María Alejandra Jaramillo Rodríguez

Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la

obtención de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a

partir de Trichoderma koningiopsis Th003

María Alejandra Jaramillo Rodríguez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería química y ambiental

Bogotá D.C, Colombia

2020

Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la

obtención de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a

partir de Trichoderma koningiopsis Th003

María Alejandra Jaramillo Rodríguez

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Ingeniería Química

Director:

Dr. Ing. Juan Carlos Serrato Bermúdez

Codirectora:

Ph.D. Eddy Johana Bautista Bautista

Línea de Investigación:

Bioproductos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental

Bogotá, Colombia

2020

A la vida, mis padres, hermanos y Alaska.

Agradecimientos

A mis papas y hermanos, por apoyarme en esta locura.

A AGROSAVIA por darme la oportunidad de desarrollar mi trabajo.

A mis directores Eddy Johana Bautista y Juan Carlos Serrato: no he podido dar con

mejores personas, los admiro como personas y como profesionales y no me alcanzaría la

vida para agradecerles por todo lo que aprendí de ustedes y todo el apoyo que me dieron.

Al grupo BAL, especialmente a Leyanis Mesa y Luis Fernando Rodríguez, por todo el

aporte que dieron a este proyecto.

A Carlos Rafael Castillo, por siempre tener la disposición de ayudarme, aún en la distancia.

A mis amigos del laboratorio: Ana María Jiménez, Duván Millán, John Pablo Vargas, Oscar

Monrroy, Stella Rincón … los llevo siempre en el corazón.

A mis amigas de la vida: Melissa Sánchez, Angela Alvarado, Marcela Ramos, Carel

Carvajal, por siempre estar ahí.

A Luis Antonio Soto, por la ayuda en el laboratorio.

A Freddy Escobar: Por salvarme de muchas (siempre).

Finalmente, a ti (Mono), por darme paz y tranquilidad.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La biomasa lignocelulósica es muy abundante en la naturaleza, una parte se genera a

partir de procesos agroindustriales especialmente del sector agrícola. Muchos de estos

materiales no tienen una aplicación directa en la industria, por lo tanto, su acumulación en

grandes cantidades puede generar problemas ambientales. Esto se puede contrarrestar

mediante el uso de estos materiales de bajo costo para generar productos con valor

agregado como enzimas, las cuales tienen una aplicación en diferentes industrias. Este

trabajo tuvo como objetivo el diseño de un proceso de fermentación a partir de bagazo de

caña y salvado de trigo para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de

Trichoderma koningiopsis Th003. Inicialmente se realizó la evaluación de tres métodos de

pretratamiento químico sobre el bagazo de caña: básico con NaOH 5%, ácido H2SO4 2,5%,

y mixto H2SO4 1% + NaOH 4%. Posteriormente, usando una estrategia de diseño

experimental, se establecieron las condiciones físicas (temperatura de fermentación),

biológicas (concentración del inóculo), nutricionales (selección y concentración de fuente

de nitrógeno) del proceso de fermentacíón. Finalmente, a través de técnicas de

optimización se definieron las mejores condiciones nutricionales (selección de la

concentración de las fuentes de carbono y nitrógeno) y fisicoquímicas (pH, altura de lecho

y tamaño de partícula) para la producción de enzimas en un sistema de fermentación en

fase sólida. Las condiciones que favorecieron esta producción fueron: temperatura de

28°C; concentración de inóculo de 1x106 conidios/mL, relación bagazo/salvado 1:0,8;

extracto de levadura 3,2 g/L, pH 5,0; tamaño de partícula 5 cm, y altura de lecho 0,5 cm

con cinco días de fermentación. Con ellas se obtuvieron las siguientes actividades

enzimáticas FPasa 0,275 U/gss, CMCasa 1,834 U /gss, y xilanasa 1261,05 U/gss.

Palabras clave: xilanasas, celulasas, bagazo de caña, fermentación en estado

sólido.

X Título de la tesis o trabajo de investigación

Abstract

Lignocellulosic biomass is the most abundant raw material in nature, a part is generated

from agro-industrial processes, especially in the agricultural sector. Many of these

materials do not have a direct application in industry, therefore their accumulation in large

quantities can generate environmental problems. This can be counteracted by using these

low-cost materials to generate value-added products such as enzymes, which have an

application in different industries. The objective of this work was to design a fermentation

process from sugarcane bagasse and wheat bran for the production of hemicellulolytic and

cellulolytic enzymes from Trichoderma koningiopsis Th003. Initially, the evaluation of three

chemical pretreatment methods was carried out on sugarcane bagasse: basic with 5%

NaOH, 2.5% H2SO4 acid, and mixed H2SO4 1% + NaOH 4%. Subsequently, using an

experimental design strategy, the physical (fermentation temperature), biological (inoculum

concentration), and nutritional (selection and concentration of nitrogen source) conditions

were established. Finally, through optimization techniques, the best nutritional conditions

(selection of the concentration of carbon and nitrogen sources) and physicochemical (pH,

bed height and particle size) for the production of enzymes in a fermentation system were

defined. in solid phase. The conditions that favored this production were: temperature of

28 °C; inoculum concentration of 1x106 conidia / mL, bagasse / bran ratio 1: 0.8; yeast

extract 3.2 g/L, pH 5.0; particle size 5 cm, and bed height 0.5 cm with five days of

fermentation. With them the following enzymatic activities were obtained: FPase 0.275

U/gss, CMCase 1.834 U/gss, and xylanase 1261.05 U/gss.

Keywords: xylanases, cellulases, sugarcane bagasse, solid state fermentation.

Contenido XI

Contenido

Contenido

Introducción .................................................................................................................... 1 Objetivos ....................................................................................................................... 6

Objetivo general ......................................................................................................... 6 Objetivos específicos ................................................................................................. 6

1. Marco teórico ............................................................................................................ 7 1.1 Biomasa lignocelulósica ..................................................................................... 7 1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica .......................................... 7

1.2.1 Celulosa .......................................................................................................... 8 1.2.2 Hemicelulosa ................................................................................................... 8 1.2.3 Lignina ............................................................................................................. 9

1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa lignocelulósica .............................. 9 1.4 Pretratamientos ................................................................................................ 10

1.4.1 Pretratamientos físicos .................................................................................. 10 1.4.2 Pretratamiento químico .................................................................................. 11 1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico .......................................................................... 12 1.4.4 Pretratamiento biológico ................................................................................ 13

1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada ........................................... 13 1.5.1 Hemicelulasas ............................................................................................... 13 1.5.2 Celulasas ....................................................................................................... 15

1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas ................................................... 16 1.7 Procesos de producción de enzimas ................................................................ 16

1.7.1 FES ............................................................................................................... 17 1.7.2 Trichoderma sp .............................................................................................. 18

1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES ......................................................... 19 1.8.1 Biorreactor en bandejas ................................................................................. 19 1.8.2 Biorreactor de lecho empacado ..................................................................... 19 1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio ...................................................................... 20

1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES ............................................................... 20 1.9.1 Temperatura .................................................................................................. 21 1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato ........................................................... 21 1.9.3 Aireación........................................................................................................ 21 1.9.4 pH .................................................................................................................. 22 1.9.5 Tamaño de partícula ...................................................................................... 22

1.10 Parámetros nutricionales de la FES ................................................................. 23 1.10.1 Fuente de carbono ......................................................................................... 23 1.10.2 Fuente de nitrógeno ....................................................................................... 24

XII Título de la tesis o trabajo de investigación

2. Evaluación de pretratamientos químicos para la producción de hemicelulasas y celulasas ..................................................................................................................... 25

2.1 Introducción ........................................................................................................... 25 2.2 Materiales y métodos............................................................................................. 26

2.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 26 2.2.2 Sustrato de fermentación ................................................................................ 27 2.2.3 Pretratamiento del sustrato ............................................................................. 27 2.2.4 FES ................................................................................................................. 28 2.2.5 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 29 2.2.6 Métodos analíticos .......................................................................................... 29 2.2.7 Determinación de la composición química del bagazo de caña y su fracción celulósica ................................................................................................................. 31 2.2.8 Diseño estadístico ........................................................................................... 31

2.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 32 2.3.1 Producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a partir de bagazo de caña pretratado con diferentes métodos de hidrólisis química. ................................ 32 2.3.2. Determinación de la composición química de los residuos agroindustriales usados como medio de fermentación. ...................................................................... 37

2.4. Conclusiones parciales ......................................................................................... 39

3. Selección de parámetros físicos, biológicos y nutricionales para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T. koningiopsis Th003 .................... 41

3.1 Introducción ........................................................................................................... 41 3.2 Materiales y métodos............................................................................................. 43

3.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 43 3.2.2 Efecto de la concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 y la temperatura sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. ......... 43

3.2.3 Selección de la fuente de nitrógeno y de la relación bagazo/salvado para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .............................................. 44

3.2.4 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 45 3.2.5 Métodos analíticos .......................................................................................... 46 3.2.6 Tratamiento estadístico ................................................................................. 46

3.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 47 3.3.1 Influencia de la concentración de inóculo. ....................................................... 47 3.3.2 Efecto de la temperatura de incubación .......................................................... 51 3.3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado ........................ 52

3.4 Conclusiones parciales .......................................................................................... 59

4. Optimización de los parámetros fisicoquímicos y nutricionales y efecto de la aireación sobre la producción de hemicelulasas y celulasas ................................... 61

4.1 Introducción ........................................................................................................... 61 2.3. Materiales y métodos ........................................................................................ 63

4.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 63 4.2.2 Optimización de la concentración del extracto de levadura y la relación bagazo/salvado ........................................................................................................ 63 4.2.2.1 Validación del efecto de los parámetros nutricionales .................................. 64 4.2.3 Efecto de las condiciones fisicoquímicas (pH, tamaño de partícula, altura de lecho) sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .................. 64 4.2.3.1 Validación del efecto de los parámetros fisicoquímicos ................................ 65 4.2.4 Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas .............................................................................................................. 66

Contenido XIII

4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos .................................. 69 4.2.6 Diseño estadístico ........................................................................................... 69

4.3 Resultados y discusión ......................................................................................... 70 4.3.1 Optimización de la concentración de extracto de levadura y la relación bagazo/salvado ........................................................................................................ 70 4.3.2 Optimización del pH, tamaño de partícula y altura de lecho ............................ 77 4.3.3 Efecto de la aireación ...................................................................................... 87 4.3.4 Actividad enzimática antes y después de la optimización ................................ 89

4.4 Conclusiones parciales ......................................................................................... 90

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 93 Conclusiones .............................................................................................................. 93 Recomendaciones ...................................................................................................... 94

Contenido XIV

Lista de figuras

Pág.

Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020) ....................... 8

Figura 2. Actividad FPasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes

pretratamientos. .............................................................................................................. 32

Figura 3. Actividad CMCasa durante 9 días de fermentación usando bagazo pretratado

con diferentes tratamientos. ............................................................................................ 34

Figura 4. Actividad xilanasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes

pretratamientos. .............................................................................................................. 35

Figura 5. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de FPasa de T.

koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 48

Figura 6. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de enzima CMCasa

de T. koningiopsis Th003 ................................................................................................ 49

Figura 7. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de xilanasas de T.

koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 50

Figura 8. Influencia de la temperatura de incubación sobre la producción de FPasa,

CMCasa y xilanasa de T. koningiopsis Th003 ................................................................. 51

Figura 9. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la

producción de enzimas FPasas. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ............ 53

Figura 10. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la

producción de CMCasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ........................ 54

Figura 11. Efecto de la fuente de Nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la

producción de enzimas Xilanasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio .......... 55

Figura 12. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto

de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto

positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 56

Figura 13. Diagrama de contorno de interacción entre la relación bagazo/salvado y

concentración del extracto de levadura (g/L) teniendo como respuesta la producción de

enzimas xilanasas (U/gss) .............................................................................................. 57

Figura 14. Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 (Cruz, 2014). ...... 66

Figura 15. Efecto de la concentración de extracto de levadura y la relación

bagazo/salvado sobre la producción de enzimas FPasa. ................................................ 70

Figura 16. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación

bagazo/salvado sobre la producción de enzimas CMCasa. ............................................ 71

Figura 17. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación

bagazo/salvado sobre la producción de enzimas xilanasa .............................................. 72

Contenido XV

Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto

de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto

positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 75

Figura 19. Gráfico de superficie de respuesta 3D para la actividad xilanasa al día 5 de

fermentación. ................................................................................................................. 76

Figura 20. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de

enzimas FPasa. .............................................................................................................. 78


enzimas CMCasa. .......................................................................................................... 79


enzimas xilanasa. ........................................................................................................... 80

Figura 23. Diagrama de Pareto de los efectos del pH, tamaño de partícula y altura de

lecho sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo

(rojo), efecto negativo (gris). ........................................................................................... 82

Figura 24. Superficie de respuesta (3D) y gráfico de contorno que muestran los efectos

de la interacción para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación. (a,b) efectos

del pH y tamaño de partícula; (c,d) efectos del pH y la altura de lecho; (d,e) efectos del

tamaño de partícula y la altura de lecho. La variable de respuesta aumenta de negro a

rojo ................................................................................................................................. 83

Figura 25. Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas FPasa, CMCasa y

xilanasa al día 5 de fermentación. .................................................................................. 87

XVI Título de la tesis o trabajo de investigación

Contenido XVII

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica ................ 10

Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos ............................................... 14

Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES ......... 17

Tabla 4. Pretratamientos químicos empleados para el bagazo. ..................................... 28

Tabla 5. Composicion del forraje de avena. ................................................................... 37

Tabla 6. Composición química de la fracción celulósica del bagazo antes y después del

tratamiento alcalino y del salvado de trigo ...................................................................... 37

Tabla 7. Tratamientos para evaluar el efecto de la concentración de inóculo de T.

koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44

Tabla 8. Tratamientos para evaluar el efecto de temperatura de incubación de T.

koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44

Tabla 9. Factorial con fuente de nitrógeno orgánica ....................................................... 45

Tabla 10. Factorial con fuente de nitrógeno inorgánica ................................................. 45

Tabla 11. Diseño de tratamientos para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación

bagazo/salvado para cada uno de los diseños factoriales. ............................................. 45

Tabla 12. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5. ................. 55

Tabla 13. Factores y niveles empleados en la optimización relación bagazo/salvado y

fuente de nitrógeno ........................................................................................................ 63

Tabla 14. Diseño central compuesto para la optimización de la fuente de nitrógeno y la

relación bagazo/salvado. ................................................................................................ 63

Tabla 15. Box Behnken para la optimización parámetros fisicoquímicos........................ 64

Tabla 16. Diseño de tratamiento para la optimización de parámetros fisicoquímicos. .... 65

Tabla 17. Dimensiones de los parámetros para evaluar el efecto de la aireación .......... 68

Tabla 18. Tratamientos para evaluar el efecto de la aireación ....................................... 69

Tabla 19. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de

fermentación. ................................................................................................................. 73

Tabla 20. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas

xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 77

Tabla 21. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de

fermentación .................................................................................................................. 81

Tabla 22. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas

xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 84

Tabla 23. Porcentaje de humedad del sustrato al final del proceso de FES. .................. 88

XVIII Título de la tesis o trabajo de investigación

Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización. ......................... 90

Tabla 25. Productividad y porcentaje de aumento de la actividad enzimática con la

optimización .................................................................................................................... 90

Contenido XIX

Introducción

La ganadería bovina en Colombia representa uno de los principales sectores

económicos del país pues aporta el 48,7 % del PIB pecuario, el cual corresponde

al 3,3% del PIB nacional (FEDEGAN, 2019). Los sistemas de producción ganadera

en el país utilizan técnicas de pastoreo para la alimentación de los animales, pues

esta práctica disminuye los costos de mano de obra, sin embargo, pueden tener un

efecto negativo en la productividad, puesto que los efectos producidos por la

estacionalidad y el cambio climático han afectado considerablemente la producción

de leche y carne (FAO, 2020). Durante las épocas secas, hay una disminución en

la disponibilidad de forraje que reduce los niveles productivos por no encontrar

alimento de calidad, y en época de lluvia hay un exceso de forraje que se suministra

al animal en avanzado estado de madurez, el cual no le brinda los nutrientes

necesarios (FAO, 2020). Por tal motivo, el ensilaje se ha convertido en una

alternativa viable y de bajo costo para enfrentar los cambios producidos por las

variaciones climáticas. Sin embargo, Colombia aún no dispone de información

consolidada que demuestre procesos de ensilaje eficientes y controlados

(FENALCE, 2018). Por lo tanto, diversas investigaciones se han centrado en

estandarizar y mejorar los procesos de ensilaje, siendo la inoculación de enzimas

del complejo hemicelulolítico, uno de los factores claves para obtener silos que

puedan satisfacer las necesidades alimentarias del ganado, principalmente en

época de sequía.

El ensilaje, es un proceso de fermentación anaerobia de forraje verde de pastos,

gramíneas, leguminosas o cereales, mediada por la acción de las bacterias ácido-

lácticas (BAL) que transforman los carbohidratos simples en ácido láctico,

provocando la disminución del pH del medio, lo que impide la colonización de

2 Introducción

microorganismos, principalmente patógenos, favoreciendo su conservación (Dogi

et al., 2015). Este proceso proporciona alimento estable para los sistemas de

producción ganadera; sin embargo, la baja concentración de azúcares simples que

presentan algunos forrajes y las malas prácticas de ensilaje, conllevan a una

desestabilización del sistema permitiendo la proliferación de microorganismos no

deseables como Clostridium sp, afectando negativamente la calidad del proceso y

por consiguiente del producto final (Dogi et al., 2015). Para contrarrestar estos

efectos, y que el proceso sea más eficiente, se ha aplicado una mezcla de enzimas

al forraje para aumentar la hidrólisis de polisacáridos complejos logrando la

liberación de los carbohidratos simples, haciéndolos disponibles para las BAL, y

con ello obteniendo mayor concentración de ácido láctico en menor tiempo (Muck

et al., 2018). La adición de estas enzimas a los inoculantes bacterianos ha tenido

un efecto positivo en la calidad del ensilaje, aumentando y mejorando la eficacia de

la alimentación en el ganado de engorde y lechero (Muck et al., 2018). Silva et al,

evaluaron la influencia de la alimentación con silo de maíz tratado con enzimas

hemicelulolíticas y celulolíticas sobre el rendimiento en novillas lactantes,

encontrando que el silo de maíz tratado con enzimas favoreció la ingesta de materia

seca y la digestibilidad de la fibra detergente neutra (FDN), aumentando de esta

manera el tiempo de rumia de las vacas, y la producción de cadenas cortas de

ácidos grasos en el rumen, parámetros que estarían involucrados en el rendimiento

de leche (T. A. L. Silva et al., 2018). Por otro lado, Gandra et al, demostraron que

el uso de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas en el ensilaje de maíz, aumentó

la FDN del ensilaje, la cual al ser suministrada a vacas lactantes mejoró la ingesta

de nutrientes, la fermentación ruminal, la síntesis de proteínas microbianas y la

producción de metabolitos sanguíneos teniendo como resultado mayores

rendimientos en la producción de leche (Gandra et al., 2017).

En AGROSAVIA (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria) se han

venido adelantando estudios para el mejoramiento de los ensilajes principalmente

de avena forrajera (variedad Altoandina), en donde la producción de enzimas y de

inoculantes microbianos a base de BAL han sido uno de sus objetivos (Agrosavia,

2018). De acuerdo con análisis bromatológicos realizados por el Laboratorio de

Introducción 3

microbiología pecuaria de AGROSAVIA, el cultivo de avena forrajera arrojó como

resultado una baja concentración de azúcares libres (0,76-1%), lo que llevaría a

una baja producción de ácido láctico durante el proceso de ensilaje (sin adición de

enzimas), y por consiguiente un proceso deficiente. Sin embargo, se observaron

altos porcentajes de celulosa (22,09%) y hemicelulosa (36,91%) en el forraje, que

con la inoculación de enzimas se podrían hidrolizar y de esta manera aumentar los

azúcares libres, principalmente glucosa, xilosa, manosa, galactosa y arabinosa,

favoreciendo la producción de ácido láctico por parte de las BAL.

Adicionalmente, las esporas del hongo T. koningiopsis Th003 son el principio activo

del bioplaguicida Tricotec y han sido objeto de varios estudios en AGROSAVIA por

sus características para el control biológico de diferentes patógenos en cultivos de

tomate, lechuga y arroz. Este bioplaguicida se produce en un proceso de

fermentación en estado sólido usando granos de cereal como sustrato (Corpoica.,

2010). Se ha podido demostrar que este hongo además de su capacidad

antagónica tiene un alto potencial para producir una amplia variedad de enzimas

hidrolíticas, especialmente celulasas (11,149 ± 0,523 U/gss de FPasa, 10,94 ±

0,276 U/gss de CMCasa) y xilanasas (115,8 ± 1,08); sin embargo, la concentración

lograda es baja, en comparación con las actividades de otros microorganismos

pertenecientes al mismo género, pues el sustrato de fermentación en el que se

produce masivamente no está diseñado para este propósito (Bautista, Jiménez,

Chavarro-anzola, & Gómez, 2018).

Por tal motivo, es necesaria la búsqueda de sustratos que favorezcan la producción

de enzimas hidrolíticas para poder ser adicionadas a los procesos de ensilaje.

