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i
UFAL
Universidade Federal de Alagoas
Instituto de Química e Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Química e
Biotecnologia
IQB
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES MOLUSCICIDA E LARVICIDA DE Tocoyena selloana K. Schum.
(RUBIACEAE)
Marcos Oliveira Rocha
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Química.
Orientadora: Profa. Dra. Margarida Maria dos Santos Humberto
Maceió - Alagoas Dezembro de 2009
Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecária Responsável: Helena Cristina Pimentel do Vale R672e Rocha, Marcos Oliveira. Estudo fitoquímico e avaliação das atividades moluscicida e larvicida de Tocoyena selloana K. Schum. (Rubiaceae) / Marcos Oliveira Rocha, 2009. xii, 82 f. : il. grafs. e tabs. Orientador: Geraldo Majela Gaudêncio Faria. Dissertação (mestrado em Química e Biotecnologia) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de Química e Biotecnologia, 2009. Bibliografia: f. 77-82.
1. Fitoquímica. 2. Tocoyena selloana. 3. Rubiaceae. 4. D-Mantol. I. Título. CDU: 547.9
iii
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Margarida Maria dos Santos Humberto, pelos ensinamentos, paciência,
estímulo e orientação;
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, em
especial: Lúcia Maria Conserva, Marília Oliveira Fonseca Goulart, Antônio Euzébio
Goulart Sant’Ana, Margarida Maria dos Santos Humberto e Marcia Pletsch, pelos
ensinamentos a mim repassados;
Ao Prof. Dr. Edson de Souza Bento pela obtenção dos espectros de Ressonância
Magnética Nuclear;
À botânica Rosário de Fátima de Almeida Rocha pela identificação do material vegetal;
Aos técnicos Aldy dos Santos e D. Margarida Tenório pelo apoio e por tantas ajudas;
Ao Prof. Dr. Dennis de Oliveira Imbroisi, por ter cedido o aparelho para determinação
de ponto de fusão e a balança analítica;
À Profa. Dra. Simone Margaretti Plentz Meneguetti pela obtenção dos espectros no
Infravermelho;
Ao Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Sant’Ana, pelo fornecimento dos solventes
deuterados para a obtenção dos espectros de RMN;
Ao Prof. Dr. João Xavier de Araújo Júnior e a Profa. Dra. Lucia Maria Conserva, pela
colaboração no Exame de Qualificação;
Aos doutorandos Cenira Monteiro e Karlos Lisboa pela realização dos testes biológicos;
Aos funcionários do Instituto de Química e Biotecnologia, em especial Rejane
Montenegro por tantas ajudas;
À Danielle de Lima do Laboratório de Pesquisa em Química dos Produtos Naturais
pela amizade e inúmeros favores;
Aos colegas e amigos do Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, em
especial ao Jataí Sobreira e ao Sivaldo Paulino pelo apoio e amizade;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) pelo apoio
financeiro concedido através de bolsa de mestrado;
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
iv
Dedico este trabalho a Deus que está comigo em
todos os momentos.
Aos meus pais Claudio e Mônica pelo apoio
incondicional em todos os momentos da minha vida, pela
educação e bom exemplo que sempre me deram.
À minha amada esposa Magna pelo carinho,
companheirismo e paciência.
vi
SUMÁRIO
Lista de Figuras viii
Lista de Tabelas viii
Lista de Esquemas ix
Lista de Quadros ix
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos x
Resumo xi
Abstract xii
1. Introdução 1
1.1 Aspectos gerais dos produtos naturais 2
1.2 Considerações sobre a Família Rubiaceae 3
1.2.2 Estudos químicos sobre a família Rubiaceae 6
1.3 Considerações sobre o Gênero Tocoyena 11
1.4 Considerações sobre a Esquistossomose 14
1.5 Considerações sobre a Dengue 17
1.6 Caracterização do espécime 19
2. Objetivos 20
2.1. Objetivo Geral 21
2.2. Objetivos Específicos 21
3. Parte Experimental 23
3.1. Solventes, Reagentes e Equipamentos 23
3.2. Coleta e Identificação do Material Vegetal 24
3.3. Preparação dos Extratos das Folhas e do Caule 24
3.3.1. Preparação dos Extratos e Frações das Folhas 24
3.3.2. Preparação dos Extratos e Frações do Caule 25
3.4. Isolamento e Purificação das Substâncias 25
3.4.1. Fração em Hexano das Folhas de Tocoyena selloana 25
3.4.2. Fração em Clorofórmio das Folhas de Tocoyena selloana 27
3.4.3. Fração em Acetato de Etila das Folhas de Tocoyena selloana 29
3.4.4. Fração Aquosa Proveniente das Folhas de Tocoyena selloana 29
3.4.5. Fração em Acetato de Etila do Caule de Tocoyena selloana 29
3.4.6. Fração Aquosa do Caule de Tocoyena selloana 30
3.5. Ensaios Biológicos 33
3.5.1. Atividade Larvicida Frente às Larvas do Mosquito Aedes Aegypti 33
3.5.2. Atividade Moluscicida 34
3.6 Dados físicos e espectroscópicos das substâncias isoladas 35
3.6.1 Substância TsFA-1 35
3.6.2 Substância TsFH-1 35
3.6.3 Substância TsFC-2 35
3.6.4 Substância TsFC-1 36
4. Resultados e Discussões 37
4.1. Identificação Estrutural das Substâncias Isoladas 38
4.1.1 Identificação Estrutural da Substância TsFA-1 38
4.1.2 Identificação Estrutural da Substância TsFH-1 40
4.1.3 Identificação Estrutural da Substância TsFC-2 43
4.1.4 Identificação Estrutural da Substância TsFC-1 46
4.2. Resultados dos Testes de Atividade Biológica 49
vii
4.2.1. Atividade Larvicida 49
4.2.2. Atividade Moluscicida 50
5. Considerações Finais 51
6. Espectros das Substâncias Isoladas 53
7. Referências Bibliográficas 77
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Plantas ornamentais da família Rubiaceae 5
Figura 2. Ciclo de vida do schistosoma 16
Figura 3. Mosquito Aedes aegypti 18
Figura 4. Fotos de Tocoyena selloana K. Schum. 19
Figura 5. Espectro de IV da substância codificada de TsFA-1 54
Figura 6. Espectro de RMN 1
H da substância codificada de TsFA-1 55
Figura 7. Espectro de RMN 13
C da substância codificada de TsFA-1 56
Figura 8. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFA-1 56
Figura 9. Espectro de RMN 1
H da substância codificada de TsFH-1 57
Figura 10. Espectro de RMN 1
H de TsFH-1 (Ampliado) 58
Figura 11. Espectro de RMN 13
C da substância codificada de TsFH-1 59
Figura 12. Espectro de RMN 13
C de TsFH-1 (Ampliado) 60
Figura 13. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFH-1 61
Figura 14. Espectro de RMN DEPT de TsFH-1 (Ampliado) 62
Figura 15. Espectro de IV da substância codificada de TsFC-2 63
Figura 16. Espectro de RMN 1
H da substância codificada de TsFC-2 64
Figura 17. Espectro de RMN 1
H de TsFC-2 (Ampliado) 65
Figura 18. Espectro de RMN 1
H de TsFC-2 (Ampliado) 66
Figura 19. Espectro de RMN 13
C da substância codificada de TsFC-2 67
Figura 20. Espectro de RMN 13
C de TsFC-2 (Ampliado) 68
Figura 21. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFC-2 69
Figura 22. Espectro de RMN DEPT de TsFC-2 (Ampliado) 70
Figura 23. Espectro de IV da substância codificada de TsFC-1 71
Figura 24. Espectro de RMN 1
H da substância codificada de TsFC-1 72
Figura 25. Espectro de RMN 13
C da substância codificada de TsFC-1 73
Figura 26. Espectro de RMN 13
C de TsFC-1 (Ampliado) 74
Figura 29. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFC-1 75
Figura 30. Espectro de RMN DEPT de TsFC-1 (Ampliado) 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados de RMN 1
H de TsFA-1 e do D-Manitol 39
Tabela 2. Dados de RMN 13
C de TsFA-1, do D-Manitol, do L-Initol e do D-
Sorbitol
40
Tabela 3. Dados de RMN 13
C de TsFH-1, dos ácidos ursólico e oleanólico 42
Tabela 4. Dados de RMN 13
C de TsFC-2, dos ácidos quinóvico, 3-O-β-D-
glicopiranosilquinóvico e 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico
45
Tabela 5. Dados de RMN 13
C de TsFC-1 47
Tabela 6. Dados de RMN 13
C de TsFC-1M e do ácido ursólico 48
Tabela 7. Resultado dos bioensaios preliminares de atividade larvicida 49
ix
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Procedimento Realizado com a Fração Clorofórmica das Folhas
de Tocoyena selloana K. Schum.
28
Esquema 2. Procedimento efetuado com as folhas da espécie de Tocoyena selloana K.Schum.
31
Esquema 3. Procedimento Realizado com o caule da espécie Tocoyena selloana K. Schum.
32
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Cromatografia da fração hexânica resultante do extrato etanólico
das folhas de Tocoyena selloana K.Schum.
26
Quadro 2. Fracionamento cromatográfico da subfração 17-27 do extrato
hexânico das folhas de Tocoyena selloana K.Schum
26
Quadro 3. Extratos e Frações Submetidas a Ensaios Larvicida 33
Quadro 4. Valores de Ponto de Fusão de TsFA-1, do D-Manitol, do L-
Iditol e do D-Sorbitol
40
x
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
AcOEt Acetato de Etila
ATR Attenuated total reflectance
BuOH Butanol
ºC Grau Ceusius
CHCl3 Clorofórmio
CDCl3 Clorofórmio deuterado
C5D5N Piridina deuterada
CL Concentração letal
cm Centímetro
d Dupleto
dd Duplo dupleto
ddd Duplo duplo dupleto
DEPT Distortioless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO-d6 Dimetil sulfóxido deuterado
EtOH Etanol
g Grama
Hz Hertz
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento em Hertz
MeOH Metanol
CD3OD Metanol deuterado
mg Miligrama
MHz Megahertz
mL Mililitros
OMS Organização mundial de Saúde
p. Página
p.f. Ponto de fusão
ppm Partes por milhão
RMN 1
H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN 13
C Ressonância magnética nuclear de carbono
xi
RESUMO
O presente trabalho descreve o isolamento de alguns constituintes químicos,
bem como a avaliação das atividades moluscicida e larvicida de extratos e frações
das folhas e do caule da espécie Tocoyena selloana K. Schum. (Rubiaceae),
conhecida como genipapo-bravo e coletada em Barra de São Miguel / Alagoas. O
estudo fitoquímico conduziu ao isolamento de dois triterpenóides, o ácido 3β-hidróxi-
urs-12-en-28-óico (ácido ursólico), o qual está sendo descrito pela primeira vez no
gênero Tocoyena e o ácido 3-O-β-D-glicopiranosílquinóvico; o carboidrato (2R, 3R,
4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-hexano (D-Manitol), também descrito pela primeira vez
no gênero e uma quarta substância, possivelmente um triterpeno que não teve ainda
sua estrutura caracterizada. Todas as substâncias isoladas tiveram suas estruturas
identificadas com base na análise dos dados espectrais (IV, RMN 1H, 13C e DEPT) e
comparação com dados descritos na literatura. Os extratos em etanol das folhas e
do caule, bem como as frações em hexano, clorofórmio, acetato de etila, butanol e
água foram considerados inativos frente ao caramujo Biomphalaria glabrata e às
larvas do mosquito Aedes aegypti na concentração de 500 ppm.
Palavras chave: Tocoyena selloana, Rubiaceae, D-manitol.
xii
ABSTRACT
This work describes the isolation and elucidation of some chemical
constituents, as well as evaluation of the molluscicidal and larvicidal activities of the
extracts and fractions from the leaves and stem of Tocoyena selloana K. Schum.
(Rubiaceae), known popularly as genipapo-bravo, colleted in Barra de São Miguel /
Alagoas. From the phytochemical investigation, were isolated of the two
triterpenoids, the 3-O-β-D-glucopiranosil quinovic acid and the ursolic acid, the last
one, is being described for the first time in the genus Tocoyena. The carbohydrate D-
Mannitol, was also isolated it is described for the first time in the genus too, a fourth
substance, possible triterpen, is not fully characterized yet. All isolated substances
were elucidated on the basis of their spectral data (IR, NMR 1H, 13C and DEPT) and
compared with data described in the literature. The ethanol extracts and fractions
from the leaves and stem of T. selloana did not show activity against the
Biomphalaria glabrata and Aedes aegypti in concentration of 500 ppm.
Key words: Tocoyena selloana, Rubiaceae, D-mannitol.
2
1.1. Aspectos Gerais dos Produtos Naturais
A utilização de plantas com fins medicinais, para tratamento, cura e
prevenção de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da
humanidade (Veiga Júnior et al, 2005). Na história do desenvolvimento das
civilizações Oriental e Ocidental encontram-se muitos exemplos da utilização de
recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa.
