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BUNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Mariana Natalice de Siqueira
TRANSFERIBILIDADE E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
MARCADORES MICROSSATÉLITESGÊNICOS EM Eugenia
klotzschiana BERG (MYRTACEAE)
Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
GOIÂNIA – GO
AGOSTO – 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Mariana Natalice de Siqueira
TRANSFERIBILIDADE E VARIABILIDADE GENÉTICA NOS
MICROSSATÉLITESGÊNICOS EM Eugenia klotzschiana BERG
(MYRTACEAE)
Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
Dissertação apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Genética e
Biologia Molecular, da Universidade Federal de
Goiás, como exigência para obtenção do título de
Mestre.
GOIÂNIA – GO
AGOSTO – 2014
MARIANA NATALICE DE SIQUEIRA
TRANSFERIBILIDADE E VARIABILIDADE GENÉTICA NOS
MICROSSATÉLITESGÊNICOS EM Eugenia klotzschiana BERG
(MYRTACEAE)
Dissertação apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Genética e
Biologia Molecular, da Universidade Federal de
Goiás, como exigência para obtenção do título de
Mestre.
APROVADA:
________________________ _________________________
Mariana Pires de Campos Telles
(Orientadora)
DEDICATÓRIA
À minha mãe, Maria Conceição, às
minhas irmãs, Gleice e Janaina e ao meu
noivo Geovânio, por ter me apoiado e me
dado força em todos os momentos. Amo
vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Capes pela concessão da bolsa de mestrado, à FAPEG (FAPEG
/AUX PESQ CH 007/2009) e ao CNPq(563839/2010-4) pelo apoio financeiro aos
projetos, que foram de singular importância para o andamento e conclusão do mestrado.
Agradeço ao pesquisador Dr. Dario Grattapaglia (Embrapa CENARGEN) por
ter cedido o conjunto deprimers para que este trabalho pudesse ser realizado.
Ao Prof. Lázaro José Chaves agradeço por todo apoio nas expedições de coleta.
À minha orientadora professora Dra. Mariana Pires de Campos Telles, pela
oportunidade, confiança, pelos ensinamentos e pelas palavras de amizade que me
ajudaram a seguir em frente.Meus sinceros agradecimentos.
Às professoras Dra. Rosane Garcia Collevatti e Dra. Thannya Nascimento
Soares, pelas contribuições no meu processo de aprendizagem, e também a todos os
professores do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular da
Universidade Federal de Goiás, por contribuir com a minha formação no mestrado.
Agradeço às bolsistas AT e DTI que estiveram no LGBio (Thaís Castro,
Ludymila Guedes, Fernanda Fraga, Daniela Anjos, Ramilla Braga e em especial a Sara
Giselly Gondim) pela paciência, respeito, ensinamentos e amizade. Agradeço aos
colegas e amigos do LGBio (Vanessa Bernardes, Tatianne Piza, Warita Melo, Kássia
Marquês, Ueric José, Luciana Vitorino, Ana Clara Barbosa, Leciane, Monik, Lays, e em
especial aElen Miranda, Ariane Rolins e Rejane Araújo). Obrigada pela amizade,
conselhos e trocas de conhecimentos. Nossa convivência, as conversas e brincadeiras
deixarão saudades, sei que são amizades que o tempo não vai apagar. Meninas, as
nossas festinhas e comemorações foram as melhores. Agradeço também aos demais
colegas pela convivência.
Agradeço aos meus amigos e conhecidos que sempre acreditaram em mim, me
ajudaram e me incentivaram, Marília, Karolina, Letícia, Kássia Gonçalves, Thayane,
José Neto, professora Dra. Adriana Freitas Neves, Cássia Silva, Dona Jandira, entre
outros.
Agradeço a Deus e a Nossa Senhora, por terem me dado força e coragem para
seguir adiante mesmo nos momentos difíceis. Se eu não desisti foi por ter fé que tudo
iria dar certo.
Agradeço à minha família que me apoiou e me ajudou de forma direta ou
indireta, nessa etapa da minha caminhada, em especial a minha mãe Maria Conceição,
que foi minha fortaleza emeu apoio para eu seguir a diante. A minha irmã Gleice, pelo
carinho e apoio, e minha irmã Janaina Siqueira, que esteve ao meu lado nos momentos
bons e ruins, agradeço pela paciência comigo nas minhas crises, sendo quase mãe
quando necessário, me apoiando sempre. Agradeço ao meu pai Donizetti, minha tia
Luiza, pelo carinho. E ao meu irmão Maximiliano (in memoriam), que viverá sempre
em meu coração. Vocês são o motivo de todo meu esforço, amo vocês!
E por fim, porém não menos importante agradeço ao meu noivo Geovânio Peres,
que me apoiou com palavras de incentivo e carinho, mesmosendo necessárioestar longe
por esses dois anos. Agradeço pelo carinho, amor e compreensão.Eu te amo!
RESUMO
Siqueira, M. N.Transferibilidade e variabilidade genética de marcadores microssatélitesgênicos em Eugenia klotzschiana berg (Myrtaceae). 2014. 81f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular), Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.
Eugenia klotzschiana Bergé uma espécie da família Myrtaceae com distribuição restrita no Cerrado. Seus frutos apresentam potencial alimentício e podem ser utilizados de forma extrativista,como matéria-primapara produção de doces, geleias e sucos. Neste contexto, torna-se necessário a avaliação de aspectos genético-populacionais a fim de disponibilizar informações que auxiliem no direcionamento de estratégias de manejo e conservação. Marcadores microssatélites têm sido utilizados nos últimos anospara avaliar a variabilidade genética em um contexto populacional. As sequências que flanqueiam as regiões microssatélites no genoma encontram-se altamente conservadas entre espécies relacionadas, o que possibilita a transferibilidade destes marcadores, reduzindo, desta forma, os custos de desenvolvimento dos mesmos para cada uma das espécies que se pretende estudar. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi testar o potencial de transferibilidade para o genoma de Eugenia klotzschiana, de marcadores microssatélites gênicos desenvolvidos para Eucalyptus, assim como caracterizar a variabilidade genética existente em suas populações. Para tanto, o DNA foi extraído a partir de tecido foliar de indivíduos de E. klotzschianae utilizado para testar a amplificação cruzada de 120 pares de primers. Amostras oriundas de sete localidades foram utilizadas para a caracterização da variabilidade genética populacional. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose, poliacrilamida e emeletroforese capilar, em diferentes etapas. Do total deprimers testados, 67 (55,83%) não amplificaram, 42 (35%) apresentaram muitos produtos de amplificação inespecíficos e 11 (9,2%) foram considerados transferidos com sucesso. Dos 11 transferidos, oito apresentaram polimorfismo. Para os oito marcadores polimórficos, a probabilidade de identidade foi alta (2,02x10-3) e o poder de exclusão de paternidade foi moderado (0,74). Na população, o valor médio da heterozigosidade esperada (He) foi de 0,28 e a heterozigosidade observada (Ho) foi de 0,44, já nas subpopulações os valores médios de He variaram de 0,18 a 0,27 e os valores médios de Ho variaram de 0,36 a 0,53.Não foram observados valores significativos para o índice de fixação (f) nas subpopulações, indicando que as frequências alélicas seguem as proporções esperadas pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg. A medida de divergência genéticaentre as subpopulações apresentou diferenciação genética relativamente alta,com valor de θigual a0,20, e com valores par-a-par variando entre 0,00 e 0,34. A estratégia de transferibilidade de marcadores microssatélites foi eficiente para gerar um painel de marcadores microssatélites polimórficos e conhecer um pouco da variabilidade genética da espécie. Foi possível verificar que existe uma baixa variabilidade genética dentro das subpopulações para os marcadores avaliados. Todavia, esse trabalho é um ponto de partida para futuros estudos que permitam conhecer melhor a biologia reprodutiva da espécie Eugenia klotzschiana. Palavras-chave:Ferramentas moleculares, genética de populações, pera-do-cerrado, SSR. __________________________
1Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles. ICB-UFG.
