを 40℃以下（またはオフ）に設定し、サーマルサイクラー内で 16℃、1時間インキュベーション

する。

3.8. 2本鎖 cDNAの精製3.8.1. SPRIselect Beadsまたは NEBNext Sample Purification Beadsをボルテックスして再懸濁する。3.8.2. 再懸濁したビーズ 144 µl（1.8X）を Second Strand cDNA合成反応産物（約 80 µl）に添加する。ボルテッ

クスミキサーまたはピペッティング（10回以上）で十分に混合する。3.8.3. 5分間、室温でインキュベーションする。3.8.4. チューブをスピンダウンし、全溶液をチューブの底に落とす。チューブをマグネットスタンド上に設置

し、ビーズを上清から分離する。溶液が透明（約 5分間）になったら、上清を注意深く除去して廃棄する。ビーズには cDNAが結合しているため、触れないように注意する（注意：ビーズは捨てないこと）。


3.8.6. ステップ 3.8.5.をさらに 1回繰り返し、合計 2回の洗浄を行う。3.8.7. チューブをスピンダウンし、マグネットスタンド上に設置する。必要に応じて、p10ピペットチップで微

量のエタノールを除去する。マグネットスタンド上に設置した状態で、チューブの蓋を開けて最長 5分間ビーズを風乾させる。





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3.9. cDNAライブラリーのエンドプレップ（末端処理）3.9.1. ステップ 3.8.9.からの第 2鎖 cDNA合成産物に以下の構成品を氷上で添加する。





マスターミックスを調製している場合は、第 2鎖 cDNA 50 µlに 10 µlのマスターミックスを添加する。3.9.2. 100 µlまたは 200 µlのピペットを 50 µlにセットし、10回以上ピペッティングして十分に混合する。スピ

ンダウンしてチューブ内の側面か�

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manual NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina # ...LIBRARY PREPARATION NEB #E7760S/L, #E7765S/L be 24/96 reactions 英語版マニュアルVersion 3.1 5/20 に対応 NEBNext®