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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA A SAÚDE
MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.
(Clusiaceae).
NITERÓI, RJ
2016
MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.
(Clusiaceae).
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
Campo de Confluência: Pesquisa e
Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.
Orientação:
PROFª DRª SELMA RIBEIRO DE PAIVA
PROFª DRª ALESSANDRA LEDA VALVERDE
Niterói, RJ
2016
R 484 Ribeiro, Mariana Martinelli Junqueira.
Estudos químicos e biológicos de Clusia grandiflora Splitg. / Mariana
Martinelli Junqueira Ribeiro; Orientadora: Selma Ribeiro de Paiva;
Coorientação: Alessandra Leda Valverde. - Niterói, 2016.
118 f.: il.
Monografia (Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas em
Produtos de Saúde) – Universidade Federal Fluminense, 2016.
1. Tecnologia farmacêutica 2. Clusiaceae 3. Cromatografia de filtração.
em gel I. Paiva, Selma Ribeiro II. Valverde, Alessandra Leda III. Título.
CDD 615.19
MARIANA MARTINELLI JUNQUEIRA RIBEIRO
ESTUDOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DE Clusia grandiflora Splitg.
(Clusiaceae).
Dissertação apresentada ao Curso
de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
Campo de Confluência: Pesquisa e
Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.
BANCA EXAMINADORA
Profª Drª Selma Ribeiro de Paiva (UFF) - Orientadora
Profa. Dra. Ana Joffily Coutinho (UFF) - Titular
Profa. Dra. Angélica Ribeiro Soares (UFRJ) - Titular
____________________________________________
Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier (UFJF) – Suplente
Niterói, RJ
2016
I
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, à Deus, por ter concedido a força de sempre continuar,
independente do que aconteça.
Às minhas orientadoras, Selma Ribeiro de Paiva e Alessandra Leda Valverde,
pela oportunidade deste trabalho, pela orientação, pela paciência e carinho durante
os anos em que estivemos juntas.
A todos alunos que estão ou passaram pelo Laboratório de Botânica
Funcional e Estrutural e Laboratório de Produtos Naturais Marinhos. Principalmente,
à Maria Carolina Anholeti e Arthur Macedo por sempre me ajudarem com seus
conhecimentos, as alunas, Tatiana Godoi, Luana Sodré e Fernanda Moreira pela
ajuda cotidiana no laboratório e a Karen Dutra pela ajuda e amizade.
À professora Adriana Lobão pela identificação da espécie. E à professora Ana
Joffily por sempre me ajudar durante esses anos.
Ao Jardim Botânico do Rio de Janeiro, principalmente à Profª Drª Claudia
Barros e a aluna Karla Marins, e à Plataforma de Metodologia Analítica de
Farmanguinhos - Fiocruz pelo suporte na pesquisa.
Ao Laboratório de Produtos Naturais (PN3) em Farmanguinhos-Fiocruz,
principalmente ao funcionário Alan Heringer, e ao Laboratório de RMN da UFF pelas
análises realizadas.
Ao Laboratório de Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará, principalmente Profª. Drª. Raquel Carvalho
Montenegro e a aluna Laine Celestino, ao Laboratório de Antibióticos, Bioquímica,
Ensino e Modelagem Molecular do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Helena Carla Castro e a aluna Louise
Azulay Palavecino, que se dispôs sempre para as análises, e ao Laboratório de
II
Metabolismo de Parasitos do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense, principalmente a Profª. Drª. Evelize Folly das Chagas, pela colaboração
para realização das atividades biológicas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para
Saúde pela oportunidade de continuar meus estudos.
À Fundação Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior pelo
fomento concedido.
Aos demais professores e alunos, que estão ou já passaram, pelo Setor de
Botânica pela convivência durante esses quase 7 anos.
Aos meus colegas da pós-graduação pelos dias de estudos e conversas
durante esses dois anos, principalmente a Glauce Duarte a Aline Fleck.
A todos os amigos que fiz na graduação, principalmente aqueles que
permanecem com o convívio diário, Lucas Fajardo, Mariana Dupim, Thamires Conti,
Pedro Ramos, Thaíz Mattos, Juliana Araújo, Ana Amélia Ribeiro, Esthefanie Ribeiro,
Rafaela Bahia, Amanda Cecília, Ana Carolina Cavalini, João Paladino, Renato
Pereira, Júlia Hauaji, Luciana Cardoso e Raísa Reis.
Aos meus pais, Luciene Pereira e Marcos Martinelli, meus avós, Paulo Ferraz,
Tereza Mota e Aldaíza Ribeiro, ao meu tio Carlos Ribeiro e demais familiares que
sempre acreditaram e incentivaram meus estudos.
Ao meu namorado Vitor Balestro, não só por entender meus estudos, mas por
sempre me incentivar a continuar, por me ensinar tantas outras coisas e me
proporcionar muita felicidade. E sua família, pois foi onde sempre encontrei um “vai
dar tudo certo”.
III
Aos demais amigos, que entenderam e conviveram com meus estudos,
Mariah Conti, Aline Mota, Ana Paula Carneiro, Daniele Lima, Nathália Jardim, Maísa
Cavalcanti, Gercia Maria, Rubia Monteiro e a todos os outros.
E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte de tudo isso.
IV
“ Por isso, os frutos servirão
de alimento e as folhas de remédio. ”
(Ezequiel 47:12).
V
RESUMO
Clusia grandiflora Splitg. é uma espécie distribuída, principalmente, na floresta Amazônica. Pertence à família Clusiaceae Lindl., que merece destaque pela sua representatividade e potencial biológico. Há poucos trabalhos com C. grandiflora, apresentando, assim, grande relevância seu estudo para sua melhor caracterização morfológica, química e biológica. Partes vegetativas e reprodutivas de C. grandiflora foram coletadas no bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ. Folhas e ramos foram caracterizados morfologicamente por técnicas tradicionais em anatomia vegetal. A folha apresentou epiderme unisseriada, presença de hipoderme, estômatos restritos à face abaxial e cilindro vascular com feixes acessórios, que também foram identificados no pecíolo. O ramo apresentou tecidos primários ainda instalados, assim como início de crescimento secundário. Os testes histoquímicos localizaram substâncias fenólicas, amido e lipídeos. O material coletado foi processado e, posteriormente, submetido à extração por maceração estática com hexano, seguido de etanol. Os extratos brutos obtidos tiveram seus perfis analisados por CCD, CLAE-DAD e RMN de H1, tendo sido identificados principalmente substâncias fenólicas simples, flavonoides, benzofenonas e terpenos. O perfil dos extratos brutos hexânicos também foram analisados por CG/EM e observaram a presença de hidrocarbonetos alifáticos, triterpenos e esteroides. Os extratos brutos etanólicos foram avaliados quanto a atividade antioxidante e o extrato bruto das raízes adventícias apresentou o melhor CE50 (1,8±0,4 g extrato/g DPPH) com menor concentração de DPPH remanescente nas concentrações de 125 e 250 µg/mL (aproximadamente 5 % em ambas). A análise do doseamento de flavonoides totais nos extratos brutos etanólicos indicou maior presença de flavonas e flavonóis no extrato bruto das flores (1,6 ± 0,0 %). Os extratos brutos foram avaliados quanto a citotoxidade e tiveram resultados promissores para o extrato etanólico dos ramos e folhas. Os extratos também foram avaliados quanto atividade antimicrobiana, sendo os extratos etanólicos dos ramos, folhas e raízes adventícias os mais ativos. Foi feita a atividade acaricida para os extratos brutos hexânicos e o melhor resultado foi para o extrato dos ramos. O extrato bruto etanólico dos ramos foi fracionado por CLV, e submetidos a testes de atividade antimicrobiana, com o melhor resultado para fração em diclorometano. Esta fração foi, então, novamente fracionada por cromatografia em coluna com sílica gel, resultando em frações enriquecidas com 3-oxo-friedelina. Esta foi testada quanto a atividade antimicrobiana e o resultado indicou que esta atividade não está relacionada a 3-oxo-friedelina ou que esta não age sozinha.
Palavras-chave: Clusiaceae Lindl., Clusia grandiflora Splitg., cromatografia, terpenos, atividades biológicas.
VI
ABSTRACT
Clusia grandiflora is a distribuited species mainly in the Amazon forest. Belongs to the family Clusiaceae Lindl., which worth mentioning for its representativeness and biological potential. There are few studies with C. grandiflora, and thus its study shows relevant for best morphological, chemical and biological description. Vegetative and reproductive parts of C. grandiflora were collected in the Botanical Garden neighborhood, Rio de Janeiro, RJ. Leaves and stems were morphologically characterized by traditional techniques in plant anatomy. The leaves presented uniseriate epidermis, presence of hypodermis, stomata restricted to abaxial face and vascular cylinder with accessory bundles, which were also identified in the petiole. The stems presented primary tissues already installed and early secondary growth. The histochemical tests located phenolic substances, starch and lipids. The collected material processed and after subjected to static maceration by extraction with hexane, followed by ethanol. The obtained extracts had their profiles analyzed by TLC, HPLC-DAD and 1H-NMR, being mainly identified simple phenolic substances, flavonoids, benzophenone and terpenes. The profile of the hexane crude extracts were also analyzed by GC/MS and presence of aliphatic hydrocarbons, triterpenes and steroids were observed. The ethanol crude extracts were evaluated for antioxidant activity and the adventitious roots crude extract showed the best EC50 (1,8 ± 0,4 g extract / g DPPH) with lower concentrations of remaining DPPH at concentrations of 125 and 250 mg/mL (approximately 5 % in both). The analysis of total flavonoids content in ethanol crude extracts showed greater presence of flavones and flavonols in the flowers crude extract (1.6 ± 0.0 %). The extracts were evaluated for cytotoxicity and had promising results for the stems and leaves ethanol extract. The extracts were also evaluated for antimicrobial activity and the stems, leaves and adventitious roots ethanol extracts the most active. It was made acaricide activity for hexane extracts and the best result was for the stems extract. The stems crude ethanol extract was fractionated by CLV and subjected to antimicrobial activity test, with the best result for dichloromethane fraction. This fraction was again fractionated by column chromatography with silica gel, resulting in fractions enriched with 3-oxo-friedelin. This was tested for antimicrobial activity and the results indicated that this activity is not related to 3-oxo-friedelin or that it does not act alone. Keywords: Clusiaceae Lindl, Clusia grandiflora Splitg, chromatography, terpenes,
biological activities.
VII
SUMÁRIO
Resumo.........................................................................................................V
Abstract.........................................................................................................VI
Lista de figuras.............................................................................................IX
Lista de tabelas............................................................................................XIII
Lista de siglas e símbolos..........................................................................XIV
1. Introdução................................................................................................1
1.1. Família Clusiaceae Lindl......................................................................2
1.2. Gênero Clusia L....................................................................................3
1.3. Espécie Clusia grandiflora Splitg.......................................................3
2. Objetivo....................................................................................................5
2.1. Objetivos específicos..........................................................................5
3. Revisão da Literatura.............................................................................5
3.1. Aspectos gerais de Clusiaceae, Clusia L. e Clusia grandiflora Splitg
......................................................................................................................5
3.2. Terpenoides.........................................................................................17
4. Materiais e Métodos...............................................................................20
4.1. Levantamento bibliográfico...............................................................20
4.2. Coleta da planta..................................................................................21
4.3. Identificação da planta.......................................................................21
4.4. Descrição anatômica..........................................................................21
4.5. Testes histoquímicos.........................................................................21
4.6. Processamento do material botânico...............................................22
4.7. Extração do material botânico...........................................................23
4.8. Atividade antioxidante........................................................................23
4.9. Dosagem de flavonoides....................................................................24
4.10. Atividade citotóxica..........................................................................24
4.11. Atividade antimicrobiana.................................................................25
4.12. Atividade acaricida...........................................................................26
4.13. Perfil cromatográfico dos extratos bruto.......................................27
4.13.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD) .....................27
VIII
4.13.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de
arranjo de fotodiodo (CLAE-DAD) ..............................................................28
4.13.3. Perfil por ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H)
.....................................................................................................................28
4.13.4. Perfil por cromatografia com fase gasosa acoplado à espectrômetro de
massas (CG-EM) ........................................................................................29
4.14. Fracionamento do extrato bruto.....................................................29
4.15. Isolamento e purificação de substâncias......................................29
4.16. Elucidação estrutural de substâncias...........................................30
5. Resultados e discussão.......................................................................30
5.1. Descrição anatômica.........................................................................30
5.2. Teste histoquímico............................................................................36
5.3. Processamento e extração do material botânico...........................39
5.4. Atividade antioxidante......................................................................40
5.5. Doseamento de flavonoides............................................................46
5.6. Atividade citotóxica.........................................................................49
5.7. Atividade antimicrobiana................................................................52
5.8. Atividade acaricida..........................................................................54
5.9. Perfil dos extratos brutos...............................................................56
5.9.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD) ....................56
5.9.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .............61
5.9.3. Perfil por ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H)
.................................................................................................................66
5.9.4. Perfil por cromatografia com fase gasosa acoplado à espectrômetro de
massas(CG-EM) .....................................................................................76
5.10. Fracionamento do extrato bruto CGREt.....................................87
5.10.1. Atividade antimicrobiana das frações da CLV........................91
5.10.2. Isolamento e purificação de substâncias obtidas em CGREtD e suas
elucidações estruturais........................................................................91
5.10.3 Atividade antimicrobiana da 3-oxo-friedelina.........................100
6. Conclusões.......................................................................................100
7. Referências.......................................................................................102
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição geográfica da família Clusiaceae .........................2
Figura 2. Aspecto das folhas e fruto de Clusia grandiflora Splitg
..................................................................................................................4
Figura 3. Estrutura de metabólitos secundários encontrados em Clusiaceae
..................................................................................................................9
Figura 4. Benzofenonas identificadas em C. grandiflora.........................16
Figura 5. Esquema geral da biossíntese de terpenoides........................18
Figura 6. Exemplos de triterpenos...........................................................19
Figura 7. Estrutura química dos triterpenos 13 e 14................................20
Figura 8. Estrutura química do triterpeno 15...........................................20
Figura 9. Pecíolo e mesofilo de C. grandiflora em cortes transversais...33
Figura 10. Nervura principal de C. grandiflora em cortes transversais...34
Figura 11. Bordo e ramo de C. grandiflora em cortes transversais........35
Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C.
grandiflora................................................................................................38
Figura 13. Estrutura do DPPH antes e depois da reação com um agente
antioxidante (A-H)
................................................................................................................41
Figura 14. Cinética reacional do BHT com DPPH..................................43
Figura 15. Cinética reacional da rutina com DPPH................................44
Figura 16. Cinética reacional das raízes adventícias com DPPH..........44
Figura 17. Cinética reacional dos ramos com DPPH.............................45
Figura 18. Cinética reacional das folhas com DPPH.............................45
Figura 19. Cinética reacional das flores com DPPH..............................46
Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides
................................................................................................................47
Figura 21. Teste de Correlação de Pearson entre os valores de CE50 dos extratos de
C. grandiflora e o percentual de flavonoides ..........................................49
Figura 22. Teste de imersão de fêmeas adultas nos extratos brutos hexânicos de C.
grandiflora ...............................................................................................55
X
Figura 23. CCD dos extratos brutos etanólicos e hexânicos de C. grandiflora eluídos
em hexano: acetato de etila: ácido acético (65:34:1) e revelados em lâmpada de luz
UV .........................................................................................................57
Figura 24. CCD dos extratos brutos etanólicos de C. grandiflora eluídos em hexano:
acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e revelados em Dragendorff
..............................................................................................................58
Figura 25. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora eluidos em hexano:
acetato de etila: ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica
.............................................................................................................59
Figura 26. CCD dos extratos brutos de C. grandiflora revelados em DPPH
............................................................................................................60
Figura 27. Estrutura química das substâncias 13, 15 e 16................61
Figura 28. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora e frações
enriquecidas com as substâncias 13, 15 e 16 (setas) eluidos em hexano: acetato de
etila: ácido acético (80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica..........61
Figura 29. Cromatogramas dos extratos hexânicos de C. grandiflora em água (A) e
acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético, variando de 25% a 55%
de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min), mantendo os 100% até 30 min,
em 270 nm..........................................................................................64
Figura 30. Cromatogramas obtidos dos extratos etanólicos de C. grandiflora em
água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético, variando de
10% a 45% de B (0 – 40 min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100%
até 55 min, em 270 nm........................................................................65
Figura 31. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das raízes
adventícias (CGRAH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz)..................67
Figura 32. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico dos ramos
(CGRH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).......................................68
Figura 33. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das folhas
(CGFoH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).....................................69
Figura 34. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das flores
(CGFH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).......................................70
XI
Figura 35. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das raízes
adventícias (CGRAEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).............72
Figura 36. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico dos ramos
(CGREt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)..................................73
Figura 37. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das folhas
(CGFoEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)................................74
Figura 38. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das flores
(CGFEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz)..................................75
Figura 39. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRAH...............79
Figura 40. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRAH
.........................................................................................................80
Figura 41. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRH.................81
Figura 42. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRH
.........................................................................................................82
Figura 43. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFoH...............83
Figura 44. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFoH
.........................................................................................................84
Figura 45. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFH.................85
Figura 46. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFH
........................................................................................................86
Figura 47. Fluxograma do fracionamento do CGREt.....................88
Figura 48. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas por CLV
eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1) e reveladas em lâmpada
de luz UV em 254 nm.....................................................................89
Figura 49. CCDs do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas na CLV
........................................................................................................90
Figura 50. CCD das frações obtidas na CLV e frações enriquecidas com as
substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1)
e revelados em vanilina sulfúrica...................................................90
Figura 51. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD, das
frações 1 a 4 e frações 3 e 4 recristalizadas eluídas em hexano: acetato de etila:
XII
ácido acético (85:14:1) e revelados sob lâmpada de luz UV em 365 nm
......................................................................................................92
Figura 52. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD e das
frações 5 a 9 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e
revelados sob lâmpada de luz UV em 256 nm.............................93
Figura 53. CCD das frações 1 a 9, frações recristalizadas e frações enriquecidas
com as substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético
(80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica.................................93
Figura 54. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 3rec...............................................................................95
Figura 55. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 4rec..............................................................................96
Figura 56. Proposta de fragmentação da 3-oxo-friedelina.........97
Figura 57. Espectro de RMN de H1 da 3-oxo-friedelina e expansões do campo alto
....................................................................................................98
Figura 58. Estrutura química da 3-oxo-friedelina (13)
....................................................................................................99
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Gêneros pertencentes a Clusiaceae e suas respectivas tribos..6
Tabela 2. Espécies de Clusia utilizadas na medicina popular....................11
Tabela 3. Atividades biológicas descritas para alguns extratos e substâncias
isoladas a partir de espécies do gênero Clusia..........................................13
Tabela 4. Testes histoquímicos utilizados para caracterização em C. grandiflora
....................................................................................................................22
Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo
de C. grandiflora utilizando teste histoquímico...........................................39
Tabela 6. Rendimentos extrativos obtidos de C. grandiflora.....................39
Tabela 7. Valores do CE50 dos padrões e dos extratos etanólicos de C.