ABSTRACT
Siqueira, M. N. Transferability and genetic variability of microsatellite markers genic Eugeniaklotzschianaberg (Myrtaceae).2014. 81f.Dissertation (Master in Genetics and Molecular Biology), Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014.
Eugenia klotzschiana Berg is a species of Myrtaceae with restricted distribution in the Cerrado. Its fruits present nutritional potential and can be used in extractive way, as raw material for production of jams, jellies and juices. In this context, it is necessary to evaluate population-genetic aspects in order to provide information to assist in targeting strategies for management and conservation. To assess the genetic variability in a population context microsatellite markers have been used in recent years. The sequences flanking the microsatellite regions of the genome are highly conserved between related species, enabling the portability of these markers, reducing thereby the costs of developing the same for each species under study. In this context, the aim of this study was to test the potential for transferability to the genome of E. klotzschiana of genic microsatellite markers developed for Eucalyptus, as well as to characterize the genetic variability in their populations. For this purpose, DNA was extracted from leaf tissue of E. klotzschiana individuals and used to test the cross 120 pairs of amplification primers. Samples from seven locations were used to characterize the population genetic variability. The amplification products were analyzed on agarose and polyacrylamide capillary electrophoresis gel in different stages. Of total primers tested, 67 (55.83%) did not amplify, 42 (35%) had many nonspecific amplification products and 11 (9.2%) were successfully transferred. Of the 11 transferred eight showed polymorphism. For the eight polymorphic markers, the probability of identity was high (2.02 x10-3) and the power of paternity exclusion was moderated (0.74). In this population the average value of expected heterozygosity (He) was 0.28 and observed heterozygosity (Ho) was 0.44, as in subpopulations of He mean values ranged from 0.18 to 0.27 and the mean values Ho ranged from 0.36 to 0.53, respectively. No significant for the fixation index (f) were observed in the populations values indicating allele frequencies below the expected Hardy-Weinberg proportions.The extent of genetic divergence among subpopulations showed relatively high genetic differentiation, with a value of θ equal to 0.20, and peer-to-peer values ranging between 0.00 and 0.34. The strategy of transferability of microsatellite markers was efficient to generate a panel of polymorphic microsatellite markers and learn a little of the genetic variability of the species. It was possible to verify that there is a low genetic variability within subpopulations for biomarkers. However, this work is a starting point for future studies to better understand the reproductive biology of the species Eugenia klotzschiana.
Keywords: Molecular tools, population genetics, pera-do-cerrado, SSR.
SUMÁRIO 1.0 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 13 2.0 OBJETIVOS.......................................................................................................... 15 2.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................... 15 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 15
3.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................ 16
3.1 MARCADORES MICROSSATÉLITES................................................................ 16
3.2 SISTEMA REPRODUTIVO E VARIABILIDADE GENÉTICA EM
PLANTAS............................................................................................................... 26
3.3 BIOMA CERRADO E FAMÍLIA MYRTACEAE................................................ 29
3.4 ESPÉCIE Eugenia klotzschiana BERG............................................................... 33
4.0 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 37
4.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS........................................................................... 37
4.2 OBTENÇÃO DOS DADOS MOLECULARES..................................................... 37
4.3 CARACTERIZAÇÃO DA VARIABILIDADE NOS LOCOS
MICROSSATÉLITES............................................................................................. 40 5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 41 5.1 TRANSFERIBILIDADE........................................................................................ 41
5.2 VARIABILIDADE GENÉTICA NOS LOCOS..................................................... 46
5.3 VARIABILIDADE GENÉTICA NAS SUBPOPULAÇÕES................................. 51
6.0 CONCLUSÕES..................................................................................................... 56
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 57
ANEXOS................................................................................................................ 73 APÊNDICE........................................................................................................... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação de trabalhos que avaliaram o potencial de transferibilidade de primers
de regiões microssatélites entre espécies vegetais........................................ 25
Tabela 2. Localidade, código da população, número de indivíduos coletados de Eugenia
klotzschiana com suas respectivas georeferências.................................................. 37
Tabela 3. Protocolo para reações de PCR demonstrando os reagentes utilizados e suas
respectivas concentrações de uso para um sistema de 10 µL................................ 38
Tabela 4. Trabalhos de transferibilidade de marcadores microssatélites.............................. 42
Tabela 5. Sistemas de multiplexes de eletroforese estabelecido para Eugenia klotzschiana. 43
Tabela 6. Relação dos pares de primers de regiões microssatélites transferidos de
Eucalyptus para Eugenia klotzschiana................................................................... 45
Tabela 7. Caracterização genética dos 11 locos microssatélites na população de Eugenia
klotzschiana. Número de indivíduos analisados (n); número de alelos por loco
(NA); heterozigosidade esperada (He); observada (Ho); probabilidade de
identidade (I) e probabilidade de exclusão de paternidade (Q)............................. 48
Tabela 8. Caracterização da variabilidade genética em cinco subpopulações de Eugenia
klotzschiana, sendo elas, Santo Antônio do Rio Verde (SAR), Silvânia (SIL),
Portelândia (POT), Senador Canedo (SCN) e Rio Verde (RIV). Em que, n:
número de indivíduos; NA: número de alelos; He: heterozigosidade esperada;
Ho: heterozigosidade observada; f: índice de fixação..................................... 53
Tabela 9. Teste de aderência às proporções esperadas para o equilíbrio de Hardy-
Weinberg (Teste Exato de Fisher).......................................................................... 54
Tabela 10. Divergência genética (θ) entre subpopulações de Eugenia klotzschiana............... 54
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Base genética e detecção de polimorfismo de microssatélite. Em A e B apresenta
genótipos homozigoto e heterozigoto e em C, um gel de eletroforese com
diferentes genótipos homozigotos (uma banda) e heterozigotos (duas bandas)
(Fonte: FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).............................................. 17
Figura 2. Mecanismo de mutação slippage durante a replicação em uma região
microssatélite (Adaptado de GOLDSTEIN & SCHLÖTTERER, 1999)............ 20
Figura 3. Protocolo do isolamento de microssatélites a partir de seleção por hibridização
com oligonucleotídeos 5’ biotinilados e revestido de estreptavidina (Kandpal et
al., 1994 , Kijas et al., 1994, Billotte et al., 1999).(Adaptado de Zane et al., 2002) 23
Figura 4. Mapa mostrando áreasde Cerrado e suas transições (Fonte: IBGE - Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística, 2011)........................................................ 29
Figura 5. Flor de Eugenia klotzschiana (Pera-do-Cerrado) (Fonte:LGBio).................... 34
Figura 6. Fruto de Eugenia klotzschiana (Pera-do-Cerrado) (Fonte:LGBio).................. 35
Figura 7. Padrão de amplificação de alguns pares de primers no genoma de três indivíduos
de Eugenia klotzschiana em gel de acrilamida a 6% (Amplificação cruzada).
