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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DEPARTAMENTO DE SALUD PÚBLICA
CATEDRA DE MEDICINA PREVENTIVA
LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS
Manual realizado por: Jeanette M Tromp
Médico Veterinario- Msc Ciencia y tecnología de Alimentos
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INTRODUCCIÓN
El objetivo primordial del examen bacteriológico del agua es proporcionar todo el
material informativo que se relaciona con su potabilidad; es decir, evitar el peligro de
ingerir organismos que pueden producir enfermedades hídricas. El procedimiento lógico
consistiría en, la detección de microorganismos patógenos específicos en el agua que se
examine. Sin embargo los procedimientos que se usan actualmente para el aislamiento,
identificación y enumeración son difíciles y complicados además de que requieren
mayor volumen de muestra para ser concentrada y mayor tiempo de procesamiento. Al
final de los procedimientos, no se obtienen resultados concluyentes para evaluar la
calidad sanitaria del agua. Por estas dificultades, se han adoptado procedimientos
indirectos que nos permiten la información requerida sobre la posible presencia de estos
microorganismos patógenos en el agua; cuando el medio ambiente no les ofrece las
condiciones favorables a su desarrollo y tomando en consideración su corta
permanencia en el agua, ya que mueren rápidamente y se extinguen en ella.
Los procedimientos indirectos consisten en dos determinaciones:
1) El recuento Standard en placas de colonias que se desarrollan en agar nutritivo por 24
horas de incubación a la temperatura de 35° C.
2) El indice de coliformes, que consiste en la determinación del número más probable
de bacterias coliformes que se definen de origen fecal y de otras fuentes.
El uso del índice de coliformes y de la cuenta normal de colonias sirve para juzgar la
calidad sanitaria del agua. En los últimos años se ha manifestado la tendencia a limitar
el examen bacteriológico a la determinación del grupo coliforme; pero las experiencias
obtenidas de la cuenta normal de colonias a 35° C ha demostrado datos de valiosa
información en la calidad de un sistema de distribución de agua potable y la efectividad
de los procedimientos de purificación, como también la proximidad de un punto de
contaminación con desecho humano y animales.
Se ha usado por muchos años el grupo de bacterias coliformes en conjunto, en lugar
de un solo organismo; se incluyen en este “todo” el Escherichia coli (fecal) y las
bacterias afines (no fecales) como indicadores de contaminación bacteriana, siendo su
adopción de gran valor para la evaluación de calidad de un abastecimiento para futuro
tratamiento, para piscina, o sitios de natación, balnearios y para demostrar la efectividad
de las plantas purificadoras de agua.
Desde la adopción del grupo coliforme han surgido progresos que aumentan la
sensibilidad de las pruebas de tubos multiples para el examen bacteriológico de una
gran significación en su aplicación y el índice coliforme: Expresión usada para la
estimación cuantitativa de las bacterias coliformes y el cálculo en términos del número
más probable de organismos coliformes en un volumen determinado de 100 ml de agua.
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Se expresan los resultados de las pruebas bacteriológicas por el procedimiento de
tubos múltiples, aplicando el índice “Número Más Probable” (NMP) en un volumen
determinado (100 ml); debe entenderse que al proceder así se concede que es un índice
de bacterias coliformes que tienen mayor probabilidad sobre cualquier otro número. No
es la enumeración real de coliformes, pero es una indicación muy valiosa para juzgar la
calidad sanitaria del agua; ya que la presencia del grupo coliforme indica la existencia
de canales por los cuales los organismos patógenos han podido invadir y nos conduce a
investigar estos canales de polución.
Los procedimientos directos
La técnica de membrana de filtración que da una siembra directa para detección y
estimación de la densidad coliforme de un volumen dado de agua, las modificaciones
introducidas en el método, ha demostrado que los valores de esta prueban son
comparables a los obtenidos por los tubos múltiples. Existen limitaciones en la
aplicación de la técnica de membrana filtrante para el examen de todo tipo de agua.