grandiflora..................................................................................................41
Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os
extratos etanólicos de C. grandiflora.........................................................47
Tabela 9. Valores da concentração do CI50 dos extratos brutos obtidos de C.
grandiflora.................................................................................................50
Tabela 10. Diâmetro dos halos de inibição formados em função dos extratos de C.
grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli..................................52
Tabela 11. Concentrações inibitória mínima (CIM) dos extratos ativos de C.
grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli..................................54
Tabela 12. Índice de postura de ovos (IPO) e inibição de postura, em porcentagem,
15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora
.................................................................................................................56
Tabela 13. Substâncias identificadas nos extratos hexânicos de C. grandiflora por
CG/EM, sua correlação com o banco de dados e abundância...............76
Tabela 14. Concentrações mínimas necessárias de cada fração para inibir o
crescimento das cepas P. aeruginosa e E. coli......................................91
Tabela 15. Substância majoritária identificada nas frações cromatogradas em coluna
com gel de sílica de C. gradiflora por CG/EM........................................94
Tabela 16. Dados do RMN de H1 da friedelina comparados a literatura
...............................................................................................................99
XIV
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
AAT- Atividade antioxidante total
AGP-01- Linhagem de células tumorais de ascite gástrica
ANOVA- Análise de variância simples
ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC- American Type Culture Collection
BHT- Butil-hidróxitolueno
CCD- Cromatografia em camada delgada
CE50- Concentração de amostra necessária para reduzir em 50% a concentração
inicial
CIM- Concentração inibitória mínima
CG/EM- Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora
CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora
CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora
CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora
CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora
CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora
CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora
CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora
CGREtH: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em hexano da CLV
CGREtD: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em diclorometano da
CLV
CGREtAc: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em acetato de etila
da CLV
CGREtM: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em metanol da CLV
CGREtMA: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora fração em metanol:água da
CLV
CGREtD 3rec: fração 3rec da coluna obtida da fração em diclorometano da CLV do
extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora
XV
CGREtD 4rec: fração 4rec da coluna obtida da fração em diclorometano da CLV do
extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora
CGREtF: fração enriquecida com friedelina de C. grandiflora
CL50- Concentração de amostra letal necessária para reduzir em 50% a
amostragem inicial
CLAE-DAD- Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de arranjo
de fotodiodo
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
CLV- Cromatografia líquida à vácuo
DMEM- Meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco
DMSO- Dimetilsulfóxido
DNFH- 2,4-dinitrofenilhidrazina
DPPH- 2,2-difenil-1-picrilhidrazina
FDA- Food and Drug
HCT-116- Linhagem de células tumorais de cólon humano
IC95- Intervalo de confiança de 95%
IE- Índice de eficácia
IPO- Índice de postura de ovos
MCF7- Linhagem de células tumorais de mama humana
MRC5- Linhagem de fibroblasto humano
MRSA- Staphylococcus aerus resistente à meticilina
MTT- Teste do sal tetrazóleo
NCI- Nacional Cancer Institute
PEG- Polietilenoglicol
PF- Ponto de fusão
Rf- Fator de retenção
RMN 1H- Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
THF- Tetraidrofurano
TSA- Teste de sensibilidade bacteriana
UV- Ultravioleta
VRE- Enterococcus faecium resistente à vancomicina
MHz- Mega-hertz
XVI
µL- Microlitros
mL- Mililitros
mg- Miligramas
µg- Micrograma
M- Molar
µM- Micromolar
m- Metros
mm- Milímetros
µm- Micrometros
nm- Nanômetros
h- Horas
min- Minutos
%- Porcentagem
δ- Deslocamento químico
ºC – graus Celsius
1
1.INTRODUÇÃO
O uso de espécies vegetais com fins de tratamento e cura de doenças
remete ao início da civilização humana, desde o momento em que o homem
despertou a consciência e começou um longo percurso de manuseio, adaptação e
modificação de recursos naturais para o seu benefício (DI STASI, 1998). As
propriedades curativas das plantas foram descobertas inicialmente de forma
empírica e por diversas vezes resultavam da observação de animais. O
conhecimento adquirido acerca de tais propriedades foi então repassado entre as
gerações, permitindo ao longo do tempo o reconhecimento e a diferenciação de
plantas benéficas e tóxicas à sua saúde (FERRO, 2006).
A utilização de produtos naturais pela população vem apresentando um
acelerado acréscimo, sendo na maioria dos casos de forma indiscriminada. Esse
fato se agrava, quando se observa que muitas plantas medicinais vêm sendo
comercializadas sem que haja um eficaz controle da qualidade (SILVA et al., 2010).
Junto ao uso indiscriminado, há o agravamento dos problemas ambientais,
ocorrendo assim, o crescimento da filosofia que busca a manutenção da
biodiversidade e desenvolvimento sustentável. Aliado a esses problemas muitas
espécies provavelmente se extinguiram sem ao menos serem conhecidas (VIEIRA et
al., 2005).
É notória a importância dos estudos para produção de substâncias que
possam servir como protótipo de novas drogas, já que se observa o uso de produtos
naturais na área da saúde, impulsionando as indústrias farmacêuticas a
desenvolverem novos fármacos, que possuam atividades frente a doenças nas quais
o tratamento original mostrava-se ineficaz. São inúmeros os exemplos de
medicamentos que foram desenvolvidos direta ou indiretamente a partir de fontes
naturais, especialmente das plantas, como a morfina, pilocarpina, digitálicos,
atropina, entre outros (YUNES & CALIXTO, 2001).
Segundo o Ministério do Meio Ambiente, o Brasil é responsável pela maior
biodiversidade do mundo, com cerca de 11% a 14% da flora. Apresenta
aproximadamente, até o ano de 2014, mais de 41 mil espécies catalogadas e
milhares ainda desconhecida pela ciência.
2
1.1. Clusiaceae Lindl.
Clusiaceae Lindl. (=Guttiferae Juss.) pertence à ordem Malpighiales (APG III,
2009) e apresenta-se constituídas por plantas lenhosas, de porte arbóreo ou
arbustivo, e raramente lianas (BITTRICH, 2015), muitas com grande valor
econômico fornecendo madeiras-de-lei, frutos comestíveis, resinas e óleos
essenciais (JOLY, 1987). Possuem látex na maioria dos seus tecidos, motivo pelo
qual a família recebeu originalmente o nome Guttiferae, que significa “portando
goma” (FERNANDES, 2007).
A família conta com 14 gêneros e aproximadamente 600 espécies
(STEVENS, 2001 onwards) de ampla distribuição geográfica, com maior ocorrência
nos trópicos (Figura 1). No Brasil ocorrem 12 gêneros (sendo 2 endêmicos) e 127
espécies (43 endêmicas) (BITTRICH, 2015). Alguns gêneros originalmente
pertencentes a essa família foram reorganizados formando outras famílias, como o
gênero Hypericum que, atualmente, pertence à família Hypericaceae (APG III, 2009).
Figura 1. Distribuição geográfica da família Clusiaceae.
Fonte: http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/. Acesso em
26/03/2015
As lâminas foliares de espécies da família Clusiaceae são, normalmente,
espessas, com margens inteiras e com canais de resina. As flores têm pétalas e
sépalas livres e grande número de estames, por vezes, podem se apresentar em
3
fascículos. O fruto, quando há deiscência, abre ao longo do raio de septo
(STEVENS, 2001 onwards).
Do ponto de vista químico e biológico, a família possui diferentes metabólitos
secundários identificados, assim como atividades biológicas, como exemplo, a
presença de terpenoides com atividade frente à leucemia humana (WANG et al.,
2008), flavonoides com efeito antinociceptivo in vivo (BITTAR et al., 2000) e
benzofenonas com atividade antimicrobiana (LOKVAM et al., 2000).
1.2. Clusia L.
O gênero Clusia L. ocorre na região neotropical e reúne cerca de 330-400
espécies semi-epífitas, trepadeiras, arbustivas e arbóreas (BITTRICH & AMARAL,
1996, 1997; STEVENS, 2001 onwards), das quais 68 ocorrem no Brasil, sendo 23
endêmicas (BITTRICH, 2015).
Todas as espécies produzem látex que quando extravasado formam uma
barreira química defensiva contra insetos além da produção de resinas florais que
atuam como recompensa para as abelhas na construção de seus ninhos e
polinização (OLIVEIRA et al., 1999; PORTO et al., 2000; LOKVAM et al., 2000;
LANGENHEIM, 2003; MEDINA et al., 2004). Os frutos são cápsulas carnosas
septífragas com geralmente duas ou mais sementes por lóculo, as sementes podem
ser cobertas por um arilo não-vascularizado (BITTRICH et al., 2013). As folhas de
Clusia variam de tamanho e em geral são inteiras e suculentas, podem ser coriáceas
e não são estipuladas (STEVENS, 2007), o que ajuda na tolerância a condições de
seca.
Quanto à composição química, há presença de benzofenonas, flavonoides e
terpenoides, principalmente. Esses metabólitos estão associados às atividades
encontradas no gênero, como anti-inflamatória (DE MELO et al., 2014) e que serão
discutidos adiante.
1.3. Clusia grandiflora Splitg.
4
A espécie (Figura 2) apresenta-se como árvores hemiepífitas e encontra-se
principalmente na Amazônia em florestas de terra firme, sendo conhecida
popularmente como apuí, cebola da mata e cebola grande da mata (BITTRICH,
2015).
Figura 2. Aspecto das folhas e fruto de Clusia grandiflora Splitg.
Área urbana - Bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro - RJ
Fonte: Mariana M. J. Ribeiro
Apesar da escassez de estudos com a espécie, os encontrados na literatura
mostraram que do látex presente nos caules (LOKVAM et al., 2000) e das resinas
das flores femininas de Clusia grandiflora foram isoladas benzofenonas com potente
atividade biológica, como antimicrobiana (DE CASTRO et al., 2011; SERKEDJIEVA
et al., 1992).
Plantas pouco estudadas necessitam de um controle botânico, químico e
microbiológico para se eleger marcadores que possam servir como controle para
não serem comercializadas de forma equivocada ou com adulterações. Assim, estes
estudos em Clusia grandiflora se fazem importantes, já que se trata de uma espécie
nativa, originada de uma família botânica com grandes aplicações em atividades
biológicas e com uso popular, podendo ser uma promissora fonte de substâncias
que atuem como protótipo na indústria farmacêutica.
5
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo a análise e descrição da organização celular,
a caracterização química dos extratos e a investigação de atividades biológicas de
Clusia grandiflora, ampliando o conhecimento da espécie em estudo.
2.1. Objetivos específicos:
• Caracterização da organização e morfologia celular das folhas e ramos;
• Estudo histoquímico das folhas e ramos;
• Obtenção de extratos brutos;
• Prospecção química dos extratos;
• Avaliação da atividade antioxidante e o doseamento de flavonoides dos
extratos etanólicos;
• Avaliação da atividade citotóxica, antimicrobiana e acaricida dos extratos e
frações;
• Isolamento, purificação e identificação de metabólitos secundários.
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. Aspectos gerais de Clusiaceae, Clusia L. e Clusia grandiflora.
Do ponto de vista taxonômico, segundo Stevens (2001 onward), a família
Clusiaceae inclui-se na ordem Malphighiales e possui 14 gêneros distribuídos
conforme a Tabela 1.
6
Tabela 1. Gêneros pertencentes a Clusiaceae e suas respectivas tribos, conforme
Stevens (2001 onwards).
Família Clusiaceae
Tribos Clusieae Garcinieae Symphonieae
Gêneros Clusia L. Allanblackia
Bentham
Lorostemon
Ducke
Chrysochlamys
Poepp.
Garcinia L. Montrouziera
Planchon &
Triana
Dystovomita
(Engler) D'Arcy
Moronobea
Aublet
Tovomita Aublet Pentadesma
Sabine
Tovomitopsis
Planchon & Triana
Platonia Martius
Symphonia L. f.
Thysanostemon
Maguire
Do ponto de vista anatômico, segundo Metcalfe & Chalk (1950), são
características da família Clusiaceae: estômatos paracíticos em grande parte das
espécies; ocorrência de cristais de oxalato de cálcio em tecidos parenquimatosos;
cavidades e canais esquizógenos frequentes em raízes, caules e folhas, locais onde
vários metabólitos secundários seriam elaborados e secretados (ALVAREZ &
POTIGUARA, 2013).
Do ponto de vista químico, a família Clusiaceae se caracteriza pela presença
de xantonas, benzofenonas, flavonoides, cumarinas, terpenoides, esteroides, entre
outros (OLIVEIRA et al., 1996; FERREIRA et al., 2012). Algumas dessas
substâncias são importantes na biologia de espécies de Clusiaceae, outras já foram
isoladas e submetidas a testes biológicos (OLIVEIRA et al., 1996), demonstrando
7
um grande potencial biodinâmico, o que incentiva o estudo mais aprofundado dos
constituintes químicos produzidos por espécies dessa família.
Espécies do gênero Allanblackia Bentham são comuns e de grande
importância comercial na África. O óleo das sementes de algumas espécies é
utilizado tradicionalmente como alimento funcional, decoctos das folhas e casca são
usados para tratar dor de dente, disenteria e hipertensão, quando em extrato é
aplicado topicamente como um analgésico (CROCKETT, 2015). Xantonas já foram
isolados a partir de espécies do gênero, tendo a xantona 1 (Figura 3) atividade frente
à leucemia (CROCKETT, 2015; AZEBAZE et al., 2009). Xantonas também já foram
isoladas dos gêneros Symphonia L. f. (FROMENTIN et al., 2015); Montrouziera
Planchon & Triana (ITO et al., 2000) e Lorostemon Ducke (FILHO et al, 1973), além
dos gêneros Chrysochlamys Poepp. com atividade antimalárica (MOLINAR-TORIBIO
et al. 2006); Pentadesma Sabine (DJOUFACK et al., 2010) com atividade
antiplasmodial e citotóxica (ZELEFACK et al., 2009) e Garcinia L. (STARK et al.,
2015) com atividade antiproliferativa, in vitro, à células leucêmicas (LI et al., 2015) e
atividade antioxidante (THONG et al., 2015);.
O gênero neotropical Tovomita Aublet está distribuído pela América Central e
Sul (NOGUEIRA et al., 1998). A classe metabólica mais comumente encontrada em
diferentes espécies do gênero também foram as xantonas (DE OLIVEIRA et al.,
1972; GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; MESQUITA et al., 1975; DE OLIVEIRA et al.,
1984; MARQUES et al., 2000), das quais foram descritas atividades fungicida
(ZHANG et al., 2002), citotóxica e antimicrobiana (PECCHIO et al., 2006). Além da
presença dos esteroides 2 e 3 (Figura 3) (GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; DE
OLIVEIRA et al., 1972).
A casca do caule do gênero Garcinia L. é usado tradicionalmente na África
para tratar doenças gastrointestinais e metabólicas e seu uso levou a estudos
fitoquímicos que constataram como principais substâncias bioativas os flavonoides
(STARK et al., 2015). Uma série de trabalhos já foram realizados e mostraram que o
biflavonoide 4 (Figura 3), entre outros, possuem atividade antioxidante (STARK et
al., 2015). Do gênero Pentadesma Sabine também já foram caracterizados
flavonoides (DJOUFACK et al., 2010). O extrato alcoólico dos frutos do gênero é
usado tradicionalmente para febre, constipação, bronquite, diarreia e disenteria
8
(TAMOKOU et al., 2013) e possuem atividade antitumoral e antimicrobiana
(TAMAKOU et al., 2013).
As benzofenonas são metabólitos bastante presentes na família sendo,
encontradas nos gêneros Allanblackia Bentham (LENTA et al., 2007); Tovomitopsis
saldanha Engl. (BITTRICH et al., 2003) e Moronobea Aublet (DIAS et al., 1974;
MARTI et al., 2009) demonstrando atividade antiplasmodial (MARTI et al., 2009). Em
Garcinia L., mostraram atividade antitumoral (IONTA, et al., 2015) e em Pentadesma
Sabine, atividade antiproliferativa (ZELEFACK et al., 2009; WABO et al., 2010).
Plantonia insignis, a espécie mais estudada de Platonia Martius, a árvore
frutífera e madeireira é de maior importância socioeconômica da região Norte do
Brasil (DE SOUZA et al., 2013). É conhecida popularmente como bacuri e na
medicina tradicional é utilizada para o tratamento de diarreia (SILVA et al., 2015),
depressão, doenças de pele e inflamatórias (DA SILVA, et al. 2014). Da espécie
foram também isoladas benzofenonas com atividade leishmanicida, antioxidante,
vasorelaxante, antiplasmodial, antiviral, antinflamatória (SILVA et al., 2015) e tendo a
benzofenona 5 atividades anticonvulsivante (DA SILVA, et al. 2014).
O gênero Symphonia L.f. é, principalmente, representado pela espécie
Symphonia globulifera L.f.. As folhas, o látex e o caule são amplamente utilizados na
medicina tradicional da África e América do Sul contra doenças parasitárias, dores
no corpo, sarna, tosse, febre, malária, diabetes, entre outras (FROMENTIN et al.,
2015). A literatura descreve a presença, principalmente, das benzofenonas na
espécie, que apresentaram atividade biológica interessante, como antiplasmodial,
antioxidante, antiparasitária, antimicrobiana e citotóxica (FROMENTIN et al., 2015).
