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MARIA APARECIDA SOARES MURÇA
CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS RÁPIDO E TRADICIONAL DE DISCO-DIFUSÃO NA AVALIAÇÃO DE
SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS DE HEMOCULTURAS DA SANTA CASA DE SÃO PAULO
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde
São Paulo
2007
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
MARIA APARECIDA SOARES MURÇA
CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS RÁPIDO E
TRADICIONAL DE DISCO-DIFUSÃO NA AVALIAÇÃO DE SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS DE HEMOCULTURAS
DA SANTA CASA DE SÃO PAULO
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientadora:
Profa. Dra. Lycia Mara Jenné Mimica
Co-orientadora: Profa. Dra. Suely Mitoi Ykko Ueda
São Paulo
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Murça, Maria Aparecida Soares Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemocultura do Hospital Central da Santa Casa de São Paulo./ Maria Aparecida Soares Murça. São Paulo, 2007.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Lycia Mara Jenne Mimica Co-Orientador: Suely Mitoi Ykko Ueda 1. Resistência bacteriana a drogas 2. Coleta de amostras
sangüíneas/normas 3. Técnicas bacteriológicas 4. Testes de sensibilidade microbiana 5. Sangue/microbiologia
BC-FCMSCSP/34-07
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
MURÇA MAS
DEDICATÓRIA
À minha mãe, Milda Soares Murça, por seu amor, compreensão e,
sobretudo pelo incentivo e apoio que me fortalecem e tornam tudo possível.
Ao meu pai, Geraldo Rocha Murça, in memoriam, pelo exemplo e
determinação.
Aos meus filhos: Carolina Murça e Gabriel Murça, companheiros fiéis e
inseparáveis, especialmente nos momentos de solidão.
A vocês, todo o meu amor e carinho!!!!
Aos meus irmãos, cunhados e sobrinhos por acreditarem em mim.
A Carlos Roberto Ribeiro, pelo amor, compreensão, paciência e incentivo a
cada dia.
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MURÇA MAS
AGRADECIMENTOS
Á Deus, por sua inspiração.
À Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo e Irmandade da Santa de Misericórdia de São Paulo, pelo auxílio na minha
formação.
À Profa. Dra. Lycia Mara Jenné Mimica, pela acolhida, dedicação, paciência
e oportunidades proporcionadas no decorrer deste trabalho.
À co-orientadora Profa. Dra. Suely Mitoi Ykko Ueda, pelo estímulo e auxílio
criterioso na execução de todas as etapas deste estudo.
Ao Prof. Dr. Igor Mimica Mimica, pelo apoio e conhecimento compartilhado
ao longo deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Waldemar Francisco, pelo carinho e apoio inestimável no
direcionamento e finalização deste estudo.
À Profª. Dra. Marinês Dalla Valle Martino, pelo convívio instrutivo,
cooperação e apoio em tantas situações.
Ao amigo Dr. Thiago Zinsly Sampaio Camargo pela colaboração e auxílio
imediato nos momentos de dificuldade.
Ao Mestre Dr. Bezerra de Menezes, pelo exemplo de dedicação, resignação
e perseverança.
À Profª. Dra. Rozane de Lima B. Carvalho, por sua amizade e presteza ao
longo desta jornada.
Ao Dr. Wilmar Silvino que, gentilmente, cedeu parte do seu tempo para que
este estudo pudesse ser realizado.
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
MURÇA MAS
Aos Prof. Drs. Carmem Lúcia Penteado Lancellotti e Flávio Alterthum,
da banca examinadora de qualificação, pela atenção e apoio.
À Cely Barreto da Silva, minha profunda gratidão pelo entusiasmo,
dedicação e disponibilidade. Sua valiosa colaboração foi imprescindível para a
realização deste estudo.
À Srta. Sadia Mustafá Hussein, pela atenção e auxílio na pesquisa
bibliográfica.
À Secretária Geral do Curso de Pós-Graduação: Rita de Cássia Santos Oliveira e Mirtes Dias Souza, Curso de Ciências da Saúde, e Celina Casagrande Federico, pela atenção e informações oferecidas.
Aos estagiários do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo e do Serviço de Controle de Infecção
Hospitalar da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo: Dálete Paulini Repker, Denise Yamamoto, Elaine Barros Ingrid Petschulat, Juliana Ferraz Rosa, Roberta Canuto do Rego Monteiro, Samira Geraldo, Vanessa da Silva, meus sinceros agradecimentos no apoio para realizar este estudo.
À equipe de enfermagem do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo: Adenilde Andrade, Hiroko Sato Pizzo, Maria Helena Nogueira, Mirian Varanda, Tereza Carboni, Valéria Cândido e Verônica O.S. Brito, pelo apoio com que sempre contei.
Aos queridos colegas do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e do Serviço de Controle de
Infecção Hospitalar da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo:
Alessandra Navarini, Carlos José dos Santos, Carlos Henrique Santana, Fátima Aparecida Silva Pinto, Maria Aparecida Silva Gennari, Maura Aparecida Lopes Miranda, Ronaldo de Souza Campos e Susethe Matiko Sassagawa, pela
inestimável contribuição na realização deste estudo, meu especial agradecimento.
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
MURÇA MAS
À Maria Aparecida Paschoallotti, pelo incentivo e apoio.
A Ting Hui Ching, pela orientação nos dados estatísticos.
À Probac do Brasil, pelo fornecimento de insumos utilizados neste estudo.
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MURÇA MAS
LISTAS DE SÍMBOLOS % - porcentagem oC - graus Celsius β - Beta
LISTAS DE ABREVIAÇÕES ATCC – American Type Culture Collection BA - Bact/Alert
BaCl2 - Cloreto de Bário
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
CO2 - Dióxido de Carbono
H2SO4 - Ácido Sulfúrico
HT - Hemobac Trifásico
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
PCR - Reação de Polimerase em Cadeia
SCIH - Serviço de Controle de Infecção Hospitalar
SPS - Polianetol-sulfonato de Sódio
TBS - Tryptic soy Broth
UFC - Unidade Formadora de Colônias
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MURÇA MAS
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Revisão da literatura 04
1.1.1. Hemocultura 04
1.1.1.1. Indicação do exame 05
1.1.1.2. Incubação e avaliação das hemocultuas 06
1.1.1.3. Sistema Hemobac Trifásico 07
1.1.2. Teste de susceptibilidade 09
1.1.2.1.Técnica de difusão em meio sólido ou método de disco-difusão ou técnica de Kirby-Bauer
12
1.1.2.2. Resistência aos antibióticos 13
1.1.3. Teste de susceptibilidade rápido 14
2. OBJETIVOS 18
3. CASUÍSTICA E MÉTODO 20
3.1. Identificação da positividade das hemoculturas 21
3.2. Bacterioscopia a partir da coloração de Gram das colônias isoladas 21
3.3. Antibiograma 22
3.4. Análise Estatística 24
4. RESULTADOS 27
4.1. Staphylococcus spp 28
4.2. Enterococcus spp 29
4.3. Enterobactérias 29
4.4. Bacilos Gram Negativos não fermentadores de glicose 30
5. DISCUSSÃO 34
6. CONCLUSÃO 37
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39
RESUMO 44
ABSTRACT 46
APÊNDICE 48
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
Murça MAS.
1. INTRODUÇÃO
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Murça MAS
2
Prioriza-se, cada vez mais, a relação eficácia/tempo, nos Laboratórios de
Microbiologia; isto é, durante a rotina laboratorial, todas as etapas do método são
analisadas, visando à resultados reportados. Portanto, é inevitável a busca por
métodos rápidos, que se mostrem eficazes no diagnóstico e na avaliação de
sensibilidade.
Cada método deve ser considerado de acordo com a condição do paciente e
dos agentes etiológicos potenciais. Dependendo do tipo de microrganismo
envolvido, a liberação de resultados em um tempo menor do que o habitual pode
determinar importante diferença na evolução do paciente, justamente pela indicação
terapêutica precoce.