Cualquiera de las dos técnicas es valiosa para la interpretación del examen
bacteriológico corno indicadores del grado de contaminación y efectividad del
tratamiento.
Surge la necesidad de aplicar pruebas más específicas para diferenciar la
contaminación de origen fecal de la proveniente de otras fuentes no fecales, tal
diferenciación ha sido considerada en el pasado de poco valor debido a que en la
presencia de cualquiera de los tipos de bacterias coliformes hace que la fuente sea de
calidad cuestionable y por lo tanto inaceptable para uso potable. Investigaciones
recientes dan una fuerte indicación que la porción de organismos coliformes presentes
en los intestinos de animales de sangre caliente, generalmente incluyen organismos
capaces de producir gas y lactosa en un medio de cultivo selectivo incubado a 44,5 ° C
más o menos 0.2° C. ya que los organismos de otro origen no pueden producir gas en
estas condiciones; este criterio puede ser utilizado para definir la parte fecal del grupo
coliforme.
No se presentan técnicas especiales para aguas salinas debido a que la experiencia
hasta el presente sugiere que las técnicas que se aplican pueden ser usados
satisfactoriamente tanto para el agua dulce como para aguas salinas.
PROPIEDADES DE UN INDICADOR DE POLUCIÓN
1.- Ser aplicable en todos los tipos de agua.
2.- Estar siempre presente en el agua cuando las bacterias patógenas fecales están
presentes.
3.- Su densidad debe estar relacionada directamente con el grado de polución.
4.- Debe sobrevivir, por un tiempo mayor que los patógenos entéricos.
5.- Debe desaparecer rápidamente del agua seguido de la desaparición de los patógenos.
por medios naturales o aplicados por el hombre.
6.- Debe estar ausente en un agua bacteriológicamente segura.
7.- Servir para el examen cuantitativo de rutina, sin interferencia.
8.- Ser inocuo para el hombre y los animales.
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EVALUACION DE LOS COLIFORMES COMO INDICADORES DE
POLUC1ON
a. - La ausencia de coliformes es una evidencia de un agua bacteriológicamente segura.
b.- La densidad de los coliformes es proporcional a la cantidad de polución por excretas
presentes.
c.- Si están presentes bacterias patógenas de origen intestinal, las bacterias coliformes
están presentes en un número mayor.
d.- Los coliformes están siempre presentes en los intestinos de humanos y animales y
son eliminados en grandes cantidades en las heces.
e.- Los coliformes son más persistentes en el ambiente acuático que las bacterias
patógenas de origen intestinal.
f.- Los coliformes son generalmente inocuos a los humanos y pueden determinarse
cuantitativamente por procedimientos rutinarios de laboratorio.
INSTRUCCIONES PARA LA CAPTACION DE MUESTRAS DE AGUAS.
La muestra para exámenes bacteriológicos debe captarse en frascos esterilizados que
suministra el laboratorio. Estos frascos se protegen cubriendo la tapa con papel aluminio
u otro resistente.
No usarse después de 8 días de esterilizado, ya que no se garantiza su esterilidad
después de este tiempo.
Los frascos para captación de agua potable clorada, deberán contener 0,1 ml de
tiosulfato de sodio al 10% por cada 100 ml de muestra de agua, esta cantidad neutraliza
un residual de cloro de 15 mg/l.
PROCEDIMIENTO PARA CAPTAR LAS MUESTRAS
El frasco no debe destaparse sino hasta el momento del muestreo, ni desprenderle su
cubierta; se destapa cuidadosamente para evitar que se ensucie sin tocar la boca del
frasco para protegerlo de contaminación. El agua no debe tocar ningún objeto mientras
se toma la muestra.
El frasco no se llenará totalmente sino las tres cuartas parte de su capacidad (100 ml).
Se tapa el frasco y se deposita en el termo respectivo donde se ha colocado una bolsa
con hielo para su refrigeración.