Outra classe química também encontrada foi a das isocumarinas, sendo a
cumarina 6 (Figura 3) isoladas do gênero Montrouziera Planchon & Triana (ITO et
al., 2000).
Tovomitopsis Planchon & Triana é um gênero pequeno quanto ao número de
espécies e está bastante ligado ao gênero Clusia L., sendo ainda pouco investigado
sobre o ponto de vista químico (BITTRICH et al., 2003). Um estudo realizado
demonstrou atividade antibacteriana do extrato etanólico das folhas de Tovomitopsis
psychotriifolia contra Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Pseudomonas
9
aeruginosa, sendo a substância ativa identificada como o ácido 7 (Figura 3)
(SETZER et al., 1995).
Os gêneros, Dystovomita (Engler) D'Arcy e Thysanostemon Maguire, não
apresentaram, até o momento, estudos do ponto de vista químico e farmacológico
descritos nas bases de dados consultadas.
Figura 3. Estrutura de metabólitos secundários encontrados em Clusiaceae
(CROCKETT, 2015; AZEBAZE et al., 2009; GABRIEL & GOTTLIEB, 1972; DE
10
OLIVEIRA et al., 1972; STARK et al., 2015; DA SILVA, et al. 2014; ITO et al., 2000;
SETZER et al., 1995).
Quanto à Clusia L., dados da literatura mostram que suas espécies
apresentam grande número cavidades secretoras, muitas destas preenchidas de
látex (LÜTTGE E DUARTE, 2007; METCALFE E CHALK, 1950). Anatomicamente,
as folhas ainda podem apresentar características comumente presentes em
espécies que se adaptaram a ambientes xéricos, como por exemplo: cutícula
espessa, número elevado de estômatos e abundância de tecido mecânico
(FERNANDES, 2007). Algumas espécies são amplamente utilizadas na medicina
popular, como mostra a Tabela 2. Os estudos químicos e biológicos mostraram
ainda atividades biológicas de extratos e substâncias isoladas como terpenoides,
cumarinas, xantonas, flavonoides e, principalmente, benzofenonas, apresentados na
Tabela 3.
11
Tabela 2. Espécies de Clusia utilizadas na medicina popular.
Espécie
Nome popular Origem Parte utilizada Uso medicinal popular Referência
Clusia amazonica
Planch. & Triana
capei e cope Brasileira raiz e casca lepra HASHIMOTO, 2002
Clusia coclensis
Standl.
azahar de
monte, copey e
copeicillo
Costa
Rica
folhas hipertensão arterial GARCIA-GONZÁLEZ &
MATAMOROS, 1998
Clusia flava Jacq. não informado México folhas carminativo, dores de
cabeça, feridas e sífilis
BARRIOS et al., 1991
Clusia insignis Mart. apuí; cebola-
brava, e guapoí
Brasil resinas constipação e cicatrizante de
fissuras nos seios
HASHIMOTO, 2002
Clusia lineata (Benth.)
Planch. & Triana
came Peru cascas e caules reumatismo SANZ-BISET et al.,
2009
Clusia opaca Maguire não informado Brasil resina cicatrização LANGENHEIM, 2003
Clusia palmicida Rich.
ex Planch. & Triana
Came Peru cascas reumatismo, hérnia inguinal e
ossos quebrados
SANZ-BISET et al.,
2009
Clusia planchoniana
Engl.
não informado Colômbia resina dores de dente LANGENHEIM, 2003
Clusia salvinii Donn.
SM.
orelha de
coyote
México não informado gonorreia e dores renais YASUNAKA et al.,
2005
12
Clusia purpurea
(Splitg.) Engl.
cebola-brava Brasil entrecasca antisséptico e cicatrizante de
feridas
FENNER et al., 2006.
13
Tabela 3. Atividades biológicas descritas para alguns extratos e substâncias isoladas a partir de espécies do gênero Clusia.
Espécie Substâncias / Extratos Atividade Referência
Clusia amazonica
Planch. & Triana
extrato aquoso das folhas e caules leishmanicida ODONNE et al., 2009
Clusia coclensis
Standl.
extrato aquoso das folhas hipotensor em ratos
GARCÍA-GONZÁLEZ
& MATAMOROS,
1998
Clusia columnaris Engl. I3,II8-binaringenina (flavonoide) antinociceptivo BITTAR et al., 2000
Clusia flava Jacq. extrato metanólico das folhas leishmanicida PERAZA-SÀNCHEZ
et al., 2007
Clusia guatemalensis
Hemsl.
extrato metanol/diclorometano (1:1)
das folhas
inibição da enzima transcriptase
reversa do vírus HIV-1
HUERTA-REYES et
al., 2004
Clusia hilariana Schltdl. ácido oleanólico (terpenoide)
nemorosona A e B (benzofenona)
toxidez sobre larvas R. prolixus e
promoção de atraso da ecdise
promoção de atraso de ecdise de
larvas de R. prolixus
KELECON et al.,
2002
KELECON et al.,
2002
Clusia insignis Mart. resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000
Clusia lanceolata
Cambess
resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000
Clusia massoniana extrato metanol/diclorometano (1:1) antiviral HUERTA-REYES et
14
Lundell das folhas al., 2004
Clusia nemorosa G.
Mey.
ácido betulínico (terpenoide)
prevenção da obesidade em
camundongos
DE MELO et al., 2009
Clusia palmana Standl. vitexina e epicatequina (flavonoides) neutralização do efeito hemorrágico
induzido por veneno de Bothrops
asper em ratos
CASTRO et al., 1999
Clusia paralicola G.
Mariz
clusiparalicolina A e B (derivados
bifenila)
promotora de cisão em fitas de DNA
e atividade antitumoral
SEO et al., 1999
Clusia quadrangula
Bartlett
extrato diclorometano/metanol (1:1)
das folhas
antiviral HUERTA-REYES et
al., 2004
Clusia renggerioides
Planch. & Triana
resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000
Clusia rosea Jacq.
guttiferona E e xantochimol
(benzofenona)
nemorosona (benzofenona)
inibição dos efeitos citopáticos da
infecção pelo vírus HIV em células
linfoblastóides humanas
citotoxidez contra as linhagens de
células humanas HeLa, HEp-2
(carcinoma laríngeo), PC-3 (câncer
de próstata) e células de
neuroblastoma
GUSTAFSON et al.,
1992
CUESTA-RUBIO et
al., 2002; DÍAZ-
CARBALLO et al.,
2008a
15
nemorosona (benzofenona)
bloqueio da proliferação e indução
de apoptose em linhagens de
células de leucemia
DÍAZ-CARBALLO et
al., 2008b
Clusia spiritu-
sanctensis G.Mariz et
Weinberg
resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000
Clusia torresii Standl.
vitexina e epicatequina (flavonoides)
clusianona e 7-epiclusianona
(benzofenona)
neutralização do efeito hemorrágico
induzido por veneno de Bothrops
asper em ratos
inibição da infecção pelo vírus HIV-
1 na linhagem de células humanas
C8166 (células T linfoblastóides)
CASTRO et al., 1999
PICCINELLI et al.,
2005
Clusia weddelliana
Planch. & Triana
resinas das flores masculinas antimicrobiano PORTO et al., 2000
16
Das resinas florais de Clusia grandiflora já foram identificadas as
benzofenonas 8 e 9 e isolada a benzofenona 10 (OLIVEIRA, 1999; LOKVAM et al.,
2000). Do látex do caule foram isoladas as benzofenonas 11 e 12 (LOKVAM et al.,
2000) (Figura 3). As substâncias 10 e 11 mostraram atividade antimicrobiana contra
os patógenos do mel Paenibacillus larvae e Paenibacillus alvei (LOKVAM et al.,
2000). As resinas das flores estaminadas mostraram atividade antimicrobiana contra
S. aureus, B. subtilis, e C. albicans em ensaio de bioautografia, enquanto as resinas
florais pistiladas apresentaram atividade antimicrobiana contra S. aureus e B. subtilis
(PORTO et al.,2000).
Figura 4. Benzofenonas identificadas em Clusia grandiflora (OLIVEIRA, 1999;
LOKVAM et al., 2000).
17
Assim, a partir do levantamento bibliográfico, constata-se que a espécie
estudada pertence a uma família com grande potencial farmacológico e diferentes
classes de substância, sendo os terpenoides a classe mais abundante, o que
justifica o estudo de C. gradiflora.
3.2. Terpenoides em Clusia.
Os terpenoides ou terpenos formam uma diversificada classe de metabólitos
secundários de origem vegetal e são considerados como derivados do isopreno,
uma molécula com cinco átomos de carbono ou unidade C5 (MCNAUGHT &
WILKINSON, 1997). Os terpenoides se classificam em monoterpenos,
sesquiterpenos, diterpenos, sesterpenos, triterpenos e tetraterpenos, seguindo o
número de unidades isoprênicas que os formam. O uso ampliado dos terpenoides na
indústria e na medicina, desperta o interesse por novas substancias desta classe
(UGAZ, 1994).
Os terpenos, de modo resumido, são formados a partir da condensação de
uma unidade da acetoacetil-CoA com uma molécula da acetil-CoA, que após uma
hidrólise se reduz a mevalonato. O mevalonato é, então, convertido em pirofosfato
de isopentenila ou isopreno ativo. A polimerização do mevalonato vai originar
moléculas de cadeias carbonadas crescentes de cinco em cinco átomos de carbono.
O isopreno ativo e seu isômero formam o pirofosfato de geranila (monoterpeno) que
é responsável pela formação dos demais monoterpenos. Ligações cabeça-cauda
entre geranila e isopentenila geram sesqui- e diterpenos, ligação cauda-cauda entre
duas moléculas de pirofosfato de farnesila (sesquiterpeno) origina o esqualeno,
precursor da maioria dos triterpenos (Figura 5) (SIMÕES et al., 2007).
18
Figura 5. Esquema geral da biossíntese de terpenoides (SIMÕES et al., 2007).
Os terpenos fazem parte dos metabólitos especiais com maior ocorrência em
espécies de Clusia, sendo os sesquiterpenos os de maior ocorrência, seguido dos
triterpenos (VIRGINIO, 2015).
Os triterpenos são estruturas relativamente complexas, geralmente são
tetracíclicos e pentacíclicos e podem conter grupos hidroxilas, cetonas, aldeídos e
ácido carboxílicos (UGAZ, 1994), conforme mostra a Figura 6.
19
Figura 6. Exemplos de triterpenos (UGAZ, 1994).
Dentre os triterpenos identificados em Clusia destacam-se os pentacíclicos,
sendo de maior ocorrência o tipo friedelano (VIRGINIO, 2015).
Os triterpenos friedelano podem ser classificados em cinco grupos conforme
sua estrutura química: friedelanos “normais” (Tipo I), secofriedelanos (Tipo II),
norfriedelanos (Tipo III), dímeros de friedelanos (Tipo IV) e friedelanos rearranjados
(Tipo V). Essas substâncias são comumente encontradas nas famílias Celastraceae,
Hippocrateaceae, Euphorbiaceae, Flacourtiaceae e Clusiaceae. Algumas destas
substâncias têm sido utilizadas como protótipos farmacológicos nos estudos de
processos biológicos ou para o desenvolvimento de medicamentos (SHAN et al.,
2013). Dentre os friedelanos, a 3-oxo-fridelina (13) (Figura 7) foi o triterpeno com
maior ocorrência em espécies de Clusia (VIRGINIO, 2015) e já foi identificada
também em diferentes gêneros de Clusiaceae (SPINO et al., 1995; MARQUES et al.,
2000; MEDINA et al., 2004; AZEBAZE et al., 2009).
A substância 13 é um friedelano “normal” e possui diversos estudos
mostrando sua atividade anti-inflamatória por diminuir edemas induzidos em ratos
(SHAN et al., 2013; SHIMIZU & TOMOO, 1994), atividade antimicrobiana in vitro
sobre S. aureus, E. coli e também contra o fungo Aspergillus niger (SINGH &
DUBEY, 2001) e atividade citotóxica (ZHENG, 1994). Possui também ação
alelopática (SANTOS et al., 2008) e antiulcerogênica (QUEIROGA et al., 2000)
20
quando associada ao epi-friedelanol (14) (Figura 7) (SANTOS et al., 2008). Assim
como 13, 14 é um friedelano “normal” (SHAN et al., 2013) e estudos relatam que
este também possui ação anti-inflamatória (SUPUDOMPOL et al., 2005) e
antitumoral (KUNDU et al., 2000).
Figura 7. Estrutura química dos triterpenos 13 e 14 (SHAN et al., 2013).
A substância 13 foi identificada nas espécies C. nemorosa (FERREIRA et al.,
2015), C. burlemarxii (RIBEIRO et al., 2011), C. obdeltifolia (TEIXEIRA et al., 2006) e
C. schomburgkiana (MEDINA et al., 2004). O trabalho de Medina e colaboradores
(2004) explorou a composição de ceras epicuticulares para caracterizar espécies
mediante marcadores químicos, sendo 13, junto ao triterpeno taraxerol (15), os
marcadores em C. grandiflora.
Figura 8. Estrutura química do triterpeno 15.
4. MATERIAS E MÉTODOS
4.1. Levantamento bibliográfico
21
O levantamento bibliográfico da família Clusiaceae foi realizado entre os anos
de 2014 3 2015. Foi realizada a pesquisa sobre dados fitoquímicos, usos medicinais,
atividade biológicos de extratos, substâncias isoladas e triterpenos em bases de
dados on-line (Scopus, Web of Science e SciFinder).
4.2. Coleta da planta
Partes vegetativas e reprodutivas (raiz adventícia, ramo, folha e flor
masculina) de Clusia grandiflora foram coletadas no dia 04/12/2012 em área urbana
na Rua Zara no Bairro Jardim Botânico, Rio de Janeiro – RJ.
4.3. Identificação da planta
A espécie coletada foi identificada pela Profa. Adriana Quintella Lobão (UFF) e
um voucher encontra-se depositado no Herbário do Jardim Botânico do Rio de
Janeiro sob número de registro RB 603161.
4.4. Descrição anatômica
Para a descrição da organização celular, foram selecionados folhas e ramos
que foram fixados em álcool 70%. Foram retirados fragmentos da região mediana do
pecíolo e ramos, e da lâmina foliar na região da nervura principal, região intercostal
e bordo. O ramo e o pecíolo foram emblocados em polietilenoglicol (PEG) puro
(Proquímios), conforme proposto por Burger e Richter (1991) e lâmina foliar em
historesina (Leica), conforme metodologia do laboratório do Jardim Botânico.
Posteriormente, secções foram realizadas em micrótomo rotativo RMC
Products MT990 e coradas em Azul de Astra (Sigma-Aldrich) e Fucsina Básica
(Vetec), conforme indicado por Johansen (1940). As secções já coradas foram
dispostas em lâminas semi-permanentes (montadas com glicerina 50%) e
visualizadas e fotografadas em microscópio óptico Primo Star Zeis.
4.5. Testes histoquímicos
22
Para os testes histoquímicos foi utilizado material fresco proveniente do ramo
e folhas, que foram seccionados transversalmente à mão livre. As folhas foram
também emblocadas em historesina e seccionadas em micrótomo para observação
em reagentes fluoróforos.
O material foi tratado com diferentes reagentes para a detecção de
metabólitos secundários (Tabela 4), conforme metodologia proposta por Sant’Anna-
Santos et al. (2006) com modificações.
Tabela 4. Testes histoquímicos utilizados para caracterização em Clusia grandiflora.
Substância Reagente Referência
Substâncias lipofílicas Sudam III
Sudam IV
Auramina 0,05%
(JOHANSEN, 1940)
(JOHANSEN, 1940)
(CONSIDINE & KNOX, 1979)
Flavonoides Cloreto de alumínio (CHARRIÈRE-LADREIX, 1976)
Alcaloides Reagente de Wagner (FURR & MAHLBERG, 1981)
Taninos Vanilina Clorídrica (MACE & HOWELL, 1974)
Substâncias fenólicas Cloreto férrico (JOHANSEN, 1940)
Carboidratos: Amido
Celulose
Lugol
Calcoflúor
(JOHANSEN, 1940)
(HERTH & SCHNEPF, 1980)
As secções coradas foram dispostas em lâminas semi-permanentes
(montadas com glicerina 50%) e visualizadas e fotografadas em microscópio óptico.
As secções coradas com fluoróforos Auramina (Excitação 450-480
nanometros (mn)/ Emissão 515 nm) e Calcoflúor (Excitação 360-370 nm/ Emissão
420 nm) foram visualizadas e fotografadas em microscópio de fluorescência com
software LAS AF LITE (versão 2.6.0) (Leica Microsystems) com confocal de
varredura a laser Leica TCS SPE, acoplado a câmera CoolSnap anexado a um BX
Olympus 50.
Foram utilizadas lâminas com o material fresco sem o uso de reagentes como
controle.
4.6. Processamento do material botânico
23
As partes vegetativas e reprodutivas coletadas foram secas em estufa Solab
SL com circulação de ar forçada a 40ºC e, posteriormente, reduzidas a pequenos
fragmentos com o uso de um processador Tron.
4.7. Extração do material botânico
Raízes adventícias, ramos, folhas e a flores processados foram submetidos à
extração por maceração estática em hexano VETEC (a cada uma semana foi feita a
troca do solvente tendo um total de quatro semanas) e, posteriormente, em etanol
VETEC (a cada uma semana foi feita a troca do solvente tendo um total de cinco
semanas). O material extraído foi concentrado em evaporador rotatório Buchi R 114,
resultando na obtenção dos extratos brutos hexânicos e etanólicos. Para realização
dos estudos químicos e biológicos foi obtido autorização junto ao CGEN nº
010415/2013-0.
4.8. Atividade antioxidante
A avaliação da atividade antioxidante total (AAT) dos extratos brutos
etanólicos foram determinados pelo método do sequestro do radical livre DPPH (2,2-
difenil-1-picrilhidrazila) (Sigma-Aldrich), conforme metodologia proposta por Silva &
Paiva (2012).