En ese sentido, la biomasa lignocelulósica es una de las materias primas más

abundantes en la naturaleza, gran parte se genera a partir de procesos

agroindustriales especialmente del sector agrícola (Bill & Ozkan, 2019). Se ha

demostrado que estos materiales son una importante fuente de energía renovable,

con potencial para la producción de biocombustibles, generación de energía,

compuestos químicos y orgánicos, entre otros (Chun, Zhenquan, & Yeong, 2019).

4 Introducción

Uno de los muchos ejemplos de esta biomasa es la producida por el sector

industrial de la caña, del procesamiento de arroz y el café. De acuerdo con cifras

de la Unidad de Planeación Minero-Energética de Colombia, para el año 2019 se

produjeron alrededor de 9 millones de toneladas de biomasa residual procedentes

de estas industrias, de las cuales 1.871.023 toneladas corresponden a desechos

de bagazo de caña (Asocaña, 2019), 2.564.250 toneladas corresponden a tamo de

arroz (Fedearroz, 2019) y 3.420.000 a pulpa de café (Asocafé, 2019). Por tal

motivo, existe un alto potencial para el uso de la biomasa lignocelulósica que se

genera a partir de los procesos productivos agrícolas (Y. P. Castro, 2014). En

general, la biomasa lignocelulósica está compuesta por celulosa, hemicelulosa y

lignina. La celulosa es el polímero orgánico en mayor proporción y está compuesto

por monómeros de D-glucosa unidos entre sí por enlaces glucosídicos β-1,4. La

hemicelulosa es un heteropolisacárido ramificado de hexosas (D- glucosa, D-

galactosa y D- manosa) y pentosas (D- xilosa y L- arabinosa). La lignina es un

biopolímero aromático y rígido con un alto peso molecular. La celulosa y la

hemicelulosa están estrechamente vinculadas con la lignina mediante enlaces

covalentes y puentes de hidrógeno, lo que hace que la estructura de la biomasa

sea robusta con una alta resistencia a los ataques biológicos y físicos (Cheah et

al., 2020).

Como se mencionó anteriormente, entre los residuos lignocelulosicos

agroindustriales de interés en Colombia estan el bagazo y el salvado de trigo, los

cuales van a ser utilizados en esta investigación. A pesar del uso que se les da a

esos residuos, grandes cantidades se acumulan en las plantas de procesamiento

convirtiéndose en una fuente de contaminación. No obstante, esta biomasa es

recalcitrante al ataque enzimático, ya que, la lignina actúa como una barrera que

interfiere en la accesibilidad de las enzimas para hidrolizar la celulosa y la

hemicelulosa y por tanto en su aprovechamiento (Philippini, Martiniano, Chandel,

Carvalho, & Silvio, 2019). Para reducir dicha recalcitrancia, se aplican

pretratamientos químicos, físicos, y termoquímicos, que afectan la composición y

estructura del material vegetal. Particularmente, los métodos alcalinos,

Introducción 5

hidrotérmicos, y ácidos son los más comúnmente utilizados para mejorar la

sacarificación enzimática (Savou et al., 2019). Los tres métodos de pretratamiento

tienen diferentes ventajas y desventajas con respecto a los requerimientos

energéticos y la facilidad del proceso, por tal motivo, se ha buscado el desarrollo

de pretratamientos combinados que requieran bajos niveles energéticos, sean de

fácil manejo y mejoren la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica (Philippini et al.,

2019).

Posteriormente, se logra la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica previamente

tratada mediante la acción sinérgica de diferentes enzimas entre las que se

encuentran las xilanasas y celulasas (Yang, Yang, Duan, Alexandra, & Wang,

2019). Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos,

específicamente hongos del género Trichoderma. Se ha reportado que este hongo

es capaz de producir 0,26 U/gss de FPasa, 64,54 U/gss de CMCasa, 1130,70 U/gss

de xilanasas (Alves et al., 2013), las cuales son producidas para diferentes

aplicaciones industriales como la producción de azúcares fermentables utilizados

para biocombustibles, prebióticos, textiles y la industria de pulpa y papel. Sin

embargo, como fue mencionado anteriormente, una de las aplicaciones que se ha

venido desarrollando dada la necesidad de intensificar los sectores productivos,

especialmente del sector ganadero, es el mejoramiento de las propiedades del

ensilaje por acción enzimática para alimentación bovina (Muck et al., 2018).

Por lo anterior, la producción de enzimas celulolíticas por T. koningiopsis Th003

puede constituir un paso importante para el mejoramiento de los procesos de

ensilaje que se están llevando a cabo en AGROSAVIA para la alimentación de

ganado bovino a partir de avena Altoandina. La optimización del medio de cultivo y

las condiciones de operación, principalmente la relación carbono: nitrógeno:

fósforo, el pH del medio, temperatura y tiempo de incubación, humedad y el tamaño

del inóculo son parámetros a tener en cuenta para la producción de celulasas y

hemicelulasas (Taherzadeh-ghahfarokhi, Panahi, & Mokhtarani, 2019).

6 Introducción

Por lo anterior, surge la pregunta de investigación ¿cuáles son los parámetros

fisicoquímicos y nutricionales para un proceso de fermentación en estado sólido

que favorecen la producción de enzimas del complejo hemicelulolítico?

Para dar respuesta a la pregunta de investigación, se presentarán cinco capitulos

en los cuales, en el primer capítulo se mostrará una recopilación de investigaciones

previas y consideraciones teóricas en las que se sustenta el proyecto de

investigación, permitiendo la interpretación de los resultados y la formulación de las

conclusiones. En el capítulo 2 se estudian los pretratamientos realizados al sustrato

de fermentación para la producción enzimática. En el capitulo 3, se presentan los

resultados de la selección de parámetros físicos como la temperatura de

incubación, biológicos como la concentración de inóculo y nutricionales como la

selección de la fuente de nitrógeno para la mayor producción de ezimas en un

proceso de fermentación en fase solida. Posteriormente, en el capítulo 4 se

muestran los resultados de las optimizaciones nutricionales, fisicoquímicas y el

efecto de la aireación en el proceso de fermentación, y por último las conclusiones

y recomendaciones.

Objetivos

Objetivo general

Diseñar un proceso de fermentación a partir de bagazo de caña y salvado de trigo para la

producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa de T. koningiopsis

Th003.

Objetivos específicos

▪ Evaluar diferentes métodos de hidrólisis química sobre el bagazo de caña como

pretratamiento para la producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa.

▪ Establecer a escala laboratorio las condiciones fisicoquímicas y nutricionales del

proceso de fermentación que favorezcan la producción de enzimas hemicelulolíticas y

celulolíticas.

1. Marco teórico

1.1 Biomasa lignocelulósica

La biomasa lignocelulósica es uno de los recursos renovables de carbono orgánico en la

naturaleza (Liao, Latif, Trache, Brosse, & Hussin, 2020). Las diferentes fuentes de biomasa

lignocelulósica son los residuos agrícolas (hojas,pajas), residuos pecuarios (estiércol),

biomasa forestal (cedro, abeto, sauce), desechos forestales (aserrín, madera), desechos

industriales (pulpas) y desechos municipales (desechos de alimentos) (Su, Zhao,

Khodadadi, & Len, 2020). Es considerada como una de las materias primas más

prometedoras para la producción de biocombustibles y otros productos químicos debido a

que es renovable, no compite con la producción de alimentos, además ayuda en la

reducción de emisión de gases de efecto invernadero (Alayoubi et al., 2020).

Algunos de los residuos agroindustriales más utilizados a nivel mundial para la producción

de diferentes productos son: bagazo de caña, residuos de yuca, bagazo de naranja, pulpa

de café, salvado de trigo, entre otros (Ferreira, Mahboubi, Lennartsson, & Taherzadeh,

2016). Los componentes básicos de estos materiales son principalmente: lignina, celulosa,

hemicelulosa, almidón, pectina y fibras.

1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica

La pared celular de la biomasa lignocelulósica consiste en una mezcla compleja de

polisacáridos y otros polímeros, organizados por medio de un conjunto de enlaces

covalentes y no covalentes. Es una matriz amorfa que contiene pectina, proteínas, lignina,

hemicelulosa y celulosa que es conocida como complejo lignocelulósico (Figura 1).

8 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis

Th003

1.2.1 Celulosa

La celulosa está constituida por una larga cadena de monómeros de glucosa que se unen

entre sí mediante enlaces β-1,4, lo que le otorga la característica de ser insoluble en agua.

Estos enlaces forman cadenas lineales de glucosa estables que son resistentes a los

tratamientos físicos y químicos principalmente por la interacción de los puentes de

hidrógeno (Laluce, Roldan, Pecoraro, Igbojionu, & Ribeiro, 2019).

1.2.2 Hemicelulosa

La hemicelulosa es la estructura que sirve de conexión entre la lignina y la celulosa. A

diferencia de la celulosa, la hemicelulosa es un heteropolímero de cadena corta más

amorfo, ramificado y aleatorio lo que facilita las reacciones de hidrólisis que dan lugar a

azúcares fermentables (Laluce et al., 2019). Está compuesta principalmente por hexosas

(glucosa, galactosa, manosa, ramnosa, fructosa) y pentosas (xilosa y arabinosa).

Hemicelulosa Celulosa

Biomasa

lignocelulósica Lignina

Pared

celular

Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020)

Capítulo 1 9

Adicionalmente también se pueden encontrar ácidos como el ácido galacturónico,

glucurónico, etc (Liao et al., 2020).

1.2.3 Lignina

La lignina después de la celulosa es el segundo biopolímero más abundante sobre la tierra.

Su función es rodear y proteger las fibras de celulosa, otorgándole mayor rigidez y

resistencia al ataque enzimático a la estructura vegetal. Es un heteropolisacárido fenólico

altamente complejo que consta de tres monómeros diferentes: alcoholes cumarílico,

coniferílico y sinapílico, los cuales están unidos entre sí por enlaces éter, y a su vez estan

unidos a la celulosa y a la hemicelulosa (Jatuwong et al., 2020). La estructura de la lignina

depende principalmente del tipo de material vegetal, por lo tanto no ha sido posible

establecer una estructura definida (Laluce et al., 2019).

1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa lignocelulósica

Debido a las propiedades de los polímeros presentes en la estructura de la biomasa

lignocelulósica y a la interacción entre ellos, la biomasa lignocelulósica exhibe una

resistencia biológica, química y mecánica que dificulta la separación de sus tres

componentes principales (lignina, hemicelulosa y celulosa), y que le da su conocida

recalcitrancia (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Para reducir esta última y aprovechar

la hemicelulosa y la celulosa, se pueden aplicar diferentes tratamientos físicos, químicos

y/o biológicos, que afectan la composición y estructura del material vegetal con el fin de

obtener diferentes productos de interés industrial (Cheah et al., 2020).

Una variedad de pretratamientos han sido desarrollados con el objetivo de desintegrar la

fracción reticulada de la biomasa lignocelulósica para mejorar la accesibilidad a la celulosa

y la hemicelulosa por acción de enzimas celulasas y hemicelulasas respectivamente (de

Oliveira Gorgulho Silva & Filho, 2017). A continuación, se presentarán algunos de estos

métodos, sus ventajas y desventajas.


Th003

1.4 Pretratamientos

Un pretratamiento efectivo debe ser capaz de: 1) mejorar los rendimientos del azúcar para

su posterior procesamiento, 2) tratar todo tipo de biomasa lignocelulósica, 3) ayudar en la

disminución en la formación de coproductos o inhibidores y 4) minimizar los costos de

energía y operación (Cheah et al., 2020). Por tal motivo, se han evaluado una variedad de

pretratamientos para determinar su efectividad hacia la biodegradación de la celulosa y la

hemicelulosa (Tian, Zhao, & Chen, 2018). La elección de los métodos de pretratamiento

depende del factor económico, el tipo de materia prima y sus impactos ambientales (R.

Kumar, Singh, & Singh, 2008). La tabla 1 muestra un resumen de los métodos de

pretratamiento más utilizados para la desintegración de la biomasa lignocelulósica.

Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica

Químicos Físicos Fisicoquímicos Biológicos

- Acido

- Alcalino

- Organosolv

- Oxidativo

- Molienda

- Extrusión

- Congelación

- Ultrasonido

- Irradiación

- Explosión de

vapor

- Explosión

con

amoniaco

- Percolación

- Agua

caliente

- Bacterias

- Hongos

1.4.1 Pretratamientos físicos

Los pretratamientos físicos como la molienda, la extrusión, congelación, ultrasonido y la

irradiación se aplican sobre la biomasa. La extrusión es un método reconocido utilizado

para producir carbón y productos gaseosos, en donde la biomasa lignocelulósica se trata

a temperaturas superiores a 300°C con una mezcla de cizallamiento para eliminar y acortar

la fibras de la biomasa (Cheah et al., 2020).

Capítulo 1 11

La molienda es otro de los pretratamientos físicos utilizados, ya que aumenta el área de

superficie específica y reduce la cristanilidad de la celulosa para la hidrólisis enzimática

(Rezania et al., 2020).

La biomasa lignocelulósica puede pretratarse usando el método de congelación; el

volumen de agua cambia a medida que se transforma de líquido a sólido a bajas

temperaturas. A medida que el agua se difunde en la biomasa, el volumen de agua

aumenta durante la congelación, lo que resulta en la descomposición de las paredes

celulares (Rooni, Raud, & Kikas, 2017).

El pretratamiento con ultrasonido es otra alternativa, a través de la deslignificación y

erosión de la superficie, ofrece un tiempo de corto de procesamiento, una temperatura de

funcionamiento más baja y menos uso de productos químicos; la eficiencia de este

pretratamiento varía dependiendo del solvente utilizado, la frecuencia ultrasónica y el

diseño del reactor (Cheah et al., 2020).

La irradiación con microondas proporciona una operación fácil. Sin embargo, la duración

de la irradiación es un factor importante a tener en cuenta para un tratamiento efectivo. Un

mayor tiempo de exposición puede conllevar a la producción de inhibidores y la

degradación de los azúcares ya presentes (Soltanian et al., 2020).

En general, los petratamiento físicos son difíciles de escalar ya que incurren en altos costos

de operación y energía (Abraham et al., 2020).

1.4.2 Pretratamiento químico

Los pretratamientos químicos son los más aplicados a escala comercial. Los productos

químicos aplicados pueden ser: ácidos (orgánicos e inorgánicos), álcalis, y líquidos iónicos

(Liao et al., 2020).

▪ Pretratamiento ácido

Este pretratamiento es uno de los pretratamientos más utilizados. Consiste en exponer la

biomasa a una solución ácida, donde el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico y

el ácido clorhídrico se usan típicamente. El proceso se puede llevar a cabo a temperaturas

mayores a 180°C durante uno a cinco min, o temperaturas bajas (<120 ° C) pero con


Th003

tiempos de contacto más largos (30-90 min); también se puede realizar a temperaturas

menores a 100°C pero con concentraciones más altas de ácidos (30-70%) o viceversa: a

temperaturas más altas (100-250 °C) con ácidos diluidos (<10%) (Baruah et al., 2018). Las

desventajas de la utilización de este pretratamiento incluyen: 1) La producción de

inhibidores como: furfural, hidroximetil furfural, ácido fórmico, entre otros; 2) la naturaleza

corrosiva del ácido y 3) pérdida de azúcares fermentables debido a las reacciones de

degradación mediadas por el ácido (M. F. Li, Yang, & Sun, 2016).

▪ Pretratamiento alcalino

Es caracterizado por su efectividad para remover la lignina de la biomasa, a través de la

ruptura de los enlaces que la unen con la hemicelulosa y la celulosa. La hemicelulosa se

solubiliza, sin embargo, lo hace en menor proporción que con los pretratamientos

hidrotérmicos y ácidos. Los puentes de hidrógeno entre la cadena de glucanos se rompen

parcialmente permitiendo que la celulosa esté más disponible, además se generan menos

inhibidores. Soluciones básicas de hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH),

hidróxido de calcio (Ca(OH2)) son las más utilizadas (de Oliveira Gorgulho Silva & Filho,

2017)

▪ Pretratamiento organosolv

Es una mezcla de solventes orgánicos capaces de extraer la lignina y solubilizar la

hemicelulosa. Los solventes que se usan comúnmente para catalizar el proceso

organosolv son: metanol, etanol, acetona, etilenglicol, ácido oxálico, ácido salicílico y ácido

acetil salicílico. Está técnica conduce a la deslignificación e hidrólisis completa de la

hemicelulosa (Cheah et al., 2020).

1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico

La biomasa lignocelulósica también puede tratarse física y químicamente en combinación,

como por ejemplo la molienda (pretratamiento físico) se puede realizar junto con el

pretratamiento alcalino (pretratamiento químico) para mejorar la eficiencia del

pretratamiento. En general esta combinación de métodos es efectiva para modificar la

estructura lignocelulósica en tiempos reducidos y a bajo costo (de Oliveira Gorgulho Silva

& Filho, 2017).

Capítulo 1 13

1.4.4 Pretratamiento biológico

Algunas especies de hongos y las bacterias son capaces de tratar biológicamente la

biomasa lignocelulósica, al modificar su estructura e hidrolizarla en sustratos mas simples.

Este pretratamiento elimina la lignina mediante la utilización de hongos de podredumbre

marrón o blanca, exponiendo la celulosa y la hemicelulosa al ataque enzimático

microbiano. Los hongos de podredumbre blanca promueven la degradación de la lignina a

través de una variedad de enzimas ligninolíticas oxidativas, como la lignina peroxidasa,

manganeso peroxidasa y lacasas (B. Kumar, Bhardwaj, Agrawal, Chaturvedi, & Verma,

2020). Este pretratamiento está influenciado por varios factores, incluidos factores físicos

como la temperatura, la humedad, el tiempo de incubación, la aireación, el tamaño de

partícula, el área superficial accesible, entre otros; factores químicos como pH y la

composición del sustrato; y factores biológicos como los consorcios de microorganismos,

su interacción y competencia, que requieren mucho tiempo y un estrecho seguimiento a

estas condiciones (A. Kumar, Anushree, Kumar, & Bhaskar, 2020). Sin embargo, las

ventajas que presenta es la baja utilización de energía y la no utilización de químicos

(Rezania et al., 2020).

1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada

Varios microorganismos son capaces de producir enzimas que degradan la celulosa y la

hemicelulosa de la pared celular de las plantas para generar compuestos de alto valor

industrial. Estas enzimas se conocen como celulasas y hemicelulasas, las cuales son

secretadas como metabolitos extracelulares por hongos filamentosos, actinomicetos y

algunas bacterias aerobias (Bajaj & Mahajan, 2019).

1.5.1 Hemicelulasas

Las hemicelulasas o xilanasas son enzimas glicosidasas que catalizan la hidrólisis de los

enlaces 1,4-β-D xilosídicos del xilano presente en la hemicelulosa, lo que conlleva a la

liberación de xilosa. La hidrólisis de la hemicelulosa requiere de varias enzimas que tienen

diversos modos de acción: endoxilanasa y exoxilosidasa (β-xilosidasa) (Yang et al., 2019).

▪ Las endoxilanasas (endo-1,4-β-xilanasa (EC 3.2.1.8) y endo-1,3-β-xilanasa (EC

3.2.1.32)) catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D-xilosídicos y 1,3-β-D-xilosídicos


Th003

respectivamente, de la cadena principal del xilano de manera aleatoria liberando

xilooligosacáridos, lo que reduce el grado de polimerización de la hemicelulosa.

▪ Las exoxilanasas (exo-1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y exo-1,3-β-xilosidasa (EC

3.2.1.72)), catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D y 1,3-β-D de los extremos no

reductores de los xilooligosacáridos liberando xilobiosa y xilosa respectivamente.

Cuando la hemicelulosa presenta ramificaciones, la hidrólisis se ve favorecida por la acción

de enzimas como las glucuronidasas, arabinasas, acetil xilano esterasas, ácido ferúlico

esterasas y ácido p-cumárico esterasas, que hidrolizan las cadenas laterales. Sin embargo,

la determinación de la actividad hemicelulolítica, se hace a partir de las endoxilanasas,

debido a la dificultad de purificar las otras enzimas del complejo hemicelulósico (V. Kumar,

Dangi, & Shukla, 2018).

▪ Microorganismos productores de hemicelulasas

Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos incluidos

hongos filamentosos, levaduras y bacterias.

Los hongos filamentosos han sido usados como productores potentes de enzimas a nivel

industrial, especialmente de enzimas hidrolíticas como las xilanasas. Los genomas de

hongos como Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Phialophora sp., Malbranchea

pulchella y Myceliophthora thermophila codifican para una diversidad de enzimas que

hidrolizan los componentes de la hemicelulosa (Basit, Liu, Rahim, Jiang, & Lou, 2018). Sin

embargo, en estudios recientes se ha podido demostrar que los mejores microorganismos

para la producción de xilanasas son: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Penicillium

sp., Fusarium oxysporum, y Humícola sp (Tabla 2) (Corrêa et al., 2014).

Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos

Microorganismo Unidades de actividad

xilanasa Referencia

Aspergillus niger 42,5 U/g

(Alokika & Singh, 2019)

Trichoderma harzianum 288 U/mL

Penicillium canescens 8932 U/g

Capítulo 1 15

Fusarium oxysporum 1840 U/g

Humicola laniginose 7832 U/g

1.5.2 Celulasas

Las celulasas, son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4 de la celulosa para liberar

oligosacáridos, celobiosa y glucosa (Patel, Singhania, Sim, & Pandey, 2019). Según el

modo de acción, existen tres tipos de celulasas: endoglucanasas, exoglucanasas, y β-

glucosidasa (EC 3.2.1.21) (Yang et al., 2019).