Em virtude disto, são evidenciados vários métodos capazes de detectar uma
imensa variedade de microrganismos: há bases diagnósticas que possibilitam a
detecção dos mesmos a partir de antígenos tóxicos e não-tóxicos, enzimas,
produção de substratos coloridos e podemos optar pela biologia molecular, que
utiliza sondas genéticas na reação de polimerase em cadeia (PCR). Apesar dos
novos métodos, muitas vezes os procedimentos tradicionais ainda são utilizados, em
razão de seu custo menor.
Um importante processo de detecção de microrganismos muito utilizado, sem
dúvida nenhuma, é a microscopia direta a partir da amostra clínica. A bacterioscopia
pode proporcionar resultados preliminares satisfatórios em determinados casos,
como: Streptococcus pneumoniae ou Neisseria meningitidis, observados em
amostras de líquor, Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de secreção uretral,
Clostridium sp em materiais sugestivos de infecção por anaeróbios. As bactérias de
exemplos como estes são facilmente detectadas pela morfologia e coloração
específicas, assim como a pesquisa por microscopia de outros microrganismos
fastidiosos: Mycobacterium tuberculosis e outras micobactérias, como
Mycobacterium leprae a partir da coloração de Ziehl-Neelsen (Isenberg, 1998).
Outro exemplo prático de utilização do método rápido é para o diagnóstico de
infecções urinárias, principalmente quando se refere ao principal agente causador, a
Escherichia coli (Johnson et al, 1995). Na utilização de alguns laminocultivos, foi
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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observado que a leitura precoce, após 6-8 horas de incubação, tem relação de 100%
com a tradicional incubação de 24 horas ou overnight (Martino, 1998). O teste de
sensibilidade também pode ser realizado diretamente da amostra da urina, com boa
relação com o método padronizado, ou seja, realização do antibiograma antes
mesmo da verificação do crescimento das possíveis colônias e da preparação do
inóculo (Oakes et al, 1994).
Atualmente, dispõe-se de inúmeros métodos rápidos em bacteriologia, porém
há alguns mais dispendiosos, como a citometria de fluxo, que é uma técnica de
medição das propriedades óticas das células individuais, ou de partículas em geral,
em fluxo contínuo, uma de cada vez, seqüencialmente, em frente de um feixe de
laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz (Sprules et al,
1992). Esta técnica não é somente utilizada para diagnósticos de infecções do trato
urinário, mas tem sido empregada também em testes de sensibilidade para alguns
antimicrobianos (Álvarez-Barrientos et al, 2000).
A presença de microrganismos no sangue de um paciente é um evento de
grande importância diagnóstica e prognóstica. Quando há isolamento de um agente
clinicamente importante nas hemoculturas, não é somente a causa infecciosa para a
doença do paciente que fica estabelecida, mas o agente torna-se disponível para o
teste de susceptibilidade ao antimicrobiano e otimização terapêutica. A necessidade
de identificação do agente etiológico de septicemia resulta em um direcionamento
adequado dos recursos aplicados na qualidade dos laboratórios (Baron, 2005).
Infecção de corrente sanguínea é causa importante de morbidade e
mortalidade; quando se tabulam hemoculturas positivas, sem distinção da síndrome
infecciosa em questão, ocorrem altas taxas de mortalidade, variando de 5% a 40%
(Koneman et al, 2001; Diekema et al, 2004).
A indicação de antibioticoterapia precoce tem demonstrado melhoria no
prognóstico desta infecção. A detecção imediata da infecção da corrente sanguínea,
com identificação microbiana e teste de susceptibilidade exato, assim como a
informação ágil e precisa dos resultados são importantes para a segurança do
paciente (Diekema et al, 2004).
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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1.1. Revisão da Literatura
1.1.1. Hemocultura Hemocultura é a cultura realizada a partir da amostra proveniente da corrente
circulatória de um paciente, viabilizando o diagnóstico de bacteriemia (presença de
microrganismos na corrente circulatória) e septicemia (disseminação de
microrganismos pela corrente circulatória), com os objetivos de diagnosticar o
agente etiológico, minimizar a antibioticoterapia e detectar bactérias resistentes
(Fréjaville, Kamoun, 1989).
A entrada direta de bactérias e fungos na corrente sanguínea ocorre com
infecções intravasculares, como endocardite infecciosa, fístula arteriovenosa
infectada, aneurismas micóticos, tromboflebite supurativa e colonização de implantes
vasculares (cateter venoso central e periférico, linhas arteriais, ports subcutâneos e
enxertos vasculares, caracterizando bacteriemia e fungemia (Baron, 2005).
O padrão clínico da infecção de corrente sanguínea pode ser transitório,
intermitente ou contínuo. A bacteriemia transitória é a mais comum e ocorre após a
manipulação de tecidos infectados (por exemplo, abscesso, furúnculo e celulite),
instrumentação da superfície de mucosas contaminadas (procedimentos
odontológicos, manipulações urológicas como cistoscopia, dilatação uretral e
cateterização urinária; e procedimentos endoscópicos gastrintestinais superiores e
inferiores), cirurgia envolvendo áreas contaminadas (ressecção transuretral da
próstata, histerectomia vaginal e debridamento de queimaduras infectadas). A
intermitente é freqüentemente associada a abscessos não drenados intra-
abdominais, pélvicos, perianais, hepáticos, prostáticos, entre outros, observando que
os abscessos são causa comum da febre de origem desconhecida, enquanto a
bacteriemia contínua é um aspecto fundamental das infecções intravasculares,
notavelmente, endocardites infecciosas agudas e subagudas (Baron, 2005).
O sangue deve ser colhido antes da administração de terapia antimicrobiana
sistêmica em qualquer paciente que tenha febre (>38°C) ou hipotermia (<36ºC),
leucocitose (principalmente se houver desvio à esquerda), granulocitopenia absoluta
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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ou uma das combinações acima (Fréjaville, Kamoun, 1989; Baron, 2005). A
positividade decai quando a coleta é realizada no pico febril e nunca deve ser
realizada após este pico, pois a probabilidade de isolamento do agente é quase
nula.
O volume colhido é critico e a mais importante variável individual na
recuperação dos microrganismos de pacientes com infecção da corrente sanguínea,
devendo ser obtido por meio de condições assépticas. A relação direta entre o
resultado diagnóstico da hemocultura e o volume de sangue foi demonstrada em
diversos estudos, comparando os métodos manuais e os semi-automatizados, pois
quando o volume aumentou de 10mL para 20mL, o resultado da cultura positiva
aumentou ao redor de 30%-50% (Baron, 2005). Baseados em dados avaliáveis, a
recomendação do volume de sangue para adulto, por cultura, é de 20 mL-30 mL;
para pacientes pediátricos, o sugerido é de 1mL-5 mL e, em recém-nascidos de
baixo peso e prematuros, o volume possível, pois pode ser impraticável obter o
volume recomendado. O número de frascos varia de 2-4 para uma ótima detecção
da bacteriemia e fungemia, salientando a eventual necessidade do aumento deste
número, quando o paciente recebe terapia antimicrobiana de amplo espectro.
Normalmente o intervalo recomendado entre as amostras é de 30-60 minutos,
exceto em pacientes criticamente sépticos, cujas amostras devem ser obtidas
rapidamente, antes do início da terapia antimicrobiana (Baron, 2005).
Seguindo as técnicas e métodos recomendados, pratica-se o “estado da arte”
para o processamento da hemocultura; entretanto, não há padrão-ouro para o
diagnóstico das infecções da corrente sanguínea (Baron, 2005).
1.1.1.1. Indicações do exame
É um procedimento diagnóstico recomendado em enfermidades febris agudas
graves, em que é indicada a antibioticoterapia empírica de início imediato, ou ainda
em pacientes com doenças infecciosas (osteomielite, artrite supurativa) que serão
submetidos a cirurgias de urgência, com febre de origem desconhecida e
endocardite infecciosa aguda e subaguda (Koneman et al, 2001).