O experimento consta de uma curva de calibração de diferentes
concentrações do DPPH, seguido das leituras da absorvância, feita em
espectrofotômetro UV-VIS Biospectro SP 220, de três ensaios independentes em
diferentes concentrações dos extratos e padrões BHT (Purifarma) e rutina (Sigma-
Aldrich), cada um em triplicata, com exceção para os extratos brutos de folhas e
flores, em que um dos ensaios foi realizado em duplicata. Como controle negativo foi
utilizado o radical DPPH.
O potencial antioxidante dos extratos foi avaliado através da comparação do
seu CE50 – concentração de amostra necessária para reduzir em 50% a
concentração inicial de DPPH - com dos padrões.
Foi observado, ainda, o comportamento cinético da reação dos extratos com o
radical DPPH por 30 minutos (min), através de uma curva dose-resposta relativa ao
decréscimo do percentual remanescente de DPPH em função do tempo.
24
As significâncias estatísticas das diferenças obtidas entre os ensaios para
uma mesma amostra e entre amostras diferentes foram avaliadas usando ANOVA
(análise de variância simples). Em caso de rejeição da hipótese nula por ANOVA,
entre amostras diferentes, foi aplicado o teste de Tukey-Kramer.
4.9. Dosagem de flavonoides
O teor de flavonoides totais expressos como flavonas e flavonóis foi
determinado nos extratos brutos etanólicos utilizando método colorimétrico
envolvendo reação com cloreto de alumínio, conforme metodologia descrita por Silva
& Paiva (2012).
O experimento consta de uma curva de calibração da rutina em diferentes
concentrações, onde foram adicionadas alíquotas etanol (VETEC), solução de
cloreto de alumínio 10% (Proquímios), acetato de potássio 1 M (VETEC) e água
destilada. A mistura reacional foi incubada à temperatura ambiente por 30 min. Após
esse período, as absorvâncias foram lidas em espectrofotômetro. Em seguida, foram
realizadas as leituras das absorvâncias dos extratos etanólicos em três ensaios
independentes, cada um em triplicata, com o mesmo procedimento aplicados às
soluções de rutina.
As significâncias estatísticas das diferenças obtidas entre os ensaios para
uma mesma amostra e entre amostras diferentes foram avaliadas usando ANOVA
(análise de variância simples). Em caso de rejeição da hipótese nula por ANOVA,
entre amostras diferentes, foi aplicado o teste de Tukey-Kramer. Para avaliar a
relação entre os teores de flavonoides e a atividade antioxidante dos extratos foi
empregado o teste de correlação de Pearson.
4.10. Atividade citotóxica
A avaliação citotóxica foi realizada em colaboração com o Laboratório de
Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Pará coordenado pela Profª. Drª. Raquel Carvalho Montenegro em colaboração com
a aluna de doutorado Laine Celestino.
O objetivo do teste foi verificar a toxidez in vitro dos extratos em linhagens de
células tumorais (HCT-116 = cólon humano, AGP-01 = ascite gástrica, MCF7 =
25
mama-humano) e uma linhagem de fibroblasto humano (MRC5 =fibroblasto humano)
através do teste com sal de tetrazóleo (MTT) [3-(4,5-dimetil-2-tiazol) -2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazóleo], seguindo metodologia proposta por Mosmann (1983), com
modificações.
Os extratos e as células já preparadas em meio adaptado para as linhagens
foram plaqueados e incubados por 72 horas (h), em seguida, foram centrifugadas. O
sobrenadante foi aspirado e adicionado a 100 μL de solução de MTT 0,5 mg/mL em
DMEM, a placa foi colocada em estufa a 5 % de CO2 por 3 h. As placas foram
novamente centrifugadas e o sobrenadante foi aspirado, o seu precipitado foi
ressuspenso em 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e agitado por 10 min, até
completa dissolução dos cristais de formazan. As placas foram analisadas em
espectrofotômetro a um comprimento de onda de 570 nm. A doxorrubicina foi
utilizada como controle positivo. A partir deste ensaio, foi obtido o percentual de
inibição de cada extrato através da média±desvio-padrão no programa Excel, e os
mais ativos foram selecionados para a realização da curva concentração-resposta
(50μg/mL-0,312μg/mL) ao qual também foi obtido a média±desvio-padrão.
Foi verificada também a atividade hemolítica, plaqueando-se os eritrócitos
coletados de camundongos junto aos extratos em triplicata e na concentração de
200 μg/mL. As placas foram incubadas por 1 h sob agitação e, posteriormente,
centrifugadas. O sobrenadante foi transferido para outra placa e foi realizada a
leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 450 nm. Triton X-100
(0,5%) e DMSO foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente.
A concentração média capaz de provocar 50% do efeito máximo (CE50) e seu
respectivo intervalo de confiança (IC95) para cada amostra foi obtido a partir da
regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão 5.0.
4.11. Atividade antimicrobiana
A avaliação antimicrobiana foi realizada em colaboração com o Laboratório de
Antibióticos, Bioquímica, Ensino e Modelagem Molecular do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense coordenado pela Profª. Drª. Helena Carla Castro
em colaboração com a aluna Louise Azulay Palavecino.
O objetivo do teste foi identificar o perfil de sensibilidade de cepas
bacterianas (TSA) ATCC (American Type Culture Collection) gram-positivas
26
(Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e S. simulans) e
gram-negativas (Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae) frente aos
extratos brutos. As placas foram semeadas e, em seguida, os discos de
antimicrobiano foram depositados na sua superfície. Nos respectivos discos foram
adicionados 5 μL de cada extrato, de controle positivo e de controle negativo. Para
finalizar, as placas foram armazenadas na estufa a 35 °C e sua leitura foi realizada
entre 16 e 18 h após o teste. Os testes foram realizados em triplicata e os extratos
com ausência de cepas ao seu redor tiveram seus halos de inibição médios medidos
em milímetros. Os extratos com atividade no teste anterior foram submetidos ao
teste de concentração inibitório mínima (CIM), conforme metodologia proposta pelo
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) apenas para as cepas inibidas no
TSA. As placas foram semeadas e armazenadas a 35 °C por 16-20 h em incubador
em ar ambiente. O CIM foi realizado em triplicata e determinado a olho nu, através
da turbidez ou não dos poços presentes na placa, e em seguida, adicionou-se o
corante azul de resazurina (7-hidroxi-10-oxidofenoxazina-10-ium-3-ona) diluída em
água destilada estéril (0,1 mg/mL) em todos os poços.
4.12. Atividade acaricida
A avaliação acaricida foi realizada em colaboração com o Laboratório de
Metabolismo de Parasitos do Instituto de Biologia da Universidade Federal
Fluminense e coordenado pela Profª. Drª. Evelize Folly das Chagas.
O objetivo foi avaliar a atividade dos extratos brutos hexânicos no carrapato
bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus conforme metodologia descrita por
Drummond e colaboradores (1973), com modificação no tempo de imersão para 1
min. As fêmeas adultas (teleóginas) após a imersão nos extratos (5 mg/mL) diluídos
em 5 % de DMSO, 47,5 % de etanol e 47,5 % de água destilada, foram separadas
em grupos de 10, colocadas em placas de Petri, pesadas e incubadas. A
mortalidade das fêmeas foi avaliada, usando como parâmetro a movimentação dos
túbulos de Malpighi observada em estereomicroscópio. Os ensaios foram feitos em
duplicata utilizando como controle negativo 5 % de DMSO, 47,5 % de etanol e 47,5
% de água destilada.
27
Para avaliar o índice de ovopostura foram utilizados os dados dos pesos das
teleógenas vivas e dos ovos postos após 15 dias do tratamento, conforme
metodologia descrita por Ribeiro e colaboradores (2008).
Índice de postura (IPO) = peso dos ovos postos (g)
peso inicial das fêmeas (g)
% de inibição de postura = (IPO grupo controle – IPO grupo tratado) x 100
IPO grupo controle
Os dados foram analisados estatisticamente utilizando o software Graph Pad
Prism e a porcentagem de mortalidade das fêmeas foi calculada de acordo com a
fórmula de Abbot (1925).
4.13. Perfil cromatográfico dos extratos brutos
Os extratos brutos hexânicos e etanólicos das raízes adventícias, ramos,
folhas e flores foram analisados por diferentes técnicas para a investigação e
comparação quanto à presença de metabólitos secundários.
4.13.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD)
Foi preparada uma solução de 20 mg/mL dos extratos brutos, onde, com a
ajuda de um capilar graduado, uma alíquota de 15 µL foi aplicada em placas
cromatográficas de gel de sílica 60 F254 Merck. As placas preparadas foram eluídas
em diferentes gradientes de concentração de hexano (VETEC), acetato de etila
(VETEC) e metanol (VETEC) em ácido acético (VETEC). Todas as placas foram
reveladas em lâmpada de luz ultravioleta (UV) BOITTON em comprimentos de onda
254 e 365 nm, para identificação de cromóforos. Utilizaram-se também as soluções
de vanilina sulfúrica, DPPH, Dragendorff e 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH),
conforme metodologias descritas por Wagner & Bladt (1987) e Mensor e
colaboradores (2001), como reveladores químicos.
28
4.13.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector
de arranjo de fotodiodo (CLAE-DAD)
As análises por CLAE-DAD foram realizadas em cromatógrafo ParkinElmer,
sistema Flexar SQ 300 MS, detector de arranjos diodo (DAD) e coluna Symmetry
Shield RP-18 (Waters), com temperatura de 25 ºC. Os extratos brutos hexânicos e
etanólicos foram preparados em tetraidrofurano (THF) (grau CLAE/UV VETEC) e
metanol (grau CLAE/UV VETEC), respectivamente, com concentração 5 mg/mL com
o auxílio do banho ultrassom UltraCleaner 1400 Unique e filtração.
Para análise dos extratos hexânicos foi utilizado sistema em gradiente que
consistiu de uma fase móvel: água Milli-Q (Millipore) (A) e acetonitrila (grau cLAE
VETEC) (B), ambos com 0,05% de ácido trifluoroacético (VETEC), com vazão de 0,8
mL/min, variando de 25% a 55% de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min),
mantendo os 100% até 30 min. Entre as análises foi realizado o reequilíbrio da
coluna que consistiu de gradiente linear de 100% a 25% de B (0 – 5 min) seguido de
5 min com 25% de B.
Para análise dos extratos etanólicos foi utilizado sistema em gradiente que
consistiu de uma fase móvel: água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de ácido
trifluoroacético, com vazão de 0,8 mL/min, variando de 10% a 45% de B (0 – 40
min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100% até 55 min. Entre as
análises foi realizado o reequilíbrio da coluna que consistiu de gradiente linear de
100% a 10% de B (0 – 10 min) seguido de 5 min com 10% de B.
Os cromatogramas foram analisados nos comprimentos de onda 220, 270,
335 e 360 nm para monitoramento.
4.13.3. Perfil por ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H)
Os extratos brutos hexânicos e etanólicos, preparados, em quantidade de 10
mg e dissolvidos em 600-700 µL de clorofórmio e metanol deuterado (Sigma-
Aldrich), respectivamente, foram enviados ao Laboratório Multiusuário de RMN da
Universidade Federal Fluminense (LaReNM-UFF) onde foram analisados por RMN
de 1H em equipamento Varian modelo VNMRS 300 MHz e 500 MHz.
29
4.13.4. Perfil por cromatografia com fase gasosa acoplado à espectrômetro de
massas (CG-EM)
Uma alíquota dos extratos brutos hexânicos foram enviados para Plataforma
de Metodologia Analítica de Farmanguinhos-FIOCRUZ. A análise foi realizada em
cromatógrafo com fase gasosa AGILENT modelo 6890N, acoplado a um detector de
massas modelo 5973N, utilizando coluna composta por 5% fenil e 95%
metilpolisiloxano modelo J&W 122-5532 DB-5ms e marca AGILENT (30 m x 0,25
mm, 0,25 µm de espessura), tendo hélio como gás de arraste com fluxo de 2 mL/min
e injeção de 1 μL da amostra. A temperatura do injetor foi de 300 ºC, detector a 280
ºC e a seguinte programação de temperatura: 150 ºC aumentando 10 ºC por minuto
até atingir os 300 ºC, mantendo-se em 300 ºC por 15 min. Os espectros de massa
obtidos na análise foram confrontados com o banco de dados Wiley.
4.14. Fracionamento do extrato bruto
O extrato bruto etanólico dos ramos de C. grandiflora foi fracionado por
cromatografia líquida à vácuo (CLV), conforme metodologia descrita por Coll &
Bowden (1986), com modificações. O sistema à vácuo foi montado, o funil
sinterizado foi preenchido com gel de sílica 5-25 µ (Merck) e o extrato foi aplicado na
forma de pastilha em celite 545 (Fluka). Foi utilizado gradiente de polaridade
crescente, utilizando-se hexano, diclorometano, acetato de etila, metanol e metanol:
água, obtendo as respectivas frações.
Os solventes foram removidos em evaporador rotatório. As frações obtidas
foram analisadas por CCD de acordo com o item 4.2.11.1.
4.15. Isolamento e purificação de substâncias
A fração dos ramos de C. grandiflora obtida em diclorometano foi
recromatografada em coluna com gel de sílica 60 (0.063 – 0.200 mm) (Merck)
utilizando como eluentes hexano, acetato de etila e metanol, em gradientes de
polaridades crescentes. As frações resultantes foram agrupadas após análise por
CCD, utilizando lâmpada de luz UV e vanilina sulfúrica como reveladores.
30
As frações reveladas anteriormente, quando oportunas foram recristalizadas
em acetato de etila e etanol, visando a obtenção de substâncias puras. Os cristais
tiveram seu ponto de fusão (PF) aferidos em Fisher – Johns.
4.16. Elucidação estrutural de substâncias
As substâncias obtidas foram enviadas para Plataforma de Metodologia
Analítica de Farmanguinhos-FIOCRUZ para análise por CG/EM e para o Laboratório
Multiusuário de RMN da Universidade Federal Fluminense (LaReNM-UFF) onde
foram analisados por RMN 1H.
5. RESULTADOS E DISCUSSÂO
5.1. Descrição anatômica
A utilização da anatomia na sistemática é útil tanto para a identificação prática
quanto para a caracterização das relações filogenéticas entre as plantas (JUDD et
al., 1999), especialmente quando associados aos aspectos ecológicos e
comparativos (METCALFE & CHALK, 1983), além de serem o primeiro passo de
identificação de uma espécie vegetal no controle de qualidade (DUARTE &
MENARIM, 2006).
A distinção morfológica do gênero é baseada, principalmente, em materiais
vegetativos e frutos (PIPOLY et al., 1998). Em C. grandiflora foram descritas as
características morfológicas dos ramos e folhas.
O pecíolo de C. grandiflora em corte transversal da região mediana,
apresentou epiderme unisseriada e cutícula espessa que formavam flanges cobrindo
toda a epiderme (Figura 9A). Subjacente à epiderme, observou-se de 10-12
camadas de colênquima anelar com estruturas secretoras em abundância (Figura
9A e 9B). Nas camadas mais internas do córtex, posterior ao colênquima,
apresentaram-se células de parênquima fundamental com paredes delgadas e
tamanhos variados e presença de cavidades secretoras e idioblastos com drusas
(Figura 9B). O sistema vascular do pecíolo apresentou formato de arco aberto com
as extremidades fletidas para o interior (Figura 9C), sendo os feixes do tipo colateral.
Verificou-se ainda presença de feixes acessórios na região do parênquima
31
fundamental cortical (Figura 9B). O sistema vascular descrito, já foi mencionado por
Paula (1976) em Clusia aff. macropoda, porém os feixes acessórios estavam
ausentes. No xilema, os elementos de proto e metaxilema estavam dispostos em
séries radiais (Figura 9D). Na região correspondente à medula, ocorreram células
parenquimáticas de tamanhos variados (Figura 9C).
Observou-se um mesofilo, em plano transversal (Figura 9E – 9G), isobilateral,
hipostomático e epiderme unisseriada, coberta por cutícula espessa que penetrou
entre as paredes, formando flanges cuticulares. Abaixo da epiderme, observou-se a
presença de uma hipoderme com cerca de duas camadas de células elípticas de
tamanho variado na face adaxial e uma camada na fase abaxial. A hipoderme é
comum no gênero Clusia (METCALFE & CHALK, 1950) e já foi descrita em Clusia
aff. macropoda (PAULA, 1976), Clusia hilariana (SILVA et al., 2005), Clusia
spiritu'sanctensis (SCHNEIDER, 1985) e Clusia criuva (FERNANDES, 2007). Para
Esau (1974), a hipoderme é uma camada subepidérmica e funciona como um tecido
armazenador de água, estando presente principalmente em xerófitas. O parênquima
paliçádico apresentou-se em duas camadas de células de tamanho variado próximo
à face adaxial e uma camada próximo à face abaxial. O parênquima lacunoso
possuiu espaços intercelulares grandes e abundantes, como descrito para outras
espécies (FERNANDES, 2007), com 10-12 camadas de células de tamanho variado,
onde foram encontradas cavidades secretoras e idioblastos com drusas. A
vascularização foi feita por diversos feixes recobertos por fibras presentes no
parênquima lacunoso próximo à face adaxial.
No plano transversal da lâmina foliar em nível da nervura principal (Figura 10)
observou-se uma epiderme unisseriada, com cutícula espessa que circundou a
célula epidérmica (Figura 10B e 10C). Subjacente à epiderme, estiveram presentes
células colenquimáticas com presença de diversas cavidades secretoras e
idioblastos com drusas, seguido de parênquima fundamental cujas células
aumentavam de tamanho em direção à medula (Figura 10A, 10D e 10E). O sistema
vascular foi formado por cerca de 30 feixes colaterais em forma circular, diferente do
pecíolo. Grupos de fibras perivasculares ocorreram junto ao tecido floemático em
toda a extensão do sistema vascular (Figura 10A e 10F). Inseridos na medula
parenquimática, observou-se de 9-10 feixes acessórios dispostos em duas faixas.
Esse sistema vascular já foi descrito na nervura e no pecíolo de Clusia obdeltifolia
(SILVA et al., 2014).