▪ Endoglucanasa (β-1,4-endoglucanasa (EC3.2.1.4): hidroliza al azar los sitios amorfos

de la celulosa, generando cadenas más cortas (oligosacáridos), y nuevos extremos en

la cadena.

▪ Exoglucanasa (celobiohidrolasa (EC3.2.1.91) y celodextrinasa (EC3.2.1.74)):

Hidrolizan los extremos reductores y no reductores de la cadena de celulosa y de los

oligosacáridos produciendo celobiosa.

▪ β-glucosidasa: actúa sobre la celobiosa liberada por las exoglucanasas para liberar

monómeros de glucosa.

Estas celulasas pueden actuar en la cadena de celulosa solas o en combinación. Sin

embargo, la acción de dos o más enzimas celulasas de manera sinérgica, facilita la

degradación de la estructura celulósica (Shokrkar, Ebrahimi, & Zamani, 2018).

▪ Microorganismos productores de celulasas

Existe una gran variedad de microorganismos que realizan la hidrólisis de la celulosa. Se

han aislado complejos enzimáticos de un sinnúmero de bacterias, particularmente

bacterias anaerobias presentes en los sistemas digestivos de bovinos (Garvey, Klose,

Fischer, Lambertz, & Commandeur, 2013). No obstante, los hongos son los

microorganismos más estudiados para la producción de estas enzimas debido a la gran

variedad de enzimas que pueden producir cuando se inducen adecuadamente, además

que estas son producidas de manera extracelular lo que facilita su separación.

Trichoderma reesei, es el hongo más extensamente estudiado. Otros de los géneros más

estudiados son: Humicola sp, Penicillium sp y Aspergillus sp. (H. Wang, Zhai, & Geng,

2020).


Th003

1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas

Se han encontrado diversas aplicaciones de las celulasas y hemicelulasas en la industria.

Estudios recientes han demostrado que la aplicación de xilanasas y celulasas tiene un

papel importante en la industria de alimentos y concentrados (Alokika & Singh, 2019).

Recientemente, las investigaciones se han centrado en el desarrollo de mejores alimentos

para los animales con el fin de aumentar el rendimiento de productos como leche, carne y

huevos (Thapa et al., 2019).

Otra de las aplicaciones importantes actualmente es la utilización de enzimas en la

industria de pulpa y papel. El proceso de blanqueamiento químico es el proceso

convencional en la fabricación de papel, este proceso requiere altas temperaturas (de

hasta 170°C) y productos químicos como el Cl2, ClO2 y NaClO para la eliminación de la

lignina (Basit et al., 2018). Estos agentes, en altas concentraciones son cancerígenos,

mutágenicos y causan contaminación ambiental. Por consiguiente, el uso de enzimas

como las xilanasas, es una alternativa ecológica para reducir el tiempo de procesamiento,

el consumo de energía y el uso de productos químicos tóxicos (Alokika & Singh, 2019).

Las xilanasas y celulasas se usan para degradar los sustratos lignocelulósicos, en

azúcares fermentables, que posteriormente se fermentan en bioetanol, biobutanol,

acetoína y 2,3-butanodiol, entre otros (Bala & Singh, 2019).

Las enzimas en los detergentes ayudan a mejorar la blancura de la tela, su color, suavizan

el algodón y aumentan la eficiencia en la limpieza de manchas y la suciedad clásica como

la hierba, la grasa animal, vegetal, entre otros. Además, las celulasas contribuyen a

modificar la estructura de la fibra de celulosa para mejorar el brillo del color y el cuidado

general del tejido (Basit et al., 2018).

1.7 Procesos de producción de enzimas

La producción de enzimas se puede llevar a cabo en procesos de fermentación en estado

líquido (FEL) o procesos de fermentación en estado sólido (FES). La FEL implica el

crecimiento de los microorganismos en un medio líquido el cual permite mantener las

Capítulo 1 17

condiciones del medio homogeneas, (Uday, Choudhury, Bandyopadhyay, & Bhunia, 2016),

mientras que la FES es el proceso en el que los microorganismos crecen sobre materiales

sólidos, sin la presencia de agua libre. La FES es utilizada principalmente para el cultivo

de hongos filamentosos, permitiendo una mayor productividad enzimática en comparación

con las FEL (Farinas, 2015). Adicionalmente, las enzimas producidas en FES son menos

susceptibles a problemas de inhibición por sustrato, y son más estables a los cambios de

temperatura, y pH (Farinas, 2015).

1.7.1 FES

La FES es un proceso de fermentación que emplea una matriz sólida ya sea natural o

inerte, con la humedad necesaria para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos,

es decir, ocurre en ausencia de agua libre (Farinas, 2015). La matriz sólida puede ser la

fuente de nutrientes o un soporte saturado con los nutrientes adecuados que permitan el

desarrollo de los microorganismos.

Desde una perspectiva ambiental, la FES presenta una importante ventaja sobre la

fermentación en estado líquido (FEL), la cual, es la posibilidad de utilizar residuos

agroindustriales sólidos como sustrato que simulan al hábitat natural del microorganismo,

además hay bajo riesgo de contaminación por parte de bacterias debido a la baja humedad

que requiere el proceso y por consiguiente hay baja producción de efluentes al final del

proceso, los cuales sirven como fuente de carbono y energía para la producción de

productos de interés. En la Tabla 3., se presentan algunos ejemplos de producción de

enzimas a partir de hongos utilizando residuos agroindustriales en FES.

Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES

Hongos Residuo

utilizado

Enzimas que

producen Referencia

Aspergillus niger Pulpa cítrica Fitasas (Jatuwong et al., 2020)

Pleurotus ostreatus Bagazo de

caña Lacasas (F. Wang et al., 2019)

Trichoderma

harzianum

Bagazo de

caña

pretratado

Xilanasas (Alokika & Singh, 2019)


Th003

Penicillium

canescens Paja de trigo Xilanasas (Alokika & Singh, 2019)

Aspergillus oryzae Harina de trigo Proteasas (R. J. S. de Castro & Sato,

2015)

Penicillium

verrucosum

Pulpa de café

pretratada Tanasas (Aharwar & Parihar, 2018)

Aspergillus sp Cáscara de

naranja Pectinasas

(Patidar, Nighojkar, Kumar, &

Nighojkar, 2018)

Ganoderma

lucidum Hoja de piña

Manganeso

peroxidasas

(Lizardi-Jiménez &

Hernández-Martínez, 2017)

Fusarium

oxysporum

Paja de trigo y

mazorca de

maíz

Celulasas (Ferreira et al., 2016)

1.7.2 Trichoderma sp

Trichoderma sp es un género perteneciente a la familia Hypocreaceae. Es un

microorganismo de vida libre, aerobio y puede crecer y desarrollarse en suelos con pH

neutro hasta ácido (Nathan, Esther Rani, Rathinasamy, Dhiraviam, & Jayavel, 2014). Son

cosmopolitas en su distribución y podrían aislarse fácilmente de la madera en

descomposición, de diferentes formas de materia orgánica y del suelo. Puede

caracterizarse por la producción masiva de conidios de varios tonos de color verde y un

rápido crecimiento sobre diferentes medios de cultivo (Adnan et al., 2019). Ha sido utilizado

ampliamente como agente de control biológico ya que tiene la capacidad de producir un

complejo de enzimas hidrolíticas y de metabolitos antimicrobianos, que tienen efecto

antagónico sobre una amplia gama de fitopatógenos transmitidos por las semillas y el

suelo. Además, por la gran diversidad de enzimas que es capaz de producir, está implicado

en la transformación de compuestos lignocelulósicos para obtener productos de interés

industrial (Fraceto et al., 2018). Debido a esto, varias especies de Trichoderma sp. han

adquirido importancia industrial y sus formulaciones actualmente se comercializan en todo

el mundo a escala industrial, utilizando diferentes sustratos principalmente residuos

Capítulo 1 19

agroindustriales. Hasta la fecha, las especies de Trichoderma más utilizadas para la

producción de celulasas y xilanasas son T. viride, T. reesei, T. virens, T. asperellum, T.

tubingensis. Siendo T. reesei el gran exponente en este género (Ezeilo, Lee, Huyop,

Zakaria, & Wahab, 2019a), ya que ha sido ampliamente producido a escala industrial por

su capacidad de producir celobiohidrolasas (CBHI y CBHII), endoglucanasas (GE1 y GE2),

y xilanasas con diferentes fines industriales (Astolfi et al., 2019).

1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES

Diferentes tipos de biorreactores han sido utilizados para la producción de enzimas en

sistemas FES, la mayoría de ellos a escala laboratorio. Sin embargo, otros biorreactores

como: bandejas, tambor rotatorio, lecho empacado y lechos fluidizados también han sido

empleados (Shokrkar et al., 2018) y serán descritos a continuación.

1.8.1 Biorreactor en bandejas

El biorreactor tipo bandeja utiliza bandejas planas, donde el sustrato se fija sobre la

superficie, creando una capa de entre 1,5 cm y 2 cm. Las bandejas son colocadas en un

cuarto con temperatura constante y con circulación de aire húmedo (Farinas, 2015). El uso

de bandejas es uno de los métodos más simples para la FES. La aplicación de este tipo

de biorreactor a escala industrial ofrece ciertas ventajas como por ejemplo la baja

utilización de energía ya que no necesita agitación durante el proceso, adicionalmente

ofrece un proceso de fácil operación y bajo costo (Thomas, Larroche, & Pandey, 2013).

Sin embargo, el intercambio gaseoso es limitado creando dificultades en la transferencia

de masa y energía (Shokrkar et al., 2018). Este tipo de reactores son ideales para la

fabricación en volumenes relativamente pequeños, no obstante, puede no ser atractivo

para procesos a gran escala ya que se requieren grandes espacios para la instalación de

equipos y mucha mano de obra.

1.8.2 Biorreactor de lecho empacado

Es utilizado frecuentemente en FES por ser un proceso de bajo costo y ser espacialmente

eficiente. Este sistema consiste en columnas en las cuales el sustrato sólido se sostiene

sobre una base perforada desde la cual se inyecta aire a través del sustrato. Este tipo de


Th003

biorreactores es ideal para sustratos que no necesiten mezcla debido al efecto adverso

que puede causar sobre el crecimiento o la estructura del producto final. Adicionalmente

se pueden equipar con controles de temperatura durante el proceso de fermentación

(Farinas, 2015).

Los biorreactores de lecho empacado son comúnmente utilizados para la hidrólisis de

biomasa lignocelulósica para la obtención de enzimas; sin embargo, a gran escala no es

utilizado comúnmente debido a las dificultades relacionadas con la caída de presión y la

canalización cuando al sistema se le inyecta un alto flujo de aire. Otros inconvenientes

asociados con el uso de este biorreactor son el crecimiento no uniforme del

microorganismo y la dificultad para la transferencia de calor dentro del sistema (Singhania,

Patel, Soccol, & Pandey, 2009).

1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio

Este biorreactor consiste en un tambor con o sin paletas, que gira para mezclar el sustrato

de fermentación. El tambor rotatorio con paletas fue diseñado para proveer una adecuada

aireación y homogenización del sustrato por que proporciona una mejor transferencia de

oxígeno dentro del sistema y reduce la aglomeración de partículas del sustrato durante el

crecimiento microbiano (Shokrkar et al., 2018).

1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES

Hay varios factores importantes involucrados en el éxito de una FES. Estos factores

incluyen: la selección del microorganismo, la selección del sustrato, y los parámetros

óptimos del proceso. Los hongos y levaduras son los microorganismos más utilizados en

este tipo de procesos por tener bajos requerimientos de humedad (Singhania et al., 2009).

La eficiencia de los procesos de FES para obtener productos de interés depende

principalmente de las condiciones fisicoquímicas, operativas y ambientales. La

temperatura, el pH, la humedad, aireación, la porosidad, el tamaño de partícula y la

capacidad de absorción del sustrato utilizado, son las variables clave que influyen en los

procesos de FES (Farinas, 2015).

Capítulo 1 21

1.9.1 Temperatura

La temperatura es uno de los parámetros que más afectan los procesos de FES. En niveles

extremos de temperatura, puede tener efectos desfavorables en el crecimiento del

microorganismo y la producción de metabolitos, especialmente se puede dar la

desnaturalización de las enzimas producidas (Raghavarao, Ranganathan, & Karanth,

2003). Por tal motivo, la caracterización del microorganismo de interés, particularmente la

influencia de la temperatura sobre la cinética de crecimiento y de producción de enzimas,

es esencial para el desarrollo de este tipo de bioprocesos.

1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato

El agua tiene varias funciones en un bioproceso: ayuda en la difusión de los nutrientes

dentro del sistema de fermentación para ser tomados por los microorganismos y en la

estabilidad y mantenimiento de la función biológica de proteínas, carbohidratos,

nucleótidos; entre otros (R. J. S. de Castro & Sato, 2015).

Un bajo contenido de agua puede reducir las tasas de crecimiento microbiano, y puede

reducir la formación de los productos de interés. Si el contenido de humedad es muy alto,

los espacios vacíos entre el sustrato son llenados por el agua, lo que dificulta la difusión

gaseosa, impidiendo la transferencia de oxígeno y el desplazamiento del CO2 (producto

del metabolismo) fuera del sistema, por tanto se pueden crear microambientes anaeróbicos

dentro del reactor que inhiben el crecimiento de los microorganismos aeróbicos (Farinas,

2015).

El contenido óptimo de humedad depende del microorganismo y del sustrato. Una

consideración importante para tener en cuenta es que la humedad varía durante el tiempo

en que se lleva a cabo la fermentación (Sharma, Kumar, Panwar, & Kumar, 2017).

1.9.3 Aireación

Las principales funciones del aire en la FES son mantener condiciones aeróbicas, remover

el CO2 producido y regular la temperatura y el contenido de humedad del sustrato. La baja

producción de metabolitos, principalmente de enzimas en FES, puede estar relacionada

con la limitación de oxígeno durante el crecimiento microbiano puesto que la transferencia

de O2 se da principalmente por difusión (Hölker, Höfer, & Lenz, 2004). Además, la

transferencia de calor y la dispersión del CO2 se ven favorecidas por inyección de aire. La


Th003

velocidad de aireación debe evaluarse cuidadosamente, ya que la pérdida de humedad a

altas velocidades de flujo puede afectar negativamente el crecimiento del microorganismo

limitando la producción de enzimas (Thomas et al., 2013).

1.9.4 pH

Así como los otros parámetros mencionados anteriormente, el pH juega un papel

importante en los procesos de FES, principalmente debido a que este puede cambiar en

respuesta a las actividades metabólicas entre el sustrato y el microorganismo.

La producción de enzimas está fuertemente influenciada por el pH, ya que en ciertas

ocasiones, los sitios activos de las enzimas dependen de la presencia de iones para

mantener una unión eficiente con el sustrato (Brijwani, Oberoi, & Vadlani, 2010). El

monitoreo y control del pH durante la FES no es fácil, por tal motivo solo se ha descrito la

influencia del pH inicial del sustrato de fermentación.

1.9.5 Tamaño de partícula

El tamaño de partícula del sustrato es un parámetro importante a tener en cuenta, ya que

está relacionado con la caracterización del sustrato y la transferencia de calor y masa

durante el proceso de FES (Krishna, 2005). Adicionalmente afecta la relación

superficie/volumen de la partícula, que determina la porosidad del sustrato y la fracción de

este que es accesible para el microorganismo. Dado que la velocidad de transferencia de

oxígeno afecta el crecimiento microbiano, el sustrato debe contener partículas de tamaño

adecuado para mejorar la transferencia de masa (Krishna, 2005). Generalmente las

partículas más pequeñas proporcionan un área superficial más grande para la acción

microbiana, por eso, los sustratos generalmente son pretratados con mecanismos físicos,

como la molienda para disminuir su tamaño y aumentar el área superficial, sin embargo,

las partículas muy pequeñas pueden provocar aglomeración en el sustrato interfiriendo con

la transferencia de oxígeno provocando una inhibición en el crecimiento (Raghavarao et

al., 2003). Por otro lado, las partículas más grandes, proporcionan una mejor relación

respiración/aireación, pero proporcionan una superficie limitada para la colonización por

parte de los microorganismos (Lizardi-Jiménez & Hernández-Martínez, 2017). Es

importante recalcar que el tamaño de partícula puede variar durante la fermentación,

Capítulo 1 23

debido a la actividad metabólica del microorganismo al consumir el sustrato (R. J. S. de

Castro & Sato, 2015).

1.10 Parámetros nutricionales de la FES

El sustrato debe brindarle al microorganismo todos los nutrientes necesarios de forma

balanceada para su crecimiento, reproducción y formación de productos. Principalmente

la relación entre la fuente de carbono y nitrógeno ejerce la mayor influencia en los procesos

de FES. Sin embargo, algunos microorganismos requieren de microelementos como el

fósforo (P), hierro (Fe), azufre (S), magnesio (Mg), calcio (Ca), manganeso (Mn), zinc (Zn),

cobalto (Co), entre otros (Thomas et al., 2013).

1.10.1 Fuente de carbono

Diferentes sustratos, tanto residuos del agro como industriales, sintéticos o naturales han

sido evaluados como fuentes de carbono para los procesos de FES. Altas concentraciones

de la fuente de carbono no siempre resultan en altos niveles de producto, por el contrario,

puede darse una limitación de la transferencia de oxígeno y el agotamiento de otro de los

nutrientes necesarios. Se ha demostrado que la mejor fuente de carbono para la inducción

de enzimas celulolíticas es la carboximetilcelulosa, aunque se han investigado diversas

materias primas. La celobiosa actúa como un inductor efectivo de celulasas, se ha

reportado que la adición de celobiosa + glucosa al sustrato de fermentación, incrementa la

tasa de producción de las endoglucanasas. Otros azúcares utilizados para la inducción de

celulasas son xilosa y sacarosa (R. Kumar et al., 2008), y lactosa para la producción de

CMCasas, FPasas y β-glucosidasas (R. Kumar et al., 2008). Para las xilanasas, está

reportado que la utilización de xilano, azúcares como la sacarosa y la lactosa, fuentes de

carbono orgánicas como el salvado de trigo actúan como inductores para la producción de

estas enzimas.(Alokika & Singh, 2019).


Th003

1.10.2 Fuente de nitrógeno

La adición de una fuente de nitrógeno al proceso de fermentación estimula la germinación

de los conidios fúngicos, adicionalmente el nitrógeno está involucrado en la producción de

proteínas esenciales para el crecimiento (Raghavarao et al., 2003). El efecto de diferentes

fuentes de nitrógeno como el sulfato de amonio, el nitrato de amonio, cloruro de amonio, y

el nitrato de sodio han sido estudiados. Se ha reportado que el sulfato de amonio permite

una mayor producción de celulasas (R. Kumar et al., 2008). Sin embargo, la incorporación

adicional de una fuente de nitrógeno a la FES incrementa los costos del proceso. Para la

xilanasas, las fuentes de nitrógeno orgánicas como el extracto de levadura, la harina de

soya, la triptona, el extracto de carne y la peptona mejoran la producción de xilanasa; en

ciertos casos, la combinación de dos o más fuentes de nitrógeno en el medio permite una

mayor producción de xilanasa (Alokika & Singh, 2019).

2. Evaluación de pretratamientos químicos para la producción de hemicelulasas y celulasas

2.1 Introducción

El bagazo de caña se obtiene del tallo de la caña después de la extracción de su jugo y

está compuesto por 41-44% de celulosa, 25-27% de hemicelulosa y 20-22% de lignina. En

las fábricas de producción de azúcar el bagazo se usa comúnmente para la generación de

vapor y electricidad utilizando calderas de alta presión (Savou et al., 2019), además en la

industria panelera se utiliza para proporcionar la energía necesaria en ese proceso.

El salvado de trigo es un residuo proveniente de la industria de procesamiento de la harina

de trigo que está compuesto por celulosa (2 - 9%), hemicelulosa (28 - 30%), y lignina (6,5

- 9,9%). Este residuo se utiliza principalmente para alimentación animal por su contenido

de micronutrientes principalmente de hierro, magnesio, manganeso, y vitaminas (B3, B6)

(Debi, Wichert, & Liesegang, 2019).

Estos residuos pueden utilizarse para los procesos de FES de manera natural (sin

pretratar) o pretratada dependiendo del porcentaje en la composición de la lignina. La alta

concentración de lignina en el bagazo de caña (20 -22%) implica la realización de

pretratamientos al sustrato para la modificación de la estructura lignocelulósica y poder

utilizar la hemicelulosa y la celulosa como fuentes de carbono para la producción de

enzimas por parte de Trichoderma koningiopsis Th003 (Maibam & Maiti, 2019). Los

pretratamientos químicos son las técnicas más estudiadas entre los diferentes métodos de

pretratamiento que se han desarrollado y, por lo tanto, se han utilizado ampliamente para

la deslignificación de materiales lignocelulósicos (D. F. Silva, Hergesel, Campioni,

Carvalho, & Oliva-Neto, 2018). Para el pretratamiento del bagazo de caña se han aplicado

una diversidad de tratamientos, sin embargo, los pretratamientos químicos (utilización de

ácidos y álcalis) han sido los más utilizados para la producción de enzimas. Salomão et


Th003

al., utilizaron bagazo de caña pretratado en dos etapas, primero con una solución de H2SO4

y posteriormente con un solución de NaOH en donde lograron obtener 8,2 U/gss de

CMCasa a partir de T. koningii (Salomão et al., 2019). Por otro lado, Marques et al.,

obtuvieron 0,26 U/gss, 64,56 U/gss y 351,74 U/gss de FPasa, CMCasa y xilanasa

respectivamente de T. viridae a partir de bagazo de caña pretratado con NaOH (Marques

et al., 2018). F. L. da Silva, et al., obtuvieron a partir de bagazo de caña pretratado con

NaOH 2,4 U/gss de FPasa y 172 U/gss de xilanasa con una ccepa de T. reesei (F. L. da

Silva et al., 2020)

Una vez el sustrato ha sido pretratado es más sencillo aprovecharlo para usos como la

producción de diferentes compuestos de interés comercial. Entre ellos, la producción de

enzimas ha mostrado un gran potencial (Maibam & Maiti, 2019), usando especies del

género Trichoderma que pueden crecer y desarrollarse sobre residuos agrícolas.