Marcador de peso molecular 10 pb......................................................................... 41
Figura 8. Porcentagem de locos microssatélites ESTs com padrão de amplificação
inespecífica, não amplificadose com bom padrão de amplificaçãoem três
indivíduos de Eugenia klotzschiana avaliados em gel de acrilamida................. 42
Figura 9. Perfil em eletroforese capilar dos locos transferidos. Organizados em sistemas
multiplex de genotipagem. Visualização dos sistemas multiplex 1, 2, 3 e 4...... 44
Figura 10. Histograma das frequências alélicas de seis locos microssatélites transferidos,
estimadas para 102 indivíduos da espécie Eugenia klotzschiana. O eixo Y indica
as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos em pares de bases (pb)........... 49
Figura 11. Histograma das frequências alélicas de cinco locos microssatélites transferidos,
estimadas para 102 indivíduos da espécie Eugenia. klotzschiana. O eixo Y indica
as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos em pares de bases (pb).............. 50
Figura 12. Proporção de locos polimórficos nas subpopulações. Santo Antônio do Rio Verde
(SAR), Silvânia (SIL), Portelândia (POT), Senador Canedo (SCN) e Rio Verde
(RIV)..................................................................................................................... 51
LISTA DE ANEXOS Anexo I Mapa da ocorrência registrada para a espécie Eugenia klotzschiana
(Fonte:Google Earth).................................................................................................. 73
Anexo II Protocolo de extração de DNA a partir de tecidofoliar............................... 74
Anexo III Protocolo de coloração com nitrato de prata (CRESTE et al., 2001)............ 76
13
1.0 INTRODUÇÃO
O Cerrado ocupa cerca de 2 milhões de km² no Brasil, representando cerca de
22% do território nacional (FELFILI & SILVA JUNIOR, 2005; MMA, 2013). O
Cerrado é considerado um dos hotspot de diversidade do mundo (MITTERMEIER et
al., 2005). No entanto, o bioma é pouco protegido por unidades de conservação, onde
possui uma das menores porcentagens de área de proteção integral (MMA, 2013),
tendogrande parte do território desmatado para ocupação de lavouras e agropecuária
(MARTINOTTO et al., 2008).
O Cerrado possui inúmeras espécies com grande potencial de utilização
econômica, empregadas na indústria medicinal e alimentícia, sendo exploradas de forma
extrativista.Dentre estas espécies, encontramos a espécie Eugenia klotzschiana Berg.
(FARIA et al., 2006), que é encontrada em áreas restritas do Cerrado brasileiro
(ALMEIDA et al., 1998), com relatos na Bolívia (VILLARROEL & PROENÇA,
2013).Eugenia klotzschiana é raramente cultivada (LORENZIet al., 2006), sendo
considerada quase rara em seu ambiente natural (ANDERSEN & ANDERSEN, 1989;
ALMEIDA et al., 1998).
Assim como outras espécies do Cerrado, Eugenia klotzschiana se encontra
vulnerável à perda de variabilidade genética, devido à exploração por extrativismo e a
constante degradação do Cerrado. Para tanto, a análise da variabilidade genética
existente nas populações das espécies de interesse torna-se importante para fins de
manejo e conservação (FALEIROet al., 2007).
Nesse contexto, marcadores microssatélites são muito empregados como
ferramentas moleculares em estudos de variabilidade genética. O elevado polimorfismo
dosmarcadores microssatélites pode ser usado para o estudo de populações naturais de
plantas, pois permite conhecer a distribuição da variabilidade genética entre e dentro de
populações naturais, o que é de grande importância para adotar estratégias eficientes
para conservação(OLIVEIRA et al., 2006).
Microssatélites são um dos marcadores mais eficientes para estudos de genética
de populações, variabilidade genética, estudos evolutivos, análise de paternidade e para
mapeamentos genéticos e físicos (VARSHNEYet al., 2005). Marcadores microssatélites
ainda são empregados na análise de genoma, mapeamento de genes e seleção assistida
por marcadores (KALIAet al., 2011). Entretanto, para diversos estudos empregando
marcadores microssatélites é necessário que se disponha de primersespécie-específicos
14
para as regiões microssatélites a serem amplificadas via PCR de uma determinada
espécie (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Marcadores microssatélites possuem uma alta taxa de transferibilidade, podendo
ser transferidos entre espécies relacionadas, diminuindo custos elevados e trabalhos
necessários na construção de bibliotecas genômicas, clonagens e sequenciamentos para
o isolamento de microssatélites e desenvolvimento deprimers.Assim, desde que
marcadores microssatélites estejam disponíveis em espécies relacionadas à espécie de
interesse, é viável testar a transferibilidade(FERREIRA &GRATTAPAGLIA, 1998;
ZUCCHI et al.,2002; WANG et al., 2009).
15
2.0 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem como objetivo disponibilizar uma bateria de marcadores
microssatélites para a espécie Eugenia klotzschiana a partir da transferibilidade de
marcadores microssatélites gênicos desenvolvidos para Eucalyptus e caracterizar a
variabilidade genética em subpopulações de Eugenia klotzschiana.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Testar o potencial de transferibilidade de marcadores microssatélites gênicos
desenvolvidos para Eucalyptus;
• Disponibilizar uma bateria de marcadores polimórficos para o genoma de
Eugenia klotzschiana;
• Caracterizar a variabilidade genética existente entre e dentro de subpopulações
de Eugenia klotzschiana.
16
3.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 MARCADORES MICROSSATÉLITES
Em meados da década de 60os marcadores utilizados na identificação de
variações genéticas eram os marcadores morfológicos, que foram de grande importância
na construção das primeiras versões de mapas genéticos e na fundamentação teórica de
estudos de ligação de genes. Marcadores morfológicoseram limitados, por se
apresentaremem baixo número, estarem sujeitos a mudanças ambientais,e por serem
voltados para espécies modelo,dificultando, assim, análises em outras espécies de
interesse.Marcadores morfológicos, não eramrobustos o suficiente para associar um
marcador a uma determinada característica, com isso viu-se a necessidade em
desenvolver novas ferramentas para detecçãoda variação genéticanonível de DNA
(FERREIRA& GRATTAPAGLIA, 1998).
A revolução em estudos de variação genética começou com o desenvolvimento
de marcadores que permitiram a detecção do polimorfismo nas proteínas, denominados
marcadores isoenzimáticos.Os marcadores isoenzimáticos, possibilitaram estudar
inúmeras espécies de plantas.Com o advento das novas técnicas em Biologia Molecular
foi possível à detecção da variação genética, por meio de vários métodosno nível de
DNA. Primeiramente, o emprego de enzimas de restrição permitiu o estudo de
RFLP(Restriction Fragmente Length Polymorphism)através de hibridização
(GRODZICKER et al., 1974). Posteriormente, Kery Mullis desenvolveu a técnica de
PCR - Polymerase Chain Reaction (MULLIS & FALOONA, 1987; SAIKI et al., 1988).
Com o desenvolvimento da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
foi possível desenvolver outros marcadores, como de sequências repetitivas no genoma,
os minissatélites ou VNTR – Variable Number of Tandem Repeats (LEWIN, 1990),
mais tardeos RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA, empregando primers
aleatórios (WILLIAMS et al., 1990), AFLP - Amplified Fragment Length
Polymorphism (ZABEAU, 1993),microssatélites/SSR - Simple Sequence Repeat(LITT
& LUTY, 1989) ou STR (Short Tandem Repeats) (EDWARDS & ELGAR, 1998), ISSR
- Inter Simple Sequence Repeats(REDDY et al., 2002),e marcadores baseados em
sequência,os SNP - Single Nucleotide Polymorphism(CHO et al., 1999; RAFALSKI
2002).
Entre tantos marcadores desenvolvidos, os marcadores microssatélites se
destacam em estudos de variação genética por possuírem alguns atributos que fazem
17
com que sejam altamente informativos e de fácil utilização,apresentando as seguintes
características: elevado polimorfismo, alelos múltiplos, padrão de herança codominante
(Figura 1), abundância e ampladistribuição ao longo do genoma(FERREIRA
&GRATTAPAGLIA, 1998).Marcadores microssatélites também conhecidos como SSR
ou STR são desenvolvidos a partir deregiões altamente variáveis encontradas ao longo
do genoma, denominadas de regiões microssatélites, que são formadas de 1 a 6
nucleotídeos(motivos) que se repetem lado a lado (FIELD & WILLS, 1998; TÓTH et
al., 2000), sendo encontradas no genoma de diferentes organismos (TAUTZ &
SCHLIITTERER, 1994; ZANE et al., 2002).