A medicina tradicional chinesa, por exemplo, desenvolveu-se com tal eficiência que
até hoje muitas espécies e preparados vegetais medicinais são estudados na busca
pelo entendimento de seu mecanismo de ação e o isolamento dos princípios ativos
(Viegas Júnior et al, 2006).
Acredita-se que cerca de 80% da população mundial usem as plantas como
primeiro recurso terapêutico (Silva & Filho, 2002) e a tendência desde a metade do
século XIX, tem sido a utilização de substâncias isoladas em substituição aos
extratos vegetais que apresentam alguma propriedade terapêutica comprovada e
tenham seus constituintes ativos identificados (Schenkel et al, 2007).
As plantas, além de seu uso na medicina popular, têm contribuído, ao longo
dos anos para a obtenção de vários fármacos, até hoje amplamente utilizados.
Como exemplo, podemos citar a colchicina (1), encontrada na espécie Colchicum
autumnale e utilizada como anti-inflamatório e a morfina (2), princípio ativo do ópio,
preparado de Papaver somniferum, que é conhecida desde a época dos Sumérios
(4000 a.C.) devido às suas propriedades soporíferas e analgésicas, havendo relatos
na mitologia grega atribuindo à papoula do ópio o simbolismo de Morfeu, o deus do
sono (Filho & Yunes, 1998; Viegas Júnior et al, 2006).
O
NH
H
H3CO
H3CO
OCH3
O
OCH3
NCH3
H
HO
O
HO
H
(1) Colchicina (2) Morfina
3
Von Martius, botânico alemão criador da obra Flora Brasiliensis, definiu o poder
das ervas brasileiras como: "As plantas medicinais brasileiras não apenas curam,
fazem milagres", de fato, das 200.000 espécies vegetais que possam existir no
Brasil, pelo menos a metade pode ter alguma propriedade terapêutica útil à
população, mas nem 1% dessas espécies foram cientificamente estudadas (Barraca,
1999; Chiquieri et al, 2004).
As plantas medicinais da flora nativa são consumidas com poucas ou nenhuma
comprovação de suas propriedades farmacológicas. Comparadas com a de
medicamentos usados nos tratamentos convencionais, a toxicidade de plantas
medicinais e fitoterápicos pode parecer trivial. Isto, entretanto, não é verdade. A
toxicidade de plantas é um problema sério de saúde pública. Os efeitos adversos
dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a ação sinérgica
ocorrem comumente (Veiga Júnior et al, 2005). Com isso, é fundamental a
realização de pesquisas para investigação dos constituintes químicos das plantas,
visando à possibilidade de aplicação no tratamento das mais diversas patologias.
Serão abordados alguns aspectos relacionados à família Rubiaceae e ao gênero
Tocoyena, assim como a esquistossomose e a dengue.
1.2 Considerações Sobre a Família Rubiaceae
A família Rubiaceae Juss., descrita pela primeira vez por Antoine Laurent de
Jussieu, em 1789, tem seu nome derivado do gênero Rubia L., do latim rubium,
relativo à tinta vermelha produzida pelas raízes de plantas deste gênero, utilizadas
para tingir tecidos (Pereira, 2007). Ela representa a quarta maior família do grupo
das Angiospermae, com cerca de 650 gêneros e mais de 13.000 espécies,
distribuídas principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo, com
poucos representantes nas áreas temperadas e frias. No Brasil, estão descritos
próximo de 130 gêneros e 1500 espécies (Hottz et al, 2007).
A maioria das espécies de Rubiaceae são árvores de pequeno porte ou
arbustos muito freqüentes em bosques e subosque. A família pode ser facilmente
reconhecida pelas folhas geralmente opostas e pela presença de estípulas
interpeciolares. A grande variação nas formas, tamanhos e cores das flores atrai um
grande número de polinizadores para a família. Os frutos carnosos também variam
4
nas cores e tamanhos, sendo dispersos por pássaros, morcegos ou ainda por
pequenos mamíferos (Taylor et al, 2007).
A família Rubiaceae tem sido dividida em quatro subfamílias: Ixoroideae,
Cinchonoideae, Antirheoideae e Rubioideae. A avaliação de dados químicos revela
que na subfamília Ixoroideae, os iridóides são considerados marcadores
quimiotaxonômicos exclusivos, enquanto em Cinchonoideae os alcalóides indólicos
predominam e, em Rubioideae, as antraquinonas estão presentes como a principal
classe de metabólitos secundários. Já na subfamília Antirheoideae não há
ocorrência de nenhum destes marcadores químicos (Gazda, 2004).
A família Rubiaceae possui espécies de grande importância econômica, que
são exploradas das seguintes formas:
Como alimentícias, tem-se como exemplo o café que é uma das bebidas mais
consumidas no mundo e provém de uma árvore do gênero Coffea que dentre as
várias espécies conhecidas se destaca a espécie Coffea arabica L. O componente
mais conhecido obtido do café é a cafeína (3), devido às suas propriedades
fisiológicas e farmacológicas. A cafeína é um alcalóide, pertencente ao grupo das
xantinas, é uma substância inodora e possui sabor amargo bastante característico
(Monteiro e Trugo, 2005).
N
NN
N
CH3
H3C
CH3O
O
(3) cafeína
Ornamentais, como a Ixora coccínea Linn., conhecida como Ixora (Figura 1)
(Dias-Arieira et al, 2007), e a Galianthe brasiliensis conhecida pelo nome de poaia-
do-campo (Figura 1), que é utilizada inclusive na medicina popular por suas
propriedades eméticas (Moura et al, 2006).
5
Ixora
http://www.florabeiradamata.com.br , acessado em agosto de 2009.
poaia-do-campo http://exactas-unam.dyndns.org, acessado em agosto de 2009.
Figura 1. Plantas ornamentais da família Rubiaceae.
Na indústria farmacêutica, a Cinchona pubescens Vahl, uma das espécies
produtoras da quinina (4), que é empregada no tratamento da malária (Coelho et al,
2006); a Cephaelis ipecacuanha (Brot.) A. Richard, planta que produz os alcalóides
isoquinolínicos emetina (5) e cefalina (6) que possuem propriedades amebicidas,
expectorantes, diaforéticas e eméticas. Além disso, várias espécies são referidas
popularmente como medicinais, dentre as quais destacam-se: Coutarea hexandra
(Jacq.) K. Schum., diversas espécies dos gêneros Borreria, Cinchona e Richardia
(Fabri, 2008; França, 2007) e plantas do gênero Diodia que são usadas como
agentes anti-reuméticos, antidiarréicos, laxativos, eméticos e no tratamento de
úlceras gástricas, urticárias e gastrites (Moura et al, 2006).
N
H3CO
HO
H
N
H
H
N
OCH3
OCH3
H
H
NH
H
H3CO
H3CO
H3C
(4) quinina
(5) emetina
6
N
OCH3
OCH3
H
H
NH
H
HO
H3CO
H3C
(6) cefalina
1.2.2 Estudos Químicos Sobre a Família Rubiaceae
Estudos químicos realizados com espécies da família Rubiaceae, indicam
uma grande diversidade de metabólitos secundários como iridóides, alcalóides
indólicos, antraquinonas, flavonóides e outros derivados fenólicos e terpenóides
(triterpenos, diterpenos). Destes, iridóides, antraquinonas e alcalóides indólicos são
considerados marcadores quimiotaxonômicos da família (Gazda, 2004). Dentre os
diversos relatos na literatura de metabólitos secundários isolados de Rubiáceas,
podemos mencionar:
Richardia grandiflora – Conhecida popularmente como ervanço, é utilizada
na medicina popular como vermífugo. Estudos fitoquímicos conduziram ao
isolamento de β-sitosterol (7), ácido salicílico (8), estigmasterol (9) e ácido-m-metoxi-
p-hidroxibenzóico (10) (Tomaz et al, 2008).
HO
H
H
COOH
OH
(7) β-sitosterol (8) ácido salicílico
7
HO
H
H
(9) estigmasterol
COOH
OH
OCH3
(10) ácido-m-metoxi-p-hidroxibenzóico
Galianthe brasiliensis - É uma planta ornamental usada como emético na
medicina popular. Desta planta foram isolados os iridóides glicosilados
asperulosídeo (11) e desacetilasperulosídeo (12) e o β-sitosterol (7) (Moura et al,
2006).
O
O
O
H
H
H3COC OO OH
OHHO
HO
O
O
O
H
H
HO OO OH
OHHO
HO
asperulosídeo (11)
desacetilasperulosídeo (12)
Guettarda pohliana – Conhecida popularmente como angélica-do-mato, é
utilizada no tratamento de ferimentos e inflamações. Estudo químico realizado com
esta espécie conduziu ao isolamento do ácido quinóvico (13), das saponinas
triterpênicas: os ácidos 28-O-β-glicopiranosilquinóvico (14), 3-O-β-D-glicopiranosil-
28-O-β-glicopiranosilquinóvico (15), 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-glicopiranosil-
quinóvico (16) e 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosilcinchólico (17) e ainda
o ácido 4,5-O-dicafeoilquínico (18) (Oliveira et al, 2008).
8
HO
COOH
COOHH
H
H
(13) ácido quinóvico
HO
COOH
COO O
HO
OHOH
HOH
H
H
(14) ácido 28-O-β-glicopiranosilquinóvico
COOH
COO O
HO
OHOH
HO
O
OH
HO
HOO
HO
H
H
H
(15) ácido 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-glicopiranosilquinóvico
9
COOH
COO O
HO
OHOH
HO
O
OH
HO
HOO
H
H
H
(16) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-glicopiranosilquinóvico
O
COOH
COO O
HO
OHOH
HOO
OH
HOHO
HO
H
H
H
(17) ácido 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosilcinchólico
COOHHO
O
OHO
O
HO
HOO
HO OH
(18) ácido 4,5-O-dicafeoilquínico
Chomelia obtusa – Esta espécie é um arbusto típico do Cerrado, conhecida
popularmente como viuvinha. Em análise fitoquímica realizada, foram isoladas as
10
substâncias: ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosil quinóvico (16)
ácido ursólico (19), ácido oleanólico (20), ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-
glicopiranosil cinchólico (21), e o flavonóide 3-O-β-D-glicopiranosil quercetina (22)
(Barros et al, 2008).
HO
COOHH
H
H
HO
COOH
H
H
H
(19) ácido ursólico (20) ácido oleanólico
O
C
O
OH
HO
HO
O
HO
OHOH
HOH
H
H
O
O
(21) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosil cinchólico
OHO
OH O
O
OH
OH
O
OHOH
HO
OH
(22) 3-O-β-D-glicopiranosil quercetina
11
1.3 Considerações Sobre o Gênero Tocoyena
O gênero Tocoyena, para o qual são descritas cerca de 30 espécies com
distribuição neotropical, ocorrendo na América Central e América do Sul, até o sul do
Brasil. São espécies típicas do Cerrado, sendo encontradas preferencialmente no
Cerrado stricto senso, mas também ocorrem em florestas com clima quente e úmido,
como a Floresta Amazônica. Todos os representantes do gênero são árvores de
pequeno porte ou arbustos (Coelho et al, 2006).
O gênero Tocoyena pertence à subfamília Ixoroideae, sendo os iridóides
considerados seus principais marcadores quimiotaxonômicos. Além de iridóides, a
subfamília é conhecida por metabolizar flavonóides, triterpenos, derivados fenólicos
e alcalóides do tipo emetínicos, quinolínicos e poliindolenínicos (Hamerski et al,
2005).
Foram encontrados na literatura apenas quatro relatos sobre avaliações
fitoquímicas de quatro espécies no gênero Tocoyena, mencionadas a seguir:
Tocoyena formosa K. Schum. é uma espécie lenhosa de porte arbustivo-
arbóreo, de ampla distribuição geográfica no bioma Cerrado e conhecida
popularmente como olho-de-boi (Carvalho et al, 2007). É uma espécie da América
do Sul, encontrada no Paraguai, Bolívia e Brasil (Coelho et al, 2006). Essa planta é
muito usada, pela população em geral, no tratamento de inflamações ósseas
e musculares, entorses e inchações, e também como calmante cardíaco. Da casca
do caule é preparado um cataplasma, que é aplicado diretamente sobre a área
lesionada, deixando o local enegrecido e acelerando o processo de reparo (Azevedo
et al, 2006).
Estudos fitoquímicos realizados com T. formosa revelaram a presença de
iridóides, entre eles o α-gardiol (23) e β-gardiol (24), os quais apresentaram
atividade antifúngica (Bolzani et al, 1997). Foram também isolados os iridóides
galiosídeo (25) e o apodantosídeo (26) (Bolzani et al, 1996) .