La tolerancia de tiempo entre la captación de la muestra y la entrega al laboratorio de
control, no deberá ser mayor de 6 horas para las aguas sin tratamientos y de 1 hora para
las aguas tratadas. Sin embargo, tomando en consideración las dificultades que puedan
presentarse con el traslado de la muestra, se tolera un tiempo máximo de 30 horas con
buena refrigeración. Se descartará toda muestra que sobrepase este limite, así como
también sino cumplen los requisitos mínimos requeridos.
Es indispensable anexar a la muestra la planilla respectiva con los datos exigidos.
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TECNICAS PARA EVALUAR LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL AGUA
Introducción
Consiste en la determinación de la densidad del grupo coliforme, expresado en
términos del Número Más Probable (NMP por 100 ml) y el Recuento Standard en
Placas que se desarrollan en un medio de agar nutritivo en 24 horas de incubación a 35
+/- 0.5 º C.
El análisis bacteriológico de rutina del agua tiene por finalidad principal determinar
los organismos miembros del grupo coliforme.
RECUENTO STANDARD EN PLACAS
Tiene por objeto determinar el contenido bacterial de la muestra de agua por unidad
de volumen (ml). Este examen nos dará rápidamente una idea de las condiciones
sanitarias del agua, teniendo como base que el agua debe estar dentro de ciertos límites.
y que una repentina elevación de la cuenta bacteriana revela una reciente
contaminación.
Procedimiento
Se agita la muestra 25 veces y a continuación con pipetas bacteriológicas estériles de
1 ml. se toman inóculos de 1 ml, se vierten en una placa de Petri estéril. Cuando se trata
de aguas contaminadas es conveniente hacer varias diluciones al décimo (0.1) centésimo
(0.0 1) milésimo (0.001). etc. en agua amortiguada estéril, agitando vigorosamente cada
dilución. A continuación se vierte al inóculo contenido en la placa de Petri, una porción
de 10 a 15 ml de agar contaje (PCA “Plate Count Agar) fundido y a la temperatura de
43 a 45° C (manteners el agar en Baño Maria a esa temperaturas). No se funda otra vez.
Encienda un mechero de alcohol o de gas y flamee la boca del tubo que contiene el
agar contaje, levante la tapa de la placa de petri lo suficiente que permita la introducción
de la pipeta o del medio de cultivo que se va a verter. Se deben mezclar inóculo más
medio, distribuyéndolos de modo uniforme mediante movimientos circulares o en forma
de 8 hasta su homogenización. Dejar solidificar por 10 minutos e inmediatamente
colocar las placas invertidas en una incubadora apropiada a 35° C durante 24 horas. El
tiempo transcurrido entre la siembra de la placa y el vertido del medio, no debe ser
mayor de 20 minutos, para evitar evaporación del inóculo.
Las cajas de Petri se deben disponer en la incubadora manteniendo una distancia
entre una y otra de 2,5 cm.
PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR EL CONTAJE DE COLONIAS
Se debe sembrar volúmenes que produzcan entre 30 y 300 colonias por placa, siendo
recomendable que se siembre un volumen de 1 ml de cada dilución de agua en cada
placa.
Cuando las colonias que aparecen en la caja no son muy numerosas se pueden contar
directamente, marcándolas con lápiz para vidrio para evitar causas de error que se
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originan al contar dos veces la misma colonia. El número de colonias se multiplica por
la dilución respectiva que debe estar anotada en la tapa de la placa.
Cuando son muchas las colonias que aparecen en la placa, especialmente aquellas con
característica puntiforme difíciles de observar a simple vista, se emplea el método de
conteo indirecto para lo cual se utiliza el contador de colonias Quebec: este posee un
vidrio dividido en cuadrícula de 1 cm, siendo su superficie total de 60 cm Se puede
contar una cuadrícula cualquiera y el número de colonias encerrada en ella se multiplica
por el factor 60 y por la dilución respectiva.
Cada cuadricula de 1 cm está subdividida en 9 cuadriculas pequeñas: cuando se
utiliza este tipo de cuadricula (colonias numerosas puntiformes y muy cercanas entre sí,
es necesario multiplicar el número de colonias que hay en una de estas cuadriculas
pequeñas por 9, para referirlo a 1 cm Se procede entonces en forma similar al caso
anterior.