32
O bordo foliar (Figura 11A – 11C) apresentou uma epiderme unisseriada com
células alongadas, com cutícula bastante espessa que, não só formaram flanges,
como circundou toda a célula epidérmica (Figura 11A). As camadas subjacentes à
epiderme foram ocupadas por células do parênquima fundamental com a presença
de cavidades secretoras e vascularização composta por um único feixe, com xilema
voltado para a face adaxial e floema para a face abaxial, com fibras perivasculares
que os circulava (Figura 11A, 11B e 11C).
Algumas características mencionadas para lâmina foliar, como cutícula
espessa, estômatos restritos à face abaxial, inúmeras cavidades secretoras e
idioblastos com drusas foram consideradas características comuns em Clusiaceae,
segundo Stevens (2007) e Metcalfe & Chalk (1950).
A cutícula espessa formando flanges descrita anteriormente já foi observada
em Clusia hilariana (SILVA et al., 2005; ROCHA et al., 2014), Clusia obdeltifolia
(SILVA et al., 2014) e Clusia lanceolata (GUIMARÃES et al., 2013).
A presença de diversos canais esquizógenos na lâmina foliar de C. grandiflora
foi observada. Paula (1976) observou em Clusia aff. macropoda a presença de
canais de origem esquizógena e esquizolisigena, porém Paula (1966) relatou a
origem dos canais em C. grandiflora como esquizógena, corroborando com o obtido
neste trabalho. Porém, ainda há necessidade de estudos de ontogênese para as
estruturas secretoras encontradas.
Paula (1966) relata ainda nas folhas a ocorrência de esclereídeos em C.
grandiflora, sendo neste trabalho não definido quais tipos de fibra presente próximo
ao sistema vascular.
O ramo (Figuras 11D, 11E e 11F) possuiu tecidos primários ainda instalados e
início do crescimento secundário. Observou-se epiderme uniestratificada, com
células de formato irregular recobertas por cutícula espessa (Figura 11D). O córtex
foi formado por camadas de células parenquimáticas, de diâmetros variados (Figura
11D). Na região vascular houve floema e xilema secundário, seguido de medula.
Solereder (1908) citou aspectos anatômicos do caule comuns a família, como raios
medulares estreitos. A medula foi formada exclusivamente por células
parenquimáticas, que aumentaram de calibre conforme se aproximam do centro
(Figura 11F). Características como a presença de epiderme em estrutura com
crescimento secundário também já foi observado em Clusia aff. Macropoda (PAULA,
1976).
33
Figura 9. Pecíolo e mesofilo de C. grandiflora em cortes transversais. A) Pecíolo
com presença de epiderme revetida por cutícula e colênquima com estruturas
secretoras (seta). B) Pecíolo com presença do colênquima, parênquima fundamental
com presença de idioblastos com drusas (seta vermelha), cavidades secretoras
(seta preta) e feixes colaterais acessórios (chave). C) Visão geral do sistema
vascular com células parenquimáticas do pecíolo. D) Feixe vascular colateral. E)
Visão geral do mesofilo com presença de epiderme, hipoderme, parênquima
paliçádico e parênquima lacunoso com feixe vascular, idioblastos com drusas (seta
vermelha) e estruturas secretoras (seta preta). F) Visão dos estômatos presentes na
34
face abaxial do mesofilo.co: colênquima, cu: cutícula, ep: epiderme, fl: floema, fva:
feixe vascular acessório, fv: feixe vascular, hi: hipoderme, pf: parênquima
fundamental; pa: células parenquimáticas, xi: xilema. pl: parênquima lacunoso, pp:
parênquima paliçádico.
Figura 10. Nervura principal de C. grandiflora em cortes transversais. A) Visão geral
da nervura principal destacando o colênquima, o sistema vascular (chave) com
fibras (seta) e os feixes vasculares anexos (chave). B e C) Face adaxial e abaxial,
respectivamente, mostrando a cutícula, epiderme e colênquima. D) Idioblasto com
drusa presente no colênquima - seta. E) Estrutura secretora presente no colênquima
- seta. F) Detalhe de feixes vasculares. co: colênquima, cu: cutícula, ep: epiderme, fi:
fibras, fl: floema, fva: feixe vascular acessório, sv: sistema vascular, xi: xilema.
35
Figura 11. Bordo e ramo de C. grandiflora em cortes transversais. A) Detalhe do
bordo evidenciando a cutícula, epiderme e parênquima fundamental. B) Estruturas
secretoras no parênquima fundamental do bordo (seta). C) Visão do feixe vascular
do bordo. D) Visão da epiderme do ramo. E) Região de fibras próximos ao tecido
vascular do ramo. F) Região vascular e medula do ramo. ep: epiderme, cu: cutícula,
fi: fibras, fl: floema, me: medula, pf: parênquima fundamental, pc: parênquima
cortical, rv: região vascular, xi: xilema.
36
5.2. Teste histoquímico
A histoquímica tem como objectivo localizar in situ, os principais grupos
químicos que ocorrem nos tecidos. Os testes histoquímicos são aplicados em
estudos de caracterização de plantas que apresentem metabólitos primários e/ou
secundários. Além destes estudos, os testes podem ser incorporados em futuro
controle de qualidade (LEITE, 2009).
Para identificar a possível presença de determinadas classes de substâncias
na folha e ramo de C. grandiflora, essas partes vegetativas foram submetidos à
diferentes reagentes.
Os alcalóides podem se acumular em células epidérmicas e a reação positiva
para o reagente de Wagner se deu devido a precipitação do metabólito em presença
de halogênios, corando em vermelho a castanho-avermelhado (Figura 12A)
(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora a presença da substância se deu na
epiderme e no feixe vascular de toda lâmina foliar e no pecíolo, porém não foram
encontrados na literatura tal metabólito secundário para o gênero.
A presença de carboidratos, metabólito primário essencial para sobrevivência
da planta, se deu devido a presença de dois tipos de polissacarídeos, o estrutural
(celulose) e de reserva (amido) (FIGUEIREDO et al., 2007). Para detecção de amido
foi utilizado o lugol, ao qual é constituído por iodeto de potássio que se acumula na
molécula de amido gerando coloração marrom, roxo ou negro (Figura 12B)
(FIGUEIREDO et al., 2007). Este metabólito foi encontrado em todas as partes da
folha, pecíolo e ramo, principalmente no parênquima cortical e medular do pecíolo e
da nervura principal, próximo ao cilindro vascular; no parênquima lacunoso da região
intercostal e parênquima cortical do ramo. Essa substância que está bastante
presente na espécie (ESAU, 1974). Para detecção de celulose foi utilizado o
calcoflúor, um fluoróforo que quando irradiado com luz UV o complexo formado
fluoresce intensamente de azul (FIGUEIREDO et al., 2007), sua presença foi
sugerida apenas na epiderme do mesofilo (FIGURA 12C).
Substâncias lipídicas e seus derivados são corados por um processo
puramente físico, isto é, afinidade do reagente pelo metabólito primário
(FIGUEIREDO et al., 2007). Para tal detecção foram utilizados sudan III, sudan IV e
auramina. Os sudans coraram em alaranjado (Figura 12D e 12E) (FIGUEIREDO et
al., 2007) e, em C. gradiflora, foram evidenciados, principalmente, nas cutículas
37
presente em toda lâmina foliar e ramo e em idioblastos presentes nos parênquimas
corticais e medulares da nervura principal, no parênquima cortical do pecíolo, no
parênquima fundamental do bordo e no parênquima cortical do ramo. Já o fluoróforo
auramina quando irradiado com luz UV o complexo formado fluoresce em
esverdeado (Figura 12F) e, em C. gradiflora foi onservado, principalmente, na
cutícula presente em toda lâmina foliar.
Substâncias fenólicas foram detectadas pela reação com cloreto férrico que
se complexaram formando precipitados cuja coloração puderam variar do verde
intenso, púrpura, azul a negro (Figura 12G) (FIGUEIREDO et al., 2007). Este tipo de
substância está amplamente distribuído no reino vegetal e compreende cumarinas,
xantonas, flavonoides, entre outras (CARVALHO et al., 1999), sendo muitas delas
encontradas em Clusiaceae e Clusia. Em C. gradiflora foram encontrados no
parênquima paliçádico da região intercostal, no parênquima fundamental do bordo,
sistema vascular do pecíolo e a região cortical do ramo.
Uma das classes de subtâncias fenólicas são os taninos. Para detecção
dessas substâncias utilizou-se vanilina clorídrica que formam um produto de
condensação resultante da reação dos grupos aldeídicos da vanilina com os fenóis,
resultando em uma coloração vermelho alaranjado (Figura 12H) (FIGUEIREDO et
al., 2007). Em C. gradiflora foram idenficados em tecidos parenquimáticos da
nervura principal e epiderme do ramo. Esta classe de substância tem atuação na
defesa contra insetos, fungos e bactérias (SANTOS & MELLO, 1999) e já foram
descritos por Fernandes (2007) em Clusia criuva.
Por fim, para detecção de outra classe de substâncias fenólicas, foi utilizado
cloreto de alumínio que se complexa com flavonóides (flavonas) com grupos
hidroxilo livres em 3' ou 5', corando em amarelo sob luz UV (Figura 12I).
(FIGUEIREDO et al., 2007). Em C. grandiflora, esta metodologia não foi a mais
promissora, sendo detectado com pouca clareza apenas no sistema vascular do
pecíolo, porém, já foram identificados flavonoides em espécies de Clusia.
A Tabela 5 evidencia as classes químicas encontradas em diferentes partes
da planta.
38
Figura 12. Testes histoquímicos da lâmina foliar e ramos de C. grandiflora. A)
Epiderme e feixe vascular corados com ragente de Wagner no bordo foliar sugerindo
presença de alcaloides. B) Parênquima medular da nervura principal, próximo ao
cilindro vascular, corado com lugol (seta) indicando a presença de amido. C)
Mesofilo envidenciando a presença de celulose na epiderme corado com calcofluor.
D) Cutícula do pecíolo corada com Sudam IV indicando a presença de lipídios. E)
Idioblastos no parênquima cortical do ramo corado com Sudam III indicando a
presença de liídeos F) Bordo foliar evidenciando a presença de lipídeos quando
corados com auramina. G) Parênquima paliçádico da região intercostal corado com
cloreto férrico, evidencia a presença de substâncias fenólicas, comum ao gênero. H)
Idioblasto presentes na nervura corado com vanilina clorídrica evidenciando a
presença de taninos, já descrito em outras espécies de Clusia. I) Possível resultado
positivo para flavonoides, classe descrita em outras espécies de Clusia, devido a
coloração amarelada quando em presença de cloreto de alumínio nas células
39
presente no pecíolo. ep: epiderme, cu: cutícula, fv: feixe vascular, pf: parênquima
fundamental, pp: parênquima paliçádico.
Tabela 5. Localização das classes químicas detectadas na lâmina foliar e no ramo
de C. grandiflora utilizando teste histoquímico.
Classe
química
Reagente Pecíolo Bordo Mesofilo Nervura Ramo
Substâncias
lipofílicas
Sudam III + + + + +
Sudam IV + + + + +
Auramina + + + + n
Flavonoides Cloreto de
alumínio
+ - - - -
Alcaloides Reagente de
Wagner
+ + + + -
Taninos Vanilina
Clorídrica
- - - + +
Substâncias
fenólicas
Cloreto
férrico
+ + + - +
Carboidratos:
Amido
Calulose
Lugol
+
+
+
+
+
Calcofluor - - + - n
Legenda: + presença, - ausência, n: não realizado teste para parte vegetatitva
5.3. Processamento e extração do material botânico
As raízes adventícias, os ramos, as folhas e as flores de C. grandiflora foram
coletadas, adequadamente processadas e submetidas à extração sucessivas com
hexano e etanol. A Tabela 6 apresenta os rendimentos extrativos obtidos.
Tabela 6. Rendimentos extrativos obtidos de C. grandiflora.
Parte da
planta
Peso
seco (g)
Solvente (mL) Peso do
extrato (g)
Rendimento
(%)
Código
Flores 31,60 Hexano (100) 0,41 1,30 CGFH
40
Etanol (100) 2,49 7,88 CGFEt
Raízes
adventícias
45,58 Hexano (100) 1,34 2,93 CGRAH
Etanol (100) 2,16 4,74 CGRAEt
Ramos 887,10 Hexano (1000) 7,41 0,84 CGRH
Etanol (1000) 26,69 3,00 CGREt
Folhas 1126,95 Hexano (1500) 25,15 2,23 CGFoH
Etanol (1500) 51,28 4,55 CGFoEt
Os melhores rendimentos foram obtidos nas partes vegetativas e reprodutivas
extraídos com etanol, tendo o extrato etanólico das flores (CGFEt) o melhor
rendimento, 7,88%.
5.4. Atividade antioxidante
Nas últimas décadas vem sendo observado um aumento importante no
conhecimento acerca de substâncias antioxidantes, particularmente aquelas
capazes de prevenir efeitos deletérios dos radicais livres no corpo humano e
prevenir a deterioração de alimentos. Nos dois casos, há uma preferência por
antioxidantes de origem natural àqueles oriundos de fontes sintéticas, já que estes
últimos são bastante voláteis e decompõem-se facilmente em temperaturas
elevadas, além de apresentarem problemas relacionados à toxidez (ABDALLA,
1999).
Para determinar o potencial antioxidante da espécie, os extratos foram
avaliados quanto a sua capacidade de sequestro radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazila), um método colorimétrico que, apesar de não representar condições
semelhantes aos processos que ocorrem in vivo, representa uma forma rápida e
simples para caracterizar a presença de substâncias com propriedades
antioxidantes em extratos vegetais brutos, afim de que estes se tornem alvo de
ensaios bioguiados com a finalidade de isolamento de tais substâncias (SILVA &
PAIVA, 2012).
O DPPH é um radical livre estável que, em solução, apresenta coloração
violeta, e quando inserido em um meio onde existem substâncias com propriedades
antioxidantes é reduzido, refletindo em uma mudança na sua coloração, que passa a
41
amarelo, com consequente diminuição da absorvância na faixa de 518 nm,
absorvância máxima da cor violeta (Figura 13) (DA SILVA, 2015).
Figura 13. Estrutura do DPPH antes e depois da reação com um agente
antioxidante (A-H) (RUFINO et al., 2009).
Inicialmente, a curva analítica do DPPH e dos padrões BHT e rutina foram
obtidas por regressão linear e resultaram em um bom coeficiente angular (r2 > 0,90).
As curvas para avaliação da atividade dos extratos foram obtidas por regressão
linear dos ensaios e mostraram um bom coeficiente de determinação (r2 > 0,80). A
Tabela 7 mostra os valores de CE50, concentração de extrato necessária para reduzir
em 50% a concentração inicial de DPPH, encontrados. O tratamento estatístico dos
dados realizados por ANOVA não mostrou diferença significativa entre os três
ensaios independentes para mesma amostra (p ≥ 0,05), exceto para o extrato bruto
dos ramos (p = 0.0139).
Tabela 7. Valores do CE50 dos padrões e dos extratos etanólicos de C. grandiflora.
Padrões/ Código das amostras CE50 (g amostra/g DPPH)
Rutina 0,58±0,03
BHT 0,75±0,12a
Raízes Adventícias 1,79±0,36a
Folhas 2,49±0,25b
Flores 2,64±0,52b
42
Ramos 3,46±0,30c
Legenda: a sem diferença significativa entre as amostras por Tukey-Kramer b um dos ensaios independente foi feito em duplicata c diferença significativa entre os três ensaios independentes por ANOVA
A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores de CE50
obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA, que considerou a
diferença significativa. Como o resultado da análise de variância levou à rejeição da
hipótese nula, ou seja, a afirmação de que todos os valores de CE50 são iguais, foi
realizado testes de comparações múltiplas que permitem identificar essas
diferenças. Para esta análise, foi escolhido o teste de Tukey-Kramer, que compara
contrastes de variância e discrimina de forma mais clara as comparações, dando
maior embasamento estatístico às análises (DA SILVA, 2015).
A Tabela 7 mostra que todos os extratos apresentaram valores de CE50
maiores que o encontrado para os padrões. No entanto, o teste de estatístico de
Tukey-Kramer sugere que há diferença significativa entre os valores de CE50 dos
padrões e dos extratos analisados, exceto quando o BHT é comparado com o
extrato das raízes adventícias.
Os extratos quando comparados aos padrões apresentaram maior CE50,
entretanto, cabe lembrar que tratam-se de extratos brutos constituídos de diversas
substâncias em menores quantidades, enquanto os padrões são substâncias puras
(SILVA & PAIVA, 2012).
Os extratos etanólicos brutos apresentam desde substâncias ligeiramente
apolares até polares, como as substâncias fenólicas. Essas substâncias podem ser
encontradas em todas as partes da planta e estão disponíveis como ácidos
fenólicos, flavonoides, lignanas, estilbenos, cumarinas e taninos (POMPILHO et al.,
2014). Os baixos valores de CE50 dos extratos analisados podem estar relacionados
com a presença dessas substâncias, tendo o extrato das raízes adventícias o menor
valor de CE50 (1,79±0,36 g amostra/ g DPPH), conferindo-lhe melhor atividade e
maior proximidade com o padrão BHT, enquanto o extrato dos ramos apresentou o
maior CE50 (3,46±0,30 g amostra/ g DPPH).
O valor de CE50 isolado nem sempre é o melhor parâmetro para avaliar a
atividade antioxidante de uma amostra, pois não leva em consideração o fato de que
43
a amostra em questão pode apresentar perfis reacionais diferentes em
concentrações diferentes (DA SILVA, 2015).
Do ponto de vista cinético, os extratos obtiveram, na maior parte das
concentrações analisadas, cinética rápida, ou seja, foi atingido o estado de equilíbrio
em menos de 5 minutos, já nas concentrações de 50 e 125 μg/mL a cinética foi
considerada intermediária, uma vez que o equilíbrio foi atingido no intervalo de 5 a
30 minutos (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). A cinética reacional da rutina se
assemelha ao observado com os extratos, porém, a cinética foi intermediária na
concentração de 25 μg/mL. Já o BHT apresentou cinética intermediária em todas
concentrações. As Figuras 14-19 apresentam as cinéticas reacionais observadas
para os extratos e padrões, em cada concentração ao longo de 30 minutos.
Figura 14. Cinética reacional do BHT com DPPH.
44
Figura 15. Cinética reacional da rutina com DPPH.
Figura 16. Cinética reacional das raízes adventícias com DPPH.