12
O
OH
HH3CO2C
H
O
HO
O
OH
CO2CH3H
H
OHO
(23) α-gardiol (24) β-gardiol
O
CO2CH3
H
OH
HO
H
HO
O
CO2CH3
H
O
H
HO2CO
OH
OH
HO
HO
(25) Galiosídeo (26) apodantosídeo
Tocoyena bullata Schum. é uma árvore pequena encontrada principalmente na
Zona Litorânea e na Restinga. É uma espécie atraente pela coloração de suas
folhas verde-brilhantes e pela disposição congesta das mesmas, associadas às
flores brancas, que a tornam possuidora de grande potencial ornamental. A
avaliação fitoquímica conduziu ao isolamento do iridóide gardenosídeo (27) (Poser,
1998).
O
OO
H3C
OH
H
H
OHO
O
H
OH
HO
HO
HO
(27) gardenosídeo
13
Tocoyena brasiliensis Mart., conhecida popularmente como genipapinho, é
facilmente encontrada no Brasil, exceto na região sul (Delprete, 2008). No trabalho
desenvolvido por Hamerski e colaboradores (2005), foram isolados um flavonóide
glicosilado, identificado como sendo o ramanzina-3-O-rutinosídeo (28) e duas
misturas binárias de saponinas triterpênicas, a primeira contendo o ácido 3-O-β-D-
quinovopiranosíl quinóvico (29) e o ácido 3-O-β-D-quinovopiranosíl cinchólico (30) e
a segunda, o ácido 3-O-β-D-glicopiranosíl quinóvico (31) e o ácido 28-O-β-D-
glicopiranosílquinóvico (14).
OHO
OH O
O
OH
OCH3
O
O
HOHO
OH O
OH
HO
OH
(28) ramanzina-3-O-rutinosídeo
O
COOH
COOH
O
OH
HO
HO
H
H
H
(29) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosíl quinóvico
O
COOH
COOH
O
OH
HO
HO
H
H
H
(30) ácido-3-O-β-D-quinovopiranosíl cinchólico
14
O
COOH
COOH
O
OH
HO
HO
HO
H
H
H
(31) ácido 3-O-β-D-glicopiranosíl quinóvico
Tocoyena selloana K. Schum., conhecida como genipapo bravo, é uma
árvore pequena. A casca do caule é utilizada na medicina popular como
antiinflamatório sob forma de compressas em áreas afetadas por contusões. De um
espécime desta planta, foram isolados uma cumarina, a escopoletina (32), e uma
saponina triterpênica, o ácido 3-β-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31), além de dois
iridóides, o β-gardiol (24) e seu epímero (33) (Jane et al, 1997).
O
MeO
HO O
O
OH
CO2MeH
H
OHO
(32) escopoletina (33) epímero do β-gardiol
1.4 Considerações Sobre a Esquistossomose
As esquistossomoses são doenças transmitidas por trematódeos do gênero
Schistosoma que, para o homem, têm como principais agentes etiológicos as
espécies S. mansoni, S. heamatobium e S. japonicum (Pordeus et al, 2008).
O controle da esquistossomose é uma das tarefas mais difíceis dos serviços
de Saúde Pública. A importância da doença não se restringe à persistência da
prevalência e larga distribuição geográfica no mundo. Ela diz respeito, também, ao
mecanismo de escape do molusco frente ao moluscicida, precárias condições de
moradia e saneamento básico, atividades econômicas ligadas ao uso da água –
15
principalmente em zonas rurais –, longo tempo para educação sanitária e adesão
aos programas de controle. Além disso, há de se considerar a inexistência de
mecanismos naturais de defesa imunológica, bem como de uma vacina efetiva
(Pordeus et al, 2008).
A esquistossomose mansônica é uma endemia mundial, ocorrendo em 52
países e territórios, principalmente na América do Sul, Caribe, África e Leste do
Mediterrâneo, onde atinge as regiões do Delta do Nilo, além de países como Egito e
Sudão. No Brasil, a transmissão ocorre em 19 estados, numa faixa contínua ao
longo do litoral, desde o Rio Grande do Norte até o interior do Espírito Santo e Minas
Gerais. Atualmente, as prevalências mais elevadas são encontradas nos estados de
Alagoas, Pernambuco, Sergipe, Minas Gerais, Bahia, Paraíba e Espírito Santo
(Ministério da Saúde, 2005). Em Alagoas, 60% do território é área endêmica e mais
de dois milhões de indivíduos estariam expostos à infecção (Couto, 2005).
O ciclo biológico de transmissão da esquistossomose é descrito da seguinte
forma. Os ovos do S. mansoni são eliminados pelas fezes do hospedeiro humano
infectado e, se as fezes são lançadas nas coleções de água doce, eles eclodem
liberando uma larva ciliada, denominada miracídio, responsável por infectar o
hospedeiro intermediário. Após quatro a seis semanas, as larvas abandonam o
caramujo e ficam livres na água, na forma de cercária. Se o homem tiver contato
com águas infectadas pelas cercárias, estas penetram ativamente, pela pele e
mucosa, fazendo com que o indivíduo adquira a infecção. O verme se desenvolve no
organismo humano durante duas a seis semanas após a penetração das cercarias
(Figura 2, p. 16). Passado esse período, o homem infectado pode transmitir a
doença eliminando ovos de S. mansoni nas fezes, por muitos anos. O verme, por si
só, não é capaz de induzir uma significante patologia no homem. A deposição de
ovos no fígado e outros órgãos, entretanto, é o responsável pela vigorosa resposta
inflamatória. Assim, no combate a esquistossomose há dois caminhos a seguir: o
tratamento de indivíduos infectados e a profilaxia mediante a destruição dos
caramujos que são hospedeiros intermediários, com o uso de substâncias
moluscicidas (Pordeus et al, 2008; Ministério da Saúde, 2005).
As substâncias moluscicidas são um fator crucial para o controle da
esquistossomose. Apenas uma substância sintética, a niclosamida (34), é
recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como moluscicida. Em
16
países do Terceiro Mundo o uso de moluscicidas sintéticos tem causado problemas
de toxidade, contaminação do meio ambiente e a resistência dos caramujos
(Biomphalaria glabrata) transmissores da esquistossomose. Em contraste, o uso de
plantas com atividade moluscicida pode representar uma alternativa barata, além de
não poluir o meio ambiente (Pinheiro et al, 2003).
N
Cl
Cl
NO2
OH
O
H
(34) niclosamida
(http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/IFN_Esquisto.htm acessado em abril de 2008).
Figura 2. Ciclo de vida do Schistosoma.
17
1.5 Considerações Sobre a Dengue
A dengue tem se destacado entre as enfermidades reemergentes e é
considerada a mais importante das doenças virais transmitidas por artrópodos. A
incidência de dengue tem aumentado nas últimas décadas. A doença ocorre em
mais de 100 países e expõe mais de 2,5 bilhões de pessoas ao risco de contraí-la
nas áreas urbanas, periurbanas e rurais dos trópicos e subtrópicos. A dengue é
endêmica na África, nas Américas, no Leste do Mediterrâneo, no Sudeste Asiático e
no Oeste do Pacífico (Braga & Valle, 2007).
A dengue ocorre e dissemina-se especialmente nos países tropicais, onde as
condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do
Aedes aegypti, principal mosquito vetor. O A. aegypti, encontrou no mundo moderno
condições muito favoráveis para uma rápida expansão, pela urbanização acelerada
que criou cidades com deficiências de abastecimento de água e de limpeza urbana;
pela intensa utilização de materiais não-biodegradáveis, como recipientes
descartáveis de plástico e vidro; e pelas mudanças climáticas (FUNASA, 2002;
Ministério da Saúde, 2005).
O combate ao mosquito A. aegypti (Figura 3, p. 18) deve ser feito de duas
maneiras: eliminando os mosquitos adultos e, principalmente, acabando com os
criadouros de larvas. O inseticida aplicado em regiões epidêmicas, elimina apenas a
forma adulta do mosquito, mas não tem nenhuma eficácia para acabar com as
larvas desse inseto. Para controlar os criadouros, foram utilizadas alternativas tais
como: controle biológico através de peixes, moluscos, bactérias etc; uso de
larvicidas químicos, como o temefós e o metoprene (Cavalcanti et al, 2004).
http://www.rc.unesp.br/ib/zoologia/%20.htm, acessado em setembro de 2009.
Figura 3. Mosquito Aedes aegypti
18
Com o surgimento de formas resistentes do mosquito aos inseticidas
convencionais utilizados, tem crescido a procura por extratos vegetais e substâncias
naturais que sejam efetivas no combate ao mosquito adulto e/ou à larva de A.
aegypti e que sejam isentas de toxidade para o meio ambiente. Plantas, como
organismos que co-evoluem com insetos e outros microorganismos, são fontes
naturais de substâncias inseticidas e antimicrobianas (Simas et al, 2004).
Dentre as substâncias extraídas de plantas com propriedades larvicidas
cientificamente comprovadas, destacam-se o ácido anacárdico (35), e os
sesquiterpenos: E-nerolidol (36) e E, E-farnesol (37) (Cavalcanti et al, 2004).
OH
COOH
(35) Ácido anacárdico
HO
OH
(36) E-nerolidol (37) E, E-farnesol
1.6 Caracterização da Espécie
A espécie Tocoyena selloana (Cham. & Schltdl.) K. Schum. (Figura 4),
pertencente à família Rubiaceae, com distribuição neotropical, tem como sinônimos:
Gardenia sellowiana Cham. & Schltdl., T. sellowiana, T. brasiliensis e T.
lichmophora. No Brasil, ocorre nos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Minas Gerais,
Pará, Paraná, Paraíba, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte e Santa
Catarina. É geralmente encontrada na mata úmida e em outros ambientes
litorâneos.
19
São plantas lenhosas com altura variando de 2 - 4m de altura, caule glabro e
entrenós 0,7- 4,2 cm de comprimento. Estípulas 0,5-0,9 x 0,4-0,5 cm, inteiras,
triangulares e glabras. Folhas obovada a lanceoladas, limbo com 8,3-16,5 x 5,2-
10,5 cm, pecíolo 0,9-1,6 cm, opostas, membranáceas a cartáceas, glabras em
ambas as faces, cor castanha quando seca, margem inteira, ápice obtuso a agudo,
base atenuada a aguda, nervura peninérvea, 7-10 pares de nervuras. Inflorescência
em dicásio compostos terminais, flores diclamídeas, andrógenas. Cálice
campanulado esverdeado, persistente, 1,1-1,5cm de comprimento. Corola amarela,
pentâmera, tubo 11,1-13,2 de comprimento. Ovário bilocular, pluriovular. Estilete
terminal, bífido, 10,6 – 10,9cm de comprimento. Estames 5 livres, sésseis; anteras
0,8-1,0cm de comprimento, dorsifixas, amarelas. Frutos carnosos tipo baga,
subglobosa, glabra. Sementes lisas (Rocha, 2007).
Figura 4. Fotos de Tocoyena selloana (Rocha, 2007)
21
2.1 Objetivo Geral
Realizar análise fitoquímica dos extratos das folhas e do caule da espécie
Tocoyena selloana (genipapo bravo) e avaliar as atividades moluscicida e larvicida.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a atividade moluscicida e larvicida dos extratos etanólicos e frações,
provenientes dos extratos etanólicos das folhas e caule de um espécime de
Tocoyena selloana (genipapo bravo) coletada em Barra de São Miguel/Alagoas.
Conhecer a composição química das folhas e caule de Tocoyena selloana
(genipapo bravo).
Contribuir para o conhecimento de alguns constituintes químicos e atividade
biológica das plantas do estado de Alagoas.
23
3.1 Solventes, Reagentes e Equipamentos
Na preparação dos extratos utilizou-se percolador de aço inoxidável;
Nas separações cromatográficas utilizou-se gel de sílica 60 (70-230 e 230-
400 mesh da Merck) e Sephadex LH-20, bem como solventes (hexano,
clorofórmio, acetato de etila, e metanol) pró-análise (P.A.)(Dinâmica);
A concentração das soluções com grande volume foi efetuada em evaporador
rotatório (Büchi, modelo RE-111), e as com volume pequeno a temperatura
ambiente e em capela de exaustão (Permution);
Nas separações cromatográficas em coluna, utilizou-se como adsorvente
sílica (70-230 mesh). O tamanho e o diâmetro da coluna variaram de acordo
com a quantidade da amostra e da sílica a serem empregadas;
Nas permeações em gel foi utilizada Sephadex LH-20 (Pharmacia);
Nas cromatografias em camada delgada foram utilizadas cromatoplacas pré-
fabricadas (Merck), bem como confeccionadas no próprio laboratório (0,75
mm de espessura) utilizando-se sílica gel 60 da Merck. Sendo estas
preparadas utilizando-se suspensão de sílica gel em água destilada,
espalhada sobre placas de vidro através de um espalhador mecânico e
ativadas em estufa (Biopar) a 100ºC;
Os cromatogramas foram revelados através de irradiação com luz
ultravioleta em comprimento de onda 245 e 365 nm, imersão em cubas
contendo vapores de iodo, borrifação com reagente de Lieberman-Burchard e
borrifação com solução ácida de sulfato cérico;
Os pontos de fusão foram determinados usando um aparelho da Macro
Química, modelo MQAPF-302;
Na secagem da vidraria utilizou-se estufa de esterilização universal Biopar,
modelo S225T;
As pesagens dos extratos e frações foram efetuados em balança eletrônica
analítica (Shimadzu, modelo AX200) ou semi analítica (OHAUS);
Nas dissoluções dos extratos utilizou-se ultra-som Branson (mod. 1210);
Os espectros de RMN (1H: 400 MHz; 13C: 100 MHz) foram registrados em
espectrômetro da Brüker Avance 400 do Instituto de Química e Biotecnologia
24
da Universidade Federal de Alagoas e as amostras foram dissolvidas em
solventes deuterados (metanol, clorofórmio, piridina e água);
Os espectros no Infravermelho foram obtidos em equipamento Varian 660-IR,
utilizando acessório ATR;
A solução ácida de sulfato cérico utilizada como revelador foi preparada com
0,30g de sulfato cérico e 7 mL de ácido sulfúrico 100 mL de solução aquosa
(Matos, 1997).