Recomendamos usar placas de petri de diámetro standard y en caso contrario verificar
el diámetro de la placa ya que una variación en este diámetro influye en el área total de
la placa.
Se tendrá menos causas de error mientras mayor sea el número de cuadriculas que se
cuentan y se promedien los valores de todas ellas: Este promedio será más
representativo de la población de la placa. El tamaño normal de la placa es 100 x 15
mm.
Como se realiza el recuento
Para llevar a cabo la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250
UFC, con el fin de disminuir el error en el recuento. Las placas de al menos una de tres
diluciones deben estar en dicho intervalo.
Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de
mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio
para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas
partículas de alimento.
Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas:
a) En cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas
por la desintegración de un cúmulo de bacterias.
b) En colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
c) En colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del
agar.
Contar cualquiera de los tipos establecidos como provenientes de una sola fuente. En el
caso de las colonias descritas en a), si la caja contiene una sola cadena, contar como
una sola colonia. En cambio, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse
de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. Las colonias
establecidas en a) y b) generalmente se observan como crecimiento diferenciable de
otras colonias y se cuentan como tales.
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Expresión de resultados
Cálculos.
Ejemplo 1 Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, calcular la cuenta
promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.
Ejemplo 2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta
promedio dada por cada dilución antes de promediar la cuenta de ambas diluciones para
obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro.
Ejemplo 3 Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran menos de 25
UFC, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el número de
colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta
en placa. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado".
Ejemplo 4 Cuando el número de colonias por placa exceda de 250 UFC para todas las
diluciones, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas
de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2 respectivamente. Si solamente
pueden contarse algunos cuadros, considerar el diámetro de la caja de Petri, y calcular el
número de cuadros por área. Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda
"valor estimado".
Ejemplo 5 En caso de que una dilución se encuentre dentro del intervalo y otra dilución
presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden
contar las colonias.
Ejemplo 6 Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la
cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilución más baja usada.
Ejemplo 7 Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250
colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determinar
la cuenta en placa.
Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la
inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo del
producto. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos
dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dígito al
número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por
ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el
tercer dígito con cero y el segundo dígito mantenerlo igual (por ejemplo: 2417 a 2400).
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Referencia: Proyecto de Norma Oficial Mexicana Proy Nom 210-SSA1-2002
Pruebas para detectar la presencia de miembros del grupo coliforme.
El grupo coliforme incluye a todos los bacilos aerobios o anaerobios facultativos,
Gram - negativos, no esporógenos que fermentan la lactosa con formación de gas dentro
de las 48 horas a una temperatura de 35° C. Es de interés destacar que para la
evaluación de la potabilidad del agua se ha adoptado corno índice de contaminación
todo el grupo coliforme y no un solo organismo (Escherichia coli).
En los trabajos rutinarios de laboratorio no se acostumbra diferenciar las especies, ya
que se les considera a todas en forma colectiva, como miembros del grupo coliforme y
se les concede la misma importancia desde el punto de vista sanitario, constituyendo un
indicio delicado y fidedigno de polución así como de la eficacia de la purificación y de
la potabilidad del agua.
La demostración del grupo coliforme se puede llevar a cabo mediante la técnica de
los tubos múltiples de fermentación. (Prueba presuntiva, prueba confirmativa).
TÉCNICA DE LOS TUBOS MÚLTIPLES DE FERMENTACIÓN
A pesar de la agitación vigorosa de la muestra, la distribución de las bacterias en la
misma es irregular y la probabilidad de tomar un germen en el inóculo es al azar, por lo
que se ha adoptado la utilización de series de tubos múltiples de fermentación; cuyo
resultado se expresa en término del “Número Más Probable” de bacterias coliformes
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(NMP en 100 ml de muestras). En realidad, este término es una estimación que se basa
en ciertas fórmulas de probabilidad
Prueba presuntiva
1. Aguas de calidad potable
Procedimiento
Después de agitar 25 veces el frasco con muestra ; se inoculan una serie de 3 ó 5
tubos de fermentación que contienen 10 ml de caldo lactosado (doble concentración)
estéril, con l0 ml de la muestra, series de tubos con 10 ml de caldo lauryl sulfato
concentración simple, con 1 ml de muestra y series de tubos con 10 ml de caldo lauryl
sulfato concentración simple con 0,1 ml de muestra.