Por lo anterior, en este capítulo se presentará la evaluación de diferentes métodos de

hidrólisis química (ácido, básico, y mixto) en la transformación del bagazo de caña para la

producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de Trichoderma koningiopsis

Th003.

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Microorganismo y producción del inóculo

El microorganismo utilizado en este estudio fue el hongo Trichoderma koningiopsis Th003,

actualmente conservado en el Banco de trabajo de Agrosavia. Esta cepa es nativa de

Colombia, y se tiene permiso de uso bajo el contrato de acceso a recursos genéticos y

productos derivado No. 168 de 2017.

A partir de un cultivo del hongo, se tomó un disco de agar de la cepa y se transfirió a una

caja Petri con agar avena donde se dejó crecer el hongo durante 7 días. Posteriormente,

se realizó un raspado de los conidios y se agregaron a una solución de tween 80 al 0,01%.

Se ajustó la concentración a 1x106 conidios/mL por recuento en cámara de Neubauer.

Capítulo 2 27

2.2.2 Sustrato de fermentación

Se utilizó una mezcla de bagazo de caña - salvado de trigo (1:1) y una solución de sacarosa

al 1%. El bagazo de caña fue suministrado por la estación experimental CIMPA de

AGROSAVIA ubicada en Barbosa – Santander. Se aseguró que tuviera un tamaño máximo

de 10 cm para realizar los respectivos experimentos. Se secó en cuarto de secado a 40°C

hasta obtener una humedad <10%, que se determinó mediante una balanza de humedad

Kern© MLS 50-3, y se almacenó en bolsas de plástico herméticas a 4°C hasta su uso. La

sacarosa fue marca comercial Riopaila-Castilla S.A.

2.2.3 Pretratamiento del sustrato

Se probaron tres tratamientos de hidrólisis química para el bagazo de caña: básico con

NaOH, ácido con H2SO4, y mixto con H2SO4 y NaOH (Tabla 3). Teniendo en cuenta que el

salvado de trigo tiene una concentración <10% de lignina, no se le realizó ningún

pretratamiento.

2.2.3.1. Pretratamiento básico

El bagazo de caña se mezcló con una solución de NaOH al 5% en una relación de 1:6 (g

sustrato:mL de solución) y se sometió a 15 PSI durante 30 minutos en autoclave.

Posteriormente, se lavó con agua de la llave hasta obtener un pH = 7,0, se secó a 40 °C

durante 48 horas o hasta obtener una humedad <10% y se almacenó en bolsas herméticas

a 4°C hasta su uso (Asgher, Ahmad, Muhammad, & Iqbal, 2013).

2.2.3.2. Pretratamiento ácido.

El tratamiento ácido consistió en mezclar el bagazo de caña con una solución de H2SO4 al

2,5% (1 g sustrato: 5 mL solución), se llevó a 121°C durante 30 minutos, después se lavó

con agua hasta obtener un pH = 7, se secó a 40°C durante 48 horas o hasta obtener una

humedad <10% y se almacenó en bolsas herméticas a 4°C hasta su uso (Unrean & Ketsub,

2018).

2.2.3.3. Pretratamiento mixto.

El tratamiento mixto se realizó con una solución de H2SO4 al 1% a una relación de 1:2 (g

de sustrato: mL de solución), se llevó a 15 PSI durante 30 minutos en autoclave, se lavó

con agua hasta obtener un pH = 7 y se retiró el exceso de agua. Posteriormente, el bagazo


Th003

se mezcló con una solución de NaOH al 4% en una relación 1:5 (g sustrato: mL de

solución), se llevó a 121°C durante 30 minutos. Se lavó con agua hasta ajustar el pH 7.0,

se secó a 40°C durante 48 horas o hasta obtener una humedad <10% y se almacenó en

bolsas herméticas a 4°C hasta su uso (Rocha, Maeda, Santa Anna, & Pereira, 2013).

2.2.4 FES

Se realizaron fermentaciones en estado sólido por triplicado en bandejas de aluminio de

18 cm x 10 cm, las cuales contenían el bagazo previamente pretratado con salvado de

trigo en una relación 1:1 y una solución de sacarosa al 1%. Se utilizó una relación 1:3 (g

de sustrato/mL de agua) de agua. Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en

autoclave a 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas con una relación 1,05:1

(mL de inóculo/g de sustrato), se sellaron con una película plástica, y se incubaron en un

cuarto de fermentación por nueve días a 28°C ± 2, con una humedad relativa del 80-90%.

Como variable de respuesta de cada uno de los tratamientos se determinaron las

actividades enzimáticas (FPasa, CMCasa y xilanasa) a los 0, 3, 5, 7 y 9 días de

fermentación haciendo muestreos destructivos con el fin de establecer el tratamiento y el

Tabla 4. Pretratamientos químicos empleados para el bagazo.

Tto Sustrato Solución Condiciones Relación g sustrato/

mL solución

Control Bagazo de

caña - -

Básico Bagazo de

caña NaOH 5%

15 psi durante

30 min. 1:6

Ácido Bagazo de

caña H2SO4 2.5%

15 psi durante

30min. 1:5

Mixto Bagazo de

caña

H2SO4 1% +

NaOH 4%

1% H2SO4 + 15

psi durante

30min + NaOH

al 4% a 15 psi

durante 30min.

1:2

1:5

Capítulo 2 29

tiempo que favorece la producción de estas enzimas. Se tuvo como control la fermentación

del hongo sobre bagazo de caña sin pretratar.

2.2.5 Obtención del extracto enzimático

Se tomó una muestra compuesta de 10 g de diferentes puntos de la bandeja de cada uno

de los tratamientos a los días 0, 3, 5, 7 y 9 de fermentación, se les adicionó una solución

de Tween 80 (0,1%) (1:2 (g/mL)) y se agitó durante un minuto en vortex. Se dejó reposar

durante una hora a 4°C. El material suspendido y la biomasa fueron separadas por

centrifugación a 8000 rpm durante 15 min y se filtraron al vacío con papel filtro Whatman

#1. Al sobrenadante obtenido se le realizaron las pruebas de actividad enzimática.

2.2.6 Métodos analíticos

Todas las actividades enzimáticas se expresaron como Unidades de actividad

enzimática/gramo de sustrato seco (U/gss). Una unidad de actividad enzimática (U) es

definida como la cantidad de extracto enzimático capaz de liberar 1 mmol de azúcar

(glucosa/xilosa) por minuto bajo las condiciones de reacción.

2.2.6.1. Actividad FPasa

La actividad FPasa (celulasas totales) se evaluó utilizando filtros Whatmann #1 como

sustrato, de acuerdo con la metodología descrita por Ghose (1987) y Pachauri, et al (2017).

La reacción enzimática se realizó en microtubos Eppendorf®. La mezcla del ensayo

contenía 500 µL de extracto enzimático, 1,0 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05

M (pH:4,8) y papel filtro Whatmann #1 (6 cm x 1 cm). El blanco consistió en 1,5 mL de

solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la

mezcla de 500 µL de extracto enzimático y 1,0 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05

M (pH:4,8) (sin sustrato) y el control del sustrato consistió en la mezcla de 1,5 mL de

solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8) y papel filtro Whatmann #1 (6 cm x 1 cm).

Se homogenizaron las muestras y controles en shaker y se incubaron durante 30 minutos

a 50°C y al finalizar el tiempo se detuvo la reacción en hielo. Se tomaron 250 µL de cada

muestra y se transfirieron a tubos de ensayo 15x100mm, se mezclaron con 250 µL de

ácido dinitrosalicílico (DNS), se llevó a ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción


Th003

en hielo. Se leyó la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm (Pachauri, Chakradhari, &

Veeramani, 2017). La glucosa liberada se determinó comparando la absorbancia con la

curva de calibración que se realizó usando como estándar una solución de glucosa (Anexo

A).

2.2.6.2. Actividad CMCasa

La actividad endo β 1-4 glucanasa o CMCasa, se evaluó utilizando como sustrato una

solución de carboximetil celulosa (CMC) al 1% en buffer citrato de sodio 0,05M, de acuerdo

con la metodología estándar descrita por Ghose (1987) y Pachauria, et al (2017). La

reacción enzimática se realizó en microtubos Eppendorf®. La mezcla del ensayo contenía

1 mL del extracto enzimático y 1 mL de la solución de CMC. El blanco consistió en 2 mL

de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la

mezcla de 1 mL de extracto enzimático y 1 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M

(pH:4,8) (sin sustrato) y el control del sustrato consistió en la mezcla de 1 mL de solución

tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8) y 1 mL de la solución de CMC 1% (sin extracto

enzimático). Se incubaron las muestras y los controles durante 30 minutos a 50°C y se

detuvo la reacción en hielo. Posteriormente, se tomaron 250 µL de la muestra y se

transfirieron a tubos de ensayo 15x100mm, se mezclaron con 250 µL de DNS, se llevó a

ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción en hielo. Se leyó la absorbancia en

espectrofotómetro a 540 nm (Pachauri et al., 2017). La glucosa liberada se determinó

comparando la absorbancia con la curva de calibración que se realizó usando como

estándar una solución de glucosa (Anexo A)

2.2.6.3. Actividad xilanasa

La actividad xilanasa se evaluó utilizando una solución de xilano de beechwood

(Megazyme® Purified, 10g; P-XYLNBE-10G) al 2% en buffer citrato de sodio 0,05M como

sustrato. La mezcla del ensayo contenía 500 µL del extracto enzimático y 500 µL de la

solución de xilano al 2%. El blanco consistió en 1 mL de solución tampón citrato de sodio

0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la mezcla de 500 µL del extracto

enzimático y 500 µL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH: 4,8). El control del

sustrato consistió en 500 µL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH: 4,8) y 500 µL

Capítulo 2 31

de la solución de xilano al 2%. Las muestras y controles se incubaron a 50°C durante 60

minutos y se frenaron las reacciones en hielo. Se tomaron 250 µL de la muestra y se

mezclaron con 250 µL de DNS, se llevó a ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción

en hielo. Se leyó la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm. La xilosa liberada se

determinó comparando la absorbancia con la curva de calibración que se realizó usando

como estándar una solución de xilosa (Ezeilo, Lee, Huyop, Zakaria, & Wahab, 2019)

(Anexo B)

2.2.6.4. Humedad

La humedad se determinó usando una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto

se tomó un g de sustrato de las bandejas correspondientes a los días 0, 3, 5 y 7 de

fermentación y se secó hasta peso constante. Con el dato de humedad se determinaron

los gramos de sustrato seco (gss) usando la ecuación que se describe a continuación:

Ecuación 1.

𝑔𝑠𝑠 = [𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 −(𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 ∗ % 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑)

100

2.2.7 Determinación de la composición química del bagazo de caña y su fracción celulósica

Los componentes químicos del bagazo de caña sin pretratar y con pretratamiento básico

(celulosa, hemicelulosa y lignina) fueron determinados de acuerdo con el método AOAC

973.18 de 2016 por el laboratorio de nutrición animal de AGROSAVIA. Los análisis

químicos descritos se realizaron por duplicado y los valores se expresaron en g/100g (%).

2.2.8 Diseño estadístico

Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como el promedio ±

DS (Desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron

determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,05 utilizando un

modelo lineal generalizado con la prueba de comparaciones de Tukey con el software

Minitab (versión 18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU).


Th003

2.3 Resultados y discusión

2.3.1 Producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a partir de bagazo de caña pretratado con diferentes métodos de hidrólisis química.

Para evaluar el efecto de los tres pretratamientos sobre el bagazo de caña, se llevó a cabo

la cinética de producción enzimática durante los 9 días de fermentación en estado sólido

con T. koningiopsis Th003 para las enzimas FPasa (Figura 2), CMCasa (Figura 3) y

xilanasa (Figura 4).

Como se muestra en la Figura 2, todos los pretratamientos tuvieron una mayor actividad

FPasa (excepto al dia 3) en comparación con las fermentaciones realizadas con bagazo

1 3 5 7 9

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Un

idad

es d

e a

ctivid

ad F

Pa

sa

(U

/gss)

Tiempo (Día)

Sin tratamiento

H2SO4 + NaOH

H2SO4

NaOH

Figura 2. Actividad FPasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes pretratamientos.

Capítulo 2 33

de caña sin pretratar, adicionalmente tanto el pretratamiento con NaOH como el

pretratamiento con H2SO4 + NaOH tienen un comportamiento creciente en el tiempo,

mientras que el pretratamiento ácido se mantiene constante después del día 7. Con el

sustrato de caña sin pretatar no se observa una tendencia definida. Se observa que las

máximas actividades encontradas en cada uno de los pretratamientos presentaron

diferencias estadísticamente significativas (p=0,000). La máxima actividad FPasa se da al

día 7 de fermentación utilizando sustrato pretratado con H2SO4 (1,622 ± 0,29 U/gss) y se

mantiene constante hasta el día 9 (1,55 ± 0,34 U/gss). La segunda mayor actividad se da

con pretratamiento con NaOH al día 9 (0,95 ± 0,06 U/gss). La actividad con sustrato sin

tratamiento logra un máximo de 0,84 ± 0,03 U/gss al día 3 de fermentación, un 51,7%

menos en comparación con el obtenido en el pretratamiento ácido (día 7). Para el

pretratamiento H2SO4 + NaOH se obtuvo la mejor producción a los 9 días, obteniendo 0,59

± 0,02 U/gss de actividad FPasa.

La evaluación de la actividad CMCasa se presenta en la Figura 3, en donde se observa

que todos los pretratamientos tuvieron una mayor actividad CMCasa (excepto al día 5) en

comparación con las fermentaciones realizadas con el bagazo de caña sin pretratar. Las

actividades correspondientes a los pretratamientos con H2SO4 y con H2SO4 + NaOH tienen

una tendencia creciente, mientras que con el pretratamiento con NaOH y sin pretatar

disminuye a partir del día 7 de fermentación. La máxima actividad se encuentra al día 7 de

fermentación con pretratamiento ácido, la cual no presentó diferencias significativas

(p=0,070) desde el día 5 hasta el final de la fermentación (2,49 ± 0,10 U/gss). Las máximas

actividades encontradas para cada uno de los pretratamientos presentaron diferencias

estadísticamente significativas (p=0,000).


Th003

El pretratamiento ácido produjo una mayor producción de enzimas FPasa y CMCasa en

comparación a los otros pretratamientos evaluados. La hidrólisis ácida del bagazo

solubiliza la mayoría de la hemicelulosa y permite que la fracción celulósica restante

induzca la producción de enzimas celulolíticas facilitando su accesibilidad a la matriz de

celulosa y lignina restante en la biomasa (Ladeira-Ázar, Morgan, Maitan-Alfenas, &

Guimarães, 2019). Sin embargo, varias desventajas se han relacionado con su utilización,

ya que se ha demostrado que durante el pretratamiento se da la formación de

componentes tóxicos como furfural, hidroxil-metilfurfural, ácido acético, ácido fórmico,

ácido levulínico, que afectan directamente el crecimiento del hongo (Salihu, Abbas, Sallau,

& Alam, 2015). En contraste, la actividad CMCasa se empieza a producir al tercer día de

1 3 5 7 9

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Un

idad

es d

e a

ctivid

ad C

MC

ase (

U/g

ss)

Tiempo (Día)

Sin tratamiento

H2SO4 + NaOH

H2SO4

NaOH

Figura 3. Actividad CMCasa durante 9 días de fermentación usando bagazo pretratado con diferentes tratamientos.

Capítulo 2 35

fermentación, esto puede ser debido al hecho de que está reportado que varias especies

del género Trichoderma presentan endoglucanasas (CMCasa) constitutivas localizadas en

la membrana plasmática las cuales pudieron ser liberadas (Gutiérrez-Rojas, Moreno-

Sarmiento, & Montoya, 2015), pudiendo ser las responsables de la actividad temprana.

La Figura 4 muestra la actividad xilanasa. Se puede observar que al igual que con la

actividad FPasa y CMCasa, todos los experimentos con el sustrato pretratado tuvieron

mayor actividad xilanasa (excepto al dia 5 con H2SO4 y H2SO4 + NaOH y al día 3 con

H2SO4) en comparación con las fermentaciones con bagazo de caña sin pretratar. Se

observa que tanto el pretratamiento con NaOH, como sin pretratar tienen una tendencia

creciente hasta el día 5, después de este día la actividad comienza a disminuir; por otro

lado, el pretratamiento ácido tiene una tendencia creciente hasta el día 7, mientras que el

Figura 4. Actividad xilanasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes pretratamientos.


Th003

pretratamiento H2SO4 + NaOH no tiene una tendencia definida. Se obtuvo la máxima

actividad (579,94 ± 5,3 U/gss) con el bagazo pretratado con NaOH al día 5 de fermentación

y después disminuyó un 29,0% (411,70 ± 1,5 U/gss). Para el pretratamiento con H2SO4 +

NaOH se obtuvo la máxima actividad al día 3 (442,67 ± 3,6 U/gss), siendo este valor un

31% menor que el obtenido con el pretratamiento de NaOH. El bagazo sin pretratamiento

tiene su máxima actividad al día 5 (348,46 ± 1,09 U/gss), sin embargo, este representa un

66,4% menos de actividad en comparación con el máximo obtenido con NaOH. Las

máximas actividades encontradas para cada uno de los pretratamientos presentaron

diferencias estadísticamente significativas (p=0,000).

Con base en los resultados obtenidos, el pretratamiento alcalino (NaOH 5%) es el método

químico más efectivo para la producción de enzimas xilanasas y el segundo mejor para la

producción de celulasas (FPasa y CMCasa), puesto que este método ayuda en la

precipitación de la lignina presente en la biomasa lignocelulósica, lo que conduce a la

ruptura de los enlaces éster que unen la lignina y el xilano, y en efecto ayuda a aumentar

la porosidad de la biomasa y al aumento de la superficie interna dejando casi intacta la

hemicelulosa (Salihu et al., 2015); por lo tanto, los polisacáridos restantes (celulosa y

hemicelulosa) actúan como fuente de carbono y energía para el hongo ya que son más

susceptibles a la hidrólisis enzimática principalmente de las enzimas celulasas y

hemicelulasas (Philippini, Martiniano, Chandel, de Carvalho, & da Silva, 2019). Se ha

demostrado que el xilano y sus derivados (xilooligosacáridos) son fuertes inhibidores de

las enzimas celulolíticas (H. Li et al., 2019), de esta manera la hidrólisis de la celulosa

aumenta a medida que el hongo consume la xilosa y los xilooligosacáridos producidos

durante la hidrólisis del xilano (Huang et al., 2018).

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se decidió usar como sustrato de

fermentación para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T.

koningiopsis Th003 una mezcla de bagazo de caña pretratado con NaOH 5% + salvado de

trigo en una relación 1:1 y solución de sacarosa al 1%. Ya que, 1) este hongo, tiene más

potencial para la producción de enzimas xilanasas que celulasas; está reportado que

hongos del género Trichoderma tienen una alta actividad FPasa y CMCasa; T. koningii es

capaz de producir 120,15 U/gss de FPasa y 253,67 U/gss de CMCasa (Pachauri et al.,

2017). T. viridae produce 0,26 U/gss y 64,54 U/gss de FPasa y CMCasa respectivamente

(Marques et al., 2018) y T. reesei tiene una actividad de 6,71 U/gss de FPasa y 20,7 U/gss.

Capítulo 2 37

Mientras que con T. koningiopsis Th003 se obtuvo 1,622 ± 0,29 U/gss de FPasa y 2,49 ±

0,10 U/gss de CMCasa; 2) teniendo en cuenta que el extracto enzimático producido va a

ser usado para el ensilaje de la avena forrajera y en ella la hemicelulosa es el componente

en mayor proporción (36,91%) (Tabla 5), por lo tanto, las xilanasas producidas hidrolizarían

este componente liberando más azúcares disponibles como xilosa, manosa, galactosa,

entre otros, para la producción de ácido láctico durante el proceso del ensilaje por las BAL;

3) como se mencionó anteriormente, el xilano y sus derivados son fuertes inhibidores de

la hidrólisis de la celulosa por lo tanto, al encontrar xilano, xilooligosacáridos o xilosa en el

sustrato de fermentación, se va a inhibir la producción de enzimas celulasas por parte de

T. koningiopsis Th003 y 4) los bovinos pueden aprovechar directamente la celulosa del

ensilaje ya que dentro de sus sistemas digestivos tienen microorganismos nativos

productores de enzimas celulolíticas.