O reagente de Liebermann-Burchard foi preparado com 50 mL de anidrido
acético e 1mL de ácido sulfúrico concentrado. Este reagente é utilizado para
diferenciar triterpenóides de esteróides, através da mundança de coloração.
Para triterpenóides a coloração varia de rósea a vermelho, já para esteróides
apresenta coloração azul esverdeado (Matos, 1997).
Os solventes utilizados (Hexano, clorofórmio, acetato de etila, butanol,
metanol e etanol) foram P. A. da marca Dinâmica Química.
3.2 Coleta e identificação do Material Vegetal
O caule e as folhas da espécie vegetal Tocoyena selloana foram coletados
em março de 2007, no município de Barra de São Miguel – Alagoas. A identificação
botânica foi realizada pela botânica Ms. Rosário de Fátima de Almeida Rocha do
Instituto de Desenvolvimento Científico e Tecnológico de Xingó (Instituto Xingó),
onde exsicata da planta foi catalogada no Herbário Xingó - HXG, da Unidade de
Projetos Biodiversidade da Caatinga do referido instituto, sob o número HXG nº
05217.
3.3 Preparação dos Extratos das Folhas e do Caule
3.3.1 Preparação dos Extratos e Frações das folhas de T. selloana
As folhas, após secagem à temperatura ambiente e trituração por
turbopercolação, foram extraídas através de maceração com etanol. Após
concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, o extrato
25
bruto resultante (222,0 g) foi suspenso em uma solução de metanol e água (4:1) e
extraído exaustivamente e sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila
e n-butanol. Após concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador
rotativo, foram obtidas as frações em hexano (19,9 g), clorofórmio (68,6 g), acetato
de etila (27,7 g), n-butanol (26,7 g) e em água (43,0 g) (Esquema 2, p. 31).
3.3.2 Preparação dos Extratos e Frações do caule de T. selloana
O caule, após secagem à temperatura ambiente e trituração, foi extraído
através de maceração com etanol. Após concentração das soluções, sob pressão
reduzida em evaporador rotativo, resultaram 155,5 g de extrato. O extrato bruto foi
suspenso em uma solução de metanol e água (3:2) e extraído exaustivamente e
sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila e n-butanol. Após
concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, foram
obtidas as frações em hexano (26,0 g), clorofórmio (25,3 g), acetato de etila (12,3 g),
n-butanol (16,8 g) e em água (25,1 g) (Esquema 3, p. 32).
3.4 Isolamento e Purificação das Substâncias
3.4.1 Fração em Hexano das folhas de T. selloana
A fração em hexano (17,5g), proveniente da partição do extrato etanólico das
folhas, foi submetida à fracionamento cromatográfico, utilizando-se gel de sílica
(230-400 mesh) como fase estacionária e como eluentes: hexano, n-hexano/CHCl3
33%, n-hexano/CHCl3 50%, CHCl3, AcOEt, AcOEt/MeOH 2%, AcOEt/MeOH 5% e
MeOH (Quadro 1). Este procedimento forneceu 56 subfrações de 125mL, as quais
foram reunidas em cinco grupos (1-13, 14-16, 17-26, 27-38 e 39-56), após
eliminação dos solventes sob pressão reduzida e análise comparativa por
cromatografia em camada delgada (CCD).
26
Quadro 1. Cromatografia da fração hexânica resultante do
extrato etanólico das folhas de T. selloana
Eluentes Subfrações (125mL)
n-hexano 1-10
n-hexano / CHCl3 33% 11-26
n-hexano / CHCl3 50% 27-34
CHCl3 35-40
AcOEt 41-44
AcOEt / MeOH 2% 45-46
AcOEt / MeOH 5% 47-48
MeOH 49-56
O grupo de subfrações 17-26 (1,0 g), eluídas em n-hexano/CHCl3 33%, foi
submetido à cromatografia utilizando coluna de sílica. Este procedimento forneceu
220 frações com volume médio de 5 mL cada, as quais, após análise comparativa
através de cromatografia em camada delgada de sílica, foram reunidas em 7 grupos
(Quadro 2).
Quadro 2. Fracionamento cromatografico da subfração 17-26 da fração hexânica
das folhas de T. selloana
Grupos Frações reunidas Massa (mg) Substância
isolada
I 1-26 40
II 27-52 60
III 53-76 90
IV 77-91 200 TsFH-1
V 92-125 410 TsFH-1
VI 126-164 130
VII 165-220 60
O grupo IV (frações 77-91), após ser submetido a novo procedimento
cromatográfico utilizando coluna de sílica forneceu um sólido branco cristalino, de
ponto de fusão 232-234ºC, codificado de TsFH-1 (13 mg).
27
O grupo V (frações 92-125) foi submetido a novo procedimento
cromatográfico, utilizando coluna de sílica, obtendo-se 24 mg de um sólido branco
cristalino, de ponto de fusão 232-234 ºC, o qual após análise, observou-se que
também se tratava da substância codificada de TsFH-1.
Os demais grupos de frações não conduziram ao isolamento de substâncias.
3.4.2 Fração em Clorofórmio das folhas de T. selloana
Parte da fração clorofórmica das folhas (36,0 g) foi submetida à filtração em
sílica. Desta filtração resultaram as subfrações em n-hexano (0,1 g), n-hexano/CHCl3
50% (1,9 g), CHCl3 (5,6 g), AcOEt (13,3 g) e MeOH (13,2 g) (Esquema 1, p. 28).
A subfração em clorofórmio (5,6 g) foi submetida à fracionamento
cromatográfico utilizando coluna de sílica. Esta forneceu 365 frações, que após
análise comparativa através de cromatografia em camada delgada de sílica, foram
reunidas em 5 grupos. O grupo de frações 42-102, eluído em hexano/acetato de etila
50%, após sucessivos procedimentos cromatográficos utilizando coluna de sílica
forneceu um sólido branco cristalino, de ponto de fusão 218-221ºC, codificado de
TsFC-1 (25 mg).
A subfração em metanol (13,2 g) oriunda da fração clorofórmica das folhas foi
realizado procedimento cromatográfico utilizando coluna de sílica. A fração 24,
eluída em acetato de etila/metanol 5%, após concentração do solvente em capela de
exaustão, mostrou-se como um sólido amorfo de coloração amarela, esta fração foi
então submetida à permeação em Sephadex, a qual originou 14 frações que foram
reunidas através de análise comparativa por CCD. As frações reunidas 6-13 foram
recromatografadas utilizando coluna de sílica, este procedimento forneceu um sólido
branco cristalino, de ponto de fusão 245-248 ºC, codificado de TsFC-2 (16 mg).
28
ESQUEMA 1: Procedimento realizado com a fração clorofórmica das folhas.
Partição
Fração em
C6H14/CHCl3
50%
(1,9 g)
Fração em
C6H14
(0,1 g)
Fração em
CHCl3
(5,6 g)
Fração em
AcOEt
(13,3 g)
Fração em
MeOH
(13,2 g)
Coluna de sílica
TsFC-1
(25 mg)
Fração em CHCl3
(Folhas)
(36,0 g)
Frações 27-41
(170 mg)
Frações 1-26
(110 mg)
Frações
103-138
(1,3 g)
Frações
42-102
(1,5 g)
Frações
139-365
(1,0 g)
Colunas de sílica
Coluna de sílica
Frações 14
(30 mg) Frações 6-13
(110 mg) Frações 1-5
(80 mg)
TsFC-2
(16 mg)
Coluna de sílica
Sephadex
Frações 1-11
(600 mg)
Fração 24
(250 mg)
Frações 12-23
(2,0 g)
Frações 25-29
(190 mg)
29
3.4.3 Fração em acetato de etila das folhas de T. selloana
A fração em acetato de etila (27,7g), apesar das tentativas de purificação
utilizando coluna cromatográfica de sílica, permeação em Sephadex e lavagens com
diversos solventes, não conduziu ao isolamento de substância com grau de pureza
apropriado para determinação estrutural.
3.4.4 Fração aquosa das folhas de T. selloana
A fração aquosa (43,0 g), oriunda do extrato etanólico das folhas, foi
submetida à lavagem com metanol à temperatura ambiente, seguida de filtração,
resultando cristais de coloração verde-claro (230 mg). A água-mãe resultante da
filtração, foi submetida à permeação em Sephadex, utilizando metanol/água 30%
(frações 1 e 2 com 125 mL cada) e metanol (frações 3 e 4 com 125 mL cada). A
fração 1, foi tratada com etanol dando origem a um material branco amorfo.
Utilizando-se metanol/água 10%, o material branco amorfo foi submetido à
cristalização. Observou-se a formação de cristais finos, de ponto de fusão 163-
165ºC, que foram codificados de TsFA-1 (530 mg). O mesmo procedimento foi
adotado para a fração 2, fornecendo cristais finos, de ponto de fusão 164-167ºC, o
qual observou-se também se tratar da substância codificada de TsFA-1 (95 mg).
O material cristalino de coloração verde-claro, oriundo da fração aquosa das
folhas (Esquema 2, p. 32), foi dissolvido em metanol/água 30% e submetido à
permeação em Sephadex, originando 8 frações. As frações 2-6 foram reunidas e
após tratamento com etanol formou-se um material branco. Utilizando-se
metanol/água 10%, o material foi submetido a recristalização a qual deu origem a
uma solução contendo cristais finos em forma de agulhas, de ponto de fusão 162-
165ºC, que foi submetida a filtração a vácuo e posteriormente com os dados de
RMN verificou-se que também era a substância codificada de TsFA-1 (50 mg).
3.4.5 Fração em Acetato de Etila do Caule de Tocoyena selloana
A fração em acetato de etila (12,3 g), proveniente da partição do extrato
etanólico do caule (Esquema 3, p. 32), foi submetida à cromatografia em coluna de
30
sílica, obtendo-se 10 frações com volume médio de 125 mL cada, após
concentração das soluções em evaporador rotativo, foi observado que a fração 9,
eluída em acetato de etila/metanol 50%, apresentava sólido de coloração escura.
Esta fração foi submetida à recristalização usando metanol/água 10%,
originando cristais finos, de ponto de fusão 154-156 ºC, que apesar da diferença de
pontos de fusão também se tratava de TsFA-1 (114 mg).
3.4.6 Fração Aquosa do Caule de Tocoyena selloana
A fração aquosa do caule (25,1 g) foi submetida à filtração em sílica gel,
utilizando funil de separação sob vácuo. Foram obtidas as frações em hexano (0,4g),
clorofórmio (2,2g), acetato de etila (3,8g), metanol (1,7g) e aquosa (4,7g) (Esquema
3, p. 32).
A fração metanólica (1,7 g) proveniente da filtração em sílica da fração
aquosa do caule (Esquema 3, pág. 32), apresentou material branco com aspecto de
farinha. Este foi suspenso em uma solução de metanol e água (4:1), e extraído
sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila e n-butanol. Após
concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, foram
obtidas as subfrações em hexano (30 mg), clorofórmio (40 mg), acetato de etila (290
mg), butanol (410 mg) e metanol (270 mg).
A subfração em acetato de etila, após eliminação do solvente apresentou
material cristalino de coloração amarronzada. Depois de ser solubilizado em
metanol/água 30% foi filtrado a vácuo, obtendo-se o material cristalino ainda com
uma coloração marrom. Este foi submetido à recristalização usando metanol/água
10% e forneceu cristais finos, de ponto de fusão 164-166 ºC, que também foi
confirmado como TsFA-1 (88 mg).
A subfração butanólica foi submetida à permeação em Sephadex, fornecendo
um material branco que foi cristalizado, levando a quantidade adicional de TsFA-1
(27 mg).
