Marcatori Molecolari

Introduzione Marcatori proteici DNA Marcatori RFLP PCR

Marcatori RAPD Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi Considerazioni

Applicazioni

Che cosa sono i Marcatori Molecolari ??

Introduzione I fattori ambientali possono influenzare i caratteri morfologici I marcatori molecolari (MM) focalizzano la diversità del materiale genetico e misurano le variazioni controllate da geniI MM possono essere usati per :

misurare diversità genetica costituire mappe genetiche selezione assistita (MAS) supporto all’isolamento genico (PC)

Marcatori Molecolarisequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e la cui eredità può essere controllata

Polimorfismo in proteineproteine del semeisoenzimi ed alloenzimi

Polimorfismi di DNAnuclearecitoplasmatico

Proprietà desiderabili Polimorfico Eredità codominante Distribuito in tutto il genoma Facile e veloce da individuare Poco costoso Riproducibile / Trasferibile

Nessun marcatore le possiede tutte

Marcatori proteici

Breve introduzione alle proteine

Proteine di conservazione del seme

Isoenzimi

Alloenzimi

Struttura delle proteine

Struttura delle proteine

Struttura primaria – backbone del polipeptide

Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali

Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R

Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi

Proteine ed ambiente

La struttura tridimensionale delle proteine è il risultato dell’interazione con l’ambiente.

Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle proteine ….

…. e della diversità della loro funzione ……facilitata dalla complessità di struttura

Proteine seed storage

Perché usiamo le proteine del seme ??

• i semi sono ricchi di proteine

• le proteine sono disponibili in sufficiente quantità

• i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito

La metodologia

• si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi

• si visualizzano sul gel con la colorazione (staining)

• si analizza il pattern delle bande

Considerazioni ed Applicazioni

Considerazioni

• co-migrazione

• pattern delle bande complesso

• variazione intraspecifica

Applicazione della tecnica

• es. frumento, orzo

• recentemente anche melanzana

Isoenzimi ed Alloenzimi

Forme multiple dello stesso enzima

• isoenzima : un enzima, più di un locus genico

• alloenzima : un enzima, un locus genico Metodologie

• tessuti macerati

• enzimi separati per elettroforesi

• visualizzazione per colorazione istochimica

• analisi del pattern

Interpretazione del pattern

Formazioni di eteromeri

Omozigote o eterozigote ??

Struttura quaternaria dell’enzima

Numero di loci

Numero di alleli

Analisi genetiche spesso necessarie

Applicazioni

Marcatori su DNA

Metodo potente e riproducibile per :

• caratterizzare/identificare genotipi

• studi di genetica di popolazione

• esaminare patterns di variazione geografica

Limitato numero di enzimi disponibili

Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi

Le basi del DNA

La sintesi del DNA

Marcatori RFLPRestriction Fragment Length

Polymorphism

Gli RFLP esaminano differenze in peso mole-colare di specifici frammenti di DNA ristretti

Usualmente si utilizza il DNA totale

Richiedono DNA puro e di alto peso molecolare

Metodologia RFLP

Tagliare il DNA in piccoli frammenti

Separare i frammenti in gel eletttroforesi

Trasferire i frammenti di DNA su filtro

Metodologia RFLP Visualizzazione dei frammenti di DNA

• sonde radioattive

• sonde non-radioattive

Analisi dei risultati

• bande selezionate per presenza/assenza

• differenze nel pattern riflettono differenze genetiche

Interpretazione dei Risultati

La scelta di sonda ed enzima di restrizione è cruciale

Esempio di Analisi RFLP su fragola

RFLP : vantaggi e svantaggi

Riproducibili Marcatori codominanti Tecnica semplice

Tecnica lunga e costosa Utilizzo di sonde radioattive

Marcatori su DNA

Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla Metodi basati sulla PCRPCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi

PCR Polymerase Chain Reaction

Potente tecnica per amplificare il DNA

Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature

• step di denaturazione

• step di annealing

• step di elongazione

Il DNA amplificato viene separato su gel elettroforesi

I tre passaggi della PCR

PCR : componenti reazione

Utilizzo della Taq polimerasi Condizioni di reazione Importanza della standardizzazione Una reazione contiene :

• target DNA

• Taq polimerasi

• uno o più starter o primer

• 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP

• buffer di reazione con il cofattore MgCl2

PCR : riassunto

DNA polimerasi Apparecchio Thermal Cycler Profilo delle temperatura (programma) Concentrazione del DNA target Concentrazione dello ione Mg

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando primer arbitrari

Metodo veloce per individuare polimorfismi

Marcatori dominanti

Problemi di riproducibilità

Interpretazione dei RAPDs

I marcatori RAPDs sono anonimi I marcatori RAPDs sono dominanti Problemi di co-migrazione

una banda, un frammento ? stessa banda, stesso frammento ?

RFLP : vantaggi e svantaggi

Semplici e veloci Poco costosi Non utilizza radioattivo

Marcatori dominanti Problemi di riproducibilità Problemi di interpretazione

Marcatori su DNA

Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STSMarcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi

STS Sequence-Tagged Sites

Utilizzano la PCR a partire da : Sequence-Tagged Microsatellites (STMS)

Oligonucleotidi ancorati a MS inter-simple sequence repeat (ISSR)

Sequence-characterized amplified regions (SCARs)

Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)

Marcatori Microsatelliti

SCARs and CAPS

SCARs – sequence characterized amplified regions

marcatore single locus derivante da frammento RAPD

CAPS – cleaved amplified polymorphic sequence

Marcatore locus specificoProdotto di amplificazione RAPD utilizzato come sonda RFLP

Sequence-Tagged MS In genere single locus multiallelico Codominante

Inter-simple sequence repeats Amplificano segmenti adiacenti sequenze ripetute (repeats)

Marcatori dominanti

Marcatori su DNA

Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLPMarcatori AFLP Tecniche elettroforesi

AFLPAmplified Fragment Length Polymorphism

Tecnicamente sfruttano la combinazione tra RFLP e PCR Il risultato è un fingerprint altamente informativo Il metodo diviene sempre più popolare

AFLPLa Tecnica

AFLP : vantaggi e svantaggi

Altamente sensibili Altamente riproducibili Largamente applicabili

Costosi Tecnicamente difficili Necessari radioisotopi Problemi di interpretazione

Analisi RAPD su melanzana

Esempio di Analisi AFLP su vite