2.3.2. Determinación de la composición química de los residuos agroindustriales usados como medio de fermentación.

Una vez definido el sustrato de fermentación para FES, el cual corresponde a bagazo de

caña pretratado con NaOH 5% + salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa al 1%, se

realizó el análisis de la composición química del bagazo de caña antes y después del

pretratamiento con NaOH, del salvado de trigo y del sustrato después de la fermentación

con el hongo, los resultados se presentan en la Tabla 6.

Tabla 6. Composición química de la fracción celulósica del bagazo antes y después del tratamiento alcalino y del salvado de trigo

Tratamiento

Composición química

Celulosa Hemicelulosa Lignina

%

Bagazo Sin pretratar 38,02 ± 1,37 22,77 ± 5,06 9,42 ± 0,12

Tabla 5. Composicion del forraje de avena.

Componente %

Lignina 8,31

Hemicelulosa 36,91

Celulosa 22,09

Almidón 15,2


Th003

Bagazo pretratado con NaOH

5% 72,015 ± 0,67 10,77 ± 1,30 4,89 ± 0,53

Salvado de trigo 11,33 28,85 5,52

Sustrato FES* 41,6 19,81 5,20

Sustrato después de fermentación

49,41 17,41 11,48

*La composición del sustrato FES fue calculada de acuerdo con la composición del bagazo pretratado con NaOH 5% y el salvado de trigo, teniendo en cuenta la relación en la que se encuentran en el sustrato (1:1)

Como primera medida, se puede observar que la composición determinada para las dos

materias primas empleadas están dentro de los rangos reportados para materiales

lignocelulósicos: 10 - 20% de lignina, 20 - 35% de hemicelulosa y 35 - 50% de celulosa

para el bagazo de caña (T. A. L. Silva et al., 2018), y 2.2 - 9,0% de lignina, 20 - 35% de

hemicelulosa y 6,5 - 9,9% de celulosa para el salvado de trigo (Prückler et al., 2014).

En la tabla 6 se observa como el pretratamiento alcalino causa una reducción de la lignina,

la hemicelulosa y otros compuestos del bagazo, lo que a su vez genera una concentración

de la celulosa. Esto se debe a que, como se mencionó anteriormente, el tratamiento

alcalino elimina eficazmente la lignina de la biomasa. Adicionalmente, la composición del

sustrato después de la FES muestra como el metabolismo del hongo usa la hemicelulosa

como fuente de carbono primaria disminuyendo su composición, además probablemente

los puentes de hidrógeno entre las cadenas de glucano que unen la celulosa se rompen

parcialmente haciendo que la celulosa sea más accesible (de Oliveira Gorgulho Silva &

Filho, 2017).

El sustrato usado para la fermentación sólida contiene mayoritariamente celulosa

proveniente principalmente del bagazo de caña, mientras que el salvado de trigo aporta

mas hemicelulosa. Aunque se esperaría que, al tener más celulosa disponible, las enzimas

producidas mayormente fueran celulasas, esto no ocurrió. Varios artículos que usan otras

cepas de T. koningiopsis también reportan este tipo de comportamiento, por ejemplo,

Nutongkaew et al; obtuvieron 56,46 U/gss de xilanasa y 2,13 U/gss de FPasa

respectivamente a partir de tronco de palma aceitera, el cual contenía 36,60% ± 1.17 de

celulosa y 16,80% ± 1 de hemicelulosa (Nutongkaew, Prasertsan, Leamdum,

Sattayasamitsathit, & Noparat, 2020). Esto podría deberse al hecho de que el regulador

ACEII (regulador positivo de la transcripción de genes que codifican para la producción de

celulasas), también afecta la regulación de las xilanasas (Singh, Devi, Jaryal, & Rani,

Capítulo 2 39

2018). Por lo tanto, la presencia de celulosa en el medio de fermentación no solo induce

la producción de enzimas celulolíticas, sino también actúa como inductor en la producción

de xilanasas.

2.4. Conclusiones parciales

En general, todos los pretratamientos obtuvieron mayor actividad FPasa, CMCasa y

xilanasa, en comparación con las fermentaciones realizadas con bagazo de caña sin

pretratar.

La utilización del pretratamiento ácido permitió una mayor actividad FPasa y CMCasa,

mientras que el pretratamiento alcalino permitió una mayor actividad xilanasa.

Se seleccionó el pretratamiento alcalino del bagazo de caña para realizar las

fermentaciones para las siguientes etapas del proyecto debido al gran potencial para la

producción de enzimas xilanasas en comparación con la actividad celulasa.

3. Selección de parámetros físicos, biológicos y nutricionales para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T. koningiopsis Th003

3.1 Introducción

La producción de hemicelulasas y celulasas mediante un proceso de fermentación en

estado sólido está influenciada por parámetros tanto biológicos (tamaño y concentración

del inóculo) como fisicoquímicos (temperatura) y nutricionales (fuente de nitrógeno y

carbono) (Alokika & Singh, 2019). Estos varían de un proceso a otro dependiendo del tipo

de sustrato, el microorganismo utilizado y la escala del proceso (Krishna, 2005).

Uno de los factores biológicos más importantes, además de la selección del

microorganismo, es el tipo de inóculo y su concentración (Krishna, 2005). Se han reportado

ventajas en el uso de esporas fúngicas en lugar de células vegetativas para el inóculo

iniciador. Las esporas a diferencia del micelio vegetativo, sirven como catalizador en las

reacciones de bioconversión, ya que a menudo pueden llevar a cabo las mismas

reacciones que el micelio, adicionalmente las esporas en general poseen mayor

resistencia a las condiciones medioambientales, lo que permite mayores tiempos de

almacenamiento en caso de ser necesario (Krishna, 2005). Sin embargo, tienen una fase

de adaptación más larga la cual requiere de condiciones óptimas para su germinación y

un mayor requisito de tamaño y concentración de inóculo (Krishna, 2005). A pesar de ello,

una suspensión de esporas con una concentración aproximadamente de 1x106

esporas/mL a menudo se utiliza como inóculo iniciador en los procesos de FES (Yoon,

Ang, Ngoh, & Chua, 2014).

Entre los parámetros fisicoquímicos, la temperatura es una de las variables importantes

para tener en cuenta en los procesos de FES, pues el crecimiento microbiano en


Th003

condiciones aeróbicas produce la liberación de calor metabólico. Por ello, temperaturas

extremas pueden desnaturalizar las enzimas producidas, así como también pueden

ocasionar otros efectos negativos sobre el crecimiento del microorganismo y la producción

de metabolitos. La mayoría de los estudios realizados se han centrado en encontrar la

temperatura óptima de crecimiento de hongos para la producción de enzimas, además esa

caracterización puede usarse para predecir los efectos de los cambios de temperatura en

la productividad enzimática (Farinas, 2015). Por ejemplo, Pachauri et al., encontraron que

el hongo T. koningii tiene una temperatura óptima para la producción de celulasas y

hemicelulasas de 35°C (Pachauri et al., 2017). Sin embargo, la temperatura óptima puede

variar entre especies del mismo género.

Por otro lado, diferentes nutrientes pueden regular el crecimiento de los microorganismos.

Estos nutrientes incluyen fuentes de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas y cofactores.

La fuente de carbono representa la fuente de energía, la cual debe estar disponible para

el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Esta puede ser un monosacárido

simple como la glucosa, xilosa, lactosa, entre otras, o fuentes de carbono más complejas

como la celulosa y hemicelulosa presentes en la biomasa lignocelulósica (Krishna, 2005).

La biomasa lignocelulósica como sustrato actúa como una fuente de carbono esencial con

un importante rol para la inducción de enzimas. Sin embargo, la producción de biomasa

microbiana y de enzimas (hemi) celulolíticas puede ser estimulada por la presencia de una

fuente de nitrógeno en el medio de fermentación. Fuentes de nitrógeno como sulfato de

amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de sodio, peptonas, extracto de

levadura han sido las más estudiadas para la producción de enzimas (hemi) celulolíticas

(R. Kumar et al., 2008).

En este capítulo se estudió el efecto de la temperatura de incubación, de la concentración

de inóculo y de la selección de una fuente de nitrógeno en la producción de las enzimas

CMCasa, FPasa y xilanasas, usando como sustrato base bagazo de caña pretratado con

NaOH + salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa 1%.

Capítulo 3 43

3.2 Materiales y métodos


A partir de un cultivo del hongo, se tomó un disco de agar de la cepa y se transfirió a una

caja Petri con agar avena. Se dejó crecer el hongo durante 7 días a 28°C. Posteriormente,

se realizó un raspado de los conidios y se agregaron a una solución de tween 80 al 0,01%.

Luego, dependiendo del experimento a realizar se ajustó la concentración por recuento en

cámara de Neubauer.

3.2.2 Efecto de la concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 y la temperatura sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas.

Se realizaron experimentos del tipo un factor a la vez iniciando con la variable

concentración de inóculo, con tres posibles concentraciones (Tabla 7). Una vez se obtuvo

la concentración que favorece la producción de enzimas se evaluó la temperatura usando

dos valores (Tabla 8). Para estos experimentos el sustrato utilizado fue una mezcla de

bagazo de caña pretratado con NaOH 5% - salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa

al 1%.

Los ensayos se realizaron por triplicado en bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm x 5 cm,

las cuales contenían 40 gramos del sustrato con una relación 1:3 (g sustrato/mLde agua).

Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en autoclave a 15 psi durante 30 minutos.

Se inocularon las bandejas a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato)

posteriormente se sellaron con una película plástica y se incubaron en cuarto de

fermentación con una humedad relativa del 80-85%, haciendo muestreo destructivo a los

0, 3, 5, 7, 9 y 11 días de fermentación para la concentración de inóculo, y a los 0, 3, 5, 7 y

9 para los ensayos de temperatura.


Th003

Tabla 7. Tratamientos para evaluar el efecto de la concentración de inóculo de T.

koningiopsis Th003

Tratamiento Concentración de inóculo

(conidios/mL)

Temperatura de

incubación

(°C)

T1 1𝑥104 28

T2 1𝑥105 28

T3 1𝑥106 28

Tabla 8. Tratamientos para evaluar el efecto de temperatura de incubación de T.

koningiopsis Th003

Tratamiento Temperatura de incubación

(°C)

Concentración de

inóculo

(conidios/mL)

T1 28 1𝑥106

T2 38 1𝑥106

3.2.3 Selección de la fuente de nitrógeno y de la relación bagazo/salvado para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas.

Para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado, se realizaron dos

diseños factoriales completos con 4 repeticiones en el punto central para un total de 8

tratamientos por factorial (16 tratamientos en total): uno con fuente de nitrógeno orgánica

(Tabla 9) y el otro con fuente de nitrógeno inorgánica (Tabla 10). Para cada uno de los

diseños se evaluaron dos relaciones de bagazo pretratado con NaOH 5% y salvado de

trigo, y dos concentraciones de cada fuente de nitrógeno. El diseño de los experimentos

se muestra en la Tabla 11. Adicionalmente, se realizó una fermentación sin ninguna fuente

de nitrógeno adicionada como control.

Capítulo 3 45

Las fermentaciones se realizaron por triplicado en bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm

x 5 cm, las cuales contenían el bagazo previamente tratado + salvado de trigo y solución

de sacarosa al 1% con una relación 1:3 (g/mL) de agua. Las bandejas con el sustrato

fueron esterilizadas en autoclave a 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas

a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato), se sellaron con una película plástica,

y se incubaron en cuarto de fermentación por 7 días a 28°C ± 2 con una humedad relativa

del 80-90%., haciendo muestreo destructivo a los 0, 3, 5, y 7 días de fermentación.

Tabla 11. Diseño de tratamientos para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado para cada uno de los diseños factoriales.

TRATAMIENTO RELACIÓN

BAGAZO/SALVADO FUENTE DE

NITRÓGENO (g/L)

T1 (1:1) 10

T2 (1:1) 4

T3 (3:1) 10

T4 (3:1) 4

T5 (x4) (2:1) 7

3.2.4 Obtención del extracto enzimático

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el numeral 2.2.5, sin embargo, la obtención

del extracto se realizó hasta el día 7 de fermentación.

Tabla 9. Factorial con fuente de nitrógeno orgánica

FACTOR 1 -1

Relación bagazo/salvado (g/g) 1:1 3:1

Extracto de levadura Tecnas ®(g/L) 10 4

Tabla 10. Factorial con fuente de nitrógeno inorgánica

FACTOR 1 -1

Relación bagazo/salvado (g/g) 1:1 3:1

Sulfato de amonio (g/L) 10 4


Th003

3.2.5 Métodos analíticos

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el numeral 2.2.6 para la determinación de la

actividad FPasa, CMCasa, xilanasa y la humedad. Sin embargo, para las actividades

enzimáticas se redujo el volumen de los reactivos a la mitad y las lecturas se realizaron en

lector de ELISA a 540 nm (Anexo C).

3.2.6 Tratamiento estadístico

▪ Temperatura y concentración de inóculo


DE (desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron

determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,05 utilizando un

modelo lineal generalizado con la prueba de comparaciones de Tukey con el software

Minitab (versión 18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU).

▪ Diseños factoriales


DS (desviación estándar). Se realizó un análisis de regresión basado en los datos

experimentales y se ajustó a un modelo polinómico de primer orden como se muestra a

continuación en la ecuación 2 con un p<0,07 utilizando el software Minitab (versión 18.0,

Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU). Para demostrar la normalidad de datos se usó la

prueba de Shapiro Wilk, para la igualdad de varianzas (homocedasticidad) se utilizó la

prueba de Bartlett levene

Ecuación 2:

𝒀 = 𝜷𝟎 + ∑ 𝜷𝟏 𝑿𝟏

Donde Y representa la variable de respuesta (actividad enzimática), β0 indica la

intercepción, β1 el coeficiente lineal y X1 el nivel de la variable independiente.

Capítulo 3 47


3.3.1 Influencia de la concentración de inóculo.

En la Figura 5 se presentan los resultados del efecto de la concentración del inóculo sobre

la producción de FPasa. Se observa que no existen diferencias significativas (p= 0,906)

entre las máximas actividades de FPasa alcanzadas con el sustrato inoculado con

1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 en el día 7 (1,38 ± 0,13 U/gss) y el inoculado con 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿

en el día 9 (1,40 ± 0,26 U/gss). Sin embargo, con la primera concentración se logra una

mayor productividad (0,1968 U/gss/día) ya que la maxima actividad se logra en menor

tiempo. Con la concentración de inóculo de 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 se logra la máxima

actividad en el día 9 (0,969 ± 0,08 U/gss; no obstante, esta es un 42,4% menor a la

obtenida con las otras concentraciones.


Th003

La máxima actividad CMCasa (figura 6) y xilanasa (figura 7) se da con la mayor

concentración de inoculación al día 9 de fermentación (4,81 ± 0,10 U/gss) y (964,04 ± 6,83

U/gss), respectivamente. Con esta concentración se obtuvo un 24,2% más de actividad

CMCasa en comparación con la concentración 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (3,87 ± 0,08 U/gss) y

un 87,8% más en comparación a la concentración 1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (2,56 ± 0,1U/gss).

Por otro lado, se obtuvo un 94,7% y 210,5% más de actividad xilanasa en comparación

con las concentraciones de 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (494,98 ± 10,45 U/gss) y de

1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (310,46 ± 1,44 U/gss) respectivamente.

1 3 5 7 9 11

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Unid

ades d

e A

ctivid

ad F

Pase (

U/g

ss)

Tiempo (Día)

10E4

10E5

10E6

Figura 5. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de FPasa de T. koningiopsis Th003

Capítulo 3 49

Con los anteriores resultados se encuentra que la suspensión de conidios con una

concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 es la concentración adecuada como inóculo iniciador

para la producción principalmente de enzimas xilanasas.

Figura 6. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de enzima CMCasa de T. koningiopsis Th003

1 3 5 7 9 11

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Un

ida

de

s d

e A

ctivid

ad

CM

Ca

sa

(U

/gss)

Tiempo (Día)

10E4

10E5

10E6


Th003

Es importante que se utilice una adecuada concentración de inóculo cuando se cultivan

hongos para la producción de enzimas en FES. Una concentración de inóculo muy baja

podría tomar un tiempo más largo para que el hongo colonice el sustrato. En consecuencia,

se aumentaría el riesgo de contaminación donde otros hongos, o incluso bacterias de

rápido crecimiento puedan colonizar el sustrato afectando el proceso (Yoon et al., 2014).

Un mayor tamaño de inóculo no solo da como resultado una mayor producción de xilanasa

debido a una mayor degradación del sustrato y una mayor disponibilidad de nutrientes,

sino que también minimiza el período de latencia para el crecimiento de hongos (Ezeilo,

Lee, Huyop, Zakaria, & Wahab, 2019).

1 3 5 7 9 11

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000U

nid

ades d

e A

ctivid

ad X

ilanasa (

U/g

ss)

Tiempo (Día)

10E4

10E5

10E6

Figura 7. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de xilanasas de T. koningiopsis Th003

Capítulo 3 51

3.3.2 Efecto de la temperatura de incubación

La Figura 8 presenta los resultados del efecto de las dos temperaturas estudiadas (28°C

y 38°C) sobre las actividades enzimáticas FPasa, CMCasa y xilanasa.

En el caso de las FPasas, se observa que a 28°C hay una tendencia creciente hasta el día

5, mientras que a 38°C se observa la tendencia creciente va hasta el día 3. La máxima

actividad FPasa se da al día 5 de fermentación (0,809 ± 0,07 U/gss) a 28°C, valor que es

151,2% mayor con respecto a la actividad máxima obtenida a 38°C al día 3 de fermentación

(0,322 ± 0,1 U/gss). A pesar de que a 38°C la máxima actividad FPasa se da al día 3 de

fermentación (0,107 U/gss/día), la actividad a 28°C sigue siendo mayor en términos de

productividad (0,1618 U/gss/día).

Figura 8. Influencia de la temperatura de incubación sobre la producción de FPasa, CMCasa y xilanasa de T. koningiopsis Th003


Th003

Por otro lado, para la actividad CMCasa a 28°C se observa una tendencia creciente hasta

el día 5 y se mantiene constante hasta el día 7, mientras que a 38°C la actividad crece

hasta el día 3, manteniéndose constante hasta el día 5 y decrece al día 7. La máxima

actividad CMCasa ocurre al día 5 de fermentación a 28°C (2,98 ± 0,01 U/gss), un 61,9%

más de actividad que la obtenida a 38°C (1,84 ± 0,16 U/gss) al día 3 de fermentación. A

pesar de que a 38°C la máxima actividad CMCasa se da al día 3 de fermentación (0,107

U/gss/día), la actividad a 28°C sigue siendo mayor en términos de productividad (0,1618

U/gss/día).

En cuanto a la actividad xilanasa tanto a 28°C como a 38°C se observa una tendencia

similar la cual es creciente hasta el día 5 y decrece el día 7, en donde no existen diferencias

significativas entre las dos temperaturas desde el día 0 hasta el día 5 (866,0 ± 6,28 U/gss

y 836,51 ± 26,1 U/gss, 28°C y 38°C respectivamente).

El efecto de la temperatura de incubación para la producción de hemicelulasas y celulasas

por T. koningiopsis Th003 revela que 28°C es la temperatura adecuada para la producción

de estas enzimas. Un aumento en la temperatura conduce a una disminución de la

actividad debido al cambio en los procesos metabólicos que lleva a cabo el hongo

(Pachauri et al., 2017). Cada especie de Trichoderma tiene sus propias preferencias

ecológicas, sin embargo, la mayoría de ellas crecen mejor en condiciones mesofílicas.

Diversos estudios relacionados con la temperatura óptima de crecimiento para diferentes

especies de Trichoderma, específicamente para la producción de enzimas

hemicelulolíticas y celulolíticas, han reportado un rango de temperatura de incubación de

25°C – 35°C (Jampala, Tadikamalla, Preethi, Ramanujam, & Uppuluri, 2017).

3.3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado

A continuación, se presentan los resultados de la evaluación del efecto de la

suplementación del sustrato de fermentación con dos concentraciones de dos fuentes de

nitrógeno: extracto de levadura (orgánica) y sulfato de amonio (inorgánica), además de la

relación del bagazo de caña y el salvado de trigo.

Capítulo 3 53

Los resultados de FPasa que se presentan en la Figura 9 indican que el extracto de

levadura utilizado como fuente suplementaria de nitrógeno es la más adecuada para la

producción de estas enzimas, todos los tratamientos al día 7 de fermentación con extracto

de levadura (a excepción del T3) obtuvieron mayor actividad FPasa en comparación con

las fermentaciones realizadas sin la adición de fuente de nitrógeno (control), mientras que

con las fermentaciones realizadas con sulfato de amonio, no hubo actividad FPasa con

ningún tratamiento a excepción del tratamiento 5 (T5), el cual no presenta diferencias

significativas con la máxima actividad obtenida con el control (p>0,05). El tratamiento 1 con

extracto de levadura (T1) (relación bagazo/salvado 1:1, 10 g/L extracto de levadura) obtuvo

la máxima actividad FPasa al día 7 de fermentación (1,095 ± 0,06 U/gss), representando

un 91% más de actividad con respecto al control al día 5 (0,573 U/gss). Por otro lado, la

máxima actividad obtenida con sulfato de amonio corresponde al tratamiento 5 (T5)

(relación bagazo/salvado 2:1, 7 g/L sulfato de amonio) al día 7 de fermentación (0,591

U/gss). Tanto el control, como el T5 con sulfato de amonio representan un 85,2% menos

de actividad a la obtenida en el T1 con extracto de levadura.