31
ção
ESQUEMA 2: Procedimento efetuado com as Folhas de T. selloana
1. Maceração com etanol
2. Concentração
Partição
Extrato EtOH
(222,0 g)
Fração em CHCl3
(68,6 g)
Fração em C6H14
(19,9 g)
Fração em AcOEt
(27,7 g) Fração em BuOH
(26,7 g) Fração aquosa
(43,0 g) Filtração
Fração em MeOH
(16,6 g) Fração em CHCl3
(5,6 g) Material cristalino
(230 mg)
TsFC-2
(16 mg) TsFC-1
(25 mg)
TsFH-1
(13 mg)
Coluna de sílica
Colunas de sílica Colunas de sílica
Tratamento com MeOH
Filtração a vácuo
Água-mãe
TsFA-1
(50 mg)
TsFA-1 (530 mg)
Sephadex/
Cristalização
Sephadex/
Cristalização
TsFA-1 (95 mg)
Folhas (Trituradas)
(892,0 g)
Frações 14-16
(600 mg) Frações 17-27
(1,0 g)
Frações 77-91
(180 mg) Frações 92-105
(300 mg)
TsFH-1
(24 mg)
32
ESQUEMA 3: Procedimento realizado com o Caule de T. selloana
Maceração com etanol / Concentração
Partição
Fração em CHCl3
(25,3 g) Fração em C6H14
(26,0 g) Fração em AcOEt
(12,3 g) Fração em BuOH
(16,8 g) Fração aquosa
(25,1 g)
Fração 9
(1,2 g)
TsFA-1
(25 mg)
Colunas de sílica
Recristalização
Caule (Triturado)
(4492,6 g)
Extrato EtOH
(155,5 g)
Fração em CHCl3
(2,2 g) Fração em C6H14
(0,4 g) Fração em AcOEt
(3,8 g) Fração em MeOH
(1,7 g) Fração aquosa
(4,7 g)
Partição
Filtração
em sílica Fração 10
(1,9 g)
Frações 4-8
(5,8 g)
Frações 1-5
(2,6 g)
Subfração em
CHCl3 (40 mg)
Subfração em
C6H14 (30 mg)
(10 mg)
Subfração em
AcOEt (290 mg) Subfração em
BuOH (410 mg) Subfração em
MeOH (270 mg)
Filtração a vácuo
Material solúvel
Material cristalino
(210 mg)
TsFA-1 ( 88mg)
Recristalização Recristalização
Sephadex
Frações 1-6
(220 mg)
Fração 7
(110 mg) Frações 8-11
(70 mg)
TsFA-1 ( 27 mg)
33
3.5 Ensaios Biológicos
3.5.1 Atividade Larvicida Frente às Larvas do Mosquito Aedes aegypti
Os ensaios biológicos com as larvas de A. aegypti foram realizados no
laboratório de bioensaios do Instituto de Química e Biotecnologia da Universidade
Federal de Alagoas (IQB / UFAL), sob a orientação do Professor Antônio Euzébio
Goulart Sant’Ana e supervisão do doutorando Karlos Lisboa, utilizando-se de larvas
no quarto estágio, segundo metodologia preconizada pela Organização Mundial de
Saúde (OMS 1970). O quadro 3 relaciona os extratos que foram avaliados.
Quadro 3. Extratos e Frações submetidos aos ensaios larvicida
Partes da Planta Extratos
Folhas Extrato bruto e frações em C6H14, CHCl3, AcOEt,
BuOH e aquosa
Caule Extrato bruto e frações em C6H14, CHCl3, AcOEt,
BuOH e aquosa
Após a pesagem dos extratos, estes foram dissolvidos em solução aquosa de
dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% até a concentração de 500 ppm. Quando foi
considerado promissor (causou mortalidade superior a 75%), foi analisado em
menores concentrações visando à obtenção das concentrações letais (CL50).
Os testes preliminares foram feitos em duplicatas com 10 larvas em copos
descartáveis de 200 mL contendo 25 mL de solução. As larvas foram consideradas
mortas quando não conseguiam atingir a superfície da solução quando o recipiente
era agitado. A contagem das larvas foi realizada a hora 0 (início do experimento),
24h e 48h, como controle negativo foi utilizada uma solução a 1% de DMSO e como
controle positivo foi usada a rotenona (38) que é o larvicida sintético comercialmente
disponível.
34
O
OO
H
H
H
OCH3
H3CO
O
(38) rotenona
Dos extratos testados, foram considerados promissores e submetidos a testes
quantitativos, aqueles que obtiveram percentual de mortalidade larval superior a
75%. Os dados concentração x mortalidade dos ensaios apurados foram submetidos
a tratamento estatístico utilizando o programa Probity, para a determinação dos
valores de concentração letal (CL50).
3.5.2 Atividade Moluscicida
Nos ensaios biológicos de atividade moluscicida, foram utilizados caramujos
da espécie Biomphalaria glabrata Say criados em laboratório e descendentes de
exemplares, não infectados por trematódeos, originários da região do Barreiro de
Cima, zona periférica de Belo Horizonte, Minas Gerais. Essa população caracteriza-
se por possuir 5% de exemplares albinos (Santos, 2005). Os testes com os extratos
foram realizados no laboratório de bioensaios do Instituto de Química e
Biotecnologia da UFAL, sob orientação do Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart
Sant’Ana e supervisão da doutoranda Cenira Monteiro. Utilizando-se do caramujo B.
glabrata na fase adulta, de acordo com o protocolo da Organização Mundial de
Saúde (OMS, 1994).
Os ensaios biológicos consistiram na imersão dos caramujos em uma solução
aquosa a 100 ppm (100 g mL-1) dos extratos etanólicos brutos e também das
frações oriundas da partição. Foram utilizados 5 caramujos por concentração e os
testes realizados em duplicata. Dois conjuntos de controle foram usados visando
verificar a suscetibilidade dos caramujos, um positivo com niclosamida (34) a 3 ppm
e um negativo - somente com água desclorada.
35
O tempo de exposição destes organismos foi de 24 horas e o de observação
72 horas, com leitura e troca de água a cada 24 horas, além da remoção dos
exemplares mortos. Durante o período de observação foram alimentados com
alface.
A morte dos caramujos foi indicada pela descoloração, ausência de
contrações musculares, hemorragia e deterioração dos tecidos do corpo.
3.6 Dados Físicos e Espectroscópicos das Substâncias Isoladas
3.6.1 Substância TsFA-1
Sólido branco cristalino, isolado da fração aquosa das folhas e das frações
metanólica e em acetato de etila do caule.
P.f. = 164-166 ºC; p.f. 165-168 ºC (Oliveira et al, 2009).
IV (cm-1) (ATR) 3400, 3300, 2900, 1100, 1050 (Figura 5, p. 54)
RMN 1H (400 MHz, D2O ,δ) (Figura 6, p. 55)
RMN 13C (100 MHz, D2O ,δ) (Figura 7, p. 56)
RMN DEPT 135º (100 MHz, D2O ,δ) (Figura 8, p. 56)
3.6.2 Substância TsFH-1
Sólido branco cristalino, isolado da fração hexânica das folhas.
P.f. = 232-234 ºC; p.f. 232-235 ºC (Costa et al, 2008).
RMN 1H (400 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 9 e 10, p. 57 e 58)
RMN 13C (100 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 11 e 12, p. 59 e 60)
RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 13 e 14, p. 61 e 62)
3.6.3 Substância TsFC-2
Sólido branco cristalino, isolado da fração clorofórmica das folhas.
P.f. = 246-248 ºC; p.f. 252-254 ºC (Jane et al, 1997)
IV (cm-1) (ATR) 3600-3200, 3000-2500, 1650, 1000 (Figura 15, p. 63)
RMN 1H (400 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 16-18, p. 64-66)
36
RMN 13C (100 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 19 e 20, p. 67 e 68)
RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 21 e 22, p. 69 e 70)
3.6.4 Substância TsFC-1
Sólido branco cristalino, isolado da fração clorofórmica das folhas.
P.f. = 218-221 ºC
IV (cm-1) (ATR) 2900, 2850, 1700 (Figura 23, p. 71)
RMN 1H (400 MHz, C5D5N ,δ) (Figura 24, p. 72)
RMN 13C (100 MHz, C5D5N, δ) (Figuras 25 e 26, p. 73 e 74)
RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N, δ) (Figuras 27 e 28, p. 75 e 76)
38
4.1 Identificação Estrutural das Substâncias Isoladas
4.1.1 Identificação Estrutural da Substância TsFA-1
A substância codificada de TsFA-1, de ponto de fusão 164-166ºC, isolada
como um sólido branco cristalino, foi obtida a partir da fração aquosa das folhas e
das frações em acetato de etila e aquosa do caule.
A cromatografia em camada delgada do constituinte TsFA-1 não apresentou
fluorescência quando irradiada com ultravioleta, também não apresentou revelação
utilizando o reagente de Liebermann-Burchard e solução ácida de sulfato cérico.
O espectro no infravermelho (IV) (Figura 5, p. 54) de TsFA-1 apresentou
bandas de absorção intensas em 3400 e 3300 cm-1, em 2900 cm-1 e 1100 e 1050
cm-1, sugestivas de um composto alifático poliidroxilado (Barbosa, 2007).
O espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H)
(Figura 6, p. 55; Tabela 1, p. 39) apresentou quatro sinais referentes a 8 hidrogênios
carbinólicos, sendo dois duplo dupletos em δ 3,54 (J=11,0 e 5,8Hz) e 3,74 (J=11,0 e
2,5Hz), um duplo duplo dupleto em δ 3,62 (J=8,6, 5,8 e 2,5Hz) e um dupleto em δ
3,67. Esses dados aliados as informações obtidas no espectro de infravermelho
sugeriram que TsFA-1 se tratava de um poliálcool (Paula et al, 1998).
A análise do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN
13C) (Figura 7, p. 56; Tabela 2, p. 40) revelou a presença de apenas três sinais (δ
63,1, 69,1, 70,7) e o experimento DEPT permitiu atribuir o sinal de carbono em δ
63,1 a um CH2 e os sinais em δ 69,1 e δ 70,7 a dois CH, o que levou a propor que a
substância em questão se tratava de um alditol com seis átomos de carbono e
simétrica, descartando assim a estrutura do D-Sorbitol (39), o qual é assimétrico, e
sugerindo um poliálcool simétrico, como o D-Manitol (40) ou o L-iditol (41).
A análise em conjunto dos dados dos espectros de infravermelho, RMN 1H,
RMN 13C e DEPT, em adição ao ponto de fusão (Quadro 4, p. 40), e comparação
com dados descritos na literatura para polióis, permitiram sugerir para a substância
TsFA-1, a estrutura do carboidrato (2R, 3R, 4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-
hexano, conhecido como D-manitol, o qual apresenta um eixo de simetria C2 e
quatro centros estereogênicos (Oliveira et al, 2009; Ferreira et al, 2009).
39
HO
OH
OHOH
OH
OH
HO
OH
OHOH
OH
OH
HO
OH
OHOH
OH
OH
(39) D-Sorbitol (40) D-Manitol (41) L-Iditol
O D-Manitol é um carboidrato natural encontrado em diversos vegetais como
beterraba, cebola, figo e azeitonas e também está presente em alguns exsudados
de árvores e algas marinhas (Ferreira et al, 2009). É um poliálcool muito utilizado
para os mais variados fins, como na indústria farmacêutica onde é usado como
excipiente do tipo diluente, em comprimidos que devem dissolver na boca, devido à
agradável sensação de doçura e frescor. Por não ser higroscópico é usado também
como estabilizante em comprimidos que contenham compostos sensíveis a
umidade, como a vitamina C e o ácido acetilsalicílico (Oliveira et al, 2008). É também
utilizado como diurético osmótico para neuroanestesia e neurorremediação devido
não ser absorvido no trato gastrointestinal (Oliveira et al, 2009).
Há alguns relatos na literatura de isolamento do D-Manitol na família
Rubiaceae (Silva et al, 2007; Lapikanon et al, 1983; Luciano et al, 2004). Já no
gênero Tocoyena não foi encontrado registro de isolamento, sendo portando,
descrito pela primeira vez neste gênero.
Tabela 1. Dados de RMN 1H (400 MHz, D2O) de TsFA-1 e do D-manitol (400
MHz, D2O) (Guimarães, 2006).
H TsFA-1 D-Manitol
1a 3,54 dd (J = 11,0 e 5,8Hz) 3,58 dd (J = 11,6 e 5,8Hz)
1b 3,74 dd (J = 11,0 e 2,5Hz) 3,78 dd (J = 11,6 e 2,5Hz)
2 3,62 ddd (J = 8,6, 5,8 e 2,5Hz) 3,68 ddd (J = 8,5, 5,8 e 2,5Hz)
3 3,67 d 3,71 d
40
Tabela 2. Dados de RMN 13C (100 MHz, D2O) de TsFA-1, do D-manitol (100
MHz, D2O) (Paula et al, 1998), do L-Iditol (100 MHz, D2O) (Liu & Liu,
2008) e do D-Sorbitol (100 MHz, DMSO-d6) (Margulies et al, 2000).