Se incuban durante 24 horas a la temperatura de 35 ± 0.5° C: cada tubo se examina al
cabo de este tiempo y si no se ha producido gas, se examinan nuevamente al cabo de 48
horas. En cada examen se registra la presencia o la ausencia de gas sin tomar en cuenta
su cantidad.
La formación de cualquier cantidad de gas en cualquier tubo de fermentación de la
serie dentro de las 48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva. Si el gas
formado es producto de la fermentación de la lactosa y no una burbuja de aire, se
enturbia el caldo, lo cual indica crecimiento y fermentación del medio.
La ausencia de gas en los tubos al cabo de 48 horas de incubación, constituye una
prueba presuntiva negativa.
Es de interés recalcar que en ningún caso debe omitirse la lectura de 24 horas en esta
prueba ya que los miembros del grupo coliforme presentan su máximo crecimiento entre
6 y 24 horas.
En el análisis rutinario de los abastecimientos de agua potable en que se aplica
desinfección (cloración), el objeto del análisis es detectar la presencia o ausencia de
organismos coliformes para determinar la eficiencia de la desinfección o contaminación
bacterial presente.
2. Aguas ligeramente contaminadas
Provienen de los sistemas de red de distribución con desinfección irregular de
procedimiento desconocido.
Procedimiento
Después de agitar 25 veces el frasco con la muestra, se inocula una serie de 3 ó 5
tubos de fermentación que contienen 10 ml de caldo lactosado concentración simple
estéril, con 1 ml de la muestra. Series de tubos de fermentación (16 x 150 mm) que
contiene 10 ml de caldo lactosado concentración simple con 0,1 ml de la muestra y
tubos similar con 1 ml de una dilución 10-2 (1:100). Se incuban durante 24 horas 35±
0,5° C y se examinan los tubos al cabo de este tiempo y si no se ha producido gas se
examina nuevamente al cabo de 48 horas. Aplíquese la misma interpretación de los
resultados que en el caso precedente.
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3. Aguas muy contaminadas
Provienen de fuentes superficiales; tales como: Ríos, arroyos, quebradas. etc. embalses
con afluentes de elevada polución, etc. El objeto de estos exámenes es estimar el grado
de contaminación bacterial o determinar la fuente de polución.
Procedimiento
Se procede a realizar diluciones seriadas de la muestra y se siembra 1 ml de cada
dilución requerida en 10 ml de tubos con caldo lauryl triptosa concentración simple,
usando varias series, de tres o cinco tubos cada una. El número de series y los
volúmenes de inóculos deben estimarse de acuerdo al grado de contaminación o al
origen de la muestra.
El objeto de estos exámenes es evaluar cuantitativamente la calidad del agua por la
densidad de la contaminación bacterial.
Prueba confirmativa.
1. Coliformes Totales
Para esta prueba se emplean tubos de fermentación con caldo bilis y verde brillante,
este medio es selectivo para los miembros del grupo coliforme e inhibidor para la flora
restante.
Procedimiento
1. Tome los tubos que resultaron positivos a la prueba presuntiva (mantenga el orden).
2. Mezcle el tubo de fermentación positivo con un movimiento rotatorio.
3. Encienda un mechero de gas para mantener una atmósfera estéril
5. Tome los dos tubos por su base, tanto el de fermentación positiva como el de bilis
verde brillante que va a ser inoculado, y sostenga con la mano izquierda, destape de a
par los tubos con la mano derecha.
6. Esterilice el asa de platino o alambre cromado hasta el rojo y deje enfriar.
7. Flamee la boca de los tubos y rápidamente introduzca el asa en el tubo de
fermentación positivo. Sáquela e introdúzcala en el tubo de la prueba confirmativa.