En cuanto a la actividad CMCasa (Figura 10) se puede observar que en general todos los

tratamientos tanto con extracto de levadura como con sulfato de amonio tuvieron mayores

actividades CMCasa en comparación con el control. No se observan diferencias

significativas (p=0,099) entre las máximas actividades obtenidas con extracto de levadura

(3,74 ± 0,34 U/gss) y sulfato de amonio (4,31 ± 0,36 U/gss). Sin embargo, se observa una

1 3 5 7

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

FP

asa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

(a)

1 3 5 7

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

FP

asa

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

(b)

Figura 9. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción de enzimas FPasas. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio


Th003

actividad superior en un 71% utilizando cualquiera de las dos fuentes de nitrógeno en

comparación con el control (sin fuente de nitrógeno) y una relación bagazo/salvado de 2:1.

En la Figura 11, se muestran los resultados obtenidos para la actividad xilanasa. Se puede

observar que con extracto de levadura todos los tratamientos tuvieron una mayor actividad

en comparación con el control (a excepción del T3 y T4 al día 5 de fermentación y T4 al

día 7), mientras que con sulfato de amonio el control obtuvo mayor actividad xilanasa en

comparación con todos los tratamientos a excepción del T5 al día 7 de fermentación. La

máxima actividad se da en el tratamiento 1 (T1) con extracto de levadura (relación

bagazo/salvado 1:1 ; 10 g/L de extracto de levadura) al día 7 de fermentación (971,27 ±

6,8 U/gss), sin embargo si se observan los resultados en términos de productividad, se

puede observar que los tratamientos 2 (T2: relación bagazo/salvado 1:1 ; 4 g/L de extracto

de levadura) y 5 (T5: relación bagazo/salvado 2:1 ; 7 g/L extracto de levadura) (7,409 ±

0,01 U/gss/h y 7,474 ± 0,10 U/gss/h respectivamente) obtienen mejores resultados que el

obtenido con el T1 (6,295 ± 0,13 U/gss/h). El tratamiento que obtuvo la máxima actividad

con sulfato de amonio fue T5 (relación bagazo/salvado 2:1; 7g/L sulfato de amonio) al día

7 de fermentación (617,74 ± 23,17 U/gss), sin embargo, este representa un 57,22% menos

de actividad al obtenido en el T1 con extracto de levadura.

1 3 5 7

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

CM

Ca

sa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

1 3 5 7

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

CM

Ca

sa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

(a) (b)

Figura 10. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción de CMCasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio

Capítulo 3 55

Teniendo en cuenta el potencial que tiene T. koningiopsis Th003 para la producción de

enzimas xilanasas, en comparación con las otras enzimas, y que la producción de estas

enzimas va enfocada principalmente a la hidrólisis de la hemicelulosa del ensilaje de la

avena forrajera, se realizó el análisis estadístico de los datos de la actividad xilanasa al día

5 de fermentación con extracto de levadura, los cuales correspondieron al tiempo y fuente

de nitrógeno de mayor producción. El análisis estadístico determinó que el factor con efecto

significativo p<0,07 sobre la producción de xilanasas fue la relación bagazo/salvado. Los

valores de los coeficientes se presentan en la Tabla 12, que expone el efecto, tanto positivo

como negativo, de los parámetros evaluados.

Tabla 12. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5.

Término Efecto Coef EE del

Valor T Valor p coef.

Constante 745,8 46,0 23,73 0

Relación bagazo/Salvado 455,1 227,5 65,1 9,08 0,004a

Extracto de Levadura -37,3 -18,6 65,1 -0,74 0,780

Relación bagazo/salvado*Extracto de levadura

-96,5 -48,2 61,5 -2,22 0,473

Normalidad Shapiro-Wilk >0,100

Homocedasticidad Bartlett levene Nivel de confianza: 98,833% 0,000

1 3 5 7

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

Xila

na

sa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

1 3 5 7

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

Un

ida

de

s d

e a

ctivid

ad

xila

na

sa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1

T2

T3

T4

T5

CONTROL

(a) (b)

Figura 11. Efecto de la fuente de Nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción de enzimas Xilanasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio


Th003

a Nivel de significancia del 7% (p<0,07)

De acuerdo con la prueba de normalidad Shapiro-Wilk la hipótesis nula indica que los datos

siguen una distribución normal. Puesto que el valor p es >0,100 que es mayor al nivel de

significancia utilizado en este experimento (p=0,07), la decisión es que no se puede

rechazar la hipótesis nula (Anexo D). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican

que se puede estar un 97 % seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza

incluye las verdaderas desviaciones estándar de población para todos los experimentos.

Por otro lado, de acuerdo con la prueba de Bartlett Levene, se puede estar un 98.833 %

seguro de que la desviación estándar para los tratamientos se encuentra dentro del

intervalo de confianza, el valor p de la prueba (p=0,000) de comparaciones múltiples es

menor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre algunas de

las desviaciones estándar son estadísticamente significativas (Anexo E).

La relación bagazo/salvado tiene una incidencia significativa (p=0,004) mostrando un

efecto positivo (455,1), como se puede observar en la gráfica de Pareto de efectos

Figura 12. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo (rojo), efecto negativo (gris).

Capítulo 3 57

estandarizados (Figura 12). Esto coincide al observar que la actividad enzimática varió

entre 348,57 ± 8,34 U/gss y 840,89 ± 82,1 U/gss al modificar la relación bagazo/salvado

del nivel bajo a nivel alto, mientras que la actividad enzimática no cambió en gran medida

con la variación de la concentración del extracto de levadura (Figura 13).

La ecuación 3 expresa el modelo matemático que representa la actividad enzimática de

las xilanasas en función de las variables independientes (concentración extracto de

levadura y relación bagazo/salvado). Entre los dos factores evaluados, la relación

bagazo/salvado tuvo el mayor impacto en la producción de enzimas dada por el valor

absoluto del coeficiente lineal (972). El coeficiente de regresión (R2) de 0,9106 indica un

ajuste adecuado de los datos al modelo.

Relación bagazo/Salvado

Extr

acto

de L

evad

ura

1,00,80,60,4

10

9

8

7

6

5

4

>

–

–

–

–

–

< 500

500 600

600 700

700 800

800 900

900 1000

1000

Xilanasa

Gráfica de contorno de Xilanasa vs. Extracto de Levadura; Relación bag

Figura 13. Diagrama de contorno de interacción entre la relación bagazo/salvado y concentración del extracto de levadura (g/L) teniendo como respuesta la producción de enzimas xilanasas (U/gss)


Th003

El objetivo principal del diseño factorial fue realizar un experimento exploratorio para

seleccionar la mejor fuente de nitrógeno, determinar si los intervalos de concentración de

la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado eran adecuados para favorecer la

producción de enzimas, principalmente xilanasas. Sin embargo, se puede observar que no

son los rangos óptimos de las variables, por consiguiente, es necesario otro diseño

experimental para hallarlos.

Los resultados de los experimentos determinaron que una relación bagazo/salvado (1:1) y

una concentración de extracto de levadura de 4 g/L mejoran la producción de enzimas

xilanasas.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se pudo observar que se aumentó un 91% de

actividad FPasa, 71% de actividad CMCasa y un 57,22% de actividad xilanasa cuando se

le adiciona al medio de fermentación una fuente de nitrógeno orgánica. Algunos estudios

han demostrado que la adición de fuentes de nitrógeno inorgánicas, como el sulfato de

amonio, estimulan la producción de enzimas cuando se encuentran en la concentración

adecuada, debido a la rápida acción de estos compuestos. Sin embargo, un aumento

significativo en las concentraciones de estas fuentes conduce a la disminución de la

actividad enzimática ya que pueden ser tóxicas para los hongos (Kalsoom, Ahmed,

Nadeem, Chohan, & Abid, 2019), adicionalmente, el extracto de levadura tiene

aminoácidos (necesarios para la producción de enzimas) que el hongo puede incorporar a

su metabolismo y por lo tanto no requiere producirlos, mientras que, cuando se utiliza una

fuente inorgánica, el hongo debe utilizar parte de la energía para la producción de estos

aminoácidos, de esta manera, las fermentaciones llevadas a cabo con sulfato de amonio

la actividad enzimática disminuyó en comparación con el extracto de levadura. La

suplementación con altas concentraciones de fuente de nitrógeno orgánica en sustrato

lignocelulósico estimula la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas (Jampala

Ecuación 3. Ecuación de regresión en unidades no codificadas.

Xilanasa Día 5

(U/gss)

= 158 + 972 Relación bagazo/Salvado + 23,6 Extracto de Levadura

- 45,9 Relación bagazo/Salvado*Extracto de Levadura

Capítulo 3 59

et al., 2017), debido a la presencia de iones presentes en el extracto de levadura como

potasio (4,5-6,3%) y fósforo (1.0-2,7%), además de vitaminas del complejo B (B1, B2, B5,

B6, B8, B9, B12) y algunos aminoácidos, que ejercen un efecto positivo para el crecimiento

micelial del hongo mejorando la producción de enzimas (Pachauri et al., 2017).

3.4 Conclusiones parciales

Una concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 y una

temperadura de 28°C son las condiciones mas adecuadas para esta FES para la

producción de enzimas celulasas y xilanasas.

La adición de extracto de levadura aumenta en mayor medida las actividades enzimáticas,

especialmente la xilanasa, en comparación con la fuente de nitrógeno inorgánica.

La relación bagazo/salvado tuvo una incidencia significativa en la producción enzimática,

siendo el término que mas ejerce efecto sobre la producción de xilanasas.

4. Optimización de los parámetros fisicoquímicos y nutricionales y efecto de la aireación sobre la producción de hemicelulasas y celulasas

4.1 Introducción

En el Capítulo 3 se mostró cómo la adición de una fuente de nitrógeno, la temperatura de

fermentación y la concentración de inóculo tienen efecto sobre la producción de

hemicelulasas y celulasas. No obstante, existen otros factores que afectan directamente la

producción enzimática y encontrar su punto óptimo se convierte en un factor clave para

aumentar la productividad en los procesos de FES (Pathak, Bhardwaj, & Singh, 2014).

Factores como: la relación y concentración óptima de los parámetros nutricionales, el pH,

el tamaño de partícula, la altura de lecho de fermentación y la aireación son algunos de los

parámetros para tener en cuenta.

La actividad enzimática es fuertemente influenciada por el pH, este es un parámetro

importante para ser optimizado ya que la actividad metabólica del organismo puede

provocar un cambio de pH durante el curso de la fermentación afectando su crecimiento,

adicionalmente los sitios activos de las enzimas generalmente dependen de la presencia

de iones específicos, de la carga de los aminoácidos en su estructura para mantener la

conformación que permite la unión eficiente al sustrato. Sin embargo, el monitoreo y control

del pH en FES no es usual, y solo se ha reportado la influencia del pH inicial del medio de

fermentación (Pathak et al., 2014). En general, un pH inicial de aproximadamente 6 es

adecuado para la producción de hemicelulasas y celulasas (Ezeilo et al., 2019). También

es importante señalar que la mayoría de los sustratos lignocelulósicos tienen una

capacidad amortiguadora que minimiza los cambios de pH durante la fermentación (Yoon

et al., 2014).


Th003

El tamaño de partícula está relacionado entre otros factores, con la caracterización del

sustrato y la capacidad del sistema de fermentación para el intercambio de calor y masa

lo que a su vez está relacionado con el crecimiento microbiano durante el proceso de FES.

El tamaño del sustrato determina el espacio vacío que está ocupado por el aire. Dado que

la velocidad de transferencia del oxígeno al espacio vacío determina el crecimiento

microbiano, el sustrato debe tener un tamaño adecuado para mejorarlo. Generalmente, las

partículas más pequeñas proporcionan un área superficial mayor para la acción de los

microorganismos; sin embargo, partículas demasiado pequeñas pueden provocar

aglomeración en el sustrato, lo que puede interferir en los procesos metabólicos

provocando un crecimiento deficiente (Krishna, 2005).

La altura de lecho es otro factor crucial ya que afecta directamente el crecimiento fúngico

y por consiguiente la producción enzimática. Con alturas de lecho muy grandes, puede

haber una inhibición del crecimiento del hongo, puesto que disminuye la transferencia de

oxígeno dentro del sistema, permitiendo que el calor metabólico generado durante el

proceso se acumule, ocasionando en consecuencia un aumento de temperatura dentro del

sistema que puede afectar el desarrollo del microorganismo, adicionalmente por la baja

tasa de aireación dentro del sistema se pueden generar microcosmos anaeróbicos que

afectan directamente la productividad del microorganismo (Krishna, 2005).

La aireación tiene una influencia significativa en los procesos de FES, debido a la demanda

de oxígeno del microorganismo y a los fenómenos de transferencia de masa y calor. La

aireación proporciona oxígeno, elimina el dióxido de carbono y metabolitos tóxicos volátiles

además del calor metabólico producido dentro del fermentador (Krishna, 2005). Muchos

parámetros del proceso y características del sustrato como la presión del aire, la velocidad

del flujo, la porosidad del sustrato, la profundidad del lecho, el contenido de humedad, la

geometría del reactor, pueden afectar la transferencia de oxígeno (Mansour et al., 2016).

Por lo tanto, en este capítulo se presentará la optimización de los parámetros nutricionales

(relación bagazo/salvado y concentración del extracto de levadura) y fisicoquímicos

(tamaño de partícula, pH, y altura de lecho), y el efecto de la aireación sobre la producción

de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas.

Capítulo 4 63

2.3. Materiales y métodos


Para la optimización de los parámetros nutricionales y fisicoquímicos se siguió el mismo

procedimiento realizado en el Capítulo 3 para la producción del inóculo.

4.2.2 Optimización de la concentración del extracto de levadura y la relación bagazo/salvado

Habiendo escogido la fuente de nitrógeno (extracto de levadura), se optimizó su

concentración y la relación de bagazo/salvado para obtener la mayor producción de

enzimas hemicelulolíticas. Para ello se realizó un diseño central compuesto 23 con tres

repeticiones del punto central haciendo muestreo destructivo a los 0, 3, 5 y 7 días de

fermentación. La Tabla 13 presenta los valores de los factores y la Tabla 14 presenta los

11 tratamientos experimentales.

Tabla 13. Factores y niveles empleados en la optimización relación bagazo/salvado y fuente de nitrógeno

FACTOR -1,41 -1 +1 +1,41

Relación bagazo/salvado 1:0,8 1:1 1:2 1:2,2

Fuente de nitrógeno (g/L) 3,2 4 8 8,8

Tabla 14. Diseño central compuesto para la optimización de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado.

TRATAMIENTO RELACIÓN

BAGAZO/SALVADO FUENTE DE

NITRÓGENO (g/L)

T1 1:2 8

T2 1:2 4

T3 1:1 8

T4 1:1 4

T5 (x3) 1:1,5 6

T6 1: 0,8 6

T7 1: 2,2 6

T8 1:1,5 3,2


Th003

T9 1:1,5 8,8

4.2.2.1 Validación del efecto de los parámetros nutricionales

Las condiciones óptimas encontradas en el numeral anterior (relación bagazo/salvado y

concentración de la fuente de nitrógeno) se validaron realizando cinco fermentaciones en

bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm, las cuales contenían 20 gramos del sustrato con

una relación 1:3 (g sustrato/mL de agua). Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas

en autoclave a 121°C y 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas a una

relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato) con una concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/

𝑚𝐿, se sellaron con una película plástica y se incubaron en cuarto de fermentación por

cinco días con luz constante a 28°C ± 2, con una humedad relativa del 80-85%.

4.2.3 Efecto de las condiciones fisicoquímicas (pH, tamaño de partícula, altura de lecho) sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas.

Se realizó un diseño experimental Box Behnken de tres factores y tres niveles que se

presentan en la Tabla 15. Los factores estudiados fueron pH, el tamaño de partícula y la

altura de lecho. Adicionalmente, se realizaron tres repeticiones del punto central para un

total de 16 tratamientos (los datos de los puntos centrales fueron promediados y agrupados

en un mismo tratamiento), los cuales se muestran en la Tabla 16. Se utilizó el sustrato y

las condiciones de fermentación de acuerdo con los resultados obtenidos en la Capítulo 3,

las cuales correspondían a una relación bagazo/salvado 1:1 más 4 g/L de extracto de

levadura y solución de sacarosa 1% haciendo muestreo destructivo a los días 0, 3, y 5 de

fermentación.

Tabla 15. Box Behnken para la optimización parámetros fisicoquímicos.

FACTOR -1 0 +1

pH 5 6 7

Tamaño Partícula (log10 cm) -0,69 0 0,69

Altura de lecho (cm) 0,5 2,5 4,5

Capítulo 4 65

4.2.3.1 Validación del efecto de los parámetros fisicoquímicos

El pH, tamaño de partícula y altura de lecho que permitieron obtener la máxima actividad

hemicelulolítica se validaron realizando cinco fermentaciones en bandejas de aluminio de

13 cm x 11 cm, las cuales contenían la cantidad de sustrato de acuerdo con los resultados

obtenidos en el diseño Box Behnken y una relación 1:3 (g sustrato/mL de agua). Las

bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en autoclave a 121°C y 15 psi durante 30

minutos. Se inocularon las bandejas a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato)

con una concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿, se sellaron las bandejas con una película

plástica y se incubaron en cuarto de fermentación por cinco días con luz constante a 28°C

± 2, con una humedad relativa del 80-85%.

Tabla 16. Diseño de tratamiento para la optimización de parámetros fisicoquímicos.

TRATAMIENTO pH Tamaño partícula Altura de lecho

(cm)

T1 5 -0,69 2,0

T2 7 -0,69 2,0

T3 5 0,69 2,0

T4 7 0,69 2,0

T5 5 0 0,5

T6 7 0 0,5

T7 5 0 3,5

T8 7 0 3,5

T9 6 -0,69 0,5

T10 6 0 0,5

T11 6 -0,69 3,5

T12 6 0,69 3,5

T13 (x3) 6 0 2,0

Control ≈7 -0,69 3,0


Th003

4.2.4 Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas

Se evalúo el efecto de dos flujos de aireación (alta y baja) sobre la producción enzimática.

La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor PROPHYTA® GmbH modelo L05. El

biorreactor consistió en un sistema a escala piloto de 4 niveles, cada uno con un área de

25 x 25 cm, y un serpentín para el control la temperatura utilizando un baño termostatado

externo (Cruz, 2014). Adicionalmente estuvo equipado con un sistema en línea para

controlar el flujo de aire, el cual se pasó a través de un filtro de 0,22 micras y se alimentó

al reactor a través de una manguera de silicona previamente estéril conectada al

biorreactor (Figura 14). Para este estudio, el aire de entrada se burbujeaba en un

recipiente con agua estéril que se encontraba a 30°C para asegurar que el aire estuviera

saturado.

Teniendo en cuenta que el ensayo se llevó en un fermentador a escala piloto, se aplicó el

principio de similaridad; este permitió mantener la proporcionalidad de las relaciones

sustrato/área de la bandeja (g/cm2) (ecuación 4), agua/sustrato (mL/g) (ecuación 5) y

cantidad de inoculo/ sustrato (mL/g) (ecuación 6).

Figura 14. Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 (Cruz, 2014).

Capítulo 4 67

Ecuación 4

𝑆𝑏

𝐴𝑏=

𝑆𝑝

𝐴𝑝

𝑆𝑝 =𝑆𝑏

𝐴𝑏× 𝐴𝑝

𝑆𝑝 =10 𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

143 𝑐𝑚2× 625 𝑐𝑚2

𝑆𝑝 =10 𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

143 𝑐𝑚2× 625 𝑐𝑚2

Sb: peso en g de la cantidad de sustrato en bandejas

Sp: peso en g de la cantidad de sustrato en prophyta

Ab: Área de las bandejas

Ap: Área de un nivel del Prophyta.

Ecuación 5

𝑤𝑏

𝑆𝑏=

𝑤𝑝

𝑆𝑝

𝑤𝑝 =𝑤𝐵

𝑆𝑏× 𝑆𝑝

𝑤𝑝 =30 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎

10 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜× 43,7 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

𝑤𝑝 = 131, 1 ~ 131 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎



wb= mL de agua en bandejas

wp= mL de agua en prophyta

Ecuación 6

𝐼𝑏

𝑆𝑏=

𝐼𝑝

𝑆𝑝

𝐼𝑝 =𝐼𝐵

𝑆𝑏× 𝑆𝑝

𝐼𝑝 =10,5𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜

10 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜× 43,7 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜


Th003

𝐼𝑝 = 45,8 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜



Ib= mL de inóculo bandejas

Ip= mL de inóculo prophyta

La composición y las cantidades de sustrato, inóculo, y agua que se usaron para los

bioreactores empleados se encuentran en la Tabla 17. Se determinó el área de la bandeja

de aluminio para la producción a escala de laboratorio y las dimensiones del biorreactor

Prophyta® empleando las dimensiones del área de un rectángulo (lado x ancho).

