Marcao por citometria de fluxo Solues: Soluo de marcao e Lavagem: soluo de PBS/Soro fetal bovino a 5% Soluo de fixao: PBS/ Paraformaldedo 1% Diluir os anticorpos em PBS Concentrao dos anticorpos: CD4 Fitc ( 1:50 ) (kit) CD25 APC (1:10) (LPT)

Procedimento da marcao: 1 1 Ajustar na concentrao de 2,5 x 106 clulas/poo em soluo PBS/Soro

fetal bovino a 5%. Distribuir as clulas em placas de fundo "V" de 96 poos. 1 1 Caso o volume da suspenso seja maior que 20 l centrifugar a 1500rpm

4oC por 5 minutos. 1 1 Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 l de soro normal

de camundongo e deixar incubando por 15 minutos. 1 1 Incubar com anticorpo anti-CD4, anti-CD25 e suas respectivas IGs, por

30 minutos a 40 C no escuro (Colocar 10 l por poo). 1 1 Lavar os poos que no sero marcados com Foxp3 uma vez com 100 l

da soluo de PBS/Soro fetal bovino a 5% em cada poo, homogeneizar com cuidado, e logo depois centrifugar a 1500rpm 4oC por 5 minutos. 1 1 Ressuspender os poos que no sero marcados com Foxp3 em 200 l

em soluo PBS / 1% paraformaldedo e transferir para os tubos de FACS, previamente adicionados de 200 l da soluo PBS /1% paraformaldedo 1 1 Estocar a 4o C protegido da luz at a aquisio no citmetro de fluxo

(preferencialmente at no mximo 1 semana depois do material ter sido preparado).

Marcao do Foxp3 Solues: Soluo fixao/permeabilizao de uso: Diluir o concentrado de

fixao/permeabilizao (1 parte) no diluente (3 partes) 1:4 Tampo de permeabilizao: diluir 10x o concentrado em gua Milli-Q

1. Aps a marcao de CD4, CD25, IGs e setagem 2. Lavar as clulas com 100 l /p de Flow Cytometry Staining Buffer 1,3ml 3. Centrifugar a 1500rpm/5min/4c 4. Resuspenda o pellet com 200 l/p de soluo fixao/permeabilizao. Homogenize vagarosamente. 5. Incubar por 1 hora (entre 30min e 18horas) no escuro a 4c 6. Lavar 2 vezes as clulas com 200 l Tampo de permeabilizao a 1500 rpm por 10min a 4c. 7. Bloquear com Fc block (anti cd16/32) 3 l /p / 20min / 4c 40ul 8. Incubar com 2,5 l de anti- FoxP3 e Igs por 30 min a 4c 9. Lavar 2x as clulas com 200 l Tampo de permeabilizao a 1500 rpm por 10min a 4c. 10. Coletar as clulas em 150 l Flow Cytometry Staining Buffer e transferir para os tubos de FACS, previamente adicionados de 150 l Cytometry Staining Buffer Flow