Efectúe esta operación dos veces.
7. Flamee de nuevo la boca de los tubos y esterilice el asa.
El asa puede ser de platino o de alambre cromado y su diámetro no debe ser menor de
5 mm.
Incube los tubos inoculados de caldo lactosado con bilis verde brillante a 35° C ± 0.5
por 48 horas.
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2. Coliformes fecales
Para esta prueba se emplean tubos de fermentación con caldo EC, este medio es
selectivo para los miembros del grupo coliforme de origen fecal (termófilos) inhibidor
para la flora restante.
El procedimiento es igual que para coliformes totales, y solo cambia la temperatura de
incubación que es de 45 °C/ 24-48 horas
Se realiza el repique de las muestras en los dos medios (BVB y EC) a la vez.
Interpretación de los resultados
La presencia de gas en el tubo de DURHAM invertido del tubo de fermentación
dentro de las 48 horas de incubación constituye una prueba confirmada positiva.
Estimación de la densidad bacterial
Cálculo y registro del NMIP. Se calcula en términos del NMP los resultados del número
de tubos positivos y negativos (presuntivos, confirmados o completos), obtenidos al
hacer la siembra de tubos múltiples de diluciones decimales, por medio de las tablas
apropiadas.
Se presenta las tablas A, C y D para varios tipos de siembra, de acuerdo a la calidad
estimada del agua examinada. Se incluyen los límites del 95% de confianza para cada
valor del NMP.
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ESQUEMA PRÁCTICO PARA EVALUAR LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA
DEL AGUA
El contaje de microorganismos, es el número total de unidades formadoras de colonias
(ufc) o el número de bacterias específicas que se realizará en una cantidad determinada
de muestra bajo condiciones definidas de incubación y de medio de cultivo.
Hay cuatro vías o maneras para establecer el contaje de microorganismos en agua:
1. Método del agar vertido
2. Método por titulación
3. Método del número más probable (NMP)
4. Método de filtración por membrana
Uno de los más conocidos o usados es el Método del agar vertido.
Método del agar vertido
Coloque 1 ml o 0,1 ml de muestra en la placa de petri (agua potable), en caso de agua
polucionada o aguas servidas; se realiza previamente las debidas diluciones.
Luego se añade de 10 a 12 ml de agar contaje(45°C), una vez solidificado el agar, se
llevan las placas y se colocan invertidas en la estufa a 32ºC/ 24-48 horas.
Finalizado el tiempo, se realiza el contaje de las placas y se anotan aquellas donde se
contaron entre 25 a 250 ufc
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RECUENTO STANDARD EN PLACA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS
MESÓFILOS VIABLES
Preparación de medios de cultivo y solución para diluciones:
1. Agar contaje: 23,5 g/l de agua destilada, pH 7,0
2. Agua peptonada: 0,1 % + NaCI 0,5 g/l ó 0.05g %
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MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Este método consiste en transferir diluciones decimales de una muestra a una serie de
tubos, (3 ó 5). El método del número más probable es un índice del contaje estadístico
calculado del número de tubos donde hay crecimiento por 100 ml de muestra. Los
resultados se leen en una tabla especial (estadística).
Por lo general en agua potable se siembra 10 ml, 1 ml y 0,1 ml. Cuando se trata de
aguas servidas o contaminadas se realizan diluciones más altas.