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1.1.1.2. Incubação e avaliação das hemoculturas Existem vários sistemas utilizados para o processamento laboratorial
das hemoculturas: sistemas não automatizados ou manuais, semi-automatizados e
automatizados. Nos sistemas automatizados, a positividade das amostras pode ser
obtida por instrumentos que indicam multiplicação bacteriana no frasco onde a
amostra foi incluída (Munson et al, 2003; Paz Oplustil et al, 2004). Nos sistemas não
automatizados, são realizadas subculturas periódicas para a detecção de
microrganismos. As hemoculturas são avaliadas por um período que varia de 5 a
7dias, e liberadas como negativas logo após. Estudos recentes têm mostrado que a
liberação de resultados positivos de hemoculturas de forma precoce e por telefone
tem influenciado a terapêutica antimicrobiana e o resultado final do tratamento
(Munson et al, 2003).
1.1.1.3. Sistema Hemobac Trifásico®
O Hemobac Trifásico® (Probac do Brasil) (Fig. 1) é um sistema destinado à
realização de hemocultura. O sistema é composto por um laminocultivo com três
faces acoplado à parte superior de um recipiente plástico, contendo um caldo
suplementado com extrato de levedura e polianetol-sulfonato de sódio (SPS). As
faces do laminocultivo são: Agar Chocolate, Agar Sabouraud, Agar MacConkey e
Indicador de CO2, que detecta o crescimento de bactérias e fungos.
Figura 1: Hemobac Trifásico Pediátrico (Probac do Brasil, 2005a).
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O caldo suplementado (Fase 1) promove o crescimento de microrganismos,
devido à riqueza de nutrientes. O SPS (polianetol sulfonato de sódio) possui efeito
anticoagulante, favorece o cultivo à ação anticomplementar, antifagocitária e
inibitória da atividade antimicrobiana dos aminoglicosídeos e outras drogas que
podem estar presentes no sangue (Fig. 2 e Fig. 3).
Os meios de cultura sólidos (Agar Chocolate, Agar MacConkey e Agar
Sabouraud - Fase 2) permitem o crescimento das bactérias fastidiosas, isolamento
dos bacilos Gram-negativos e fungos, respectivamente, que são agentes produtores
de bacteriemia e fungemia (Fig. 2, Fig. 3). Indicador de CO2 (Fase 3), a viragem da
cor para rosa ocorre pela presença de CO2, produzido pelo microrganismo (Fig. 3).
Figura 2: Hemobac Trifásico Adulto: caldo e vista da lâmina dividida (Agar Sabouraud e Agar McConkey).
Figura 3: Hemobac Trifásico Adulto: caldo e vista da lâmina, face larga (Agar Chocolate e Indicador de CO2).
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Os frascos devem ser incubados por 5-7 dias a 35°C ± 2° C, observando
diariamente o aparecimento de colônias e/ou mudança do indicador. Quando
utilizada a estufa para Hemobac Trifásico® (Probac do Brasil, 2005a), que possui
agitação constante e inversão programada para semeadura no laminocultivo, o
procedimento é considerado automatizado e o resultado é analisado em até cinco
dias (Paz Oplustil et al, 2004).
As leituras são realizadas, no mínimo, duas vezes ao dia, e são interpretadas
conforme abaixo:
• Ausência de crescimento ou de alteração do indicador após o período
de incubação proposto: reportar como negativo após o período de leitura (período de
incubação mínimo: cinco dias).
• Presença de crescimento bacteriano nos meios sólidos: abrir o frasco
superior, desrosqueando a tampa com a lâmina, e proceder à identificação das
colônias presentes, trabalhando de forma a assegurar a assepsia do procedimento.
• Mudança da cor do indicador durante o período de incubação: a
presença da coloração rosa forte ou vermelho indica que há crescimento bacteriano
na amostra (alguns microrganismos pouco produtores de CO2 podem apresentar
crescimento no meio sólido, sem mudança no indicador). Se houver variação na cor
do indicador, sem a formação de colônias nos meios sólidos, fazer esfregaço a partir
do meio líquido. Algumas bactérias metabolicamente deficientes podem crescer em
meios líquidos e não nos meios sólidos. Neste caso pode ser observada a mudança
da cor do indicador, sem o aparecimento de colônias no meio sólido.
Trabalho comparativo entre o sistema Hemobac Trifásico (HT) (Probac do
Brasil, 2005a) e o BacT/Alert FAN (BA) (bioMérieux, França) mostrou positividade de
20,20%(n=39) nos frascos BA e 20,72%(n=40) nos frascos HT. As médias para
positividade do indicador de CO2 foram de 27,2h BA e 30,8h HT (p=0,8); para
disponibilidade de colônias viáveis foram de 40,26h BA e 31,78h HT (p<0,05) e o
tempo total decorrido até a liberação da identificação e do teste de susceptibilidade
foi de 56,51h BA e 48,60h HT. Foram isolados: S.aureus (n=20), E.cloacae (n=5),
K.pneumoniae (n=4), P.fluorecens (n=3), C.albicans (n=3), S.marcescens (n=2),
S.pneumoniae (n=1), E.coli (n=1) e K.oxytoca (n=1). Os autores concluíram que os
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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9
sistemas analisados apresentam desempenhos semelhantes, em que o Hemobac
Trifásico demonstra disponibilizar precocemente colônias viáveis para a rotina
microbiológica e torna-se alternativa efetiva no diagnóstico microbiológico em
relação ao BacT/Alert, com a vantagem do custo e da produção nacional, além de
menor processamento laboratorial em relação aos métodos manuais, mantendo boa
correlação custo-efetividade para laboratórios que processam diferentes
quantidades de hemoculturas (Garcez Júnior, Martins, 2003).
Kusano et al, 2005, em outro trabalho comparativo entre o sistema Hemobac
Trifásico (Probac do Brasil, 2005a) e o BacT/Alert FAN (bioMérieux, França), com
amostras de hemoculturas provenientes de pacientes de terapia intensiva,
encontraram positividade de 16,3% (n=7), concordância de 100% entre os sistemas,
e concluíram que os sistemas analisados apresentam desempenhos semelhantes. O
BacT/Alert FAN mostra indicar positividade de CO2 precoce e automaticamente para
a posterior semeadura em meios sólidos, enquanto o Hemobac Trifásico mostra
disponibilizar precocemente colônias viáveis para a rotina microbiológica,
necessitando de leitura diária dos frascos em busca de positividade.
1.1.2. Teste de susceptibilidade
O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos ou antibiograma é
habitualmente realizado pela imensa maioria dos laboratórios a partir do método
qualitativo, descrito por Bauer et al, (1966): o método de disco-difusão, que consiste
em testar antimicrobianos impregnados em discos de papel filtro, numa
concentração determinada para cada droga (Fig. 4), é considerado prático, de fácil
execução e idealizado para bactérias de crescimento rápido (Jorgensen, 1997;
Jorgensen, Ferraro, 1998).
Usando o teste de susceptibilidade em disco, a resistência antimicrobiana é
detectada pelo crescimento bacteriano ao seu redor, na placa previamente semeada
com o inóculo do microrganismo em questão (Acar, Goldstein, 1996).
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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Figura 4: Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de Kirby-Bauer
(Disco-difusão).
Estes discos, contendo uma concentração conhecida do agente
antimicrobiano, são colocados na superfície de uma placa de ágar Mueller-Hinton
recém inoculada com a bactéria a ser testada, onde o antimicrobiano começa
imediatamente a difundir-se e estabelecer um gradiente de concentração ao redor
do disco de papel filtro (Fig. 4). A maior concentração é obtida proximamente ao
disco. Após incubação, a bactéria cresce na superfície da placa, exceto onde o
gradiente de concentração atingido pelo antibiótico ao redor do disco foi suficiente
para inibir seu crescimento. Após incubação, o diâmetro da zona de inibição é
medida ao redor de cada disco, sendo este procedimento relatado em milímetros
(mm) (Acar, Goldstein, 1996).