Tabla 17. Dimensiones de los parámetros para evaluar el efecto de la aireación

PARÁMETRO Biorreactor en

bandejas Biorreactor Prophyta ®

Ancho (cm) 13 25

Largo (cm) 11 25

Cantidad de sustrato (g) 10 43,7

Cantidad de inóculo (mL) 10,5 45,8

Cantidad de agua 30 131

Área (cm2)

𝐴𝑏 = 𝐿 𝑋 𝐴 𝐴𝑃 = 𝐿 𝑋 𝐴

𝐴𝑏 = 11 𝑋 13 𝐴𝑃 = 25 𝑋 25

𝐴𝑏 = 143 𝑐𝑚2 𝐴𝑃 = 625𝑐𝑚2

La fermentación se realizó con los resultados de la optimización de las variables

nutricionales y fisicoquímicas las cuales correspondieron a una relación bagazo/salvado

1:08; 3,2 g/L de extracto de levadura; un pH inicial del sustrato de 6 y una altura de lecho

de 0,5 cm, haciendo muestreo únicamente el dia 5 de fermentación. Los tratamientos

llevados a cabo se observan en la Tabla 18, en donde se probaron en el Prophyta dos

flujos de aire de entrada: alto (20 L/min) y bajo (2 L/min).

Capítulo 4 69

Tabla 18. Tratamientos para evaluar el efecto de la aireación

Tratamiento Flujo de aire (L/min) Biorreactor

T1 2 Prophyta

T2 20 Prophyta

4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el capítulo 3 para la obtención del extracto

enzimático, la cuantificación de las enzimas FPasa, CMCasa y xilanasa, y la determinación

de humedad.

4.2.6 Diseño estadístico


DE (desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron

determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,07 para el diseño

central compuesto y un p<0,05 para el diseño Box Behnken, utilizando un modelo de

regresión cuadrática

Para el diseño central compuesto y el Box Behnken se realizó un análisis de regresión

basado en los datos experimentales y se ajustó a un modelo polinómico de segundo orden

como se muestra a continuación en la ecuación 7, utilizando el software Minitab (versión

18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE.UU).

Para demostrar la normalidad de datos se usó la prueba de Shapiro Wilk y para la igualdad

de varianzas (homocedasticidad) se utilizó la prueba de Bartlett levene

Ecuación 7

𝒀 = ∑ 𝑨𝟎 + ∑ 𝑨𝒊𝑿𝒊

𝟑

𝒊=𝟏

+ ∑ 𝑨𝒊𝒊𝑿𝒊𝟐 +

𝟑

𝒊=𝟏

∑ ∑ 𝑨𝒊𝒋𝑿𝒊𝑿𝒋

𝟑

𝒋=𝒊+𝟏

𝟐

𝒊=𝟏

Donde Y, es la variable de respuesta; A0, Ai, Aii, Aij son los coeficientes de regresión de las

variables para los términos de intercepción, lineal, cuadrático e interacción

respectivamente y Xi y Xj representan las variables independientes.


Th003


4.3.1 Optimización de la concentración de extracto de levadura y la relación bagazo/salvado

La máxima actividad FPasa (Figura 15) se da con el tratamiento 5 (T5) el cual corresponde

a una relación bagazo/salvado de 1:1,5 y 6 g/L de extracto de levadura al día 3 de

fermentación (0,704 ± 0,18 U/gss), y con el tratamiento 7 (T7) que corresponde a una

relación bagazo/salvado de 1:2,2 y 6 g/L de extracto de levadura al 7 día de fermentación

(0,55 ± 0,18 U/gss), los cuales no presentan siferencias significativas (p=0,321); sin

embargo, a pesar de que presentaron la misma actividad T5 se produce en menor tiempo

(0,234 U/gss/día) en comparación con T7 (0,078 U/gss/día).

Figura 15. Efecto de la concentración de extracto de levadura y la relación bagazo/salvado sobre la producción de enzimas FPasa.

1 3 5 7

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Un

idad

es d

e a

ctivid

ad F

Pa

sa

(U

/gss)

Tiempo (Dias)

T1: (1:2)(8g/L)

T2: (1:2)(g/L)

T3: (1:1)(g/L)

T4: (1:1)(4g/L)

T5: (1:1,5)(6g/L)

T6: (1:0,8)(6g/L)

T7: (1:2.2)(6g/L)

T8: (1:1,5)(3,2g/L)

T9: (1:1,5)(8,8g/L)

Capítulo 4 71

Para la actividad CMCasa (Figura 16), se observa que no se presentan diferencias

significativas (p= 0,279) en su valor (1,705 ± 0,15 U/gss en promedio) al día 5 de

fermentación para los tratamientos T1, T3, T4, T5, T6, T7, T8 y T9. En el T2 (0,964 ± 0,14

U/gss) el cual corresponde a relación bagazo/salvado 1:2 y 4 g/L de extracto de levadura,

se observa una disminución del 76,86% de la actividad respecto al promedio de los otros

tratamientos en el mismo día de fermentación. Sin embargo, se puede observar que T3 y

T5 al día 3 de fermentación no presenta diferencias significativas con los tratamientos

anteriormente mencionados (p= 0,121) al día 5 de fermentanción, teniendo un

Figura 16. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación bagazo/salvado sobre la producción de enzimas CMCasa.

1 3 5 7

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0U

nid

ades d

e a

ctivid

ad C

MC

asa (

U/g

ss)

Tiempo (Dias)

T1: (1:2)(8g/L)

T2: (1:2)(g/L)

T3: (1:1)(g/L)

T4: (1:1)(4g/L)

T5: (1:1,5)(6g/L)

T6: (1:0,8)(6g/L)

T7: (1:2.2)(6g/L)

T8: (1:1,5)(3,2g/L)

T9: (1:1,5)(8,8g/L)


Th003

productividad mayor (0,52 U/gss/día en comparación con los tratamientos del día 5, los

cuales tienen una productividad promedio de 0,341 U/gss/día.

En cuanto a las xilanasas (Figura 17), todos los tratamientos (excepto T5 que tiene una

tendencia variable) tienen una actividad creciente hasta el día 5, en donde para los

tratamientos T1, T2 y T6 continúa asi hasta el día 7, mientras que T3, T4, T7 y T8

disminuyen su actividad. La máxima actividad se presenta al día 5 de fermentación con el

tratamiento 4 (T4) el cual, corresponde a una relación bagazo/salvado de 1:1; y 4 g/L de

extracto de levadura (1130,31 ± 20,40 U/gss).

Figura 17. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación bagazo/salvado sobre la producción de enzimas xilanasa

1 3 5 7

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

Unid

ades d

e a

ctivid

ad X

ilanasa (

U/g

ss)

Tiempo (Dias)

T1: (1:2)(8g/L)

T2: (1:2)(g/L)

T3: (1:1)(g/L)

T4: (1:1)(4g/L)

T5: (1:1,5)(6g/L)

T6: (1:0,8)(6g/L)

T7: (1:2.2)(6g/L)

T8: (1:1,5)(3,2g/L)

T9: (1:1,5)(8,8g/L)

Capítulo 4 73

El diseño central compuesto permitió determinar las interacciones entre las variables

independientes (relación bagazo/salvado y concentración del extracto de levadura) y al

mismo tiempo maximizar la producción de xilanasas.

Se realizó el análisis estadístico de los datos experimentales de la actividad de xilanasa al

día 5 de fermentación el cual corresponde al día de mayor producción. Los valores de los

coeficientes se presentan en la Tabla 19. El valor de p del modelo fue 0,027 (p<0,07) lo

que indicó que el término del modelo fue significativo.

La ecuación 5, representa el modelo matemático de la actividad enzimática de xilanasas

en función de las variables independientes. El coeficiente de regresión (R2) igual a 0,7417

indica que el 25,83% de la variación total no podría explicarse por el modelo, esto debido

principalmente a la variabilidad de las actividades enzimáticas en cada una de las réplicas

de las fermentaciones.

Tabla 19. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación.

Término Coef EE del


Constante 375 122 3,08 0,027

Relación Bagazo/Salvado (A) -52,3 74,6 -0,7 0,514

Extracto de levadura (B) 20,8 74,6 0,28 0,791

Relación bagazo/salvado*Relación Bagazo/salvado (AA)

216,2 88,8 2,44 0,059 a

Extracto Levadura*Extracto Levadura (BB) 289,2 88,8 3,26 0,023 a

Relación Bagazo/salvado*Extracto Levadura (AB)

94 105 0,89 0,415

Normalidad Shapiro-Wilk 0,010




Th003


siguen una distribución normal. Puesto que el valor p=0,010 que es mayor al nivel de


rechazar la hipótesis nula (Anexo F). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican

que se puede estar un 97 % seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza





menor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre algunas de

las desviaciones estándar son estadísticamente significativas (Anexo G).

En la gráfica de Pareto de efectos estandarizados (Figura 18) y en la tabla 18, se evidencia

que tanto el término cuadrático de la relación bagazo/salvado (AA) como el del extracto de

levadura (BB) son significativos (p=0,059 y 0,023 respectivamente) y tienen una incidencia

positiva en la producción de xilanasas (216,2 y 289,2 respectivamente), siendo el BB el

que mayor efecto ejerce sobre la producción de enzimas xilanasas.

Ecuación 5. Ecuación de regresión en unidades no codificadas para parámetros nutricionales

Actividad Xilanasa

(U/gss) Día 5

= 5862 +(- 3262 Relación Bagazo/salvado) + (- 998 Extracto Levadura)

+ (865 Relación Bagazo/salvado*Relación Bagazo/salvado)

+ (72,3 Extracto Levadura*Extracto Levadura)

+ (94 Relación Bagazo/salvado*Extracto Levadura

Capítulo 4 75

La superficie de respuesta mostrada en la Figura 19, es un paraboloide cóncavo hacia

abajo mostrando un mínimo de actividad, por lo tanto, su valor máximo se logra tanto en

el nivel más alto de relación bagazo/salvado (1:2,2) y extracto de levadura (8,8 g/L), como

en el más bajo (1:0,8 y 3,2 g/L respectivamente). Sin embargo, la adición de grandes

cantidades de extracto de levadura y la utilización de mayor cantidad de salvado de trigo

aumentaría el costo, pudiendo ser inviable su producción a gran escala.

De acuerdo con la predicción de respuesta múltiple, la configuración óptima para obtener

la máxima actividad xilanasa es: relación bagazo/salvado 1:0,8 y 3,2 g/L de extracto de

levadura.

Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo (rojo), efecto negativo (gris).


Th003

▪ Validación

La validación de la relación bagazo/salvado y la concentración del extracto de levadura

óptimas de acuerdo con la predicción del modelo se verificó experimentalmente por medio

de cinco fermentaciones y los resultados se presentan en la Tabla 20. La producción de

xilanasa al día 5, en condiciones óptimas produjo una actividad de 1227,58 ± 81,56 U/gss,

en comparación con el rendimiento previsto, el cual se encontraba en un intervalo entre

995 – 1241 U/gss. La excelente correlación entre los valores experimentales y los

predichos, indica la validez del modelo, y confirma la existencia del punto óptimo bajo las

condiciones del proceso FES descrito aquí.

Figura 19. Gráfico de superficie de respuesta 3D para la actividad xilanasa al día 5 de fermentación.

Xil

an

asa (

U/g

ss)

4 6

500

1 000

2,05,1

0,18

15 00

azo/salvadogaB niócaleRveL otcartx )dura (g/LE a

Capítulo 4 77

4.3.2 Optimización del pH, tamaño de partícula y altura de lecho

Los resultados obtenidos de la actividad FPasa se presentan en la Figura 20, en donde se

observa que todos los tratamientos, a excepción del T6, tuvieron una actividad FPasa baja

(T4 y T12), siendo mínima en los tratamientos T1, T2, T3, T5, T7, T8, T9, T10, T11, T13 y

el control. La máxima actividad que se da con el tratamiento (T6) al día 5 de fermentación

es de 0,503 ± 0,03 U/gss, el cual corresponde a la configuración: pH 7; tamaño de partícula

1 cm y altura de lecho 0,5 cm, siendo este 100% más de actividad respecto al control (pH

≈7; tamaño de partícula 5 cm y altura de lecho 3 cm).

Tabla 20. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003

Validación Actividad enzimática (U/gss) experimental

Promedio (U/gss)

Desviación estándar

(DS)

Rango Predicción

(U/gss)

1 1273,63

1227,588 81,56 995 - 1241

2 1205,7

3 1096,27

4 1303,81

5 1258,53


Th003

En la Figura 21 se presentan los resultados para CMCasa, allí se puede observar que los

tratamientos T3, T7, T8, T9, T10, T11 y el control tienen una tendencia creciente hasta el

dia 5 de fermentación, mientras que los tratamientos T2, T4, T5, T6 y T12 disminuyen su

actividad al día 5. El tratamiento T10 (2,656 ± 0,17 U/gss) fue el que obtuvo la mayor

actividad CMCasa, aumentando un 52,64% la actividad respecto al control (1,74 ± 0,35

U/gss). Su máxima actividad se mantiene constante desde el día 3 hasta el día 5 de

fermentación (2,36 ± 0,05 U/gss; 2,65 ±0,17 U/gss, respectivamente) (pH 6; tamaño de

partícula 1 cm; altura de lecho 0,5 cm).

Figura 20. Efecto del pH, tamaño de partícula (T) y altura (A) de lecho sobre la producción de enzimas FPasa.

Capítulo 4 79

Los resultados del diseño experimental para la producción de xilanasas se presentan en

la Figura 22. Se puede observar que, en general, todos los tratamientos evaluados tienen

una tendencia creciente en el tiempo, a excepción del tratamiento T6, el cual disminuye su

actividad al día 5. La máxima actividad se obtiene con el tratamiento T5 al día 5 de

fermentación (1227,86 ± 19,69 U/gss), el cual corresponde a la configuración: pH:5;

tamaño de partícula 1 cm; altura de lecho de 0,5 cm, con el cual se obtuvo un aumento del

8,63% (1130,31 ± 20,40 U/gss), respecto al control.

Figura 21. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de enzimas CMCasa.


Th003

Los resultados del diseño Box Behnken que se utilizó para determinar los factores claves

(pH, tamaño de partícula y altura de lecho), sus interacciones y para optimizar la

producción de enzimas xilanasas fueron analizados utilizando un análisis de variancia

(ANOVA) de los datos experimentales de la actividad xilanasa al día 5 de fermentación, el

cual corresponde al día de mayor producción. El valor de p del modelo fue 0,001 (p<0,05)

(Tabla 21) lo que indicó que el modelo fue significativo. De acuerdo con los valores de p

todas las variables y sus interacciones fueron significativos (p<0,05), con excepción de la

interacción pH * altura (p=0,054).

Figura 22. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de enzimas xilanasa.

Capítulo 4 81

La ecuación de regresión (ecuación 6) obtenida después del análisis de varianza (ANOVA)

expresó el nivel de la actividad xilanasa al día 5 de fermentación en función de las variables

independientes (pH, tamaño de partícula y altura de lecho). El coeficiente de regresión (R2)

igual a 0,9728 indica que únicamente el 7,6% de la variación total, no podría explicarse por

el modelo, lo que demuestra que el modelo de regresión representa bien el

comportamiento del sistema en el intervalo definido.


siguen una distribución normal. Puesto que el valor p=0,010 que es mayor al nivel de


Tabla 21. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación

Término Coef EE del


Constante 446,2 64,0 6,97 0,001

pH (A) -173,7 39,2 -4,43 0,007a

Tamaño de partícula (B) 221,7 39,2 5,66 0,002a

Altura de lecho (C) -207,6 39,2 -5,30 0,003a

pH * pH (AA) -213,3 57,7 -3,70 0,014a

Tamaño * Tamaño (BB) 290,2 57,7 5,03 0,004a

Altura * Altura (CC) 220,4 57,7 3,82 0,012a

pH * Tamaño (AB) -138,8 55,4 -2,51 0,054

pH * Altura (AC) 291,9 55,4 5,29 0,003a

Tamaño *Altura (BC) 165,9 55,4 2,99 0,030a

Normalidad Shapiro-Wilk 0,010



Ecuación 6. Ecuación de regresión en para parámetros fisicoquímicos.

Actividad Xilanasa

(U/gss) Día 5

= -3777 + (2204 pH) + (-19 Tamaño) + (-1868 Altura) + (- 213,3 pH*pH)

+ (72,5 Tamaño*Tamaño) + (98,0 Altura*Altura) + (- 69,4 pH*Tamaño)

+ (195,3 pH*Altura) + (55,3 Tamaño*Altura)


Th003

rechazar la hipótesis nula (Anexo H). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican

que se puede estar un 95% seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza





mayor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre las

desviaciones estándar no son estadísticamente significativas. (Anexo I).

En la gráfica de Pareto de efectos estandarizados (Figura 23) se puede observar que el

tamaño de partícula (B), la altura (C) y la interacción pH*altura (AC) ejercen los mayores

efectos, seguidos por el término cuadrático del tamaño (BB), el pH (A), el término

cuadrático de la altura (CC) y la interacción tamaño*altura (BC). Adicionalmente se puede

observar que, B, AC, BB, CC y BC ejercen un efecto positivo sobre la producción de

xilanasas al día 5 de fermentación, mientras que C, A, AA tienen un efecto negativo.

Figura 23. Diagrama de Pareto de los efectos del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo (rojo), efecto negativo (gris).

Capítulo 4 83

Figura 24. Superficie de respuesta (3D) y gráfico de contorno que muestran los efectos de la interacción para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación. (a,b) efectos del pH y tamaño de partícula; (c,d) efectos del pH y la altura de lecho; (d,e) efectos del tamaño de partícula y la altura de lecho. La variable de respuesta aumenta de negro a rojo

Altura de lecho (cm) 2

Valores fijos

0

56

0

400

008

0,0

5,0-

7

0,5

008

12 00

Hp

ráfica de superficie de Xilanasa G v . Tamaño de partícula (Log cm); pHs

U/g

ss

Xil

an

asa

(a)

Altura de lecho (cm) 2

Valores fijos

pH

Tam

añ

o d

e p

artí

cu

la (

Lo

g c

m)

7,06,56,05,55,0

0,50

0,25

0,00

-0,25

-0,50

>

–

–

–

–

< 200

200 400

400 600

600 800

800 1000

1000

Xilanasa

Gráfica de contorno de Xilanasa vs. Tamaño de partícula (Log cm); pH

(b)

Tamaño de partícula (Log cm) 0

Valores fijos

0

56

0

400

008

2

1

7

3

2

008

0021

Hp

ráfica de superficie de XilanaG s vs. Altura de lecho (cm); pHa

U/g

ss

Xil

an

asa

Tamaño de partícula (Log cm) 0

Valores fijos

pH

Alt

ura

de l

ech

o (

cm

)

7,06,56,05,55,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

>

–

–

–

–

< 200

200 400

400 600

600 800

800 1000

1000

Xilanasa

Gráfica de contorno de Xilanasa vs. Altura de lecho (cm); pH

(c) (d)

pH 6

Valores fijos

5,0-00,

0

005

750

2

1

5,0

3

1000

0512

ráfica de superficie de Xilanasa vs. Altura de lecho (cm); Tamaño de G

U/g

ss

Xil

an

asa

Tamaño partícula (Log

cm)

(e)

pH 6

Valores fijos

Tamaño de partícula (Log cm)

Alt

ura

de l

ech

o (

cm)

0,500,250,00-0,25-0,50

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

>

–

–

–

< 500

500 700

700 900

900 1100

1100

Xilanasa

Gráfica de contorno de Xilanasa vs. Altura de lecho (cm); Tamaño de pa

(f)


Th003

Los gráficos de superficie de respuesta y los gráficos de contorno se muestran en la Figura

24 (a-f), los cuales representan las interacciones entre dos variables manteniendo las

terceras variables en sus niveles medios.

Tanto en la Figura 24a, b como en la Figura 24c, d, se puede observar que no hay una

interacción con un único punto óptimo entre las variables independientes, por consiguiente,

es necesario de otro diseño experimental para hallar los valores óptimos. El análisis de la

interacción del pH*altura (Figura 24c, d) sugiere que a mayor pH y mayor altura de lecho

se disminuye la actividad enzimática siendo la altura de lecho el factor que más efecto

ejerce sobre la actividad. La distribución de los datos en los gráficos (superficie de

respuesta curva (Figura 24e) y contornos elípticos (Figura 24f) demuestra que el modelo

contiene términos cuadráticos que son estadísticamente significativos, es decir existen

fuertes interacciones significativas entre los dos factores. Los contornos elípticos obtenidos

en la Figura 24f indican una fuerte interacción entre las variables independientes tamaño

de partícula * altura de lecho siendo la altura de lecho el factor que más efecto ejerce sobre

la actividad enzimática. El análisis sugiere que a menor altura de lecho y mayor tamaño de

partícula se obtienen mayores actividades enzimáticas.

De acuerdo con la predicción de respuesta múltiple, la configuración óptima de los

parámetros fisicoquímicos para obtener la máxima actividad de xilanasa es: pH 5; tamaño

de partícula 5 cm, y altura de lecho de 0,5 cm.

4.3.1.1. Validación

La validación de los parámetros fisicoquímicos óptimos de acuerdo con la predicción del

modelo se verificó experimentalmente por medio de cinco fermentaciones (Tabla 22).

Tabla 22. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003

Validación Actividad enzimática (U/gss) experimental

Promedio (U/gss)

Desviación estándar

(DS)

Rango Predicción

(U/gss)

1 1380,43

1291,29 70,55 1276 - 1949

2 1277,01

3 1307,13

4 1279,81

5 1211,97

Capítulo 4 85

La producción de xilanasa al día 5, en condiciones óptimas produjo una actividad promedio

de 1291,29 ± 70,55 U/gss, en comparación con el rendimiento previsto, el cual se

encontraba en un rango entre 1276 - 1949 U/gss. La excelente correlación entre los valores

experimentales y los pronosticados, ratifica la validez del modelo.