45
Figura 17. Cinética reacional dos ramos com DPPH.
Figura 18. Cinética reacional das folhas com DPPH.
46
Figura 19. Cinética reacional das flores com DPPH.
Todos os extratos apresentaram atividade antioxidante máxima após 30
minutos de reação, nas maiores concentrações analisadas, com aproximadamente 5
% de DPPH remanescente, ou seja, com aproximadamente 95 % de atividade, o
mesmo é observado com os padrões. Tal similaridade aos padrões demonstra o
potencial antioxidante de substâncias presentes em C. grandiflora.
Quando comparada com outras espécies do gênero, C. grandiflora
demonstrou melhor atividade para os extratos das folhas, das flores e das raízes
adventícias que os extratos metanólicos e acetônicos das folhas, frutos e caules de
Clusia fluminensis (SILVA & PAIVA, 2012). Comparando o extrato das raízes
adventícias desta espécie com os extratos metanólicos das folhas de Clusia
lanceolata (FERREIRA et al., 2014), C grandiflora apresentou também melhor
atividade.
A atividade antioxidante pode estar relacionada à presença de substâncias
fenólicas, como os flavonoides, como observado nos testes histoquímicos. Esta
classe de metabólitos já foi identificada anteriormente no gênero Clusia, podendo ser
essas substâncias as responsáveis pela atividade na espécie C. grandiflora
(FERREIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2012; BITTAR et al., 2000).
5.5. Doseamento de flavonoides
47
Para identificar as possíveis substâncias responsáveis pelo efeito antioxidante
foi feito o doseamento de flavonoides expressos por flavonas e flavonóis. O princípio
desse método consiste na formação de complexos ácidos estáveis entre o cloreto de
alumínio e a carbonila em C-4 e a hidroxila em C-5 do anel A e entre as hidroxilas
em C-3 e C-4 do anel B em flavonóis e flavonas (Figura 20) (CHANG et al., 2002). A
presença de insaturação entre o C-2 e C-3 no anel C de flavonoides fornece um
máximo de absorção do complexo na faixa de 415-440 nm (CHANG et al., 2002).
Figura 20. Esquema da complexação do cloreto de alumínio com flavonoides
(MABRY et al. 1970).
A curva padrão obtida por regressão linear da rutina para a análise da dos
extratos brutos etanólicos resultou em um coeficiente angular r2 > 0,90. O tratamento
estatístico dos dados mostrou que as diferenças entre os três experimentos
independentes realizados para cada extrato não foram estatisticamente significativas
(p ≥ 0,05). Os resultados obtidos no doseamento de flavonoides podem ser
visualizados na Tabela 8.
Tabela 8. Teor de flavonoides, expressos em flavonas e flavonóis, obtidos para os
extratos etanólicos de C. grandiflora.
Código das amostras Teor de flavonoides (%)
Flores 1,57±0,00ª
Ramos 1,56±0,00ª
48
Raízes adventícias 1,56±0,00b
Folhas 1,56±0,00b
Legenda: a, b sem diferença significativa entre os extratos por Tukey-Kramer
A avaliação do grau de significância das diferenças entre os valores do teor
de flavonoides obtidos para cada extrato também foi efetuada por ANOVA que
considerou a diferença significativa. O teste de Tukey-Kramer também sugere essa
diferença, exceto quando comparado o extrato das flores com dos ramos e extrato
das raízes adventícias com das folhas.
Todos os extratos avaliados apresentaram baixos teores de flavonas e
flavonóis quando comparados a dados de outras espécies como, C. fluminensis
(SILVA & PAIVA, 2012) e C. lanceolata (FERREIRA et al., 2014). O maior teor foi
observado na amostra das flores (1,57±0,00%) e o menor valor foi obtido para a
amostra das folhas (1,56±0,00%), sugerindo que o potencial antioxidante pode não
estar relacionado a essas substâncias ou que estas não são as únicas responsáveis,
uma vez que estudos mostram que a formação de complexos do cloreto de alumínio
com flavonoides que não possuem essa insaturação resulta em uma absorvância
muito baixa na faixa de comprimento de onda utilizado (CHANG et al., 2002). Além
disso em Clusia identificou-se maior presença de flavonas e bisflavonoides que de
flavonóis (VIRGINIO, 2015). A presença de outros esqueletos flavonoídicos
diferentes pode justificar a alta atividade antioxidante observada ao lado do baixo
teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis.
Para se saber se o teor de flavona e flavonol possui ou não correlação com a
atividade antioxidante, foi realizado o teste de Correlação de Pearson. Este teste é
uma ferramenta estatística que fornece um coeficiente definido pela medida de
associação linear entre variáveis. Os valores de Correlação de Pearson podem estar
situados entre -1 e +1, onde o número 1 indicaria uma correlação linear perfeita e o
sinal indicaria se essa correlação é negativa ou positiva, respectivamente (FILHO &
JÚNIOR, 2009). São classificados ainda como relação fraca quando os valores
estão entre 0,10 e 0,29; correlação moderada quando os valores estão entre 0,30 e
0,49 e correlação forte quando os valores estão 0,50 e 1 (COHEN, 1988).
Os resultados obtidos forneceram uma correlação positiva moderada (+0,48)
entre os valores de CE50 dos extratos e o percentual de flavonoides. Isto indica uma
49
tendência moderada de que o valor de CE50 aumenta conforme o aumento do teor
de flavonoides. A Figura 21 apresenta os resultados de Correlação de Pearson entre
o percentual de flavonoides e os valores de CE50, o que sugere a participação de
outras substâncias corroborando o efeito observado.
Figura 21. Correlação de Pearson (r2 = 0,2276) entre os valores de CE50 dos
extratos de C. grandiflora e o percentual de flavonoides.
5.6. Atividade citotóxica
Para desenvolvimento de um fármaco a toxidez pode fazer de moléculas
promissoras uma molécula descartada, já que sua segurança é um dos parâmetros
mais importantes (FLINT et al., 2000). O equilíbrio entre o efeito farmacológico e
toxicológico é sempre verificado quando se busca aplicabilidade como agente
terapêutico (MELO et al., 2000). Entretanto, para células neoplásicas o ideal é que o
fármaco seja tóxico apenas para células tumorais e não para as sadias. Por isso, o
estudo da toxidez se faz importante.
Um avanço na pesquisa de produtos naturais no campo da oncologia vem
ocorrendo desde o início do século XX. A maioria dos fármacos antitumoral, 60 %,
tem sua origem nos produtos naturais, dentre eles a vimblastina, vincristina,
vindesina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, podofilotoxina, etoposídeo, teniposídeo,
camptotecina, topotecano e irinotecano (LOTUFO et al., 2010).
50
As substâncias de origem vegetal mostram ser boas perspectivas como
anticancerígeno por possuir diversidade química e potencial ilimitado para
modificação racional (DIAZ-CARBALLO et al., 2008).
A análise da toxidez e pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa
de screening do National Cancer Institute (NCI) nos Estados Unidos, que testa mais
de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido,
sensível e barato que tem a capacidade de analisar o estado metabólico da célula.
Consiste em uma análise colorimétrica baseada na clivagem do sal de tetrazóleo
(amarelo) para cristais de formazan (azul/púrpura), a partir de substratos de enzimas
microssomais e mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente
ativas.
O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a toxidez,
mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996). Assim, o ensaio de
hemólise sugere se o mecanismo do extrato ou substância estudada pode ser
através da lise de membrana celular pelo fato da morte celular ser observada pela
presença de necrose.
A verificação da citoxicidade in vitro dos extratos brutos frente às células
tumorais HCT-116 (cólon humano), AGP-01 (ascite gástrica), MCF7 (mama-humano)
e MRC5 (fibroblasto humano) através do ensaio com MTT, assim como a atividade
hemolítica estão apresentados na Tabela 9, onde os valores da concentração
inibitória média do crescimento celular (Cl50) estão em μg/mL para os extratos e em
μM para doxorrubicina.
Tabela 9. Valores da concentração do CI50 dos extratos brutos obtidos de C.
grandiflora.
Código das
amostras
Cl50*
MCF7 AGP-01 HCT-116 MRC5 Hemólise
CGFH >50 >50 >50 >50 >200
CGFEt >50 >50 >50 >50 >200
CGRAH >50 >50 >50 >50 >200
CGRAEt >50 >50 >50 >50 >200
CGRH >50 >50 >50 >50 >200
51
CGREt >50 >50 24,30(18,54–31,84)
>50 >200
CGFoH >50 >50 >50 >50 >200
CGFoEt >50 44,15(34,79
– 56,02)
>50 >50 >200
Doxorrubicina 0,95 (0,73 – 1,24)
0,25(0,19-0,33)
0,1 (0,047-0,28)
0,2 (0,16-0,25)
>200
Legenda: * os valores das concentrações estão em µg/mL para os extratos e em µM
para dexorrubicina.
CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das
flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.
grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;
CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos
ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora;
CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.
Das amostras testadas as mais promissoras foram as extraídas em etanol. O
CGREt apresentou um bom resultado inibitório na linhagem HCT-116 com a CI50
24,3 μg/mL e o CGFoEt na linhagem AGP-01 com a CI50 de 44,2 μg/mL. Ressalta-se
que os extratos foram ativos apenas na linhagem tumoral e não inibiram o
crescimento da linhagem normal nas concentrações testadas. Segundo protocolo do
NCI (ALLEY et al., 1988), valores de CI50 ≤ 30 µg/mL devem ser considerados
interessantes para extratos brutos de origem vegetal, enquadrando-se CGREt.
O estudo realizado para a determinação de atividade hemolítica em células de
camundongos indicou que nenhuma das amostras testadas provocou lise na
membrana plasmática das células na maior concentração testada, apresentando
CI50 >200μg/mL, demonstrando não ser este o mecanismo de ação dos extratos.
Em Clusia, relatos de atividade citotóxica estão presentes na literatura, sendo
as benzofenonas os metabólitos secundários com maior ação. A nemorosona,
presente em Clusia rosea, foi citotóxica frente a diferentes linhagens tumorais e com
baixa citotoxidade em células sadias (CUESTA-RUBIO et al., 2002; DIAZ-
CARBALLO et al., 2003; DIAZ-CARBALLO et al., 2008; POPOLO et al., 2011).
Derivados bifenila presentes em Clusia paralicola também apresentaram citotoxidez
52
em linhagem de células KB (sublinhagem celular tumoral geral que formam
queratina) (SEO et al., 1999).
5.7. Atividade antimicrobiana
O crescente aumento da resistência bacteriana aos antibióticos em circulação
no mercado é considerado um dos maiores problemas atuais de saúde pública
(BALSALOBRE et al., 2014). O fato denota dados alarmantes, pois existem
bactérias que já são resistentes à grande maioria – senão a todos – os antibióticos
conhecidos, como é o caso de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina
(MRSA) e Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) (GUIMARÃES et
al., 2010). Simultaneamente o número de novos antibióticos aprovados pela Food
And Drug Administration (FDA) tem diminuído ao longo dos anos (BOUCHER et al.,
2009). Devido à complexidade de suas estruturas químicas e às interações
específicas com seus alvos (GUIMARÃES et al., 2010), produtos de origem natural
têm sido vistos como uma boa alternativa a serem explorados (HARVEY et al.,2008),
já que poucos fármacos provenientes de recursos naturais foram reprovados pelo
FDA (SUFFREDINI et al., 2006).
Em vista disso, todos os extratos obtidos de C. grandiflora foram analisados
quanto sua atividade antimicrobiana frente às cepas de bactérias gram-positivas
(Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e S. simulans) e
gram-negativas (Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae). Primeiro, foi
realizada a análise por TSA e observou-se que as únicas cepas inibidas foram de P.
aeruginosa e E. coli para cinco dos oito extratos. Os resultados obtidos da média
entre os diâmetros das zonas de inibição (Halo = mm) estão apresentados na Tabela
10.
Tabela 10. Diâmetro dos halos de inibição formados em função dos extratos de C.
grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.
Código das amostras P. aeruginosa E. coli
CGFH - -
CGFEt 6,3 mm 6,6 mm
53
CGRAH - -
CGRAEt 7,0 mm 7,0 mm
CGRH 7,6 mm 7,8 mm
CGREt 6,6 mm 7,0 mm
CGFoH - -
CGFoEt 7,3 mm 6,2 mm
Legenda: - sem formação de halo
CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGFEt: extrato etanólico das
flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato hexânico das raízes adventícias de C.
grandiflora; CGRAEt: extrato etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora;
CGRH: extrato hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos
ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora;
CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.
Dos cinco extratos que mostraram atividade frente a P. aeruginosa, todos
obtiveram um diâmetro do halo variando de 6,3 mm até 7,6 mm. Já em E. coli, os
halos variaram de 6,2 mm a 7,8 mm. Este resultado é bastante promissor por se
tratar de um extrato bruto composto por várias substâncias em pequenas
concentrações que podem estar contribuindo de maneira sinérgica e reduzindo as
chances de resistência (DA SILVA, 2001).
Segundo à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a
sensibilidade dos microrganismos frente aos antimicrobianos é representada pela
concentração inibitória mínima (CIM) de cada microrganismo para cada
antimicrobiano, que corresponde a menor concentração do antimicrobiano capaz de
inibir o desenvolvimento visível do microrganismo.
Os extratos que apresentaram atividade no ensaio de TSA tiveram a CIM
determinada. Os resultados foram mensurados pela turbidez a olho nu e, em
seguida, pela mudança de coloração, devido a uma redução, de azul, do azul de
resazurina, para rosa, da resorufina. Essa mudança de coloração se deve a
presença de respiração aeróbia. Os resultados encontram-se na Tabela 11.
54
Tabela 11. Concentrações inibitória mínima (CIM) dos extratos ativos de C.
grandiflora frente às cepas P. aeruginosa e E. coli.
Código das amostras P. aeruginosa E. coli
CGFEt 256 μg/mL 64 μg/mL
CGRAEt 32 μg/mL 16 μg/mL
CGRH 256 μg/mL 128 μg/mL
CGREt 64 μg/mL 32 μg/mL
CGFoEt 64 μg/mL 32 μg/mL
Legenda: CGFEt: extrato etanólico das flores de C. grandiflora; CGRAEt: extrato
etanólico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos
ramos de C. grandiflora; CGREt: extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora;
CGFoEt: extrato etanólico das folhas de C. grandiflora.
O extrato CGRAEt foi o mais eficaz tanto frente à P. aeruginosa como à E.
coli, apresentando um CIM de 32 μg/mL e 16 μg/mL, respectivamente. O extrato
CGREt foi capaz de inibir completamente o crescimento de P. aeruginosa em uma
concentração de 64 μg/mL. Ainda em relação a P. aeruginosa, os extratos CGRH e
CGFEt apresentaram um CIM de 256 μg/mL. No caso de E. coli, o extrato CGRAEt,
como já mencionado, apresentou o melhor resultado de CIM, inibindo
completamente seu crescimento a partir da concentração de 16 μg/mL. Os extratos
CGREt e CGFoEt mostraram-se eficazes a partir da concentração de 32 μg/mL e o
extrato CGFEt inibiu em uma concentração de 64μg/mL. Por último, o extrato CGRH
apresentou um CIM de 128 μg/mL, mas ainda dentro da faixa de concentração
aceita pelo CLSI como um bom resultado (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).
Estudos anteriores sobre C. grandiflora, mostraram que benzofenonas
possuem atividade antimicrobiana contra os patógenos do mel Paenibacillus larvae e
Paenibacillus alvei (LOKVAM et al., 2000) e as resinas florais mostraram atividade
antimicrobiana contra S. aureus, B. subtilis e C. albicans em ensaio de bioautografia
(PORTO et al.,2000). Este ensaio veio acrescentar que não apenas os componentes
das resinas florais podem apresentar atividade antimicrobiana, assim como extratos
de outros órgãos.
5.8. Atividade acaricida
55
Os carrapatos são artrópodes ectoparasitos hematófagos que afetam a
população animal e humana devido a transmissão de patógenos (ESTRADA-PEÑA
& JONGEJAN, 1999; PAROLA & RAOULT, 2001). O carrapato Rhipicephalus
microplus é um ixodídeo originário da Ásia, cujo principal hospedeiro é o bovino. Sua
incidência é maior na América, África, Ásia e Austrália (GONZALES, 1995; NARI,
1995).
Seus danos ao animal parasitado se devem, principalmente, pela espoliação
da grande quantidade de sangue (MARTINS, 2004) e transmissão de doenças
(MARTINS & CORREA, 1995), gerando grande perda econômica (GRISI et al.,
2002). Atualmente, o controle do carrapato é feito principalmente com o uso de
carrapaticidas e sua troca geralmente é indiscriminada e acaba não cumprindo o seu
objetivo de controlar os carrapatos, permitindo que sejam selecionados os indivíduos
tolerantes (FURLONG et al., 2003). O controle biológico de pragas tem sido uma
alternativa promissora, pois utiliza mecanismos naturais ao combate, menor impacto
ambiental, menor custo, maior especificidade e menor desenvolvimento de
resistência (ALVEZ, 1998; MILNER, 2000; SHAH & PELL, 2003; SHAMISH et al.,
2004).
Assim, avaliaram-se os extratos brutos hexânicos de C. grandiflora quanto
sua atividade acaricida frente ao carrapato bovino Rhipicephalus microplus. Os
resultados do teste de mortalidade por imersão de fêmeas adultas nos extratos
podem ser visualizados na Figura 22.
Figura 22. Teste de imersão de fêmeas adultas nos extratos brutos hexânicos
de C. grandiflora.
56
Os carrapatos imersos no controle apresentaram mortalidade apenas após o
quarto dia, chegando em torno de 15 % após 15 dias de análise. Já a mortalidade
por imersão no extrato CGFoH após os 15 dias foi semelhante ao controle, enquanto
que no extrato CGRAH foi o que exibiu o menor percentual de mortalidade. O extrato
que obteve a melhor atividade foi CGRH, com a mortalidade dos carrapatos
iniciando logo no primeiro dia, e com cerca de 50 % de mortalidade após 15 dias.
Os extratos foram também analisados frente ao índice de postura de ovos
(IPO) e porcentagem de inibição de postura 15 dias após o tratamento com extratos
hexânicos de C. grandiflora. Estes resultados estão expressos na Tabela 12.