Neste método, os reagentes são relativamente econômicos, não há
necessidade de equipamentos especiais, além de apresentar grande flexibilidade na
escolha do número e tipo de antimicrobianos a serem testados (Jorgensen, 1997;
Jorgensen, Ferraro, 1998).
No caso da metodologia de Kirby-Bauer, alguns laboratórios de microbiologia,
utilizando método de disco difusão, usam como rotina de 3 a 10 unidades
formadoras de colônias (UFC) suspendidas em 4 mL de meio de cultura líquido, que
é incubado por 2 a 5 horas, esperando o aumento bacteriano moderado, ou seja, o
inóculo pertinente a uma turbidez apropriada. Posteriormente, este é diluído em
água ou solução salina, observando uma densidade equivalente a 0,5 mL de BaCl2
Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo
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a 1%, adicionada a 99,5 mL de H2SO4 a 1% (Hong et al, 1996). A partir disto, em
uma placa de Petri de 15 cm, com meio Agar Mueller-Hinton de espessura de
aproximadamente 5 mm a 6 mm, com o auxílio de um swab, este inóculo será
semeado em três direções, onde devem ser imediatamente acomodados nove
discos contendo antimicrobianos, com distância de 3 cm, aproximadamente. Após
uma incubação de 24 horas, devem ser medidos os diâmetros dos halos de inibição
e interpretados de acordo com padrões estabelecidos para cada antimicrobiano
(Bauer et al, 1966).
Outros estudos descrevem uma variante do método de Kirby-Bauer, cujas
amostras são provenientes de hemoculturas positivas, com posterior inóculo de
acordo com a escala de 0,5 de McFarland, semeado em placas de Muller Hinton; o
período de incubação, em estufa a 35o C, consiste em 4, 6 e 24 horas. Os resultados
que apresentaram maiores discrepâncias foram, respectivamente, 3,5%, 0,6% e
0,7% em cepas de microrganismos Gram-negativos (Coyle et al, 1984).
A indicação de uma terapia antimicrobiana exige pesquisa de susceptibilidade
aos antibióticos pelas bactérias presumivelmente responsáveis pelas infecções.
Estas deverão ser previamente obtidas em cultura pura e identificadas. Para ganhar
tempo, é sempre recomendável iniciar o teste de sensibilidade assim que se esteja
orientado pela morfologia e afinidades tintoriais da cepa isolada (Fréjaville, Kamoun,
1989).
Para uma dada espécie bacteriana, é possível, em certa medida, prever que
um determinado número de agentes antimicrobianos atuará eficazmente. Todavia,
dentro da mesma espécie, diferentes cepas podem apresentar resistência a outros
agentes, resistência essa que não cessa de evoluir, tornando indispensável o estudo
da sensibilidade in vitro (Fréjaville, Kamoun, 1989).
Sendo conhecida a natureza do agente infeccioso, os clínicos dispõem de
uma gama de exames, muitos de execução trabalhosa, para prescrever o
antimicrobiano, levando em consideração a etiologia e a gravidade da infecção
(Fréjaville, Kamoun, 1989).
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1.1.2.1. Técnica de difusão em meio sólido ou método de disco-difusão ou técnica de Kirby-Bauer
Na prática, o antibiograma é realizado por técnica de difusão em meio com
ágar, a partir de uma fonte antibiótica: alguns discos de papel-filtro impregnados com
diferentes antibióticos são colocados sobre a superfície de uma placa de Petri com
Agar Mueller Hinton semeada com a bactéria em cultura pura. Quando o antibiótico
é inibidor, forma-se um halo sem crescimento bacteriano em torno do disco,
tornando-se zona de inibição, e cujo diâmetro é medido (Bauer, 1966). Essa técnica,
baseada na possibilidade de difusão do antibiótico em meio de ágar, é menos
utilizável para os antibióticos de difusão reduzida (Fréjaville, Kamoun, 1989).
Nem por meio dessa técnica, nem pelas que serão descritas a seguir, procura-
se reproduzir um meio biológico tal como pode existir no homem, mas trabalha-se
em condições artificiais e reprodutíveis que permitem, como demonstra a
experiência, uma extrapolação dos resultados in vitro e sua aplicação in vivo. Essas
condições foram codificadas por Ericsson, Sherris (1971) e devem ser respeitadas
por todos os laboratórios. Elas dizem respeito, principalmente: ao tempo de
observação do crescimento das bactérias (16 a 24 horas); à densidade do inóculo e
sua fase de crescimento; à composição do meio nutritivo: pH, sais, líquidos, glicídios,
proteínas, tendo como referência o Mueller-Hinton (Fréjaville, Kamoun, 1989).
O resultado final é dado sob a forma de uma planilha que comporta, para cada
antibiótico, uma interpretação qualitativa (a cepa pode ser: sensível (S),
intermediária (I) ou resistente (R) ao antibiótico) (Fréjaville, Kamoun, 1989).
A leitura do antibiograma efetuado pelo método de difusão permite observar a
bacteriostase e fornece informações de ordem qualitativa. Uma cepa resistente a um
antibiótico será indiferente à sua ação, para qualquer forma de tratamento; uma
cepa sensível deverá, em princípio, ter sua multiplicação contida por uma dose
conveniente administrada por via geral; é preciso que o antibiótico seja escolhido em
função do órgão infectado e possa atingir ali um nível eficaz. Se a resposta for
intermediária, o antibiótico pode ser usado com eficiência para tratar de infecções
em órgãos com elevada taxa de concentração do antibiótico sob forma ativa; o
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antibiótico também pode ser usado em doses superiores às habitualmente usadas,
porém, nesse caso, é preferível fazer uma medição da concentração inibidora
mínima (CIM em µg/ml) (Fréjaville, Kamoun, 1989).
1.1.2.2. Resistência aos antibióticos
Os diâmetros dos halos de inibição são relacionados com as concentrações
inibitórias mínimas (CIM), obtidas por diluição em caldo ou ágar e, por regressão
linear analítica, podemos relacionar o tamanho destas zonas com a CIM
propriamente dita, apesar de este não ser um recurso bastante aplicado, até
questionado por alguns microbiologistas. A determinação por métodos quantitativos
e não qualitativos constitui método padrão para real determinação da CIM dos
antimicrobianos (Acar, Goldstein, 1996; Brooks et al, 2000).
Em virtude disto as cepas a serem consideradas podem ser classificadas
como: resistentes, intermediárias ou sensíveis. Mesmo que este procedimento seja
questionado por alguns microbiologistas, ainda é aplicado nas rotinas laboratoriais,
determinando resultados satisfatórios. Em relação aos métodos qualitativos, no
caso, disco-difusão (Método de Kirby-Bauer), o fator determinante dos diâmetros dos
halos de inibição é conhecido como tempo crítico, que consiste no tempo que o
microrganismo necessita para obter sua massa celular ideal, ou seja, mesmo com a
difusão do antimicrobiano, a mesma continuará, proporcionando assim o
aparecimento do halo, determinando a eficácia do mesmo. Isso sugere que leituras
precoces podem corresponder àquelas obtidas após incubação prolongada, em que
leituras após 5-8 horas mostraram-se bastante confiáveis. (Doern et al, 1994; Acar,
Goldstein, 1996).
Mediante estas informações, um método rápido (5 horas), o que é uma
variante da metodologia de Kirby-Bauer, consiste em: pré-incubação das placas a
37o C, antes da inoculação; turbidez do inóculo ajustada para o padrão de 1,0 na
escala de McFarland, ao invés de 0,5, sem uma pré-incubação e leitura após 5 horas
de incubação. Com a utilização destas modificações, os resultados obtidos com
Enterobactérias, cocos Gram positivos e Pseudomonas spp em termos de
sensibilidade e resistência mostraram porcentagem de concordância entre estes
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resultados obtidos em relação ao método padrão de 98,9%, 98,7% e 97,9%,
respectivamente. Apesar de os diâmetros dos halos de inibição medidos até 5 horas
serem menores que aqueles conseguidos após incubação overnight, a classificação
final em termos de sensibilidade ou resistência não foi afetada. (Kluge, 1975; Hong
et al, 1996).