El pH es uno de los parámetros cruciales de los procesos de FES, este parámetro afecta

directamente el transporte entre las membranas celulares, el crecimiento del hongo y la

producción de enzimas (Ezeilo et al., 2019b). Cada microorganismo tiene un rango de pH

dentro del cual es posible su crecimiento y normalmente posee un pH óptimo bien definido

para el desarrollo de sus funciones metabólicas (Nanjundaswamy & Okeke, 2020). Sin

embargo, debido a la dificultad para monitorear el pH en los procesos de FES, el pH

normalmente no es un parámetro que se controle durante el proceso, sino se realiza un

ajuste de este al inicio de la fermentación y las variaciones durante el tiempo de

fermentación generalmente no se tienen en cuenta (Yoon et al., 2014). Trichoderma sp

posee un amplio rango de pH para su crecimiento, puede crecer en sustratos con pH neutro

(pH 7) hasta pH ácidos (pH 4). Las condiciones ácidas de los sustratos incrementan la tasa

de crecimiento del hongo reflejándose en la formación de conidióforos, la germinación de

conidios y por consiguiente en la producción de enzimas necesarias para el crecimiento

(Pérez-Rodríguez et al., 2014). Pachauri, et al., observaron una mayor producción de

enzimas FPasa (120,15 U/gss), CMCasa (253,67 U/gss) y xilanasa (87,56 U/gss) de

Trichoderma koningii a un pH 6, a partir de carboximetilcelulosa (CMC) y sulfato de amonio

como fuente de carbono y nitrógeno respectivamente (Pachauri et al., 2017). Por otro lado,

Pathak, Bhardwaj, & Singh, encontraron que el pH 6,5, era el pH óptimo para la producción

de enzimas FPasas (6,85 ± 0,25 U/gss) y CMCasa (23,52 ± 0,94 U/gss) de Trichoderma

harzianum a partir de salvado de trigo y sulfato de amonio como fuentes de carbono y

nitrógeno respectivamente. Para la obtención de enzimas xilanasas encontraron que el pH

óptimo correspondía a pH 6, obteniendo una actividad máxima de 1280,3 ± 78,4 U/gss

(Pathak et al., 2014). Paganini et al., obtuvieron una actividad máxima de Fpasa (0,26

U/gss), CMCasa (64,56 U/gss) y xilanasa (351,74 U/gss) a partir de Trichoderma viridae

utilizando bagazo de caña y salvado de trigo como sustrato de fermentación con un pH

ajustado de pH 4,5 (Marques et al., 2018).


Th003

Por lo anterior, se puede afirmar que la producción de enzimas, principalmente las que

hacen parte de la hidrólisis del complejo lignocelulósico, pueden variar entre especies,

incluso entre especies pertenecientes al mismo género taxonómico. Sin embargo, se

evidencia que la máxima producción de FPasas y CMCasas se obtiene entre un intervalo

de pH entre 6 y 7, mientras que la producción máxima de xilanasas se da con pH más

ácidos (entre pH 4,5 y pH 5,0), tal y como se evidenció en los resultados obtenidos en esta

investigación, en donde obtuvimos que la máxima actividad FPasa (0,503 ± 0,03 U/gss) se

dio en pH 7, la actividad CMCasa (2,65 ±0,17 U/gss) a pH 6 y la actividad xilanasa (1227,86

± 19,69 U/gss) a pH 5.

El tamaño de partícula del sustrato y la altura de lecho son dos parámetros involucrados

en la FES que están relacionados entre sí, debido a que están vinculados con la capacidad

del sistema para la transferencia de calor y masa durante el proceso (Krishna, 2005).

Debido a que la velocidad de transferencia del oxígeno al espacio vacío que es ocupado

por el aire afecta el crecimiento, el sustrato deber contener partículas del tamaño adecuado

y alturas de lecho adecuadas para mejorar la transferencia de masa (Mohamad Ikubar,

Abdul Manan, Md. Salleh, & Yahya, 2018). Generalmente, las partículas más pequeñas

proporcionarían un área superficial más grande en la cual el hongo podría crecer más

fácilmente. Sin embargo, se pudo observar que las partículas muy pequeñas en

combinación con alturas de lecho muy altas provocan aglomeración del sustrato inhibiendo

el crecimiento por la acumulación de altas concentraciones de CO2 y la baja disponibilidad

de O2 dentro del sistema (Mohamad Ikubar et al., 2018), un ejemplo de esto es el obtenido

en el tratamiento 11 (T11), con el menor tamaño de partícula (0,2 cm) y la mayor altura de

lecho (3,5 cm) en donde se obtuvieron bajas actividades 0,606 ± 0,1 U/gss y 424,74 ±

13,41 U/gss de CMCasa y xilanasa respectivamente en comparación con los mejores

tratamientos obtenidos para FPasa (T6) (0,503 ± 0,03 U/gss), CMCasa (T10) ( 2,656 ± 0,17

U/gss) y xilanasa (T5) (1227,86 ± 19,69 U/gss) los cuales tenían partículas más grandes

(1 cm) y alturas de lecho más bajas (0,5 cm). Las partículas más grandes proporcionan

una mejor eficiencia de respiración, pero proporcionan una superficie limitada para la

colonización del microorganismo (Krishna, 2005).

Capítulo 4 87

4.3.3 Efecto de la aireación

Los resultados de la evaluación del efecto de aireación sobre la producción de enzimas

FPasa, CMCasa y xilanasa al día 5 de fermentación se muestran en la Figura 25. Se puede

observar que en los tratamientos T1 y T2, los cuales corresponden a aireación baja y alta

respectivamente no se obtuvo producción de enzima FPasa.

En cuando a la actividad CMCasa y xilanasa, se puede observar que existen diferencias

significativas entre los dos tratamientos (p=0,000). La máxima actividad CMCasa y

xilanasa se obtiene con el tratamiento T1 (aireación baja) obteniendo 1,611 ± 0,04 U/gss y

840,79 ± 20,26 U/gss de actividad CMCasa y xilanasa, respectivamente. Estas actividades

representan un 382,3% y 373,6% más de actividad en comparación con el tratamiento T2

(CMCasa: 0,334 ± 0,03 U/gss y xilanasa: 177,53 ± 4,36 U/gss).

El control del calor metabólico en los procesos de FES es muy importante ya que afecta el

crecimiento del microorganismo, la formación de esporas y la germinación, así como

T1 T2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Unid

ades d

e a

ctivid

ad F

Pasa y

CM

Casa (

U/g

ss)

Tratamiento

FPasa

CMCasa

Xilanasa

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Unid

ades d

e a

ctivid

ad x

ilanasa U

/gss

Figura 25. Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas FPasa, CMCasa y xilanasa al día 5 de fermentación.


Th003

también la formación de los productos de interés (Krishna, 2005). Su eliminación es

probablemente el factor crucial en los procesos de FES, por tal motivo se utilizan sistemas

de aireación y/o agitación para mantener las condiciones de temperatura controladas (Lee,

Darah, & Ibrahim, 2017). Sin embargo, la aireación tiene efectos adversos, ya que con

flujos muy altos puede haber pérdidas de humedad, impidiendo el buen desarrollo del

microorganismo dentro del fermentador y por consiguiente baja producción de enzimas.

En la Tabla 23, se puede observar que hubo una disminución de la actividad enzimática

cuando se utiliza el sistema de fermentación con aireación (T1 y T2), esto posiblemente

debido al alto flujo de aire inyectado que disminuyó la humedad del sustrato durante el

proceso.

Se puede apreciar que los tratamientos T1 y T2, presentaron menor humedad durante el

proceso (70,23% ± 0,68 y 61,49% ± 1,78 respectivamente) y por consiguiente menores

actividades enzimáticas en comparación con las fermentaciones realizadas en bandejas,

las cuales mantuvieron su humedad por encima del 80% (82,96% ± 0,74). De acuerdo con

estos resultados, se puede señalar que las condiciones de flujo evaluadas en este estudio

no son las adecuadas para la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas, pues

se observa una disminución considerable en la actividad enzimática de T. koningiopsis

Th003.

La mayoría de las células viables se caracterizan por un contenido de humedad entre 70-

80%, sin embargo, para la producción de xilanasas se tiene estimado que una humedad

óptima puede estar entre el 70-85% (Lee et al., 2017). Pérez-Rodríguez et al., evaluaron

Tabla 23. Porcentaje de humedad del sustrato al final del proceso de FES.

Tratamiento Humedad FPasa CMCasa Xilanasa

(%) U/gss

T1 70,23 ± 0,68 - 1,619 ± 0,04 840,79 ± 20,26

T2 61,49 ± 1,78 - 0,334 ± 0,03 177,53 ± 4,36

Bioreactor

en bandejas 82,96 ± 0,74 0,275 ± 0,03 1,83 ± 0,21 1261,05 ± 32,9

Capítulo 4 89

la producción enzimática de Aspergillus niger en un biorreactor de tubo horizontal utilizando

como sustrato mazorcas de maíz a un flujo de 0,2 L/min, en donde obtuvieron una actividad

xilanasa y FPasa de 2926 U/gss y 1,116 U/gss respectivamente (Pérez-Rodríguez et al.,

2014), por tal motivo, es necesario encontrar una tasa de flujo de aireación óptima para

evitar la pérdida de humedad que afecta los procesos metabólicos del hongo.

Para el caso de Trichoderma sp, Rocky-Salimi & Hamidi-Esfahani, evidenciaron que la

aireación aumentó el crecimiento de T. reesei y la producción de enzimas celulasas. Sin

embargo, determinaron que a un flujo de aireación mayor a 0,526 L/min se produce un

secado del sustrato lo que conduce a una disminución en la producción (Rocky-Salimi &

Hamidi-Esfahani, 2010) .

4.3.4 Actividad enzimática antes y después de la optimización

La Tabla 24 resume la evolución observada de las enzimas FPasa, CMCasa y xilanasa

durante toda la investigación. A pesar de que las optimizaciones se realizaron a partir de

la actividad xilanasa, las actividades FPasa y CMCasa tuvieron cambios en las diferentes

condiciones analizadas. En cualquier caso, las actividades de estas dos enzimas fueron

“residuales” en comparación con la actividad xilanasa ya que está reportado que hongos

del género Trichoderma tienen una alta actividad FPasa y CMCasa, por ejemplo, de

acuerdo con Pachauri et al., T. koningii es capaz de producir 120,15 U/gss de FPasa y

253,67 U/gss de CMCasa utilizando como sustrato bagazo de caña suplementado con

sulfato de amonio (Pachauri et al., 2017). Marques et al., reportan que T. viridae produce

0,26 U/gss y 64,54 U/gss de FPasa y CMCasa respectivamente, a partir de bagazo de

caña y salvado de trigo como sustratos de fermentación (Marques et al., 2018) y Astolfi et

al., obtuvieron una actividad de 6,71 U/gss de FPasa y 20,7 U/gss de CMCasa utilizando

como sustrato cáscara de fríjol para una cepa de T. reesei. Por lo anterior los extractos

obtenidos después de la fermentación de T. koningiopsis Th003 pueden considerarse

como extractos de xilanasa mayoritariamente.

No solo se muestra un aumento en la actividad xilanasa a medida que se variaron las

condiciones de fermentación, sino también un incremento en términos de productividad,

como se puede observar en los resultados de la Tabla 25. La productividad aumentó desde

69,69 U/gss/día hasta 252,21 U/gss/día, (261,9%) con respecto a las condiciones iniciales

de fermentación.


Th003

Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización.

FPasa CMCasa Xilanasa

U/gss

Sin pretratamiento 0,846 ± 0,03 2,09 ± 0,04 348,46 ± 1,91

Pretratamiento con NaOH 5% 0,95 ± 0,06 2,18 ± 0,21 579,94 ± 5,39

Selección fuente de nitrógeno

(Ext levadura) 1,095 ± 0,06 3,309 ± 0,49 889,12 ± 2,05

Optimización parámetros

nutricionales 0,704 ± 0,18 1,74 ± 0,35 1130,41 ± 20,4


fisicoquímicos 0,503 ± 0,03 2,65 ± 0,17 1291,29 ± 70,5

Parámetros nutricionales y

fisicoquímicos óptimos 0,275 ± 0,03 1,834 ± 0,21 1261,05 ± 32,9

4.4 Conclusiones parciales

En los diseños experimentales se encontró que el término cuadrático de la relación

bagazo/salvado, el término cuadrático del extracto de levadura, y todos los términos

Tabla 25. Productividad y porcentaje de aumento de la actividad enzimática con la optimización

Xilanasa

U/gss

Productividad

(U/gss/día)

Aumento

(%)

Sin pretratamiento 348,46 ± 1,91 69,69 -

Pretratamiento con NaOH 5% 579,94 ± 5,39 115,98 66,4

Selección fuente de nitrógeno (Ext

levadura) 889,12 ± 2,05 177,8 155,12


nutricionales 1130,41 ± 20,4 226,08 224,4


fisicoquímicos 1291,29 ± 70,5 258,25 270,56

Parámetros nutricionales y

fisicoquímicos óptimos 1261,05 ± 32,9 252,21 261,9

Capítulo 4 91

fisicoquímicos evaluados, con excepción de la interacción pH* altura, tuvieron un efecto

significativo.

La relación bagazo/salvado 1:0,8 con 3,2 g/L de extracto de levadura, (los niveles mas

bajos estudiados), maximizan la producción de xilanasas.

Un pH inicial de sustrato de 5, una altura de lecho de 0,5 cm y un tamaño de partícula de

5 cm maximizan la producción de xilanasas.

Bajo los flujos de aire evaluados en este estudio, no fue posible el aumento de la

producción enzimática, muy probablemente por la disminución de la humedad causada por

el flujo de aire.

5. Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones

El bagazo de caña pretratado con NaOH mejoró en un 261,9% la producción de enzimas

xilanasas con respecto a la biomasa lignocelulósica sin pretratar. Esta mejora puede

atribuirse a la modificación de la estructura lignocelulósica, donde este pretratamiento se

enfoca principalmente en la precipitación de la lignina para dejar expuesta la hemicelulosa

y la celulosa.

El uso de una fuente de nitrógeno tuvo un efecto positivo para la producción de FPasa,

CMCasa y especialmente para la producción de xilanasas. El extracto de levadura permitió

aumentar la actividad xilanasa en un 155,12% en comparación con las fermentaciones

realizadas sin adición de fuente de nitrógeno, adicionalmente, se logró disminuir de 7 días

a 5 días de fermentación.

El sustrato de fermentación que contiene una mezcla de bagazo/salvado (1:0,8); extracto

de levadura 3,2 g/L; pH 5,0; tamaño de partícula 5 cm y altura de lecho de 0,5 cm durante

5 días da como resultado una producción máxima de xilanasas de 1261,05 ± 32,9 U/gss

la cual corresponde a un 261,9% mas de actividad al sustrato inicial. Esta configuración

fue validada experimentalmente mostrando una correlación con los valores pronosticados.

Los resultados obtenidos de la evaluación del efecto de la aireación indicaron que, bajo los

flujos evaluados en este estudio, no fue posible aumentar la producción enzimática debido

probablemente a la disminución de la humedad durante el proceso de fermentación. Hubo

una disminución de la actividad enzimática con los flujos de aire probados.

94 Título de la tesis o trabajo de investigación

Recomendaciones

Hacer reúso del bagazo pretratado, teniendo en cuenta que al final de la fermentación

queda un porcentaje considerable de hemicelulosa y celulosa para disminuir el uso del

NaOH que genera residuos químicos

Para disminuir costos de producción y llegar a un único punto óptimo, evaluar relaciones

de bagazo/salvado y concentraciones de extracto de levadura menores a los estudiados

en esta investigación.

Se deben evaluar menores flujos de aireación para optimizar el proceso de fermentación

con aireación, también se deben considerar factores como transferencia de calor y el

contenido de humedad, dada la estrecha relación entre ellos.

Realizar la caracterización del extracto enzimático y pruebas de estabilidad (Temperatura

y tiempo de incubación óptima, intervalos de pH)

A. Anexo: Curva de calibración de glucosa para la cuantificación de enzimas FPasa y CMCasa en espectrofotómetro

Cálculo de la actividad FPasa y CMCasa

- Se realizó la curva de calibración utilizando diferentes concentraciones de glucosa

como patrón (0,2 -3,0 g/L). Se determinó la ecuación de la recta y el R2

y = 0,5453x - 0,0222R² = 0,9974

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ab

s 5

40

nm

Concentración glucosa g/L


- La absorbancia obtenida de cada actividad enzimática se sustituyó por Y en la

ecuación y se despejó X. X corresponde a los mg de azúcares reductores/mL de

solución.

𝑿 (𝒈

𝑳) =

𝒂𝒃𝒔 𝟓𝟒𝟎𝒏𝒎 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟏𝟖

𝟎, 𝟑𝟒𝟓𝟒

- Para hallar las unidades de actividad enzimática/mL entonces:

𝑼

𝑳=

(𝒈/𝑳)𝒙(𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒏𝒔𝒂𝒚𝒐)

(𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏) ∗ (𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂) ∗ (𝒈/𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂)

FPasa

CMCasa

Volumen ensayo: 1,5mL Tiempo de reacción: 30min Volumen de la enzima: 0,5mL Glucosa (g/mmol): 0,18016

Volumen ensayo: 0,5mL Tiempo de reacción: 30min Volumen de la enzima: 0,25mL Peso glucosa (g/mmol): 0,18016

- Para halla las unidades de actividad enzimática/gramo de sustrato seco entonces:

𝑼

𝒈𝒔𝒔= (

𝑼

𝑳) /𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒔𝒆𝒄𝒐

El factor seco se determinó por la humedad del sustrato. La humedad se determinó usando

una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto se tomó un g de sustrato de las

bandejas correspondientes a los días de fermentación y se secó hasta peso constante.

Con el dato de humedad se determinaron los gramos de sustrato seco (gss) usando la

ecuación que se describe a continuación:

Ecuación 1.


100

B. Anexo: Curva de calibración de xilosa para la cuantificación de enzima xilanasa en espectrofotómetro

Cálculo de la actividad xilanasa

- Se realizó la curva de calibración utilizando diferentes concentraciones de xilosa

como patrón (0,2 -3,0 g/L). Se determinó la ecuación de la recta y el R2

y = 0,5433x - 0,0304R² = 0,9982

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

AB

S 5

40

nm

Concentración xilosa (g/L)


- La absorbancia obtenida de cada actividad enzimática se sustituyó por Y en la

ecuación y se despejó X. X corresponde a los g de azúcares reductores/mL de

solución.

𝑿 (𝒈

𝑳) =

𝒂𝒃𝒔 𝟓𝟒𝟎𝒏𝒎 + 𝟎, 𝟎𝟐𝟔𝟏

𝟎, 𝟑𝟒𝟑𝟕

- Para hallar las unidades de actividad enzimática/mL entonces:

𝑼

𝑳=

(𝒈/𝑳)𝒙(𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒏𝒔𝒂𝒚𝒐)

(𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏) ∗ (𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂) ∗ (𝒈/𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒅𝒆 𝒙𝒊𝒍𝒐𝒔𝒂)

Xilanasa

Volumen ensayo: 0,5mL Tiempo de reacción: 60min Volumen de la enzima: 0,250mL Peso xilosa (g/mmol): 0,15013

- Para halla las unidades de actividad enzimática/gramo de sustrato seco entonces:

𝑼

𝒈𝒔𝒔= (

𝑼

𝑳) /𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒔𝒆𝒄𝒐

El factor seco se determinó por la humedad del sustrato. La humedad se determinó usando

una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto se tomó un g de sustrato de las

bandejas correspondientes a los días de fermentación y se secó hasta peso constante.

Con el dato de humedad se determinaron los gramos de sustrato seco (gss) usando la

ecuación que se describe a continuación:

Ecuación 1.


100

C. Anexo: Curva de calibración de xilosa para la cuantificación de enzima Fpasa, CMCasa y xilanasa en microplaca

y = 0,3454x - 0,0318R² = 0,9994

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Ab

sorb

anci

a 5

40

nm

Concentración Glucosa g/L

Series1 Series2 Series3 Lineal (Series3)


y = 0,3437x - 0,0261R² = 0,9992

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Ab

sorb

anci

a 5

40

nm

Concentración xilosa (g/L)

D. Prueba de normalidad diseño factorial Ext Levadura


E. Prueba de Bartlett Levene diseño factorial Ext Levadura

T5

T4

T3

T2

T1

Control

25002000150010005000

Valor p 0,000

Prueba de Bartlett

Tra

tam

ien

to

Intervalos de confianza de Bonferroni de 93% para Desv.Est.

Prueba de igualdad de varianzas: Xylanasa vs. Tratamiento

Bibliografía 103

F. Prueba de normalidad diseño central compuesto


G. Prueba de Bartlett Levene diseño central compuesto

T9

T8

T7

T6

T5

T4

T3

T2

T1

5004003002001000

Valor p 0,000

Prueba de Bartlett

Tra

tam

ien

to


Prueba de igualdad de varianzas: Xilanasa vs. Tratamiento

Bibliografía 105

H. Prueba de normalidad box behnken


I. Prueba de Bartlett Levene box Behnken

T9

T8

T7

T6

T5

T4

T3

T2

T13

T12

T11

T10

T1

5004003002001000

Valor p 0,659

Prueba de Bartlett

Tra

tam

ien

to


Prueba de igualdad de varianzas: Xilanasa vs. Tratamiento

Bibliografía 107

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María Alejandra Jaramillo Rodríguez