Tabela 12. Índice de postura de ovos (IPO) e inibição de postura, em porcentagem,
15 dias após o tratamento com extratos hexânicos de C. grandiflora.
Amostras IPO Inibição de postura (%)
Controle Negativo 0,132 ± 0,014 ---
CGRH 0,106 ± 0,008 0
CGRAH 0,134 ± 0,011 0
CGFoH 0,125 ± 0,015 0
CGFH 0,107 ± 0 6,56
Legenda: CGFH: extrato hexânico das flores de C. grandiflora; CGRAH: extrato
hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH: extrato hexânico dos
ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato hexânico das folhas de C. grandiflora.
O extrato CGRH obteve melhor resultado com o menor valor de IPO e o
CGRAH foi próximo ao controle, porém, menor.
No gênero Clusia há relatos da atividade inseticida para espécie Clusia
hilariana frente as larvas de Rhodnius prolixus, transmissor da doença de Chagas,
devido a presença do triterpeno ácido oleanólico e da benzofenona nemorosona
(KELECOM et al., 2002).
5.9. Perfil dos extratos brutos
5.9.1. Perfil por cromatografia em camada delgada (CCD)
57
A presença das principais classes de metabólitos secundários nos extratos
brutos hexânicos e etanólicos de C. grandiflora foram avaliadas qualitativamente por
CCD utilizando diferentes sistemas de eluentes e reveladores.
A Figura 23 mostra a comparação do perfil dos extratos brutos hexânicos e
etanólicos, e pode ser observado uma diferença qualitativa no que diz respeito ao
aparecimento de bandas na placa sob a irradiação de 254 nm e 365 nm, entretanto,
há substâncias com Rf muito próximos em todos os extratos, como destacado.
Algumas similaridades do perfil são observadas apenas entre as partes vegetativas
e reprodutiva extraídas em mesmo solvente.
Figura 23. CCD dos extratos brutos etanólicos e hexânicos de C. grandiflora
eluídos em hexano: acetato de etila: ácido acético (65:34:1) e revelados em lâmpada
de luz UV. A) Luz UV 365nm B) Luz UV 254 nm. CG: C. grandiflora, FoH: Extrato
hexânico das folhas, FH: Extrato hexânico das flores, RAH: Extrato hexânico das
raízes adventícias, RH: Extrato hexânico dos ramos, FoEt: Extrato etanólico das
folhas, FEt: Extrato etanólico das flores, RAEt: Extrato etanólico das raízes
adventícias, REt: Extrato etanólico dos ramos.
Para confirmar o resultado positivo da presença de alcaloides no teste
histoquímico, utilizou-se Dragendorff como revelador químico na CCD. Porém, vale
ressaltar que este reagente pode resultar em um falso positivo, pois existem
descrições na literatura de uma variedade de substâncias oxigenadas não
nitrogenadas com reações alcaloide positivos devido a presença de um carbono
beta ligado a um oxigênio com alta densidade eletrônica (HABIB, 1980). O possível
58
resultado positivo é caracterizado pelo surgimento de sinais com coloração marrom
a laranja-amaronzado (WAGNER, 1984), que foi observado apenas nos extratos
etanólicos das flores (F) e das raízes adventícias (RA), conforme a Figura 24,
corroborando com os resultados dos testes histoquímicos.
Figura 24. CCD dos extratos brutos etanólicos de C. grandiflora eluídos em
hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e revelados em Dragendorff. CGEt:
C. grandiflora extrato etanólico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.
A vanilina sulfúrica é um revelador geral que pode sugerir a presença de
diferentes classes de substâncias. A análise deste revelador, conforme a Figura 25,
pode sugerir a presença de substâncias terpenoídicas, apenas nos extratos
hexânicos, em função da coloração violeta nos extratos (WAGNER, 1984). A
presença de terpenos já foi indicada na família Clusiaceae, conforme apresentado
na revisão bibliográfica. Essas substâncias podem estar presentes nos óleos
essenciais e no látex, sendo este característico de Clusia segundo Metcalfe e Chalk
(1950).
59
Figura 25. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora eluidos em
hexano: acetato de etila: ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica.
CGH: C. grandiflora extrato hexânico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.
Para detecção de substâncias com atividade antioxidante foi utilizado como
revelador o DPPH. Ele possui uma cor violeta intenso, quando aplicado na CCD
adquire coloração amarelo ouro característica em presença de substâncias com
atividade antioxidante (CONFORTI et al., 2002), conforme é observado nas Figuras
26A no extrato hexânico das flores (F) e 26B em todos os extratos etanólicos. A
presença de possíveis substâncias com atividade antioxidante na CCD dos extratos
etanólicos corrobora com o bom resultado dos testes de atividade antioxidante dos
extratos brutos etanólicos mencionados anteriormente. As substâncias reveladas
podem pertencer a diferentes classes metabólicas já descritas no gênero, como
flavonoides, benzofenonas e outras substâncias fenólicas mais simples, sendo as
benzofenonas os fenóis com maior destaque em espécies de Clusia, principalmente
as benzofenonas poliisopreniladas (PORTO, 2000; SILVA ET AL., 2012; OLIVEIRA
ET AL., 1996 E 1999; LOKVAM ET AL., 2000).
60
Figura 26. CCD dos extratos brutos de C. grandiflora revelados em DPPH. A)
Extrato hexânico eluido em hexano: acetato de etila: ácido acético (75:24:1) B)
Extrato etanólico eluido em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1). CGEt:
C. grandiflora extrato etanólico, CGH: C. grandiflora extrato hexânico, Fo: folha, F:
flor, RA: raíz adventícia, R: ramo.
Os extratos brutos foram também comparados com frações enriquecidas de
3-oxo-friedelina (13), clusianona (16) e lanosterol (17) (Figura 27) já identificadas de
outras espécies presentes no laboratório e conforme sistema de eluente proposto
por Virgínio (2015) modificado quanto a adição de ácido acético. As placas
reveladas em vanilina sulfúrica indicaram que as substâncias 13 e 16 possuem
bandas com fatores de retenção (Rf) próximos, se diferenciando apenas na
coloração. A identificação dessas substâncias foi feita apenas nos extratos
hexânicos, conforme mostra a Figura 28. Sugere-se presença da substância 17 em
todos os extratos, a substância 16 nos extratos das folhas (Fo) e a substância 13
nos extratos dos ramos (R) e folhas (Fo).
61
Figura 27. Estrutura química das substâncias 13, 16 e 17.
Figura 28. CCD dos extratos brutos hexânicos de C. grandiflora e frações
enriquecidas com as substâncias 13, 16 e 17 (setas) eluidos em hexano: acetato de
etila: ácido acético (80:19:1) e revelados em vanilina sulfúrica. CGH: C. grandiflora
extrato hexânico, Fo: folha, F: flor, RA: raíz adventícia, R: ramo, lan: fração
enriquecida com a substância 17, ben: fração enriquecida com a substância 16, fri:
fração enriquecida com a substância 13.
5.9.2. Perfil por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
62
Os perfis dos extratos brutos de C. grandiflora também foram determinados
por CLAE, não só para confirmar a presença de classes de metabólitos encontrados
por CCD como para verificar a presença de possíveis novas substâncias.
A análise dos cromatogramas dos extratos brutos hexânicos obteve melhor
detecção em 270 nm (Figura 29). Estes cromatogramas apresentaram substâncias
com os mesmos tempos de retenção e espectros de UV tanto nas partes vegetativas
como reprodutivas (substâncias 1 a 10). CGRH possuiu um perfil mais diferenciado e
com o maior número de substâncias detectadas, já o CGFH foi o que obteve o
menor número de substâncias detectadas. Porém, a utilização do CLAE para análise
de metabólitos primários ou secundários não foram esclarecedoras, sendo
necessárias utilização de outras técnicas.
Já a análise dos cromatogramas dos extratos brutos etanólicos (Figura 30),
em 270 nm, indicou a presença de sinais com mesmo tempo de retenção
(substâncias 1 a 14) e espectros de UV, indicando que as partes vegetativas e
reprodutivas possuem similaridade quanto às substâncias presentes. A análise dos
espectros de UV das substâncias no cromatograma de CGRAEt sugerem a
presença de um flavonoide com máximos de absorção em 200 nm, 260 nm e 300
nm (F1), um flavonoide com máximos em 202 nm, 260 nm e 315 nm (F6)
característicos de uma flavona (Simões et al., 2007) e três arilpropanoides com
máximos em 200 nm e 312 nm (A1, A2 e A3) (Pimenta, 2002). Nos espectros de UV
de CGREt há presença apenas do flavonoide F6 e sugerem a presença dos
flavonoides F1 e F2 ambos com máximos em 200 nm, 260 nm e 300 nm, além dos
arilpropanoides A1 e A3. Nos espectros de UV correspondentes aos sinais
presentes no cromatograma de CGFoEt há presença dos flavonoides F1, F2 e F6 e
o arilpropanoide A3. Há ainda dois flavonoides com máximos de absorção em 202
nm, 260 nm e 330 nm (F3 e F4), um flavonoide com máximos em 202 nm, 255 nm e
325 nm (F5), outro flavonoide com máximos em 202 nm, 255 nm e 315 nm que se
assemelha com uma flavona (F7) (Simões et al., 2007) e um arilpropanoide com
máximos em 200 nm e 315 nm (A4). Embora a análise do cromatograma de CGFEt
tenha indicado menor número de substâncias que em CGFoEt, ambas sugeriram os
espectros de UV flavonoides e arilpropanoides similares (F1, F2, F6, F7, A3 e A4).
A análise por CLAE dos extratos etanólicos sugeriu com maior confiabilidade
a presença de substâncias fenólicas simples e flavonoides anteriormente verificados
63
por CCD. Essas substâncias podem estar relacionadas ao potencial antioxidante da
espécie, além de já terem sido isoladas no gênero.
64
Figura 29. Cromatogramas dos extratos hexânicos de C. grandiflora em água (A) e acetonitrila (B), ambos com 0,05% de
ácido trifluoroacético, variando de 25% a 55% de B (0 – 15 min), 55% a 100% de B (15 – 18 min), mantendo os 100% até 30 min,
em 270 nm. CGRAH: extrato bruto hexânico da raíz adventícia de C. grandiflora; CGRH: extrato bruto hexânico do ramo de C.
grandiflora; CGFoH: extrato bruto hexânico da folha de C. grandiflora; CGFH: extrato bruto hexânico da flor de C. grandiflora.
65
Figura 30. Cromatogramas obtidos dos extratos etanólicos de C. grandiflora em água (A) e acetonitrila (B), ambos com
0,05% de ácido trifluoroacético, variando de 10% a 45% de B (0 – 40 min), 45% a 100% de B (40 – 50 min), mantendo os 100%
até 55 min, em 270 nm. A) Espectro de UV de um flavonoide do tipo flavona obtido em 29,9 minutos. B) Espectro de UV de um
flavonoide do tipo flavona obtido em Vila (2006). C) Espectro de UV de um arilpropanoide obtido em 33,5 minutos. D) Espectro de
UV de um arilpropanoide obtido em Macedo (2013). CGRAEt: extrato bruto etanólico da raíz adventícia de C. grandiflora; CGREt:
extrato bruto etanólico do ramo de C. grandiflora; CGFoEt: extrato bruto etanólico da folha de C. grandiflora; CGFEt: extrato bruto
etanólico da flor de C. grandiflora.
66
5.9.3. Perfil por ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio (1H)
O perfil por RMN foi avaliado para corroborar com as duas técnicas utilizadas
anteriormente. Essa técnica é utilizada principalmente para a elucidação estrutural
de metabólitos secundários, mas vem sendo eficiente também no perfil químico de
amostras complexas (LOPES DA SILVA et al., 2011).
A análise por RMN de 1H em clorofórmio deuterado (CDCl3) dos extratos
hexânicos e em metanol deuterado (CD3OD) dos extratos etanólicos da espécie, em
comparação com metabólitos encontrados para o gênero presentes na literatura
permitiu identificação de alguns metabólitos.
Em campo alto foram observados sinais para todos os extratos brutos. Os
sinais encontrados nos extratos hexânicos se restrigiram quase em totalidade nesta
região, já os etanólicos mostraram sinais tanto nesta região como em campo baixo
(Figuras 31 a 34).
Os extratos hexânicos apresentaram certa similaridade quanto a seu perfil,
principalmente em relação ao campo alto. Já em campo baixo, CGRAH (Figura 31),
principalmente, e CGFH (Figura 34) obtiveram sinais característicos de anel
aromático devido a presença de prótons entre δH 7,45 e 7,74 (PAVIA et al., 2001)
que podem estar relacionados à presença de benzofenonas, uma vez que estas já
foram identificadas na espécie, porém, por ser uma amostra complexa, comparada
com a literatura, alguns sinais não foram identificados no espectro de forma clara.
Da Silva (2011) relatou sinais, para benzofenona, entre δH 0,74 – 2,74 referentes aos
carbonos metínicos, metilênicos e metílicos; sinais entre δH 4,83 - 5,17 referentes a
dupla ligação; e sinais entre δH 7,38 – 7,53 do anel aromático, que possuíram certa
similaridade com os extratos CGRAH e CGFH. Este resultado corrobora com a CCD
devido a sugestão de presença de benzofenonas.
Os principais sinais, em todos os extratos hexânicos, variaram de δH 0,8 a 1,5
que são característicos de substâncias de cadeias longas de carbonos metínicos,
metilênicos e metílicos (PAVIA et al., 2001). A possível presença de olefinas se dá
devido aos sinais entre δH 4,15 a 4,30 presente com maior clareza apenas em
CGRAEt (Figura 31) (PAVIA et al., 2001). Foram observados também outros sinais
entre δH 2,0 a 6,0 de difícil caracterização, entretanto esse conjunto de sinais
sugerem a presença de terpenoides com insaturação ou esteroides (FERREIRA,
2011).
67
Figura 31. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das raízes adventícias (CGRAH) de C. grandiflora (CDCl3;
500MHz).
68
Figura 32. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico dos ramos (CGRH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).
69
Figura 33. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das folhas (CGFoH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).
70
Figura 34. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato hexânico das flores (CGFH) de C. grandiflora (CDCl3; 500MHz).
71
Os espectrso dos extratos etanólicos (Figuras 35 a 38) mostraram mais sinais
que os hexânicos, tanto em região de anel aromático, como olefinas e carbonos
metínicos, metilênicos e metílicos.
Os sinais mencionados anteriormente dos espectros dos extratos hexânicos
para presença de esteroides, terpenos e benzofenonas, também foram encontrados
nos extratos etanólicos, exceto para o CGREt (Figura 36) e CGFoEt (Figura 37), que
não foram observados sinais entre δH 7,45 e 7,74 referente ao anel aromático de
benzofenona.
Além destes sinais, outros também foram encontados nos extratos etanólicos,
como os deslocamentos entre δH 6-7. De acordo com Ferreira (2011), estes sinais
podem estar relacionados a presença de flavonoides. A sugestão da presença de
flavonoides corrobora com outros resultados obtidos anteriormente, como, teste
histoquímico, teste para atividade antioxidantem, CLAE e CCD.
72
Figura 35. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das raízes adventícias (CGRAEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).
73
Figura 36. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico dos ramos (CGREt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).
74
Figura 37. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das folhas (CGFoEt) de C. grandiflora (MD3OD; 500MHz).
75
Figura 38. Espectros de RMN de H1 e expansões do extrato etanólico das flores (CGFEt) de C. grandiflora (MD3OD;
500MHz).
76
5.9.4. Perfil por cromatografia com fase gasosa acoplado à espectrômetro de
massas (CG-EM)
A caracterização dos extratos hexânicos também foi feita por CG/EM para
corroborar com a técnica mais conclusiva das realizadas anteriormente, o RMN de
H1. A partir dos cromatogramas obtidos foram selecionadas substâncias mais
representativas para cada extrato, cujos espectros foram determinados em
comparação com o banco de dados do aparelho e descrições da literatura. A Tabela
13 mostra as substâncias referentes a cada extrato, junto ao tempo de retenção,
correlação com o banco de dados e abundância na amostra. Os cromatogramas e
as fragmentações das substâncias majoritárias estão presentes nas Figuras 30 a 37.
Tabela 13. Substâncias identificadas nos extratos hexânicos de C. grandiflora por
CG/EM, sua correlação com o banco de dados e abundância.
Extrato Tempo de
retenção
(min)
Substância Correlação
banco de
dados (%)
Abundância
(%)
CGRAH
14,17 Hexacosano
(Hidrocarboneto)
98 2,32
14,91 Heptacosano
(Hidrocarboneto) -
majoritário
99 5,51
15,61 Octacosano
(Hidrocarboneto)
99 4,05
16,33 Nonacosano
(Hidrocarboneto)
99 4,01
16,99 Triacontano
(Hidrocarboneto)
99 3,08
17,69 Hentriacontano
(Hidrocarboneto)
* 2,36
22,34 3-oxo-friedelina
(Triterpeno)
96* 3,62
77
CGRH
8,71 Ácido palmítico
(Hidrocarboneto –
ácido graxo)
98* 3,54
17,68 Hentriacontano
(Hidrocarboneto)
* 1,52
20,08 α-amirina
(Titerpeno)
93* 3,25
22,22 Epifriedelinol
(Triterpeno)
95* 7,20
22,72 3-oxo-friedelina
(Triterpeno) -
majoritário
96* 63,16
CGFoH
16,31 Nonacosano
(Hidrocarboneto)
* 2,16
17,72 Hentriacontano
(Hidrocarboneto)
* 6,26
19,52 Tritriacontano
(Hidrocarboneto)
* 10,65
20,69 β-amirina
(Triterpeno)
* 15,75
22,18 Epifriedelinol
(Triterpeno)
92* 11,82
22,53 3-oxo-friedelina
(Triterpeno) -
majoritário
96* 23,69
CGFH
5,99 2-propenoato de
dodecila (Éster) -
majoritário
91* 22,81
8,69 Pentadecano
(Hidrocarboneto)
* 7,12
12,58 Tetracosano 99 2,59
78
(Hidrocarboneto)
13,39 Pentacosano
(Hidrocarboneto)
99 4,88
14,16 Hexacosano
(Hidrocarboneto)
* 6,35
14,91 Heptacosano
(Hidrocarboneto)
99 6,89
15,63 Octacosano
(Hidrocarboneto)
99 6,89
16,32 Nonacosano
(Hidrocarboneto)
99 6,26
16,98 Triacontano
(Hidrocarboneto)
99 4,04
17,68 Hentriacontano
(Hidrocarboneto)
* 2,65
Legenda: *literatura (SILVERSTEIN, 1979; ALMEIDA et al., 2011; SILVA, 2007)
CGRAH: extrato bruto hexânico das raízes adventícias de C. grandiflora; CGRH:
extrato bruto hexânico dos ramos de C. grandiflora; CGFoH: extrato bruto hexânico
das folhas de C. grandiflora; CGFH: extrato bruto hexânico das flores de C.
grandiflora.