Preparación de medios de cultivo:
1. Caldo lauryl sulfato doble concentración: 71,2 g/l agua destilada, pH 6,8
2. Caldo laurel sulfato simple: 35,6 g/l agua destilada, pH 6,8
3. Caldo Bilis Verde Brillante : 40 g/l agua destilada, pH 7,2
4. Caldo Eschericia coli : 37 g/l agua destilada, pH 6,9
ESQUEMA MÉTODO DEL NUMERO MÁS PROBABLE (NMP)
Incubar : 35 °C/ 24-48 horas
PRUEBA PRESUNTIVA
10 ml 1 ml 0,1 ml
muestra 10 ml CALDO LAURYL TRIPTOSA
Doble [] [] simple [] simple
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RESULTADOS PRUEBA PRESUNTIVA:
3 1 0
Anotación: 3/3-3/1-3/0 3-1-0
PRUEBA CONFIRMATIVA
Repicar 3-1-0 en
10 ml Caldo Bilis Verde Brillante 10 ml Caldo EC
Incubar a 35°C/24-48 horas Incubar a 45°C/24-48 horas
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RESULTADOS
Anotación: Coliformes totales 3/1- 3/0-3/0 1-0-0
Coliformes fecales 3/1-3/0- 3/0 1-0-0
Ir a la tabla para NMP para expresar los resultados de NMP de coliformes totales y
coliformes fecales.
1 0 1 0
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REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:
Manual Difco para medios de cultivo deshidratados y reactivos para procedimientos de
laboratorio clínico y microbiológico. 9 ª edición 1953. Detroit Michigan.
Standards methods for examination of water and waste water. APHA, AWWA,WPCF.
(1992). USA
Manual de análisis bacteriológico, USDA, CFSAN. Enero 2001
Manual INOS. Caracas. Venezuela
Microorganismos en alimentos. Comisión Internacional de Especificaciones
microbiológicas para alimentos ICMSF. Sociedades Microbiologicas 2ª edición.
Guevara,Vera Antonio(1966). Control de calidad de agua. Métodos de análisis para la
evaluación de la calidad del agua. Centro Panamericano de Ingeniería Sanitaria y
Ciencias del ambiente. OPS. Lima, Perú
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ANOTACIÓN DE RESULTADOS
A.-
1. Los casos donde no se observa crecimiento en ninguna de las diluciones de la serie
de tubos de tres, se anota como: <3 NMP/ml
2. Los casos donde no se observa crecimiento en ninguna de las diluciones de la serie
de cinco tubos, se anota: <2 NMP/ml
B.- Cuando se utilizan porciones de muestras diferentes a lO ml, 1 ml, 0.1 ml se procede
de la siguiente manera:
1. Cuando se utiliza porciones de 100 ml, 10 ml, 1 ml; registre los resultados dados en
las tablas “A” y “B” multiplicado por 0.1
2. Cuando se utiliza porciones de 1 ml, 0.1 ml, 0.01 ml; registre los resultados dados en
las tablas “A” y “B”, multiplique por 10
3. Cuando se utiliza diluciones seriadas de 0.1 , 0.01, 0.00 1 ; registre los resultados
dados en las tablas “A” y “B”, multiplique por 100
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C.- De utilizarse más de tres diluciones, se anota los resultados de solo tres de los tubos.
En éste caso, se selecciona los tubos positivos de la más alta dilución, tomando en
cuenta lo siguientes:
1. En aquel caso donde se repite los resultados en dos diluciones, solo se toma uno en
cuenta, la dilución más alta. Ej. Caso (a).
Ejemplo
1 ml
0,1 ml
0,01
ml
0,001
ml
Combinación de
tubos positivos
a
b
c
5/5
5/5
0/5
5/5
4/5
1/5
2/5
2/5
0/5
0/5
0/5
0/5
5-2-0
5-4-2
0-1-0
2. Cuando en las cuatro diluciones hay un tubo negativo, ese tubo queda excluido,
tomando en cuenta solo los tres tubos donde hubo crecimiento Ej. Caso (b)
3. Cuando el tubo positivo queda en el medio de dos negativos, se toman en cuenta sus
dos extremos Ej. Caso ( c)
4. Cuando los cuatro tubos den positivos, se suma el resultado de la última dilución a la
antepenúltima Ej. Siguiente:
Diluciones Combinación de
tubos positivos 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml
5/5 3/5 1/5
1/5
1/5+1/5=2/5
5-3-2
Aquellos casos que no aparecen en la tabla, se calcula a partir de la fórmula de Thomas
NMP/100 ml = ____________________Nº de tubos positivos x 100______________
(ml de muestra en tubos negativos)x (ml de muestra en todos los tubos)