C TsFA-1 D-Manitol L-Iditol D-Sorbitol
1 63,1 63,7 66,0 63,7
2 69,1 69,6 73,5 73,4
3 70,7 71,2 72,0 70,7
4 70,7 71,2 72,0 72,6
5 69,1 69,6 73,5 72,5
6 63,1 63,7 66,0 63,8
Quadro 4. Valores de pontos de fusão de TsFA-1, do D-manitol (Oliveira et al,
2009), do D-Sorbitol (Willians et al, 2006) e do L-Iditol (Liu & Liu,
2008).
Substância Ponto de fusão (ºC)
TsFA-1 164-166
D-manitol 165-168
D-Sorbitol 95-99
L-Iditol 73-75
4.1.2 Identificação Estrutural da Substância TsFH-1
A substância codificada de TsFH-1, isolada como um sólido branco cristalino,
de ponto de fusão 232-234ºC, teve sua natureza triterpenoídica sugerida por
apresentar coloração rosa com o reagente de Liebermann-Burchard (Jain & Yadaya,
1994).
A análise dos dados do espectro de RMN 1H de TsFH-1 (400 MHz, CDCl3-
DMSO-d6) (Figuras 9 e 10, p. 57 e 58) permitiu identificar um sinal de hidrogênio
olefínico [δ 5,03 (sl)], sugerindo a presença de hidrogênio H-12 de triterpeno
pentacíclico com esqueleto ursano ou oleanano, tais como a α-amirina (42) e β-
amirina (43), respectivamente (Mahato & Kandu, 1994). Apresentou também sinal de
hidrogênio de carbono carbinólico [δ 3,44 (d, J = 7 Hz)] e vários sinais compatíveis
41
com deslocamentos químicos de hidrogênios metílicos (δ 0,48-1,23) e metilênicos (δ
1,34-2,89).
HO
H
H
H
HO
H
H
H
(42) α-amirina (43) β-amirina
Os dados obtidos dos espectros de RMN 13C e DEPT (100 MHz, CDCl3-
DMSO-d6) (Figuras 11 e 12, p. 59 e 60; Tabela 3, p. 41) permitiram reconhecer a
presença de 30 sinais de átomos de carbono, sendo sete carbonos não
hidrogenados, sete monoidrogenados, nove diidrogenados e sete triidrogenados.
Dentre esses, foram observados sinais com deslocamentos químicos compatíveis
com carbonos olefínicos [δ 137,8 (C, C-13) e δ 124,7 (CH, C-12)], característicos de
triterpenos com esqueleto urs-12-eno (Mahato & Kandu, 1994). Observaram-se
ainda, sinais para carbono carbonílico [δ 179,5] de ácido carboxílico e para carbono
carbinólico [δ 77,9]. A análise comparativa destas informações com os dados obtidos
na literatura (Junges et al, 2000) permitiram sugerir que TsFH-1 se tratava do ácido
3β-hidróxi-urs-12-en-28-óico, conhecido como ácido ursólico (19). A tabela 3 mostra
os dados de RMN 13C de TsFH-1, do ácido ursólico e da substância com esqueleto
oleanano, o ácido oleanólico (20).
Na família Rubiaceae existem vários relatos na literatura de isolamento do
ácido ursólico (Barros et al, 2008; Lima et al, 2009; Moura et al, 2006). Entretanto,
no gênero Tocoyena não foi encontrado registro de isolamento, sendo portando
descrito pela primeira vez neste gênero.
Várias atividades biológicas têm sido atribuídas ao ácido ursólico, tais como:
antiinflamatória, hepatoprotetora, antitumoral e antimicrobiana (Leite et al, 2001).
42
Tabela 3. Dados de RMN 13C de TsFH-1 (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6), dos ácidos
ursólico (50 MHz, CDCl3) (Junges et al, 2000) e oleanólico (CDCl3)
(Mahato & Kandu, 1994).
Posição TsFH-1 Ácido ursólico Ácido oleanólico
1 38,2 38,9 38,5 2 23,0 23,5 27,4 3 77,9 78,3 78,7 4 38,3 37,3 38,7 5 54,7 55,7 55,2 6 17,8 18,7 18,3 7 32,5 33,3 32,6 8 38,5 39,3 39,3 9 47,0 46,7 47,6
10 36,3 37,2 37,0 11 23,7 23,8 23,1 12 124,7 125,5 122,1 13 137,8 139,2 143,4 14 41,5 42,0 41,6 15 28,8 28,4 27,7 16 22,1 22,7 23,4 17 47,0 47,9 46,6 18 52,2 53,4 41,3 19 39,1 39,3 45,8 20 38,1 39,8 30,6 21 30,9 30,9 33,8 22 36,4 37,3 32,3 23 27,7 28,6 28,1 24 15,0 16,5 15,6 25 15,3 15,6 15,3 26 17,8 16,5 16,8 27 22,7 23,5 26,0 28 179,5 179,8 181,0 29 16,6 17,3 33,1 30 20,8 21,3 23,6
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
H
H
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29 30
H
H
H
(19) ácido ursólico (20) ácido oleanólico
43
4.1.3 Identificação Estrutural da Substância TsFC-2
A substância codificada de TsFC-2, isolada como um sólido branco cristalino,
de ponto de fusão 245-248ºC, teve sua natureza triterpenoídica sugerida por
apresentar coloração rosa com o reagente de Liebermann-Burchard e coloração
violeta com solução ácida de sulfato cérico (Jain & Yadaya, 1994).
O espectro na região do infravermelho, obtido com a utilização de acessório
ATR, no qual a amostra é colocada diretamente no equipamento (Figura 15, p. 63),
apresentou bandas intensas na região de 3600 a 3200 cm-1 e em 1000 cm-1,
sugestivas de estiramentos de grupos hidroxila e C-O de álcool, respectivamente
(Barbosa, 2007). Apresentou também bandas na região de 3000-2500 cm-1 e em
1650 cm-1, que sugerem a presença de grupo carboxila (Barbosa, 2007).
A análise do espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) (Figuras 16-18,
p. 64-66) mostrou, a presença de um sinal em δ 5,30, compatível com o
deslocamento químico de hidrogênio olefínico, um sinal para hidrogênio carbinólico
(δ 3,16) e sinais para hidrogênios de seis grupos metila em (δ 0,69; δ 0,63; δ 0,58; δ
0,56; δ 0,50; δ 0,42). Observaram-se também sinais sugestivos da presença de uma
unidade β-D-glicopiranosídica: δ 4,01 [(d); J = 7,7, H-1’ carbono anomérico], em δ
3,75-3,91 (m; H-3’, H-4’ e H-5’) 3,52 (dd; J = 2,7 e 11,8, H-6’a), e δ 3,41 (dd; J = 4,8
e 11,8, H-6’b). Adicionalmente foi observado um dupleto em δ 1,95, compatível com
deslocamento químico de hidrogênio em C-18 de um triterpeno pentacíclico
(Hameski et al, 2005).
Os dados fornecidos pela análise dos espectros de RMN 13C e DEPT 135
(Figuras 19-22, p. 67-70; tabela 4, p. 45), permitiram reconhecer a presença de um
total de 36 átomos de carbono (oito não hidrogenados, doze monoidrogenados, dez
diidrogenados e seis triidrogenados). Dentre esses átomos de carbonos, seis
apresentam deslocamentos químicos compatíveis com a presença de uma unidade
β-D-glicopiranosila [δ 104,5 (CH, C-1’), δ 75,1 (CH, C-2’), δ 77,3 (CH, C-3’), δ 69,4
(CH, C-4’), δ 75,9 (CH, C-5’) e δ 60,9 (CH2, C-6’)] (Hameski et al, 2005), confirmado,
portanto, as evidências fornecidas pelo espectro de RMN 1H . Os Trinta átomos de
carbono restantes correspondem à uma unidade aglicônica triterpenoídica. Assim, a
região de absorção de carbonos olefínicos revelou dois sinais com deslocamentos
químicos condizentes com a presença de uma ligação dupla trissubstituida [δ 131,6
44
(C, C-13) e δ 128,4 (CH, C-12)] que são característicos de triterpenos da série
ursano (Mahato & Kandu, 1994). Estão presentes, também, dois sinais em δ 179,9 e
δ 177,2, compatíveis com carbonilas de grupo carboxílico. A análise comparativa
destas informações com os dados obtidos da literatura permitiram sugerir que TsFC-
2 se tratava do ácido quinóvico (13) glicosilado. Quanto à posição da unidade de
açúcar, a presença de um sinal com deslocamento químico em δ 89,9 permitiu a sua
localização na posição C-3, descartando, assim, a possibilidade de tratar-se do
ácido 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (14), cuja unidade de açúcar localiza-se no
carbono C-28 (Mahato & Kandu, 1994; Oliveira et al, 2008).
A análise conjunta dos dados espectroscópicos discutidos e comparação com
dados da literatura permitiram sugerir para a substância TsFC-2, a estrutura da
saponina triterpênica conhecida como ácido 3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31)
(Hamerski et al, 2005).
O ácido 3-β-O-D-glicopiranosilquinóvico já havia sido isolado anteriormente de
espécies do gênero Tocoyena, bem como de um espécime de T. selloana estudado
por um grupo da Universidade Federal do Ceará (Jane et al, 1997).
HO
COOH
COOH
1
2
34
56
7
89
10
1112
13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26 H
H
H
HO
COOH
C
O
O
O
HO
OH
OH
HO
H
H
H
(13) ácido quinóvico (14) ácido 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico
COOH
COOH
1
2
34
56
7
89
10
1112
13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26
OO
OH
HO
HO
HO
1'
2'3'4'
5'6'
H
H
H
(31) ácido 3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico
45
Tabela 4. Dados de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2, dos ácidos
3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31) (100 MHz, CD3OD) (Hamerski
et al, 2005), quinóvico (13) (75 MHz, C5D5N ) (Oliveira et al, 2008) e
28-O-β-D-glicopiranosil quinóvico (33) (125 MHz, DMSO-d6)
(Hameski et al, 2005).
Carbonos TsFC-2 (31) (13) (33)
1 37,8 38,6 39,5 39,0 2 23,8 24,1 26,7 24,4 3 89,0 88,0 78,3 77,6 4 38,1 39,0 39,6 38,7 5 54,7 55,3 56,1 54,8 6 17,3 17,8 19,2 17,1 7 35,9 36,3 37,9 36,1 8 38,0 38,9 40,4 38,9 9 45,9 46,2 47,6 46,8
10 35,8 38,7 37,7 38,7 11 21,8 22,4 23,7 23,5 12 128,4 128,0 129,3 128,0 13 131,6 132,5 134,5 132,6 14 55,2 55,3 57,1 56,2 15 29,2 29,8 28,5 29,1 16 24,4 25,0 25,9 25,7 17 47,9 47,3 49,1 47,8 18 53,2 53,7 55,3 53,8 19 38,2 38,5 39,7 38,6 20 36,2 36,6 38,0 36,4 21 25,1 25,6 30,9 30,2 22 35,9 35,9 37,4 37,0 23 26,8 27,8 19,3 28,2 24 16,4 16,5 28,9 16,5 25 15,3 16,1 17,0 16,1 26 18,0 18,2 17,0 17,9 27 177,2 176,3 178,4 175,3 28 179,9 178,6 180,5 176,9 29 15,4 17,5 18,5 18,6 30 20,0 21,1 21,7 21,2 1’ 104,5 105,6 - 94,0 2’ 75,1 74,0 - 72,4 3’ 77,3 76,9 - 76,6 4’ 69,4 70,3 - 69,6 5’ 75,9 76,6 - 76,6 6’ 60,9 61,3 - 60,8
46
4.1.4 Identificação Estrutural de TsFC-1
A substância codificada de TsFC-1, obtida em mistura a partir da fração
clorofórmica das folhas, foi isolada como um sólido branco cristalino, de ponto de
fusão 218-221ºC. A análise da mistura por cromatografia em camada delgada de
sílica, utilizando-se vários eluentes e, como reveladores, o reagente de Liebermamn-
Burchard e solução ácida de sulfato cérico, mostrou uma única mancha de coloração
rosa e violeta, respectivamente, sugestiva de substâncias de natureza triterpênica
(Jain & Yadaya, 1994).
O espectro na região do infravermelho da mistura (Figura 23, p. 71), obtido
utilizando acessório ATR, revelou a natureza alifática dos constituintes e, dentre
outras bandas, a presença de duas bandas de absorção de grupos carbonila, uma
de baixa intensidade em 1715 cm-1 e a outra mais intensa em 1700 cm-1.
O espectro de RMN 1H (Figura 24, p. 72) da mistura foi pouco informativo
devido à baixa resolução do mesmo. No entanto, revelou na região de absorção de
hidrogênios olefínicos, um sinal com deslocamento químico em δ 5,03, sugestivo de
hidrogênio em C-12 de triterpeno pentaciclico com esqueleto urs-12-eno e/ou olean-
12-eno (Connolly & Hill, 1991). Mostrou também vários sinais na região de absorção
de grupos metila (δ 0,60-1,26).