Figura 1.Base genética e detecção de polimorfismo de microssatélite. Em A e B
apresenta genótipos homozigoto e heterozigoto e em C, um gel de
eletroforese com diferentes genótipos homozigotos (uma banda) e
heterozigotos (duas bandas)(Fonte: FERREIRA & GRATTAPAGLIA,
1998).
18
As regiões microssatélites podem ser classificadas quanto a sua localização no
genoma, como gênicas e genômicas. Quando as regiões microssatélites se encontram
dentro de regiões codificantes do genoma, são classificadas como regiões gênicas e
quando localizadas em regiões não-codificantes, são classificadas como regiões
genômicas (LITT & LUTY, 1989; TAUTZ, 1989;TAUTZ & SCHÖTTERER, 1994;
VARSHNEY et al., 2005).De acordo com o tamanho do motivo de repetição, as regiões
microssatélites podem ser classificadas como de: mononucleotídeos, uma base se repete
(A)n, dinucleotídeos, duas bases que se repetem (AG)n, trinucleotídeos, três bases que
se repetem (GTT)n, tetranucleotídeos (GAGA)n, pentanucleotídeos (CCCTT)ne
hexanucleotídeos (TTTCCC)n (TAUTZ, 1989; WEBER, 1990; KALIA et al., 2011).
Regiõesmicrossatélites podem ser altamente variáveis quanto à composiçãoda
sequência que se repete, podendo ser classificadas como: perfeitas, imperfeitas,
interrompidas ou compostas. As regiões microssatélites perfeitas não apresentambases
de interrupção (ex: TATATATATATATATA), regiões imperfeitas são aquelas que
possuem um par de bases diferente entre os motivos que se repetem (ex:
TATATATA CTATATA), regiões interrompidas possuem uma sequência diferente
dentro do motivo que se repete (ex: TATATACGTGTATATATATA), já regiões
microssatélites compostas tem duas sequências que se repetem (ex:
TATATATATA GTGTGTGTGT ) (WEBER, 1990; OLIVEIRA et al., 2006).
A composição das regiões microssatélites pode variar muito entre diferentes
táxons, sendo regiões de mononucleotídeos mais frequentes no genoma de seres
eucarióticos em relação a outras repetições, tendo na maioria das vezes a repetição de
poli (A/T) a mais frequente nos táxons. Os dinucleotídeos mais frequentes no genoma
de seres eucarióticos são AC/GT presentes nos vertebrados e artrópodes, e em plantas
repetições de AT seguidas por GA (TÓTH et al., 2000; SHARMA et al.,
2007).Normalmente, regiões compostas por dinucleotídeos são as mais frequentes em
várias espécies, no entanto, são menos observadas em regiões gênicas (LI et al., 2002),
diferente das repetições de trinucleotídeos,que são mais comuns em regiões gênicas em
muitas espécies (MORGANTE et al.,2002; LI et al., 2004).
Os marcadores microssatélites, em função de diversas características, tais como:
alto polimorfismo e herança codominante (CAVAGNARO et al., 2010) são muito
utilizados como marcadores genéticos (REN et al., 2011) empregados em estudos de
mapa de ligação (YI et al., 2006) e na identificação de variaçõesgenéticas (ELLIS
&BURKE, 2007). Estudos relatam que a alta variabilidade encontrada em regiões
19
microssatélites esteja relacionada com a grande suscetibilidade para mutação das
regiões microssatélites (TAUTZ &SCHÖTTERER, 1994; GAOet al., 2013). A taxa de
mutação varia de 10-2 a 10-6 eventos por geração,em seres eucariotos (SCHÖTTERER,
2000).
A variabilidade genéticae origem dos microssatélites podem ser explicadas por
alguns mecanismos que ocorrem na célula, como o mecanismo de transposição,
recombinação eslippageda DNA polimerase.Elementos transponíveis podem transportar
regiõesmicrossatélites, sendo responsáveis pela expansão dos microssatélites (NADIR
et al., 1996; WILDER& HOLLOCHER, 2001). Eventos de recombinação na meiose ou
mitosepodem ser responsáveis pela variabilidade genéticae origem dos microssatélites
(WANG et al., 2009), assim como aslippage ou deslizamento da DNA polimeraseno
processo de replicação do DNA (ZHU et al., 2000; NISHIZAWA & NISHIZAWA,
2002),mecanismo que pode ocasionar deleção ou inserção de base (DIERINGER &
SCHLÖTTERER, 2003).
O primeiro mecanismo explica a ocorrência dos microssatélites pela dispersão
dessas sequências repetitivas pelo genoma por elementos transponíveis, tendo locais
com predisposição a formação de microssatélites (KAZAZIAN, 2004).Autores estudam
a possibilidade de microssatélites ricos em A serem formados pela extensão de 3’ do
retrotranscrito parecido com a poliadenilação do mRNA, embora, estudos envolvendo
muitos organismos contrastam com esses resultados, relatando que nem sempre a
densidade de microssatélites coincide com a de elementos transponíveis
(SCHLÖTTERER, 2000).
Estudosenvolvendo eventos de recombinação genética (crossing-over
desigual)demonstram que também podem ser responsáveis por grande parte das
mutações que ocorrem nas sequências hipervariáveis do DNA, principalmente quando
envolve um maior número de pares de bases.Devido os cromossomos homólogos se
parearem e se recombinarem erroneamente em locais de grande quantidade de
repetições de mesma base(RICHARD & PAQUES, 2000) ocorre deleções simples ou
duplicações (JEFFREYS & NEUMANN, 1997).
O terceiro mecanismo é oslippage da DNA polimerase, que pode explicar
pequenas mutações.Omau pareamento da DNA polimerase podelevar a mudanças no
comprimento dos microssatélites, caso não ocorra um equilíbrio entre o mecanismo de
reparo (mismatch repair) e o deslizamento da DNA polimerase (ROSE & FALUSH,
1998; LI et al., 2002). Na replicação do DNA a fita molde pode formar um pareamento
20
de bases complementares (loop) e a DNA polimerase continuar adicionando
nucleotídeos, formando uma nova fita com um número de repetições menor do que da
fita molde, acontecendo uma retração da sequência, consequentemente uma diminuição
no número de repetições (ROSE & FALUSH, 1998). Um loop pode se formar também
na fita que está sendo sintetizada, ocasionando uma expansão da repetição, levando a
um aumento no número de repetições (Figura 2) (RICHARD &PAQUES, 2000;
ELLEGREN, 2004).
Figura 2. Mecanismo de mutação slippage durante a replicação em uma região
microssatélite(Adaptado de GOLDSTEIN & SCHLÖTTERER, 1999).
Alterações na sequência de DNA normalmente são rapidamente consertadas por
mecanismos de reparo, mas caso não ocorra um reparo estas alterações podem
permanecer e ser passadas para as próximas gerações, abrigando uma mutação que o
sistema de reparo não pode mais consertar. Mesmo a molécula de DNA sendo altamente
estável, ela está sujeita a alterações, isso devido ao ambiente ou a erros na replicação ou
recombinação (COX et al., 2012).