1.1.3. Teste de susceptibilidade rápido
Liberman, Robertson, em 1975, avaliaram a rápida determinação de
susceptibilidade pelo método de Kirby-Bauer, reduzindo o tempo de incubação de
16-20 horas para 7-8 horas: foram testados 100 casos isolados clínicos e não se
observaram mudanças em 558 de 664 testes (84% de concordância).
Johnson, Washington 2nd, em 1976, compararam os métodos diretos e padrão
para hemoculturas positivas. O teste direto foi feito ajustando a turbidez do caldo
removido do frasco positivo de hemocultura para a escala 1.0 de McFarland em 2mL
de caldo Mueller Hinton e incubando-se a mistura por 2-4 horas. O resultado das
discrepâncias foi classificado em muito importantes, maiores ou menores. As
principais discrepâncias foram notadas com S.epidermidis (4 erros muito
importantes, 5 maiores), Klebsiella spp (2 erros muito importantes, 4 maiores) e
Alcaligenes spp (5 erros maiores). Os antibióticos que mais freqüentemente
demonstraram discrepâncias foram penicilina, ampicilina e cefalotina. Os resultados,
segundo os autores, indicam que um teste de susceptibilidade direto e preliminar a
partir de frascos de hemocultura positiva é tanto possível como exato.
Wegner et al, em 1976, também estudaram um método direto para o teste de
susceptibilidade de microrganismos de crescimento rápido e patógenos de sangue,
das amostras suspeitas uma gota de cultura líquida (aproximadamente 0,01 mL) foi
inoculada em 2mL de caldo Columbia e este foi incubado por 4h-6h a 37ºC e o
inóculo ajustado com salina para a escala 0,5 de McFarland, para então ser
plaqueado em Agar Mueller Hinton. Após a incubação de 18h-24h as leituras foram
realizadas e os resultados mudaram somente 0,7%, o que os autores definem como
alternativa para situações clinicamente urgentes.
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Mirrett, Reller, em 1979, compararam o método padrão com o teste realizado
a partir do frasco de hemocultura (1mL do sobrenadante do frasco, diluído 1: 1 com
caldo TSB e incubado a 35ºC por uma hora e então a turbidez foi ajustada com
salina para a escala 0,5 McFarland). A concordância foi de 94,6% para 2.308
comparações. As maiores discrepâncias foram vistas com três cepas de
S.epidermidis e uma de S.aureus, E. coli e Enterobacter spp, portanto os autores
recomendam este procedimento para guiar precocemente a terapia antimicrobiana
em paciente com septicemia.
Fay, Oldfather, em 1979, padronizaram um método para o teste de
susceptibilidade direto de hemoculturas no qual encontraram que o plaqueamento
de 0,03 mL do caldo de hemocultura produzia halos muitos próximos dos obtidos no
método padrão, com 94,6% de concordância. Por outro lado, Doern et al, em 1981,
avaliaram o teste de susceptibilidade por disco-difusão a partir de amostras de
hemocultura positiva, o teste direto foi realizado com 1mL do líquido
homogeneizado, do qual seis gotas (aproximadamente 0,05mL) desta suspensão
foram plaqueadas em ágar Mueller Hinton e incubadas em ar ambiente a 35ºC por
16-18 horas. No total, 556 microrganismos e 4.234 comparações antibiótico-
microrganismos foram avaliados. O método direto demonstrou 69,8% de
concordância total com o método padronizado. Um total de 1,6% de erros menores,
1,5% de erros maiores e 0,1% de erros muito importantes foi observado.
Kiehn et al, 1982, compararam o teste susceptibilidade por microdiluição em
caldo padrão e direto de isolados de hemocultura; dos 271 microrganismos e 1.988
combinações microrganismos antibióticos testados, houve 13 discrepâncias em que
um microrganismo foi analisado como sensível por um método e resistente pelo
outro. Estas discrepâncias foram distribuídas entre diversas combinações
microrganismo-antibiótico, não mais que duas foram vistas para qualquer uma das
combinações. A alta acurácia deste resultado pode ser alcançada pela inoculação
direta de caldos de hemocultura.
De Cueto et al, 2004, inocularam diretamente o líquido do frasco do Bactec
9240 (Becton Dickinson Cockeysville , Md) da hemocultura positiva em cartão Vitek
2 System (bioMérieux, França). Para os bacilos Gram negativos, 31 de 50 (62%)
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mostraram concordância completa com o método padrão para identificação das
espécies, enquanto nenhum dos 50 cocos Gram positivos foi corretamente
identificado pelo método direto. Para os bacilos Gram negativos, eles foram 50%
concordantes entre os métodos direto e padrão para todas as drogas testadas. A
taxa de erro maior foi 2,4% e o de erro menor foi 0,6%. A taxa total de erros para os
Gram negativos foi 6,6%. Concordância completa na categoria clínica de todos os
agentes antimicrobianos avaliados foi obtida para 19 de 50 (38%) dos cocos Gram
positivos analisados, a taxa total de erro foi 8,4%, com 2,8% erros menores, 2,4%
erros maiores e 3,2% erros muito importantes; concluíram por estes dados que os
cartões de Vitek 2 inoculados diretamente com frascos positivos da Bactec 9240 não
oferecem identificação bacteriana ou de susceptibilidade aceitável em comparação
com os mesmos cartões testados pelo método padrão.
Segundo Diekema et al, 2004, o teste de susceptibilidade exato e o reporte
apropriado dos resultados para os patógenos isolados de hemoculturas são funções
críticas dos laboratórios de microbiologia. Eles estudaram o desempenho e reporte
de hemoculturas positivas (160 episódios de bacteriemia) em laboratórios de
microbiologia de hospitais de Iowa (14 hospitais). Foi detectado erro no teste de
susceptibilidade ou de identificação para 18 episódios (16%). Mais estudos são
necessários para determinar o impacto dos erros do teste e o reporte subótimo dos
resultados na condução das infecções de corrente sanguínea.
Doern et al, 1982, recomendam que os resultados de um teste rápido de
disco-difusão direto da hemocultura sejam usados para guiar a terapia , pois em seu
estudo o teste rápido indicou que 48 de 173 pacientes deveriam ter sua
antibioticoterapia mudada e, em 32 pacientes (66,6%), a indicação de mudança foi
aproximadamente 24 horas mais precoce que a convencional.
Barenfanger et al, em 1999, apontaram os benefícios clínicos e financeiros da
rápida identificação e do teste de susceptibilidade, demonstrando que a
permanência hospitalar diminuiu de 12,6 dias para 10,7 dias (p=0,006) no grupo em
que foram utilizados métodos mais rápidos e automatizados. A diferença de
liberação dos resultados foi de 39,2 horas contra 44,4 horas dos métodos de
processamento normal (p= 0,001). A mortalidade foi de 7,9% e 9,6% (p=0,45) em
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pacientes com os métodos rápido e normal, respectivamente, e os custos tiveram a
diferença de U$ 1,750 para menos (U$ 6,677 para U$ 4,927, p=0,001), nos
pacientes cujos exames foram realizados pelo método mais rápido.
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2. OBJETIVOS
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Verificar a correlação entre o método rápido de disco-difusão realizado
diretamente das cepas isoladas na hemocultura e o método de disco-difusão
tradicional na avaliação da susceptibilidade bacteriana.
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3. MATERIAL E MÉTODO
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Foram analisadas 130 amostras de hemoculturas positivas não seqüenciais,
obtidas pelo sistema Hemobac Trifásico, de diversas unidades, enviadas ao
laboratório de microbiologia do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar da Santa
Casa de São Paulo, no período de 2003 a 2005.