A análise conjunta dos dados obtidos dos espectros de RMN 13C (Figuras 25
e 26, p. 73 e 74; Tabela 6, p. 48;) e DEPT 135º (Figuras 27 e 28, p. 75 e 76), apesar
do grande número de sinais presentes, permitiu reconhecer na região de absorção
de átomos de carbono olefínicos, dois carbonos cujos valores de deslocamentos
químicos [ δ 139,1 (C, C-13) e δ 125,5 (CH, C-12)], estão condizentes com a
presença de triterpeno de esqueleto urs-12-eno (Mahato & Kandu, 1994)
A análise comparativa das informações fornecidas pelos espectros da mistura
com os dados obtidos da literatura permitiu sugerir a presença de ácido ursólico
(TsFC-1M) (19), como um dos constituintes da mistura, já isolado da fração hexânica
das folhas (p. 41) (Junges et al, 2000).
Retornando ao espectro de RMN 13C da mistura, foi possível ainda
reconhecer sinais de alta intensidade (δ 30,6, 31,2, 30,4, 30,0 e 14,4) sugestivos da
presença de hidrocarboneto saturado de cadeia longa.
47
Quanto à substância TsFC-1, exceto os sinais atribuídos aos átomos de
carbono do ácido ursólico (TsFC-1M; Tabela 6) e aos da graxa, observam-se, no
espectro de RMN 13C, um sinal com deslocamento químico em δ 206,1, indicativo de
grupo carbonila de cetona, vários sinais na região de ligação dupla (δ 139,6-114,7),
além de outros sinais compatíveis com carbono saturado, conforme mostrado na
tabela 5 (p. 47). Apesar das tentativas, com os dados fornecidos, não foi possível
propor estrutura para o componente da mistura TsFC-1.
Tabela 5. Dados de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.
Sinal Carbono
206,1 C 139,6 CH 139,4 CH 125,2 CH 124,8 CH 119,8 CH 114,7 C 34,2 C 33,7 C 30,1 CH3 29,7 CH2 29,5 CH3 29,3 C 28,8 C 25,0 C
48
Tabela 6. Dados de RMN 13C de TsFC-1M (100 MHz, C5D5N), e do ácido
ursólico (50 MHz, CDCl3) (Junges et al, 2000)
Posição TsFC-1M Ácido ursólico
1 37,6 38,9 2 23,7 23,5 3 78,2 78,3 4 37,4 37,3 5 55,9 55,7 6 18,9 18,7 7 32,2 33,3 8 40,0 39,3 9 48,2 46,7
10 35,3 37,2 11 25,0 23,8 12 125,8 125,5 13 139,1 139,2 14 42,6 42,0 15 28,2 28,4 16 23,0 22,7 17 48,1 47,9 18 53,6 53,4 19 39,6 39,3 20 39,5 39,8 21 31,5 30,9 22 39,5 37,3 23 28,9 28,6 24 16,7 16,5 25 15,8 15,6 26 17,6 16,5 27 24,0 23,5 28 180,1 179,8 29 17,7 17,3 30 21,5 21,3
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
H
H
(19) ácido ursólico
49
4.2 Resultados dos Testes de Atividade Biológica
4.2.1 Atividade Larvicida
Dentre os extratos das folhas e do caule que foram submetidos aos ensaios
preliminares, na concentração de 500 ppm, foram considerados promissores
somente o extrato bruto do caule (90% de letalidade) e a fração clorofórmica do
caule (80% de letalidade) (Tabela 7).
Para a fração em CHCl3 do caule, a concentração que causa 50% da
mortalidade da população de larvas (CL50) foi determinada em CL50 260,755 ppm,
com intervalo de confiança entre 213,374 a 319,310. Para o extrato bruto do caule, a
concentração letal foi determinada em CL50 298,808 ppm com intervalo de confiança
entre 252,672 a 355,508. De acordo com dados da literatura (Cheng et al, 2003) é
considerado um bom agente larvicida substâncias com valores de CL50 menores que
100 ppm, portanto, na concentração testada a espécie foi considerada inativa.
Tabela 7: Resultado dos bioensaios preliminares de atividade larvicida,
realizados na concentração de 500 ppm.
Fração % de Letalidade CL50
Hexânica (Folhas) 0
Clorofórmica (Folhas) 0
Acetato (Folhas) 20
Butanólica (Folhas) 0
Aquosa (Folhas) 0
Extrato bruto (Folhas) 20
Hexânica (Caule) 0
Clorofórmica (Caule) 90 260,755
Acetato (Caule) 0
Butanólica (Caule) 0
Aquosa (Caule) 20
Extrato bruto (Caule) 80 298,808
50
4.2.2 Atividade Moluscicida
Na avaliação da atividade moluscicida, os extratos brutos e as frações das
folhas e do caule de T. selloana, na concentração de 100 ppm, não causaram a
mortalidade dos caramujos, sendo portanto, considerados inativos frente ao
caramujo Biomphalaria glabrata.
52
O estudo fitoquímico dos extratos etanólicos do caule e das folhas de
Tocoyena selloana (Rubiaceae) conduziu ao isolamento de quatro substâncias, das
quais três tiveram suas estruturas identificadas.
A substância TSFA-1, isolada da fração aquosa das folhas e também das
frações em acetato de etila e aquosa do caule foi identificada como sendo o
carboidrato (2R, 3R, 4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-hexano (D-Manitol), isolado
pela primeira vez no gênero Tocoyena.
A substância codificada como TsFH-1 isolada da fração hexânica das folhas
foi identificada como o triterpeno da série ursano, conhecido como ácido ursólico,
para o qual não foi encontrado registro na literatura em espécies do gênero
Tocoyena.
A substância TsFC-2, isolada da fração clorofórmica das folhas foi identificada
como sendo uma saponina triterpênica derivada do ácido quinóvico, conhecida como
ácido 3-O-β-D-glicopiranosílquinóvico, previamente isolado de um espécime de T.
selloana estudado na Universidade Federal do Ceará.
Os extratos e frações obtidos de Tocoyena selloana apresentaram fraca
atividade larvicida frente às larvas do mosquito Aedes aegypti.
Os testes biológicos realizados com os extratos e frações obtidos de
Tocoyena selloana, foram biologicamente inativos frente ao caramujo Biomphalaria
glabrata, na concentração de 100 ppm.
54
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
60
70
80
90
100
Tra
nsm
itânc
ia%
C m-1
B
Figura 5. Espectro de IV (ATR) de TsFA-1.
HO
OH
OHOH
OH
OH
D-Manitol
55
Figura 6. Espectro de RMN 1H (400 MHz, D2O) da substância codificada de TsFA-1.
SpinWorks 2.2: MMSH - M5
PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4
4
.70
00
3
.75
82
3
.75
19
3
.72
89
3
.72
29
3
.68
19
3
.66
03
3
.64
71
3
.64
09
3
.63
23
3
.62
58
3
.61
05
3
.60
46
3
.56
62
3
.55
13
3
.53
70
3
.52
23
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\1\fid expt: <zg30>
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time domain size: 65536 points
width: 3238.34 Hz = 8.091780 ppm = 0.049413 Hz/pt
number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.199995 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
SpinWorks 2.2: MMSH - M5
PPM 3.84 3.82 3.80 3.78 3.76 3.74 3.72 3.70 3.68 3.66 3.64 3.62 3.60 3.58 3.56 3.54 3.52 3.50 3.48 3.46 3.44
0
.99
9
0
.98
4
1
.07
6
0
.98
3
3
.75
82
3
.75
19
3
.72
89
3
.72
29
3
.68
19
3
.66
03
3
.64
71
3
.64
09
3
.63
23
3
.62
58
3
.61
05
3
.60
46
3
.56
62
3
.55
13
3
.53
70
3
.52
23
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\1\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.201459 MHz
time domain size: 65536 points
width: 3238.34 Hz = 8.091780 ppm = 0.049413 Hz/pt
number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.199995 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
HO
OH
OHOH
OH
OH
56
Figura 7. Espectro de RMN 13C (100 MHz, D2O) da substância TsFA-1.
Figura 8. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, D2O) de TsFA-1.
SpinWorks 2.2: MMSH - M5
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
7
0.7
32
4
6
9.1
65
2
6
3.1
52
6
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freq. of 0 ppm: 100.630369 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 1.000 GB: 0.0000
SpinWorks 2.2: MMSH - M5
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
7
0.7
32
4
6
9.1
65
2
6
3.1
52
6
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\2\fid expt: <dept135>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 2748
freq. of 0 ppm: 100.630369 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 1.000 GB: 0.0000
HO
OH
OHOH
OH
OH
57
Figura 9. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
7
.27
00
5
.03
85
2
.98
09
2
.96
16
2
.74
60
2
.74
33
2
.74
09
2
.73
90
2
.40
72
2
.40
33
2
.01
12
1
.98
42
1
.72
22
1
.71
46
1
.69
22
1
.49
74
1
.48
32
1
.47
22
1
.44
83
1
.43
93
1
.41
41
1
.39
70
1
.37
41
1
.36
22
1
.35
41
1
.33
07
1
.31
00
1
.28
82
1
.26
96
1
.16
01
1
.14
21
1
.09
77
1
.06
05
1
.01
06
0
.99
30
0
.96
49
0
.88
69
0
.86
82
0
.86
13
0
.83
67
0
.80
79
0
.78
80
0
.75
30
0
.73
82
0
.72
26
0
.70
28
0
.68
62
0
.66
66
0
.65
05
0
.62
81
0
.57
82
0
.55
26
0
.53
77
0
.50
94
0
.48
60
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6\mmsh_02.10.09\1\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.201701 MHz
time domain size: 65536 points
width: 4432.62 Hz = 11.075975 ppm = 0.067636 Hz/pt
number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.200003 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
58
Figura 10. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 0,0 – 2,6).
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4
2
.40
72
2
.01
12
1
.98
42
1
.72
22
1
.71
46
1
.69
22
1
.49
74
1
.44
83
1
.43
93
1
.41
41
1
.39
70
1
.31
00
1
.14
21
1
.09
77
1
.06
05
0
.88
69
0
.78
80
0
.75
30
0
.73
82
0
.72
26
0
.70
28
0
.68
62
0
.66
66
0
.65
05
0
.62
81
0
.57
82
0
.53
77
0
.50
94
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\1\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.201701 MHz
time domain size: 65536 points
width: 4432.62 Hz = 11.075975 ppm = 0.067636 Hz/pt
number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.200003 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
59
Figura 11. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
17
9.4
76
9
13
7.7
91
9
12
4.7
50
3
7
7.8
92
3
77
.32
14
7
7.2
00
4
77
.00
10
7
6.6
80
6
5
4.6
86
0
5
2.1
82
8
4
7.0
19
0
4
6.9
72
1
41
.50
72
4
0.1
12
3
39
.90
41
3
9.6
94
7
39
.48
56
3
9.2
76
6
39
.06
72
3
8.9
97
8
38
.85
86
3
8.5
48
3
38
.33
92
3
8.2
33
3
38
.12
06
3
6.4
08
4
36
.25
75
3
2.4
82
2
31
.35
41
3
0.9
18
6
30
.19
69
2
9.6
32
7
29
.11
92
2
9.0
93
5
28
.79
22
2
7.7
30
0
27
.49
20
2
6.6
65
4
23
.69
47
2
3.0
30
3
2
2.7
15
7
2
2.1
32
3
20
.76
81
1
7.8
04
3
1
6.6
23
1
16
.57
60
1
5.3
35
6
14
.96
66
1
3.6
50
8
file: C:\mmsh_02.10.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 28672
freq. of 0 ppm: 100.630407 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 1.000 GB: 0.0000
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
60
Figura 12. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 60,0).
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 55.0 53.0 51.0 49.0 47.0 45.0 43.0 41.0 39.0 37.0 35.0 33.0 31.0 29.0 27.0 25.0 23.0 21.0 19.0 17.0 15.0 13.0 11.0
5
4.6
85
9
5
2.1
82
8
4
7.0
19
0
46
.97
21
4
1.5
07
2
3
9.9
04
0
3
9.6
94
7
3
9.4
85
5
3
9.2
76
6
3
9.0
67
2
38
.99
77
3
8.8
58
6
38
.54
83
3
8.3
39
2
3
8.2
33
3
38
.12
05
3
6.4
08
4
3
6.2
57
5
3
2.4
82
2
3
1.3
54
1
3
0.9
18
6
3
0.1
96
9
2
9.6
32
6
2
9.1
19
2
29
.09
34
2
8.7
92
2
27
.72
99
2
7.4
91
9
2
6.6
65
3
2
3.6
94
6
2
3.0
30
2
2
2.7
15
6
22
.13
23
2
0.7
68
1
1
7.8
04
3
1
6.6
23
1
1
6.5
75
9
1
5.3
35
6
14
.96
66
1
3.6
50
8
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 28672
freq. of 0 ppm: 100.630407 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
61
Figura 13. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
12
4.7
61
5
7
7.8
81
7
5
4.6
87
8
52
.18
03
4
6.9
69
6
38
.55
06
3
8.3
41
3
38
.12
09
3
6.2
94
8
36
.26
22
3
2.4
81
8
30
.92
80
3
0.2
28
5
30
.19
63
2
9.6
33
0
2
9.1
62
9
29
.13
12
2
9.1
04
3
28
.80
56
2
7.7
64
3
27
.73
61
2
7.5
20
7
27
.48
83
2
6.6
65
9
2
3.6
95
8
23
.06
23
2
3.0
37
2
2
2.7
42
7
2
2.7
12
5
2
0.8
07
1
2
0.7
81
2
1
7.8
05
8
16
.64
78
1
6.5
88
2
15
.38
02
1
5.3
54
7
14
.99
74
1
4.9
73
4
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\3\fid expt: <dept135>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 24576
freq. of 0 ppm: 100.630405 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 1.000 GB: 0.0000
HO
COOH
12
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
17
18
1920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
H
62
Figura 14. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 60,0).