79
Figura 39. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRAH.
80
Figura 40. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRAH. A)
Hexacosano. B) Heptacosano. C) Octacosano. D) Nonacosano. E) Triacontano. F)
Hentriacontano. G) 3-oxo-friedelina (fragmentos (m/z): 69,2; 205,3; 273,3; 426,5).
81
Figura 41. Cromatograma obtido por CG/EM de CGRH.
82
Figura 42. Fragmentação das substâncias encontradas em CGRH. A) Ácido
palmítico (fragmentos (m/z): 73,2; 185,3; 213,3; 227,3; 256,4). B) Hentriacontano. C)
α-amirina (fragmentos (m/z): 95,2; 189,3; 218,3; 426,5). D) Epifriedelinol (fragmentos
(m/z): 69,3; 95,2; 123,3; 275,4; 413,5). E) 3-oxo-friedelina (fragmentos (m/z): 69,3;
205,3; 273,4; 426,5).
83
Figura 43. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFoH.
84
Figura 44. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFoH. A) Nonacosano.
B) Hentriacontano. C) Tritriacontano. D) β-amirina (fragmentos (m/z): 95,3; 189,3;
218,3; 426,5). E) Epifriedelinol (fragmentos (m/z): 69,3; 95,2; 275,4; 413,5). F) 3-oxo-
friedelina (fragmentos (m/z): 69,3; 205,3; 273,4; 426,5).
85
Figura 45. Cromatograma obtido por CG/EM de CGFH.
86
87
Figura 46. Fragmentação das substâncias encontradas em CGFH. A) 2-propenoato
de dodecila B) Pentadecano. C) Tetracosano D) Pentacosano. E) Hexacosano. F)
Heptacosano. G) Octacosano. H) Nonacosano. I) Triacontano. J) Hentriacontano.
Dentre as substâncias identificadas como majoritárias destacaram-se, então,
a presença de triterpenos com esqueletos do tipo ursanos e friedelanos,
principalmente a 3-oxo-friedelina, que são comumente encontrados no gênero,
corroborando com os resultados encontrados por CCD.
5.10. Fracionamento do extrato bruto CGREt
88
Face os bons resultados obtidos frente aos ensaios biológicos realizados com
CGREt, parte deste extrato foi fracionado em CLV usando como eluentes hexano,
diclorometano, acetato de etila, metanol e metanol:água fornecendo cinco frações,
conforme o fluxograma da Figura 47.
Figura 47. Fluxograma do fracionamento do CGREt.
Após utilizar o solvente mais polar, metanol:água, observou-se que parte do
material ficou retido na fase estacionária, isto poderia estar relacionado com o baixo
rendimento total do fracionamento por esta técnica.
As frações obtidas foram cromatogradas em CCD e observou-se que a fração
CGREtH (1) sugere a presença de duas substâncias mais apolares como
majoritárias (setas), conforme mostra a Figura 48.
89
Figura 48. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas
por CLV eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1) e reveladas em
lâmpada de luz UV em 254 nm. b: extrato bruto etanólico dos ramos, 1: fração
CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração
CGREtMA, setas: substâncias majoritárias apolares.
A fração CGREtD (2) quando revelada em vanilina sulfúrica (Figura 49A)
sugere a presença de aproximadamente sete substâncias, além de apresentar
resultado positivo para alcaloide (Figura 49B) e atividade antioxidante (Figura 49C).
A fração CGREtAc (3) sugeriu a presença de aproximadamente cinco substâncias
(Figura 49A), resultado positivo para alcaloide (Figura 49B) e uma boa atividade
antioxidante (Figura 49C). Já a fração CGREtM (4) apresentou apenas resultado
positivo para atividade antioxidante (Figura 49C).
90
Figura 49. CCDs do extrato bruto etanólico dos ramos e das frações obtidas
na CLV. A) CCD das frações 1 a 5 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético
(60:39:1) e reveladas em vanilina sulfúrica. B) CCD das frações 2 a 5 eluídas em
hexano: acetato de etila: ácido acético (40:59:1) e reveladas em reagente
Dragendorff. C) CCD das frações 2 a 5 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido
acético (20:79:1) e reveladas em DPPH. b: extrato bruto etanólico dos ramos, 1:
fração CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração
CGREtMA.
Por fim, as frações da CLV foram comparadas com frações enriquecidas das
substâncias 13, 16 e 17 (Figura 50) e indicam a presença de 13 na fração CGREtD
(2) e de 16 na fração CGREtH (1).
Figura 50. CCD das frações obtidas na CLV e frações enriquecidas com as
substâncias 13, 16 e 17 eluídas em hexano: acetato de etila: ácido acético (80:19:1)
91
e revelados em vanilina sulfúrica. 1: fração CGREtH, 2: fração CGREtD, 3: fração
CGREtAc, 4: fração CGREtM, 5: fração CGREtMA, lan: fração enriquecida com a
substância 17, clu: fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida
com a substância 13, setas: substâncias majoritárias.
5.10.1. Atividade antimicrobiana das frações da CLV
As frações obtidas por CLV tiveram o CIM frente às cepas que foram inibidas
no CGREt (P. aeruginosa e. coli) e seus resultados encontram-se na Tabela 14.
Tabela 14. Concentrações mínimas necessárias de cada fração para inibir o
crescimento das cepas P. aeruginosa e E. coli.
Código das amostras P. aeruginosa E. coli
CGREtH >256 μg/mL 128 μg/mL
CGREtD 128 μg/mL 8 μg/mL
CGREtAc >256 μg/mL 8 μg/mL
CGREtM >256 μg/mL >256 μg/mL
CGREtMA >256 μg/mL >256 μg/mL
A fração CGREtD foi a mais eficaz frente ambas às cepas. CGREtH e
CGREtAc obtiveram atividade frente à E. coli, tendo a CGREtAc um bom resultado.
Apesar dos altas CIM, as frações ainda mostraram valores dentro da faixa de
concentração aceita pelo CLSI (512 μg/mL> CIM> 0,25 μg/mL).
5.10.2. Isolamento e purificação de substâncias obtidas em CGREtD e
suas elucidações estruturais
Como a fração CGREtD (1,0573g) obteve o melhor resultado frente à
atividade antimicrobiana e presença de um número maior de substâncias
majoritárias nas CCDs, esta foi separada por cromatografia em coluna com gel de
sílica utilizando eluentes hexano, acetato de etila e metanol, em gradiente de
92
polaridade fornecendo um total de 34 frações que após a análise por CCD foram
reagrupadas em 9 frações.
As frações 3 e 4 exibiram cristais após a evaporação do solvente. Essas
foram, então, recristalizadas utilizando etanol e analisada com as demais frações por
CCD (Figura 51) e reveladas sob a lâmpada de luz UV em 365 nm. As frações de 5
a 9 foram analisadas separadamente em outro eluente (Figura 52).
Figura 51. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD, das
frações 1 a 4 e frações 3 e 4 recristalizadas eluídas em hexano: acetato de etila:
ácido acético (85:14:1) e revelados sob lâmpada de luz UV em 365 nm. B: extrato
bruto etanólico dos ramos; C: fração CGCEtD obtida da CLV; 1 a 4: frações obtidas
da coluna em gel de sílica, 3rec e 4rec: frações obtidas após recristalização.
93
Figura 52. CCD do extrato bruto etanólico dos ramos, da fração CGCEtD e
das frações 5 a 9 eluidos em hexano: acetato de etila: ácido acético (50:49:1) e
revelados sob lâmpada de luz UV em 256 nm. B: extrato bruto etanólico dos ramos;
C: fração CGCEtD obtida da CLV; 5 a 9: frações obtidas da coluna em gel de sílica.
Por fim, as frações da coluna em gel de sílica foram comparadas com frações
enriquecidas das substâncias 13, 16 e 17 e indicam a presença de 13 na fração 3rec
e 4rec (Figura 53A) e da substância 17 nas frações de 5 a 9 (Figura 53B).
Figura 53. CCD das frações 1 a 9, frações recristalizadas e frações
enriquecidas com as substâncias 13, 15 e 16 eluídas em hexano: acetato de etila:
ácido acético (75:24:1) e revelados em vanilina sulfúrica. A) Frações de 1 a 4 obtidas
da coluna em gel de sílica, frações 3rec e 4rec recristalizadas e frações enriquecidas
com 13, 16 e 17. B) Frações de 5 a 9 obtidas da coluna em gel de sílica e frações
94
enriquecidas com 13, 16 e 17. lan: fração enriquecida com a substância 17, ben:
fração enriquecida com a substância 16, fri: fração enriquecida com a substância 13,
setas: substâncias majoritárias.
Após a análise por CCD as frações 8 e 9 foram cromatografadas em CCD
preparativa, porém, a quantidade de amostra resultante não foi o suficiente para
elucidação estrutural.
Já as amostras 3rec e 4rec, quando reveladas em vanilina com a fração
enriquecida da substância 13 apresentou mesmo Rf e mesma coloração como
proposta na literatura (NOUFOU et al., 2012). Essas amostras foram, então,
enviadas para CG/EM e tiveram suas substâncias majoritárias identificadas em
comparação com banco de dados do aparelho e dados da literatura (Tabela 15 e
Figuras 54 e 55).
Tabela 15. Substância majoritária identificada nas frações cromatogradas em coluna
com gel de sílica de C. gradiflora por CG/EM.
Fração Tempo de
retenção
(min)
Substância Correlação
banco de
dados (%)
Abundância
(%)
CGREtD 3rec 22.83 3-oxo-friedelina
(Triterpeno)
96* 92,28
CGREtD 4rec 22.85 3-oxo-friedelina
(Triterpeno)
96* 90,80
Legenda: *literatura (ALMEIDA et al., 2011)
CGREtD 3rec: fração 3rec da coluna obtida da fração em diclorometano da CLV do
extrato etanólico dos ramos de C. grandiflora; CGREtD 4rec: fração 4rec da coluna
obtida da fração em diclorometano da CLV do extrato etanólico dos ramos de C.
grandiflora.
95
Figura 54. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 3rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 3rec. B) Espectro de massas da
substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 3rec.
96
Figura 55. Cromatograma e fragmentação das substâncias obtidas na fração
CGREtD 4rec. A) Cromatograma da fração CGCEtD 4rec. B) Espectro de massas da
substância 3-oxo-friedelina obtida da fração CGCEtD 4rec.
Como as frações obtidas são ricas em 3-oxo-friedelina (C30H50O) o processo
de fragmentação originou íon molecular m/z 426 e íons fragmentos de m/z 273, m/z
205 e m/z 69, conforme encontrado em Almeida (2011). O processo de
97
fragmentação foi proposto por Fernandes (2010) e Carvalho (2013) como é
mostrado na Figura 56.
Figura 56. Proposta de fragmentação da 3-oxo-friedelina.
A substância majoritária da fração 3rec, como estava em maior abundância
no CG/EM, também foi analisada por RMN de H1 e resultaram na presença de todos
os sinais característicos para um triterpeno friedelano: sete simpletos referentes às
metilas (δH 1,18; 1,05;1,01; 1,00; 0,95; 0,87 e 0,73) e um dupleto em δH 0,88
referente aos prótons metila ligados ao carbono C-23. Os demais sinais de
hidrogênio metilênicos e metílicos se acoplaram formando multipletos difíceis de
serem visualizados na região entre δH 1,18-1,59 e multipletos entre δH 2,20-2,39
referentes a prótons α-carbonílicos. Estes sinais estão de acordo com os dados da
literatura (ALMEIDA et al., 2011; CARVALHO, 2013), conforme mostra a Figura 57 e
Tabela 16. Confirmando mais uma vez que essa substância majoritária é a 3-oxo-
friedelina (13) (Figura 58).
98
Figura 57. Espectro de RMN de H1 da 3-oxo-friedelina e expansões do campo alto.
99
Tabela 16. Dados do RMN de H1 da 3-oxo-friedelina comparados a literatura*.
H δH fração δH literatura
1 a 1,96 (m) 1,96 (m)
1 b 1,69 (ddd, J = 26,1; 13,1;
5,1 Hz) - sobreposto
1,68 (dq; J = 13,0; 5,1 Hz)
2 a 2.39 (ddd, J = 13,7; 5,1,
2.0 Hz)
2,39 (ddd; J = 13,7; 5,1;
1,9 Hz)
2 b 2.30 (m) -sobreposto 2,29 (m; J = 13,8; 13,6;
6,5 Hz)
4 2.25 (dd, J = 14,1; 6,9 Hz)
- sobreposto
2,24 (q; J = 6,5 Hz)
6 a 1,75 (dd, J= 15,4; 2,7 Hz)
- sobreposto
1,75 (m)
23 0.88 (d, J = 6,7 Hz) -
sobreposto
0,87 (d; J = 6,5 Hz)
24 0,73 (s) 0,73 (s)
25 0,87 (s) - sobreposto 0,88 (s)
26 1.01 (s) 1,01 (s)
27 1,05 (s) 1,05 (s)
28 1,18 (s) 1,18 (s)
29 1,00 (s) 1,00 (s)
30 0,95 (s) 0,95 (s)
Legenda: *ALMEIDA et al., 2011
Figura 58. Estrutura química da 3-oxo-friedelina (13).
100
Como o CG/EM e o RMN de H1 mostraram que as frações ainda não estavam
puras e se trataram da mesma substância elas foram reunidas e novamente
recristalizadas com acetato de etila e lavadas com etanol, conforme proposto por
Pires e colaboradores (2009). Após cristalização observou-se a formação de um
sólido branco em forma de agulhas (CGREtF – 3,1mg), como descrito no trabalho de
Almeida e colaboradores (2011) e seu ponto de fusão (PF) resultou numa faixa de
260-265ºC próximo ao encontrado na literatura (260-261ºC) (SEUPEL et al., 2015).
5.10.3. Atividade antimicrobiana da 3-oxo-friedelina
Como a fração CGREtD (2) da CLV foi a mais ativa frente à P. aeruginosa e
E. coli decidiu-se avaliar a atividade antimicrobiana de CGREtF frente às mesmas
cepas.
O CIM para esta fração em ambas às cepas foi maior que 256 μg/mL,
indicando que, na concentração utilizada, possivelmente a 3-oxo-friedelina (13) não
foi a responsável ou não sozinha pela atividade antimicrobiana encontrada na fração
CGREtD (2), apesar de ser encontrados relatos na literatura quanto ao seu potencial
(SINGH & DUBEY, 2001).
6. CONCLUSÕES
As características anatômicas encontradas em C. grandiflora foram epiderme
unisseriada com estômatos restritos a face abaxial, cutícula espesssa com flages,
presença de hipoderme, diversas estruturas secretoras e idioblastos com drusas.
Essas características contribuíram com os dados da literatura descritos para a
família Clusiaceae e para similaridade com outras espécies.
Os testes histoquímicos demonstraram a presença de grãos de amido,
lipídeos, taninos e flavonoides em localização esperada e descrita na literatura.
A caracterização anatômica e histoquímica da espécie permitiu o
estabelecimento de parâmetros para futura verificação de autenticidade de
amostras.
101
A análise dos valores de CE50 e da atividade antioxidante máxima mostraram
que os extratos apresentaram potencial antioxidante, destacando-se o extrato
etanólico das raízes adventícias.
O teor de flavonoides expressos como flavonas e flavonóis obtiveram baixos
valores para estas substâncias. Porém, quando foram analisados estatisticamente
obtiveram uma correlação positiva entre o CE50 e a presença de flavonoides.
A atividade citotóxica foi promissora para os extratos etanólicos dos ramos e
folhas frente às linhagens de cólon humano e ascite gástrica, respectivamente.
Para a atividade antimicrobiana os extratos apresentaram atividade apenas
frente às cepas P. aeruginosa e E. coli, destacando-se todos os extratos etanólicos e
o extrato hexânico dos ramos. As frações obtidas do extrato etanólico dos ramos
também foram avaliadas e obtiveram bons resultados para as frações em
diclorometano, principalmente, e acetato de etila. A substância majoritária presente
na fração em diclorometano, a 3-oxo-friedelina, teve seu potencial avaliado e como
resultado pode-se sugerir que esta não foi a responsável ou não sozinha pela
atividade antimicrobiana na concentração utilizada. Sugerindo a utilização de uma
concentração maior para estudos futuros.
O potencial acaricida para os extratos hexânicos não apresentaram um bom
resultado, tendo uma melhor atividade apenas o extrato dos ramos.
A prospecção química sugeriu a presença de substâncias fenólicas,
benzofenonas e terpenoídicas. O perfil obtido por CCD foi bastante amplo, podendo
ser corroborado após a realização das demais técnicas. Por CLAE-DAD foi possível
sugerir a presença, principalmente, de substâncias fenólicas nos extratos etanólicos.
Por RMN de H1 foi sugerido a presença das substâncias terpenoidicas, flavonoides e
benzofenonas, mencionadas anteriormente, mas como se trata de uma matriz
complexa os sinais estavam sobrepostos dificultando a identificação. A análise por
CG/EM dos extratos hexânicos demonstrou, principalmente, a presença de
triterpenos do esqueleto friedelano.
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que C. grandilora pode ser alvo
para estudos futuros visando o isolamento de outras classes de substâncias,
avaliação de outras atividades biológicas e busca por metabólitos que possam se
102
tornar alvo para indústria farmacêutica. Além disso, contribuiu para ampliação do
conhecimento da família e, assim, da flora brasileira.
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