3.1. Identificação da positividade das hemoculturas
As amostras positivas de hemocultivos (Sistema Hemobac Trifásico® - Probac
do Brasil, 2005a) do Laboratório de Microbiologia do Serviço de Controle de Infecção
Hospitalar e da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo foram
prospectivamente avaliadas da seguinte maneira:
1. Na presença de crescimento bacteriano nos meios sólidos (Fig 5), os frascos
foram abertos e fez-se a coloração de Gram, conforme item 3.2. e,
2. Na presença de viragem do indicador para rosa, sem crescimento bacteriano,
uma nova inversão foi realizada e a coloração de Gram, obtida do caldo com o
sangue.
Foram excluídos os hemocultivos sem crescimento, com crescimento de duas
ou mais espécies de bactérias e aquelas cujo crescimento no laminocultivo não foi
suficiente para a obtenção de um inóculo de 3x108 UFC/mL necessário para a
realização do antibiograma.
3.2. Bacterioscopia a partir da coloração de Gram das colônias isoladas
- A partir da amostra das hemoculturas positivas, foram feitos esfregaços em
lâminas, para a coloração de Gram (Carvalhal, Alterthum, 2005).
- A partir do crescimento bacteriano foi ajustada, visualmente, a suspensão
bacteriana com turvação correspondente a 1,0 da escala de McFarland, compatível
com 3,0x108 UFC/mL de bactérias em caldo de TSB (Tryptic Soy Broth) para o teste
rápido e, para o teste padrão, a escala utilizada foi a de 0,5 McFarland, que
corresponde a 1,5x108 UFC/mL. (Probac do Brasil, 2005b)
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Figura 5: Crescimento bacteriano em Agar Chocolate (Face larga da lâmina -
Hemobac Trifásico ®).
3.3. Antibiograma
A. O inóculo foi semeado em três direções em uma placa de Agar Mueller-
Hinton, previamente colocada por 30 minutos em estufa a 37o C.
B. Foram colocados os discos de antibióticos (de acordo com o CLSI (2005)
vigente), tal qual é feito no teste de sensibilidade realizado na rotina implementada
no laboratório, também de acordo com a bacterioscopia prévia e aspecto das
colônias utilizando os seguintes antimicrobianos:
• Staphylococcus spp: Penicilina, Oxacilina, Cefoxitina, Eritromicina,
Trimetoprim-Sulfametoxazol, Clindamicina, Vancomicina, Cloranfenicol,
Ciprofloxacina, Gentamicina, Tetraciclina, Levofloxacina, Teicoplanina, Cefepima,
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Meropenem e Linezolide;
• Enterococcus spp: Penicilina, Ampicilina, Vancomicina, Teicoplanina,
Gentamicina, Tetraciclina, Eritromicina, Cloranfenicol e Linezolide;
• Bacilos Gram negativos: Ampicilina, Cefazolina, Ticarcilina + Ácido
Clavulânico, Cefalotina, Gentamicina, Amicacina, Amoxacilina + Ácido Clavulânico,
Cefuroxima, Cefepima, Cefoxitima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Ciprofloxacina,
Levofloxacina, Imipenem, Meropenem, Trimetoprim-sulfametoxazol, Ceftazidima,
Aztreonam, Cloranfenicol, Tetraciclina e Tobramicina;
• Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose: Ceftazidima,
Gentamicina, Amicacina, Aztreonam, Cefepima, Ciprofloxacina, Levofloxacina,
Imipenem, Meropenem, Tobramicina, Cefotaxima, Ceftriaxona, Cloranfenicol e
Trimetoprim-Sulfametoxazol.
Quando a coloração de Gram indicou um bacilo Gram negativo, os discos
colocados foram para a família Enterobacteriaceae, na identificação deste bacilo
Gram negativo como não fermentador de glicose, foram considerados apenas os
antibióticos sugeridos para teste pelo CLSI.
Para os cocos Gram positivos, a prova da catalase foi realizada para
diferenciar os Staphylococcus spp dos Streptococcus ou Enterococcus spp, e
assumiram-se como enterococos as cepas que não apresentaram alfa hemólise no
agar chocolate, confirmando o diagnóstico na rotina padrão.
C. As placas foram incubadas em atmosfera ambiente, em estufa a 35oC -
37o C e, após cinco horas, houve a leitura do diâmetro dos halos e a interpretação
de acordo com os critérios adotados pelo CLSI – Clinical and Laboratory Standards
Institute, 2005 (antigo NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory
Standards) para halos obtidos na técnica de disco–difusão para antibiogramas, pela
metodologia padrão adotada pelos laboratórios.
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Paralelamente foi realizado o teste de susceptibilidade habitual, de acordo
com a padronização do CLSI, com leitura feita após 18-24 horas.
Como controle de qualidade laboratorial foram feitos os testes de
susceptibilidade com as cepas padrões (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923), padrão de
referência utilizado no laboratório e segue os critérios internacionais do CLSI (CLSI,
2005).
A leitura dos halos de inibição foi realizada após cinco horas de incubação,
por mensuração do halo na superfície do ágar com a placa aberta por
transiluminação devido à presença de halos mais claros.
3.4. Análise Estatística
Para avaliar a concordância entre o método padrão e rápido, utilizamos duas
formas de análise: índice Kappa (Tab. 1) e classificação de erro (Tab. 2) indicadas
pelo Serviço de Epidemiologia e Estatística da FCMSCSP.
O índice Kappa é obtido a partir da seguinte fórmula e classificado de acordo
com a tabela 1:
Kappa = Po – Pe
1 - Pe
Em que:
Po=proporção observada de cepas em concordância
Pe=proporção esperada de cepas em concordância
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Tabela 1: Classificação da concordância dos antimicrobianos a partir do índice Kappa.
KAPPA
Limite Inferior Limite Superior Classificação <0,00 Ruim
0 0,2 Fraca 0,21 0,4 Sofrível 0,41 0,6 Regular 0,61 0,8 Boa 0,81 0,99 Ótima
1 Perfeita Fonte: Adaptado do Landis J, Koch G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 1977; 33:159-74.
Tabela 2: Critérios de classificação de erros, comparando-se o teste rápido (TR)
com o teste padrão (TP). Teste Padrão Teste Rápido Erro
R Não houve erro
I EM Resistente
S EMI
R EM
I Não houve erro Intermediário S EM
R EI
I EM Sensível
S Não houve erro Fonte: Koneman E, Allen SD, Janda WM, Schereckenberger PC, Winn WC Jr. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5ª ed. São Paulo: MEDSI; 2001. onde: R = Resistente, I = Intermediário, S = Sensível, EM = Erro Menor, EMI = Erro Muito Importante e EI = Erro Importante .
Portanto, os critérios de classificação dos erros são obtidos quando há
discordância entre os resultados (Koneman et al, 2001), sendo:
- Erro muito importante (EMI): resultado no método padrão resistente (R)
e no método estudado sensível (S), R→S;
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- Erro importante (EI): resultado no método padrão sensível e no método
estudado resistente, S→R e
- Erro menor (EM): resultado no método padrão resistente ou sensível e
no método estudado intermediário ou vice – versa, R↔I↔S.
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4. RESULTADOS
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Das 130 amostras de hemoculturas estudadas provenientes das diferentes
unidades de internação da Santa Casa de São Paulo, obtivemos os seguintes
resultados:
4.1. Staphylococcus spp
Das 50 cepas estudadas, 10 (20%) eram de Staphylococcus coagulase
negativo e 40 (80%) de Staphylococcus coagulase positiva; houve comparação entre
os resultados dos métodos padrão e rápido (Tab. 3).
Tabela 3: Classificação dos antimicrobianos testados para os Staphylococcus spp, segundo o índice Kappa que avalia a comparação entre os resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.