SpinWorks 2.2: MMSH-M4
PPM 57.0 55.0 53.0 51.0 49.0 47.0 45.0 43.0 41.0 39.0 37.0 35.0 33.0 31.0 29.0 27.0 25.0 23.0 21.0 19.0 17.0 15.0 13.0
5
4.6
90
2
5
2.1
83
6
4
6.9
71
3
3
8.5
53
8
3
8.3
44
3
3
8.1
24
3
3
6.2
65
1
3
0.2
00
3
2
9.1
34
8
2
7.7
39
8
2
7.4
92
3
2
6.6
69
7
2
3.6
99
1
2
3.0
39
9
2
2.7
17
0
2
0.7
85
2
1
7.8
10
0
1
6.6
27
0
1
6.5
91
0
1
5.3
55
8
14
.97
63
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\3\fid expt: <dept135>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 24576
freq. of 0 ppm: 100.630405 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
63
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
75
80
85
90
95
100
105
Tra
nsm
itânc
ia%
C m-1
B
Figura 15. Espectro de IV (ATR) de TsFC-2.
COOH
COOH
1
2
34
56
7
89
10
1112
13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26
OO
OH
HO
HO
HO
1'
2'3'4'
5'6'
64
Figura 16. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0
7
.32
04
7
.27
20
5
.31
63
4
.42
43
4
.01
98
4
.00
04
3
.91
85
3
.90
88
3
.90
47
3
.89
43
3
.81
25
3
.79
46
3
.77
65
3
.75
98
3
.54
34
3
.53
66
3
.51
34
3
.50
70
3
.43
57
3
.42
36
3
.40
58
3
.39
38
3
.16
20
3
.06
25
1
.95
11
1
.92
87
1
.88
03
1
.73
41
1
.72
50
1
.38
16
1
.37
44
1
.34
87
1
.34
24
0
.94
85
0
.69
36
0
.63
73
0
.58
41
0
.56
36
0
.50
90
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.202471 MHz
time domain size: 65536 points
width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt
number of scans: 64
freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
COOH
COOH
1
2
34
56
7
89
10
1112
13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26
OO
OH
HO
HO
HO
1'
2'3'4'
5'6'
65
Figura 17. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 3,36 - 4,16).
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 4.16 4.12 4.08 4.04 4.00 3.96 3.92 3.88 3.84 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36
4
.01
98
4
.00
04
3
.91
85
3
.90
88
3
.90
47
3
.89
43
3
.81
25
3
.79
46
3
.77
65
3
.75
98
3
.54
34
3
.53
66
3
.51
34
3
.50
70
3
.43
57
3
.42
36
3
.40
58
3
.39
38
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.202471 MHz
time domain size: 65536 points
width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt
number of scans: 64
freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
66
Figura 18. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 0,30 – 1,00).
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 0.96 0.92 0.88 0.84 0.80 0.76 0.72 0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36
0
.94
85
0
.69
36
0
.63
73
0
.58
41
0
.56
36
0
.50
90
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.202471 MHz
time domain size: 65536 points
width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt
number of scans: 64
freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
67
Figura 19. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
17
9.8
93
2
17
7.2
91
3
13
1.6
14
8
12
8.4
71
6
10
4.5
37
2
8
9.0
75
2
78
.01
34
7
7.9
78
7
7
7.3
84
0
7
7.3
06
5
7
7.2
69
2
7
7.1
15
8
76
.98
76
7
6.7
95
5
76
.47
33
7
5.9
16
8
75
.13
98
7
3.4
06
2
7
1.2
07
1
69
.43
98
6
0.9
31
8
5
5.2
00
5
54
.70
30
5
3.2
92
9
4
8.5
46
7
48
.33
21
4
8.2
23
2
48
.11
82
4
7.9
04
9
47
.69
19
4
7.5
25
7
47
.47
80
4
7.2
64
8
47
.05
18
4
5.9
62
1
3
8.6
60
6
38
.22
18
3
8.1
59
9
3
7.8
91
8
36
.28
29
3
5.9
63
6
3
5.8
67
4
3
5.6
27
4
2
8.8
34
4
2
6.8
05
0
25
.15
47
2
1.9
57
4
20
.01
39
1
8.0
57
4
17
.37
23
1
6.4
51
7
1
5.4
75
3
1
5.4
02
6
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 25388
freq. of 0 ppm: 100.630833 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
COOH
COOH
1
2
34
56
7
89
10
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13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26
OO
OH
HO
HO
HO
1'
2'3'4'
5'6'
68
Figura 20. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0
7
8.0
13
4
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.97
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7
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84
0
77
.30
65
7
7.2
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7
6.9
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76
.79
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5
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4
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3
8.6
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6
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8.2
21
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3
8.1
59
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3
7.8
91
8
3
6.2
82
9
3
5.9
63
6
3
5.8
67
4
3
5.6
27
4
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8.8
34
4
2
6.8
05
0
2
5.1
54
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2
1.9
57
4
2
0.0
13
9
1
8.0
57
4
1
7.3
72
3
1
6.4
51
7
1
5.4
75
3
1
5.4
02
6
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 25388
freq. of 0 ppm: 100.630833 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
69
Figura 21. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 -20.0
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0.4
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.91
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5.5
42
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75
.15
26
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4.9
53
8
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.54
50
7
3.4
71
7
73
.39
71
7
2.8
52
8
71
.19
77
6
9.4
16
2
69
.14
71
6
7.4
77
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67
.14
97
6
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97
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29
2
54
.69
59
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3.2
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4
51
.60
57
4
8.9
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2
48
.51
70
4
7.9
47
0
47
.73
42
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7.5
22
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45
.94
92
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5.4
06
1
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2.3
01
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8.2
17
1
37
.99
39
3
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1
36
.27
23
3
5.9
57
5
35
.61
68
3
1.1
19
8
29
.63
68
2
9.5
85
9
29
.25
20
2
8.8
28
8
28
.78
80
2
8.6
74
1
28
.54
34
2
8.1
46
8
26
.92
71
2
6.7
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25
.14
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2
4.4
66
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23
.84
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3.6
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5
22
.93
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2.1
46
0
21
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20
.00
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.34
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1
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15
.39
06
1
5.3
17
7
1
3.0
05
3
9
.92
26
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros18.09.09\M10\mmsh_14.08.09\4\fid expt: <dept135>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 22278
freq. of 0 ppm: 100.630835 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
COOH
COOH
1
2
34
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89
10
1112
13
24 23
27
28
29
30
18
1920
21
1415
16
17
22
25 26
OO
OH
HO
HO
HO
1'
2'3'4'
5'6'
70
Figura 22. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).
SpinWorks 2.2: MMSH M10
PPM 74.0 70.0 66.0 62.0 58.0 54.0 50.0 46.0 42.0 38.0 34.0 30.0 26.0 22.0 18.0 14.0 10.0
7
7.0
04
3
7
5.9
17
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9.4
16
2
6
0.8
97
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5
4.6
95
9
5
3.2
85
4
4
8.5
17
0
4
5.9
49
2
3
8.2
17
1
37
.88
21
3
6.2
72
3
35
.95
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3
5.6
16
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2
9.2
52
0
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28
8
28
.78
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2
6.7
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2
5.1
43
9
24
.46
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2
3.8
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21
.84
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2
0.0
01
2
1
8.0
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17
.36
33
1
6.4
39
2
1
5.4
56
3
15
.39
06
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\4\fid expt: <dept135>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 22278
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70
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80
85
90
95
100
105
Tra
nsm
itânc
ia %
cm-1
B
Figura 23. Espectro de IV (ATR) de TsFC-1.
72
Figura 24. Espectro de RMN 1H (400 MHz, C5D5N) de TsFC-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M9
PPM 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
8
.69
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55
7
.23
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7
.19
47
3
.58
17
2
.03
79
2
.03
38
1
.98
72
1
.98
31
1
.47
36
1
.32
01
1
.27
16
1
.23
31
1
.21
03
1
.03
24
1
.00
77
0
.94
21
0
.86
47
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\mmsh_22.10.09\1\fid expt: <zg30>
transmitter freq.: 400.202471 MHz
time domain size: 65536 points
width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt
number of scans: 64
freq. of 0 ppm: 400.200597 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 1.000 GB: 0.0000
73
Figura 25. Espectro de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M9
PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0
20
6.1
53
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0.5
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15
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.99
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13
6.0
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5.9
14
1
13
5.7
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13
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35
.51
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12
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9 1
24
.88
89
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23
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23
.28
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23
.23
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3.2
04
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23
.17
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29
0
7
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.18
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4
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39
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4
0.1
00
6
39
.63
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9.5
46
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15
0
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.59
85
3
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16
1
35
.33
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3
4.7
93
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3
2.2
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4
31
.53
40
3
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3
30
.61
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3
0.6
02
9
30
.48
65
3
0.1
43
5
30
.07
53
3
0.0
02
9
29
.99
42
2
9.9
51
6
29
.92
13
2
9.7
68
6
2
8.9
60
1
2
8.8
21
5
28
.23
52
2
5.0
49
5
24
.05
85
2
3.7
70
1
2
3.0
96
9
2
1.5
73
2
1
7.6
78
4
1
7.6
05
3
1
6.7
42
1
15
.82
42
1
4.4
44
1
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M9\Piridina\mmsh_22.10.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 6144
freq. of 0 ppm: 100.630481 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
74
Figura 26. Espectro de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).
SpinWorks 2.2: MMSH-M9
PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0 8.0
7
8.2
84
4
5
5.9
61
1
4
8.1
99
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48
.18
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4
2.6
39
4
4
0.1
00
6
39
.63
40
3
9.5
46
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39
.52
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3
9.2
15
0
3
7.5
98
5
37
.41
61
3
5.3
37
1
34
.79
38
3
2.2
75
4
31
.53
40
3
0.6
69
3
30
.61
83
3
0.6
02
9
30
.48
65
3
0.1
43
5
30
.07
53
3
0.0
02
9
29
.99
42
2
9.9
51
6
2
9.9
21
3
2
9.7
68
6
2
8.9
60
1
28
.82
15
2
8.2
35
2
25
.04
95
2
4.0
58
5
23
.77
01
2
3.0
96
9
21
.57
32
1
7.6
78
4
17
.60
53
1
6.7
42
1
15
.82
42
1
4.4
44
1
file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M9\Piridina\mmsh_22.10.09\2\fid expt: <zgpg30>
transmitter freq.: 100.640433 MHz
time domain size: 65536 points
width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt
number of scans: 6144
freq. of 0 ppm: 100.630481 MHz
processed size: 32768 complex points
LB: 0.000 GB: 0.0000
75
Figura 27. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.
SpinWorks 2.2: MMSH-M9
PPM 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0
15
0.3
93
8
13
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9
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12
5.2
80
7 1
24
.94
44
12
4.0
59
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11
9.8
72
4
7
8.3
26
8
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53
.72
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1
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7
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.32
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04
1
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.57
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3
0.7
65
6
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0.7
47
7
30
.71
90
3
0.5
26
1
3
0.4
73
1
30
.43
94
3
0.3
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7
30
.33
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0.2
98
4
30
.27
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3
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0
30
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0.1
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30
.12
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0.0
56
2
2
9.8
18
6
2
8.2
73
5
23
.14
37
1
7.6
47
4
15
.86
55
1
4.4
91
6
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76
Figura 28. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).
SpinWorks 2.2: MMSH-M9
PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0
7
8.3
26
8
5
5.9
97
2
5
3.7
26
8
4
8.2
22
1
3
9.6
70
6
3
9.5
91
7
3
2.3
22
2
3
1.6
04
1
3
1.5
74
7
31
.53
36
3
0.7
65
6
30
.74
77
3
0.7
19
0
3
0.5
26
1
30
.47
31
3
0.4
39
4
3
0.3
65
7
30
.33
99
3
0.2
98
4
3
0.2
73
4
30
.25
30
3
0.2
39
6
30
.18
37
3
0.1
23
4
30
.05
62
2
9.8
18
6
2
8.2
73
5
2
3.1
43
7
1
7.6
47
4
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5.8
65
5
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4.4
91
6
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