Modelos de mutação de Stepwise (SMM) e de Alelos Infinitos (IAM) são os
modelos que vem sendo empregados para explicar a origem e evolução dos
microssatélites. No modelo de mutação de Stepwise proposto inicialmente por Ohta &
Kimura (1973),um microssatélite pode aumentar ou diminuir uma unidade de repetição,
levando a expansão ou contração do microssatélite, o que ocasiona uma mudança na
unidade de repetição em tandem, provavelmente para um alelo já existente na população
21
(SLATKIN, 1995; OLIVEIRA et al., 2006; BHARGAVA &FUENTES, 2010).No
modelo de AlelosInfinitos,cada evento de mutação leva a um alelo novo e não admite
homoplasia (KIMURA & CROW, 1964), neste modelo, pode ocorrer ganho ou perda de
qualquer número de unidades de repetição, deste modo é amostrado alelos novos na
população, não verificados anteriormente(OLIVEIRA et al., 2006; GROVER
&SHARMA, 2011).
Marcadores microssatélites são altamente informativos, o que permite serem
utilizados em estudos de conservação, na investigação de processos microevolutivos
que ocorrem nas populações, entre outros (HEYWOOD & IRIONDO, 2003).
Marcadores microssatélites apresentam muitas características desejáveis,no entanto,
isolar e desenvolver pares de primers para regiões específicas tem como fator limitante
a necessidade de conhecer a sequência de DNA para delimitar o loco microssatélite.
Desenvolver marcadores microssatélites é um trabalho que demanda mão de obra
qualificada, dispõem decusto elevado e tempo(FERREIRA &GRATTAPAGLIA, 1998).
O benefício de desenvolver marcadores microssatélites está na reprodutibilidade
e na praticidadedestes marcadores, que emprega a técnica de PCR para detecção de
polimorfismo nos indivíduos avaliados (CAIXETA et al.,
2006).Marcadoresmicrossatélites desenvolvidos para uma espécie podem ser
transferidos para espécies relacionadas, pois, assequências flanqueadoras das regiões
microssatélites podem se encontrar conservadas entre espécies filogeneticamente
próximas. Espécies mais próximas possuem uma maior taxa de
transferibilidade(VARSHNEY et al., 2005; BARBARÁet al., 2007).
A estratégia mais tradicional de desenvolvimento de marcadores microssatélites
inicia-se com a construção de uma biblioteca genômica, isolando os locos de interesse
na espécie alvo.É realizado o processo de fragmentação do DNA de alta qualidade,
empregando enzimas de restrição ou sonicação. O DNA fragmentado é ligado
diretamente a vetores de plasmídeo comuns, ou, depois que é ligado adaptadores
específicos. É realizada hibridização, empregando sondas com repetições simples e
sequenciamento de clones positivos. Os primers são desenhados e são realizadas PCRs
otimizando as condições ideais para amplificação dos locos, nos indivíduos de uma
população(ZANE et al., 2002).
Outro método de desenvolvimento de marcadores microssatélites foi proposto a
partir da obtenção de bibliotecas enriquecidas com repetições microssatélites de
interesse, empregando extensão de primers (OSTRANDER et al.,1992; PAETKAU,
22
1999).A obtenção de uma biblioteca genômica primária se dá pela fragmentação do
DNA genômico e inserção em um vetor de fago no intuito de obter um conjunto de
filamentos únicos de moléculas de DNA circular, estes serão usados como molde em
uma reação de extensão do primer, preparado com oligonucleótideos específicos para
uma repetição específica.Somente vetores que possuem a unidade de repetição de
interesse obterão produtos de dupla fita. Na fase de construção da biblioteca primária, é
clonada somente uma parte limitada do genoma que é investigado, levando a perda de
motivos de repetição que são raros, no entanto, este método não se tornou muito popular
devido à quantidade de etapas (ZANE et al., 2002).
A obtenção de marcadores microssatélites pode se dá pela construção de
bibliotecas enriquecidas por meio da hibridização seletiva, sendo todos os passos
baseados na hibridização de uma sequência sintética de oligonucleotídeo de
microssatélite com DNA genômico (BILLOTTE et al., 1999). Inicialmente, são ligados
adaptadores (sequências conhecidas) aos fragmentos de DNA genômico, em seguida, é
hibridizado com uma sonda com repetições que podem ser vinculadas a uma membrana
de nylon (KARAGYOZOV et al., 1993; ARMOUR et al., 1994),ou 5’biotinilado e
revestido de estreptavidina(Figura 3) (KANDPAL et al., 1994; KIJAS et al., 1994),
posteriormente é realizado muitas lavagens, o DNA enriquecido é recuperado por PCR
e clonado em um vetor apropriado, para ser realizado o sequenciamento dos clones
positivos para obtenção das sequencias, e seja possível identificar as regiões
microssatélites (ZANE et al., 2002).
Marcadores microssatélites ainda podem ser desenvolvidos por meio de
bibliotecas de cDNA (DNA complementar). Neste método, são empregadas sequências
de mRNA (RNA mensageiro) utilizando um conjunto de genes expressos em uma
amostra de um determinado organismo, deste modo, são caracterizados como
marcadores gênicos, ou seja, de regiões transcritas do DNA (ESTs-SSR) (DURAN et
al., 2009; BLAIR & HURTADO, 2013).
Um método alternativo utilizado na obtenção de marcadores microssatélites é a
procura de sequências em bancos de dados como EMBL e GenBank, usando recursos
computacionais (KALIA et al., 2011), porém, esse método é limitado, pois, grande parte
das sequências depositadas nos bancos de dados são sequências transcritas (EST) do
genoma. As sequências depositadas em maior número nos bancos de dados são de
espécies modelo, fator limitante para espécies silvestres (CARDLE et al.,2000; Hu et
al., 2004).
Figura 1. Protocolo do isolamento de microssatélitesseleção por hibridibiotinilados e revestido de estreptavidina1994 , Kijas de Zane
Aliada às metodologias de obtenção
PCR é empregada na amplificação das sequências microssatélites
primer específico de 20 a 30 bases, que é complementar às sequências flanqueadoras
Protocolo do isolamento de microssatélites a partir de seleção por hibridização com oligonucleotídeos biotinilados e revestido de estreptavidina(Kandpal 1994 , Kijas et al., 1994, Billotte et al., 1999).(Adaptado de Zane et al., 2002).
s metodologias de obtenção de marcadores microssatélites a
PCR é empregada na amplificação das sequências microssatélites, utilizado um par de
específico de 20 a 30 bases, que é complementar às sequências flanqueadoras
23
a partir de oligonucleotídeos 5’
Kandpal et al., 1999).(Adaptado
de marcadores microssatélites a técnica de
utilizado um par de
específico de 20 a 30 bases, que é complementar às sequências flanqueadoras
24
dos microssatélites de interesse. Os produtos da amplificação da PCR são separados em
gel de agarose e visualizados pela iluminação ultravioleta após coloração com brometo
de etídeo, a separação dos produtos de amplificação também pode ser feita em gel de
acrilamida, e as bandas visualizadas por coloração com nitrato de prata, ou ainda em
eletroforese capilar, empregandoprimers marcados com fluorescência para visualização
dos alelos.Quando as sequências são de tamanhos diferentes, ou os primers são de
fluorescências diferentes, pode se empregar multiplex de PCR ou de aplicação(DURAN
et al., 2009).
A alta taxa de transferibilidadede marcadores microssatélites é um dos fatores
que contribuem para que estes sejam muito empregadosem estudos de genética de
populações (ZUCCHI et al., 2002;BARBARÁ et al., 2007; AGARWAL et al., 2008;
SOARES et al., 2013).A capacidade de transferir marcadores microssatélites é
conferida a espécies relacionadas. A transferiblidade é possível devido às sequências
que antecedem as regiões microssatélites, conhecidas como regiões flanqueadoras,
serem regiões que podem se encontrar altamente conservadas entre espécies de um
mesmo gênero ou de uma mesma família (ELLIS& BURKE, 2007).
