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Marcatori Molecolari
Introduzione Marcatori proteici DNA Marcatori RFLP PCR
Marcatori RAPD Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi Considerazioni
Applicazioni
Che cosa sono i Marcatori Molecolari ??
Introduzione I fattori ambientali possono influenzare i caratteri morfologici I marcatori molecolari (MM) focalizzano la diversità del materiale genetico e misurano le variazioni controllate da geniI MM possono essere usati per :
misurare diversità genetica costituire mappe genetiche selezione assistita (MAS) supporto all’isolamento genico (PC)
Marcatori Molecolarisequenze proteiche e di DNA facilmente individuabili e la cui eredità può essere controllata
Polimorfismo in proteineproteine del semeisoenzimi ed alloenzimi
Polimorfismi di DNAnuclearecitoplasmatico
Proprietà desiderabili Polimorfico Eredità codominante Distribuito in tutto il genoma Facile e veloce da individuare Poco costoso Riproducibile / Trasferibile
Nessun marcatore le possiede tutte
Marcatori proteici
Breve introduzione alle proteine
Proteine di conservazione del seme
Isoenzimi
Alloenzimi
Struttura delle proteine
Struttura delle proteine
Struttura primaria – backbone del polipeptide
Struttura secondaria – legami ad idrogeno locali
Struttura terziaria – legami che coinvogono i gruppi R
Struttura quaternaria – interazione tra polipeptidi
Proteine ed ambiente
La struttura tridimensionale delle proteine è il risultato dell’interazione con l’ambiente.
Bisogna quindi tenere conto della denaturazione delle proteine ….
…. e della diversità della loro funzione ……facilitata dalla complessità di struttura
Proteine seed storage
Perché usiamo le proteine del seme ??
• i semi sono ricchi di proteine
• le proteine sono disponibili in sufficiente quantità
• i semi sono uno stadio dello sviluppo ben definito
La metodologia
• si estraggono le proteine e si separano in elettroforesi
• si visualizzano sul gel con la colorazione (staining)
• si analizza il pattern delle bande
Considerazioni ed Applicazioni
Considerazioni
• co-migrazione
• pattern delle bande complesso
• variazione intraspecifica
Applicazione della tecnica
• es. frumento, orzo
• recentemente anche melanzana
Isoenzimi ed Alloenzimi
Forme multiple dello stesso enzima
• isoenzima : un enzima, più di un locus genico
• alloenzima : un enzima, un locus genico Metodologie
• tessuti macerati
• enzimi separati per elettroforesi
• visualizzazione per colorazione istochimica
• analisi del pattern
Interpretazione del pattern
Formazioni di eteromeri
Omozigote o eterozigote ??
Struttura quaternaria dell’enzima
Numero di loci
Numero di alleli
Analisi genetiche spesso necessarie
Applicazioni
Marcatori su DNA
Metodo potente e riproducibile per :
• caratterizzare/identificare genotipi
• studi di genetica di popolazione
• esaminare patterns di variazione geografica
Limitato numero di enzimi disponibili
Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi
Le basi del DNA
La sintesi del DNA
Marcatori RFLPRestriction Fragment Length
Polymorphism
Gli RFLP esaminano differenze in peso mole-colare di specifici frammenti di DNA ristretti
Usualmente si utilizza il DNA totale
Richiedono DNA puro e di alto peso molecolare
Metodologia RFLP
Tagliare il DNA in piccoli frammenti
Separare i frammenti in gel eletttroforesi
Trasferire i frammenti di DNA su filtro
Metodologia RFLP Visualizzazione dei frammenti di DNA
• sonde radioattive
• sonde non-radioattive
Analisi dei risultati
• bande selezionate per presenza/assenza
• differenze nel pattern riflettono differenze genetiche
Interpretazione dei Risultati
La scelta di sonda ed enzima di restrizione è cruciale
Esempio di Analisi RFLP su fragola
RFLP : vantaggi e svantaggi
Riproducibili Marcatori codominanti Tecnica semplice
Tecnica lunga e costosa Utilizzo di sonde radioattive
Marcatori su DNA
Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla Metodi basati sulla PCRPCR Marcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi
PCR Polymerase Chain Reaction
Potente tecnica per amplificare il DNA
Prevede l’utilizzo di cicli di temeperature
• step di denaturazione
• step di annealing
• step di elongazione
Il DNA amplificato viene separato su gel elettroforesi
I tre passaggi della PCR
PCR : componenti reazione
Utilizzo della Taq polimerasi Condizioni di reazione Importanza della standardizzazione Una reazione contiene :
• target DNA
• Taq polimerasi
• uno o più starter o primer
• 4 deoxynucleotidi dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• buffer di reazione con il cofattore MgCl2
PCR : riassunto
DNA polimerasi Apparecchio Thermal Cycler Profilo delle temperatura (programma) Concentrazione del DNA target Concentrazione dello ione Mg
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
Tratti di DNA anonimi amplificati utilizzando primer arbitrari
Metodo veloce per individuare polimorfismi
Marcatori dominanti
Problemi di riproducibilità
Interpretazione dei RAPDs
I marcatori RAPDs sono anonimi I marcatori RAPDs sono dominanti Problemi di co-migrazione
una banda, un frammento ? stessa banda, stesso frammento ?
RFLP : vantaggi e svantaggi
Semplici e veloci Poco costosi Non utilizza radioattivo
Marcatori dominanti Problemi di riproducibilità Problemi di interpretazione
Marcatori su DNA
Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STSMarcatori STS Marcatori AFLP Tecniche elettroforesi
STS Sequence-Tagged Sites
Utilizzano la PCR a partire da : Sequence-Tagged Microsatellites (STMS)
Oligonucleotidi ancorati a MS inter-simple sequence repeat (ISSR)
Sequence-characterized amplified regions (SCARs)
Cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)
Marcatori Microsatelliti
SCARs and CAPS
SCARs – sequence characterized amplified regions
marcatore single locus derivante da frammento RAPD
CAPS – cleaved amplified polymorphic sequence
Marcatore locus specificoProdotto di amplificazione RAPD utilizzato come sonda RFLP
Sequence-Tagged MS In genere single locus multiallelico Codominante
Inter-simple sequence repeats Amplificano segmenti adiacenti sequenze ripetute (repeats)
Marcatori dominanti
Marcatori su DNA
Le basi del DNA Metodo RFLP Metodi basati sulla PCR Marcatori STS Marcatori AFLPMarcatori AFLP Tecniche elettroforesi
AFLPAmplified Fragment Length Polymorphism
Tecnicamente sfruttano la combinazione tra RFLP e PCR Il risultato è un fingerprint altamente informativo Il metodo diviene sempre più popolare
AFLPLa Tecnica
AFLP : vantaggi e svantaggi
Altamente sensibili Altamente riproducibili Largamente applicabili
Costosi Tecnicamente difficili Necessari radioisotopi Problemi di interpretazione
Analisi RAPD su melanzana
Esempio di Analisi AFLP su vite