Antimicrobiano
Concordância
EMI
R→SEI
S→ REM
R↔I↔S Kappa
Classificação
Eritromicina 88 4 8 0 0,715 Boa Clindamicina 88 8 4 0 0,733 Boa Ciprofloxacina 90 6 4 0 0,798 Boa Gentamicina 88 4 8 0 0,757 Boa Tetraciclina 90 0 10 0 0,703 Boa Oxacilina 98 2 0 0 0,956 Ótima Sulfa-trimetoprim 98 2 0 0 0,960 Ótima Cloranfenicol 92 4 4 0 0,840 Ótima Levofloxacina 98 2 0 0 0,960 Ótima Cefepime 98 2 0 0 0,956 Ótima Meropenem 98 2 0 0 0,956 Ótima Penicilina 100 0 0 0 1 Perfeito Vancomicina 100 0 0 0 1 Perfeito Teicoplanina 100 0 0 0 1 Perfeito Linezolida 100 0 0 0 1 Perfeito
Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obteve-se R e EM: erro menor quando houve resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.
Das 50 cepas estudadas, houve concordância para os Staphylococcus
coagulase negativo de 60,0% e para os Staphylococcus coagulase positiva de
52,5%.
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4.2. Enterococcus spp
Foram isolados Enterococcus spp em culturas de 15 pacientes internados nas
várias enfermarias da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
Todas as cepas de Enterococcus spp estudadas apresentaram 100% de
concordância em seus resultados, os quais foram avaliados de acordo com a
correlação entre os métodos padrão (TP) e rápido (TR).
4.3. Enterobactérias
Foram isoladas Enterobactérias em culturas de 32 pacientes. Das cepas
estudadas, 13 (40,6%) eram de Klebsiella pneumoniae; 9 (28,0%), de Enterobacter
spp; 5 (15,6%), de E.coli; 1 (3,1%), de Proteus mirabilis; 1 (3,1%), de Proteus
vulgaris; 2 (6,3%), de Klebsiella oxytoca e 1 (3,1%), de Morganella morganii. Para
comparar os métodos padrão (TP) e rápido (TR), construiu-se tabela, em que se
observou a concordância entre dois métodos por meio da análise de erros (Tab. 4).
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Tabela 4: Classificação dos antimicrobianos testados para as Enterobactérias, segundo o índice Kappa que avalia a comparação dos resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.
Antimicrobiano
Concordância
EMI R→S
EI S→ R
EM R↔I↔S
Kappa
Classificação
Amicacina 84 3 3 9 0,585 Regular Ampicilina 97 0 0 3 0,788 Boa Ticarcilina+ácido clavulânico 88 3 0 9 0,708 Boa
Cefalotina 84 3 0 13 0,677 Boa Cefepime 84 9 0 6 0,707 Boa Cefoxitina 91 9 0 0 0,798 Boa Cefotaxima 88 9 0 3 0,750 Boa Aztreonam 88 3 0 9 0,761 Boa Tetraciclina 88 0 3 9 0,747 Boa Cefazolina 94 6 0 0 0,862 Ótima Gentamicina 94 3 0 3 0,870 Ótima Amoxacilina+ácido clavulânico 94 0 0 6 0,877 Ótima
Cefuroxima 97 0 0 3 0,931 Ótima Ceftriaxona 91 6 0 3 0,809 Ótima Sulfa-trimetoprim 97 3 0 0 0,920 Ótima Cloranfenicol 91 3 0 6 0,815 Ótima Tobramicina 94 0 0 6 0,882 Ótima Ciprofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Levofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Imipenem 100 0 0 0 1 Perfeito Meropenem 100 0 0 0 1 Perfeito Ceftazidima 100 0 0 0 1 Perfeito Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obteve-se R e EM: erro menor quando se obtiveram resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.
4.4. Bacilos Gram Negativos não fermentadores de glicose
Foram isolados BGN NF em culturas de 33 pacientes; das cepas estudadas,
21 (64%) eram de Acinetobacter baumannii; 7 (21%), de Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas spp 2 (6%), Stenotrophomonas maltophilia 2 (6%), Burkholderia
cepacia 1 (3%). Para comparar os métodos padrão (TP) e rápido (TR), construiu-se
tabela, observando a concordância entre dois métodos por análise de erros (Tab. 5).
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Tabela 5: Classificação dos antimicrobianos testados para os Bacilos Gram negativos Não Fermentadores da Glicose, segundo o índice Kappa que avalia a comparação dos resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.
Antimicrobiano
Concordância
EMI
R→S EI
S→ R EM
R↔I↔S Kappa
Classificação
Gentamicina 76 3 18 3 0,553 Regular Amicacina 76 3 6 15 0,537 Regular Tobramicina 73 3 18 6 0,500 Regular Cefotaxima 76 9 3 12 0,561 Regular Cefepime 85 0 3 12 0,725 Boa Ceftriaxone 79 3 6 12 0,627 Boa Cloranfenicol 88 0 0 12 0,784 Boa Ceftazidima 94 0 3 3 0,893 Ótima Aztreonam 91 3 3 3 0,824 Ótima Imipenem 94 3 3 0 0,857 Ótima Meropenem 94 3 3 0 0,857 Ótima Sulfa-trimetoprim 94 3 3 0 0,878 Ótima Ciprofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obtivemos R EM: erro menor quando obtivemos resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.
De acordo com a metodologia proposta, a tabela a seguir demonstra o resumo
da relação de concordância entre o TP e o TR, segundo o número total de cepas
(Tab. 6).
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Tabela 6: Distribuição dos microrganismos isolados das hemoculturas e as concordâncias obtidas entre o teste padrão e o teste rápido, de acordo com os microrganismos isolados de hemoculturas.
Agente isolado Amostras Concordância Nº Nº %
Enterococcus spp 15 15 100 Cocos Gram (+) Staphylococcus aureus 40 20 50
Staphylococcus coagulase (-) 10 6 60 Total 65 41 63 Klebsiella pneumoniae 13 10 77 Escherichia coli 5 2 40 Enterobacter sp 9 0 0
Bacilo Gram (-) Morganella morganii 1 0 0 Klebsiella oxytoca 2 0 0 Proteus mirabilis 1 0 0 Proteus vulgaris 1 0 0 Total 32 12 38 Acinetobacter baumannii 21 10 48
Bacilo Gram (-) não Pseudomonas aeruginosa 7 3 43 fermentadores da Pseudomonas spp 2 1 50
Glicose Stenotrophomonas maltophilia 2 2 100 Burkholderia cepacia 1 0 0
Total 33 16 48 Total geral 130 69 53 Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP.
Os resultados obtidos para as cepas controle Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
foram satisfatórios quando comparados com os intervalos preconizados para o teste
de controle de qualidade do método, segundo o CLSI vigente no período de estudo
2003-2005 (CLSI 2003-2005).
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5. DISCUSSÃO
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As infecções da corrente sanguínea são a décima causa de morte nos
Estados Unidos da América e também aumentam a morbidade, o tempo de
permanência e os custos hospitalares. O tempo para a notificação dos resultados
positivos é um dos fatores óbvios para diminuir o tempo de permanência da
hospitalização, portanto o laboratório de microbiologia deve focar a diminuição da
notificação priorizando a rotina das hemoculturas e a liberação dos resultados da
coloração de Gram, comunicando-os imediatamente aos responsáveis pelo paciente
(Beekmann et al, 2003).
Atualmente as culturas provenientes de pacientes internados levam ao redor
de 72 horas para liberação final dos resultados e, nestes casos, a terapêutica
definida será confirmada após a obtenção desses exames.
Escolhemos realizar um teste cuja determinação do perfil de sensibilidade
seria reduzida de 24 horas para 5 horas e, assim, teríamos uma confirmação de
eficácia terapêutica em um tempo menor. A gravidade das infecções também foi
considerada, escolhendo somente hemoculturas positivas em meio especial
Hemobac Trifásico (Probac do Brasil ®, 2005a), cuja característica é identificar os
agentes diretamente nos laminocultivos.
Associando as duas características, observamos que os resultados finais
poderiam ser obtidos em 30 horas, agilizando a indicação da terapêutica adotada
para os pacientes.