Estudos de transferibilidade de locos microssatélites tem sido realizados em
vários táxons (BARBARÁ et al., 2007), espécies da mesma família e de gênero
diferente (Tabela 1), mostrando a possibilidade de utilizar marcadores já desenvolvidos,
em outras espécies. Tanto marcadores de regiões gênicas como de regiões genômicas
podem ser transferidos, entretanto, marcadores de regiões gênicas ou (EST- Expressed
Sequence Tangs) tendem a apresentar uma maior taxa de transferibilidade, devido às
regiões se encontrarem mais conservadas entre espécies, no tempo evolutivo, embora,
marcadores de regiões genômicas possam ser transferidos, estes apresentam uma menor
taxa de transferibilidade, assim, a escolha do melhor marcador a ser utilizado está
diretamente relacionada com o tipo de trabalho a ser realizado (WANG et al., 2009;
KALIA et al.,2011).
Normalmente, marcadores microssatélites são desenvolvidos para uma espécie
modelo, ou seja, uma espécie que já desperta interesse econômico, para depois serem
transferidos para espécies relacionadas de menor interesse. Para que esses marcadores
sejam transferidos é necessário que eles sejam polimórficos, sendo capaz de caracterizar
a variabilidade genética da espécie (WANG et al., 2009).
25
Tabela 1. Relação de trabalhos que avaliaram o potencial de transferibilidade de primers de
regiões microssatélites entre espécies vegetais.
Espécie / marcadores desenvolvidos
Espécie / marcadores transferidos
Número de Primers Testados
Porcentagem de Transferibilidade
Referência
Prunus persica (Rosaceae) Prunus
(Rosaceae) 15 59 %
Cipriani et al., 1999
Oryza sp. (Poaceae)
Oryza sp. (Poaceae)
15 53 % Brondani et al.,
2003
Tabebuia aurea(Bignoniaceae)
Espécies do gêneroTabebuia (Bignoniaceae)
21 42,5 % Braga et al., 2007
Aegiphila sellowiana(Lamiaceae)
Espécies de diferentes gêneros
(Lamiaceae) 11 81 % Ruas et al., 2011
Enterolobium cyclocarpum (Fabaceae)
Enterolobium contortisiliquum
(Fabaceae) 9 100 %
Moreira et al., 2012
Psidium guajava L. (Myrtaceae)
Eucalyptus citriodora
(Myrtaceae) 23 78 % Rai et al., 2013
Morus albaL. (Moraceae) Artocarpus
heterophyllus (Moraceae)
42 76 % Mathithumilan et
al., 2013
Byrsonima. cydoniifolia(Malpighiaceae)
B. crassifólia (Malpighiaceae)
17 70 % Bernardes, 2014
Phaseolus vulgaris (Fabaceae)
Pterodon emarginatus (Fabaceae)
539 4 % Santana, 2014
A transferibilidade de marcadores microssatélites desenvolvidos para uma
espécie modelo para outa espécies não modelo utilizando primers heterólogos é uma
alternativa, quando estes primers se encontram disponíveis, não sendo necessário
sintetiza-los e/ou quando não dispõem da tecnologia necessária para desenvolver
primers, já que transferir marcadores também demanda muito trabalho.Desde que
marcadores microssatélites estejam disponíveis em espécies modelo relacionadas à
espécie de interesse, o emprego da transferibilidade supri uma demanda de trabalhos e
recursos financeiros necessários ao desenvolvimento destes marcadores,
minimizandocustos e trabalhos necessários à construção de bibliotecas genômicas,
clonagens e sequenciamentos para o isolamento de microssatélites e desenvolvimento
26
dos primers (FERREIRA &GRATTAPAGLIA, 1998; ZUCCHI et al.,2002; WANG et
al., 2009).
3.2 SISTEMA REPRODUTIVO E VARIABILIDADE GENÉTICA EM PLANTAS
O sistema reprodutivo em plantas de modo geral pode ser classificado como
reprodução sexuada e assexuada. As formas sexuadas exibem diferentes sistemas de
cruzamento, como autógamas (plantas com autofecundação), alógamas (plantas com
fertilização cruzada) e sistema misto (apresentam autofecundação e fertilização
cruzada). Na reprodução assexuada abrange todos os mecanismos que geram plantas
clones idênticas geneticamente a planta mãe(FRYXEL, 1957).
Na reprodução assexual não há participação de gametas ou somente participação
parcial. A progênie é idêntica à planta mãe. A reprodução assexuada acontece por meio
da divisão mitótica das células somáticas ou da oosfera, sendo caracterizada como
reprodução apomítica ou vegetativa (CAVALLI, 2003; RAVEN et al., 2007).
Na reprodução vegetativa diferentes partes da planta mãe podem dar origem a
novos indivíduos, não tendo ligação com os órgãos reprodutivos (CAVALLI, 2003).
São variadas estratégias adotadas pelas plantas para promover a reprodução
vegetativa:caules rastejantes comoestolhos ou estolões; caules subterrâneos ou
rizomasque exercem papel importante de armazenamento em algumas plantas e são
órgãos de reprodução importantes em orquídeas e samambaias; caules de
armazenamento e reserva como cormos, bulbos ou tubérculos;ramificações de raízes ou
ramos eretos na base de caules, raízes ou rebentos; e folhas que produzem numerosas
plântulas de um tecido meristemático ou enraizamento na ponta(RAVEN et al., 2007;
SILVETOWN, 2008).
Já na reprodução apomítica ocorre à produção de sementes por partenogênese,
que é a produção de sementes sem que aconteça a polinização, ou seja, não há fusão de
gametas (agamospermia)(HARTMANN & KESTER, 1975; RICHARDS, 1997;
APPELS et al., 1998),assim, as sementes férteis geradas pelo processo apomítico serão
clones, tendo constituição genética igual à planta mãe somando as mutações que possam
ocorrer (ASKER & JERLING, 1992; KOLTUNOW, 1993; KOLTUNOW &
GROSSNIKLAUS, 2003). A ocorrência da formação da semente no órgão reprodutivo
feminino é o que diferencia o processo apomítico de outros processos de reprodução
vegetativa (CZAPIK, 1994).
27
Embora a apomíxia gere clones, a possibilidade de gerar variabilidade genética
existe, devido a eventos que podem ocorrer, como no nível de cromossomo, levando a
alterações, incluindo recombinação nas células somáticas ou acidentes na divisão
celular (disjunção), acumulo de mutações e recombinação das células femininas durante
a meiose.Outros eventos de mutaçãono DNA e o acumulo dessas mutações (incluindo
possíveis alterações nos genes envolvidos na regulação da apomixia) (VAN BAARLEN
et al., 2000; MESet al., 2002). Diversos autores consideram que omecanismo apomítico
não é independente do sexual e que os genes que controlama apomixia estariam
envolvidos na reprodução sexual, mas com a regulaçãoespacialmente e/ou
temporalmente alterada (TUCKER et al., 2003; KOLTUNOW & GROSSNIKLAUS,
2003; OZIAS-AKINS & VAN DIJK, 2007).
Alterações podem ocorrer na célula, o que acarretaem possíveis variações entre
indivíduos (BATTJES et al., 1992; RICHARDS, 1996; MAJESKÝ et al., 2012). A
reprodução apomítica acontece em diferentes plantas como emTaraxacum (VAN
BAARLEN et al., 2000; MES et al., 2002; MAJESKÝ et al., 2012),Hymenaea
stigonocarpa mart. ex Hayne (MORENO, 2009), entre outras.
Para melhor entendimento dos padrões de variabilidade genética em qualquer
espécie é necessário que se tenha conhecimento dos sistemas naturais de cruzamento.