Os resultados alcançados nestes testes in vitro mostraram variação com
relação ao padrão-ouro já utilizado, e foi observada, para diferentes cepas
analisadas, uma concordância de 37,5% até 63%, com média de 53%, demonstrada
nos resultados (Tab.6). Nesta mesma tabela, podemos observar uma concordância
de 100% da metodologia rápida para os Enterococcus spp e 77% para Klebsiella
pneumoniae, determinando que, para esses agentes, tenhamos melhor expectativa
de realização do teste rápido. Para outras bactérias a discordância foi total (100%),
porém o número de cepas testado foi pequeno, portanto com necessidade de maior
quantidade de testes para confirmar estes resultados.
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Lembrando que as maiores divergências ocorreram nos antibióticos que
atuam na síntese protéica e na alteração do material genético bacteriano,enquanto
as maiores concordâncias foram para os que atuam na parede celular.
Nossos resultados são semelhantes aos obtidos por Kluge (1975), que utilizou
o inóculo de 0,5 de McFarland e realizou as leituras nos tempos de 4, 8 e 12 h,
demonstrando concordância de 100% para cloranfenicol e gentamicina nos
Staphylococcus spp. Para os Enterococcus spp, obteve em estreptomicina,
meticilina, kanamicina, trimetoprim-sulfametoxazol concordância de 100% e, para as
demais drogas, porcentagem acima de 90%.
Podemos observar, também, nos resultados, três tipos de discordâncias
principais: ERRO MUITO IMPORTANTE: um isolado determinado como resistente
pelo TP e sensível pelo TR; ERRO IMPORTANTE: um isolado determinado como
sensível pelo TP e resistente pelo TR; ERRO MENOR: um isolado determinado
como intermediário pelo TP e resistente ou sensível pelo TR (Koneman et al, 2001).
Analisando estes erros, os prováveis fatores que os explicam são: inóculo, tempo de
difusão do antimicrobiano, erros de leitura (variação de leitura pessoa-pessoa e
valores próximos aos intervalos estabelecidos).
Em trabalhos anteriores, os autores ignoravam a sensibilidade intermediária,
considerando-a como sensível, fazendo com que esses resultados aumentassem a
concordância para os testes (Doern et al, 1994; Acar, Goldstein, 1996).
Os resultados deste estudo foram comparados com alguns artigos analisados
(Tab. 7).
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Tabela 7: Comparação das concordâncias entre os testes.
Referência Método Microrganismo Antimicrobianos Resultado
Presente estudo DD
Enterococcus spp K.pneumoniae Staphylococcus spp Bacilo Gram (-) Bacilo Gram (-) NF
NCCLS, 2003-2004 CLSI, 2005
100% 77% 50% 35% 50%
Kluge, 1975 DD Enterococcus spp
streptomicina, meticilina, kanamicina, trimetoprim-sulfametoxazol Demais drogas
100%
90%
Liberman, Robertson,
1975 DD
A. calcoaceticus, A. lwoffii, E.coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Hafina sp, P. mirabilis, M. morganii, P.rettgeri, Pseudomonas spp
streptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina, ampicilina, cefalotina Polimixina B
84%
S.aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp
penicilina, meticilina, cefalotina, clindamicina, ampicilina, tetraciclina Mirret,
Reller, 1979 DD E.coli, K. pneumoniae, S. marcenscens, Salmonella spp, Enterobacter spp
ampicilina, cefalotina, gentamicina, kanamicina, cloranfenicol, tetraciclina
94,6%
DD = método de disco- difusão
Quando comparamos o fármaco e sua correlação entre os dois tipos de
testes, observamos que as drogas podem ser classificadas em categorias de acordo
com o índice Kappa (Tab. 1) e foram correlacionadas aos grupos de bactérias (Tab.
3, 4 e 5), cuja concordância para as diferentes drogas variou de 73 até 100.
Para o laboratório, a realização de métodos rápidos cria uma alternativa para
padronizar novos exames mais eficazes com redução de gastos.
Para a instituição, toda melhoria na qualidade do atendimento ao paciente
com implantação de exames alternativos eficazes implica satisfazer o cliente, reduzir
os custos hospitalares, a resistência bacteriana e diminuir o tempo de internação.
Para a sociedade, a alta precoce e o retorno às atividades normais desses cidadãos
reduzem os custos sociais.
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6. CONCLUSÃO
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O teste rápido teve correlação de 100% em Enterococcus spp, 40,6% em
Enterobactérias, 44% em Staphylococcus spp e 51,5% em bacilos Gram negativos
não fermentadores da glicose, para os antimicrobianos utilizados na rotina do
laboratório de microbiologia do SCIH da Santa Casa de São Paulo, quando
comparados com o método tradicional de disco-difusão.
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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RESUMO
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Murça MAS. Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo. Tese (Mestrado). 2007
Cada vez mais se busca nos Laboratórios de Microbiologia a relação
eficácia/tempo, visando a rapidez com que os resultados devem ser reportados. Este
estudo avalia um método rápido para o teste de susceptibilidade a antimicrobianos
(5 horas), uma variante do método de Kirby-Bauer, consistindo em: pré-incubação
das placas à 37o C, antes da inoculação; turbidez do inóculo ajustada para o padrão
de 1,0 na escala de McFarland, ao invés de 0,5, sem pré-incubação e leitura
realizada após 5 horas de incubação. O objetivo foi verificar a correlação existente
entre os dois métodos de determinação de susceptibilidade bacteriana (clássico e
rápido) a antimicrobianos, utilizando-se cepas isoladas de hemoculturas. A placa foi
incubada em atmosfera ambiente, em estufa a 35-37o C e após 5 horas foi realizada
a leitura do diâmetro dos halos; a interpretação dos resultados foi realizada de
acordo com os critérios adotados pelo CLSI - Comitte Laboratory Standards Institute,
(antigo NCCLS - National Comittee for Clinical Laboratory Standards). Os resultados
obtidos nestes testes “in vitro”, mostraram variação com relação ao padrão ouro já
utilizado: foi observada, para diferentes cepas analisadas, a concordância de 53%,
em média. O teste rápido realizado, com os discos de antimicrobianos utilizados na
rotina do Laboratório de Microbiologia do S.C.I.H. da Santa Casa de São Paulo, teve
correlação de 100% para Enterococcus spp. Para bacilos Gram negativos não
fermentadores da glicose, Staphylococcus spp e enterobactérias a correlação foi de
51,5%, 44%, e 40,6% respectivamente.
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ABSTRACT
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Murça MAS. Correlation between two methods of susceptibilit by testing tradiconal and rapid in blood cultures in Santa Casa of Sao Paulo. Thesis. 2007.
There has been a growing interest in the cost effectiveness of expediting test
results in Microbiology Laboratories. The current study evaluates a rapid (5-hour) test
of antimicrobial susceptibility. This test was modified from the Kirby-Bauer method,
consisting of a pre-incubation of the plates at 37oC before inoculation, turbidity of the
inoculate set at a standard of 1.0 on the McFarland scale (instead of 0.5), no pre-
incubation, and reading of the test results following 5 hours of incubation. The
objective was to compare both methods of establishing bacterial susceptibility to
antimicrobial drugs (classical vs rapid) using bacterial strains isolated from
hemocultures. The plate was incubated at room temperature and at 35-37o C for five
hours. The zone diameter of the halo was established at room temperature and after
incubation. Results were analyzed according to the Comitte Laboratory Standards
Institute Criteria (CLSI) , (former NCCLS - National Comittee for Clinical Laboratory
Standards). This “in vitro” test presented results that differred from those described
as “gold-standard”, with an average agreement of only 53%. The rapid test using
routine antimicrobial plates from the Microbiology Laboratory of Santa Casa of São
Paulo Hospital presented a 100% correlation with Enterococcus spp, and a 51.5%,
44%, and 40.6% correlation with non-glucose fermenting gram negative bacilli,
Staphylococcus spp, and enterobacteria, respectively.
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