Parker & Hamrick (1992), relatam que os níveis de diversidade genética não mudam de
espécies predominantemente assexual para espécies com reprodução sexual, no entanto,
a variabilidade genética intrapopulacional é maior em espécies com fecundação
cruzada. Segundo Arnaud-Haond et al. (2007) o emprego de marcadores moleculares
robustos tem facilitado estudos de estrutura genética em populações de plantas clonais.
A variabilidade genética permite a espécie se adaptar as diferentes mudanças que
possam ocorrer no meio ambiente, sendo determinante na sobrevivência da espécie em
um espaço de tempo (FRANKHAM et al., 2002; MANEL et al., 2003; DESALLE &
AMATO, 2004; RODRIGUES, 2009).Avariabilidade genética se manifesta na variação
de muitos caracteres, como características morfológicas que diferenciam organismos,
diferença nas proteínas, enzimas e sequência de DNA na maioria dos organismos. E a
variedade de genótipos e alelos caracteriza a variabilidade genética nas populações,
espécies ou grupos de uma espécie, sendo de fundamental importância para que as
populações passem por processos contínuos, como evolução e adaptação a mudanças
ambientais (FRANKHAM et al., 2008).
28
As variações genéticas são originadas por mutação e intensificadas por
mecanismos de recombinação do DNA e sexual. A variação genética pode ser neutra,
influenciada apenas pela Deriva ou adaptativa, influenciada pela Deriva e Seleção
Natural (FRANKHAM et al., 2008).A caracterização molecular possibilita a
quantificação e a utilização da variabilidade genética conservada, refere-se à detecção
da variação a partir de diferenças na sequência de DNA ou genes específicos
(VICENTE et al., 2005).
Conhecer os padrões de distribuição da variabilidade genética dentro e entre
populações naturais é fundamental para adotar estratégias de conservação efetivas e
eficientes (FRANKHAN, 2010). A variabilidade genética pode ser detectada nas
populações por meio de parâmetros que estimam a diversidade genética(FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998).
Marcadores microssatélites são muito empregados em estudos genéticos como
ferramentas moleculares para estimar a diversidade genética das populaçõescomo
medida de variabilidade genética(COLLEVATTI et al., 2010). A análise dadiversidade
genética empregando marcadores microssatélites é normalmente utilizada estimando os
parâmetros a seguir: (A) número de alelos por loco, (P) porcentagem de locos
polimórficos, (Ho) heterozigosidade observada, (He) heterozigosidade esperadasegundo
o equilíbrio de Hardy-Weinberg, (f) índice de fixação, e o (PIC) conteúdo de
informação polimórfica.
Como índices de diversidade genética em populações naturais visando
caracterizar e comparar os níveis de variação genéticas nestas populações é empregado
às estimativas de número de alelos por loco (A) e a porcentagem de locos polimórficos
(P) (CONTE, 2004). Segundo Weir (1996) & Nei (1973) a frequência de heterozigotos
é um importante indicador de diversidade genética, pois cada indivíduo heterozigoto
carrega alelos diferentes o que representa melhor a variação que existe nas populações.
O (PIC) conteúdo de informação polimórfica é uma medida de qualidade do
marcador em estudo. Os valores podem variar de 0 para perfil monomórfico à 1 para
altamente polimórfico (BOTSTEIN et al., 1980).O índice de fixação (f) estima o
excesso ou deficiência de heterozigotos em relação ao esperado pelo equilíbrio de
Hardy-Weinberg, ou seja, assumindo que as populações são panmíticas(ALFENAS et
al., 1991) .
29
Levando em consideração que existem poucos estudos com a espécie E.
klotzschiana(LAGE et al., 2005; COSTA et al., 2010), verifica-se uma necessidade em
disponibilizar ferramentas que acessem essa variabilidade genética da espécie.
3.3 BIOMA CERRADO E FAMÍLIA MYRTACEAE
O Cerrado ocupa uma área de 2.036.448 milhões de km2 do Planalto do Brasil,
cerca de 22% do território nacional, compartilha transições com outros domínios, como:
a Floresta Amazônica, Caatinga, Pantanal e a Mata Atlântica (Figura 4) (FELFILI &
SILVA JUNIOR, 2005; MMA,2013). O Cerrado é uma das mais ricas e diversificadas
savanas do mundo (LEWINSOHN & PRADO, 2005), sendo considerado um dos 34
hotspots de biodiversidade (MITTERMEIERet al., 2005) devido ao elevado grau de
espécies endêmicas e a perda acelerada de habitats (BUSTAMANTE et al., 2012).
Figura 4.Mapa mostrandoáreasde Cerrado e suas transições (Fonte: IBGE – Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística, 2011).
30
Sendo a segunda maior região biogeográfica brasileira,o Cerrado possui uma
área que incide sobre toda a área do Brasil central, incluindo os estados de Goiás,
Tocantins, Mato Grosso do Sul,Minas Gerais,Bahia, Maranhão, Piauí, Rondônia,
Paraná, São Paulo e Distrito Federal, além dos encraves no Amapá, Roraima e
Amazonas. Na área territorial do Cerrado encontram-se as nascentes das três maiores
bacias hidrográficas da América do Sul, bacia Amazônica/Tocantins e bacia São
Francisco e Prata (MMA, 2013).
O Cerrado é formado por um complexo de biomas cujas fitofisionomias variam
de campestres a florestais. O clima caraterístico das regiões do Cerrado é o sazonal
úmido, podendo apresentar grande variação climática por influência de regiões vizinhas
(amazônica, nordestina, atlântica e continental) (MITTERMEIER et al., 1997;
BUSTAMANTE et al., 2012).
As fitofisionomias encontradas no Cerrado podem variar em formações
florestais (matas de galerias, matas ciliares, mata seca e cerradão), savânicas (cerrado
sensu stricto, parque de cerrado, palmeiral e veredas) e formações campestres (campo
sujo, campo rupestre e campo limpo).As formações florestais caracterizam-se pelo
domínio de espécies arbóreas podendo ser contínuo ou descontínuo. As fitofisionomias
savânicas do Cerrado são formadas de áreas com árvores e arbustos espalhadas em
proporções diferentes, já nas formações de vegetações campestreshá predomínio de
espécies herbáceas, eem menores proporçõesarbustos e subarbustos (RIBEIRO &
WALTER, 2008).
O Cerrado sensustrictoou sentido restrito é a fitofisionomia predominante no
bioma e caracteriza-se pela presença de árvores baixas, inclinadas, tortuosas, com
ramificações irregulares e retorcidas, normalmente com evidências de queimadas,
verificando também arbustos, subarbustos e ervas.O Cerrado sensustrictopode ser
subdividido em cerrado denso, cerrado ralo, cerrado rupestre e cerrado típico,
dependendo da cobertura do estrato arbóreo e das condições de sítio (RIBEIRO &
WALTER, 2008).
Além das características descritas, as espéciessavânicas apresentam taxa de
crescimento lenta, com um padrão de crescimento inicial sem muitas ramificações e
com maior alocação de recursos para as raízes (RATNAMet al., 2011). Mesmo com
condições de estresse hídrico e presença de eventos de queimadas, as plantas jovens de
espécies savânicas tendem a possuir menores taxas de mortalidade, no entanto, o
31
estabelecimento dessas espécies em áreas florestais é limitado (HOFFMANN &
FRANCO, 2003; HOFFMANN et al., 2004).
Os solos dominantes no bioma Cerrado são da classe de latossolos, areia
quartzosa e os solos litólicos, cobrindo cerca de 56%, 20% e 9% da região
(HARIDASAN, 2007).As propriedades típicas dos solos do Cerrado os tornam
adequados para produção agrícola, mesmo tendo limitações quanto à fertilidade natural,
o que não é mais considerado um obstáculo, devido às tecnologias existentes a seu favor
(BRASIL, 2002).O domínio do bioma Cerrado ocupa cerca de 204 milhões de hectares
dos quais pelo menos 127 milhões (62%) do total acontecem em solos com perspectivas
adequadas para mecanização agrícola (RIBEIROet al., 2005).
Em uma perspectiva de Forzza et al. (2012) baseada em dados coletados de
diversos artigos publicados até 2010, foi confirmado que o Cerrado brasileiro é um dos
locais mais ricos em flora de savana do mundo, com 12,669 espécies de plantas nativas
já catalogadas, com extrema abundância de espécies endêmicas, cerca de 4,215. Muitas
espécies endêmicas sofrem uma grande perda de habitat.Se tem conhecimento
deaproximadamente 199 espécies de mamíferos, cerca de 837 espécies de avifauna,
1200 espécies de peixes, 180 espécies de répteis e 150 espécies de anfíbios,sendo
grande parte das espécies endêmicas da região (MMA, 2013).
A flora do Cerrado é constituída por variadas espécies vegetal, sendo bastante
diversificada, distinguindo-se mais de 40 tipos fisionômicos com elevado potencial de
utilização econômico, medicinal e alimentício (BRASIL, 2002; CARAMORIet al.,
2004; VIEIRAet al., 2006).As espécies frutíferas nativas ocupam uma posição de
destaque no ecossistema do Cerrado, devido a grande parte dos frutos serem
comercializados e consumidos “in natura” ou beneficiados pelasindústrias caseiras.
Grande parte dos frutos contém elevado teor de açúcares, proteínas, vitaminas e sais
minerais, apresentando um sabor característico. Frutos como o araticum, o baru, jatobá,
pequi, cagaita, entre outros, possuem grande aceitação popular, são explorados por
pequenas indústrias de doces, sorvetes, geleias, sucos, farinhas, licores, etc. (VIEIRA et
al., 2006).
Mesmo com o reconhecimento da sua importância biológica de todos os hotspots
mundiais, o bioma do Cerrado é o que possui a menor porcentagem de áreas sobre
proteção integral (MMA,2013).Grande parte deste bioma tem sido ocupada por lavouras
de grãos e pastagens (MARTINOTTOet al., 2008). O avanço das fronteiras agrícolas no
Cerrado tem levado a perda da biodiversidade, o que é preocupante diante de tantas
32
espécies que possuem um grande potencial de utilização, como fonte de renda para
muitas famílias e principalmente de fonte de alimento para muitas espécies da fauna
local. Esses dados reforçam cada vez mais a necessidade de estudos envolvendo essas
espécies, de maneira a minimizar a ação do homem sobre o Cerrado. Conhecer a
biologia da espécie ajuda na preservação e permite estabelecer meios para sua
incorporação ao processo tradicional de cultivo (MESQUITAet al., 2007).
O Cerrado possui inúmeras espécies frutíferas nativas com um elevado potencial
para introdução ao cultivo, tendo a variabilidade continuamente ameaçada pelos
desmatamentos indiscriminados (PEIXOTOet al., 2003), Entre espécies frutíferas,
destacam-seespéciesda família Myrtaceae, que é uma das maiores famílias da América
do Sul e Central, com ocorrência na região neotropical e subtropical.Espécies frutíferas
como a goiabeira (Psidium guajava), a pitangueira (Eugenia uniflora), a cagaitera
(Eugenia dysenterica), entre outras,se destacam por serem muito utilizadas in natura, na
produção de doces, sucos e geleias(PROENÇA, 1993; LORENZIet al., 2006).
A família Myrtaceae pertencente à ordem Myrtales é composta por
aproximadamente 132 gêneros e mais de 5600espécies (GOVAERTSet al., 2008), no
Brasil, conta com cerca de 24 gêneros e927 espécies (SOBRALet al., 2010).A família
Myrtaceae apresenta uma grande importância ecológica, devido a seus frutos suculentos
e carnosos servirem de fonte de alimento à fauna silvestre. Muitas aves e macacos se
alimentam de frutos da família Myrtaceae atuando como dispersores das sementes e
com isso favorece a sobrevivência e a permanência das espécies do qual se beneficiam
(PIZO, 2003; GRESSLER, 2006).Proença & Gibbs (1994) verificaram que no período
de floraçãode algumas espécies de Myrtaceae as abelhas como seus principais
polinizadores se beneficiam do pólen das flores, além de desempenhar seu papel
ecológico de polinizadores.
Estudos envolvendo dados moleculares contrastam com dados anteriores, em
que o grupo representado pelos frutos carnosos não é monofilético como era relatado,
pois a evolução desse tipo de fruto ocorreu várias vezes na família. Diante destes
estudos pesquisadores sugeriram uma nova organização da família, separando-a nas 2
subfamílias Psiloxyloideae, Myrtoideae e17 tribos. A subfamília
Psiloxyloideaerepresentada pelos gêneros Psiloxylon Thou.ex Tul. e Heteropyxis Harv.,
tem ocorrência na África (WILSON et al., 2005).
Todas as mirtáceas brasileiras estão incluídas na tribo Myrtae, tendo
representantes em muitos dos hotspots de biodiversidade do mundo, como no sudoeste
33
da Austrália, e no Brasil, as espécies sãoencontradas na Mata Atlântica e no Cerrado,
com até 90 espécies de Myrtaceae por hectare (GOVAERTSet al., 2008). A família
Myrtaceae se encontra entre as mais importantes em grande parte das formações
vegetacionais no Brasil (SOUZA & LORENZI, 2008).
Alguns gêneros se destacam por reunir o maior número de espécies de
importância econômica do país, sendo eles: Eugenia, Campomanesia, Psidium e
Myrciaria(LORENZI & SOUZA, 2008). Algumas espécies frutíferas que são
exploradas comercialmente, além das citadas anteriormente a uvaia (Eugenia uvalha
L.), o jambo (Syzygium jambos (L.) Alston) e a jabuticaba (Plinia cauliflora
L.),apresentam uma pequena fração do grande potencial econômico da família, levando
em conta o grande número de frutos comestíveis de espécies não comerciais, como por
exemplo, a pera-do-cerrado. Várias espécies de Eucalyptus L. Her se destacam entre as
grandes produtoras de madeira e também antissépticos. OsMyrtus communis L. e
Melaleuca L. se destacam como ornamentais (LANDRUM & KAWASAKI, 1997;
COSTA, 2004).
Os representantes brasileiros da família possuem característica lenhosa, de
hábitos arbustivos a arbóreos, apresentando numerosos canais oleíferos nas folhas,
flores, frutos e sementes (BARROSO, 1991).As flores são normalmente brancas, ou às
vezes vermelhas (BARROSO, 1991; LANDRUM & KAWASAKI, 1997).Os frutos são
carnosos (LANDRUM & KAWASAKI, 1997), e as sementes são potencialmente
dispersas por vertebrados frugívoros. As abelhas formam o principal grupo de
polinizadores das mirtáceas na região central do Brasil, área de ocorrência natural da
maior parte do Cerrado no país (PROENÇA & GIBBS, 1994).
3.4ESPÉCIEEugenia klotzschiana BERG
O gênero Eugenia é um dos maioresdentro da família Myrtaceae (FISCHERet
al., 2005), compreendendo cerca de 400 espécies (FONTENELLE et al., 1994),
distribui-se desde o Brasil até o Norte e Nordeste da Argentina, Uruguai e Paraguai
(CONSOLINI et al.,1999). As plantas do gênero Eugenia consistem em árvores ou
arbustos verdes durante o ano todo(AURICCHIO & BACCHI,2003).
Muitas espécies do gênero Eugeniasão apreciadas por seus frutos, que são
usados como alimento (FISCHER et al., 2005). As plantas desse gênero são muito
empregadas na medicina popular, utilizadas como recursos terapêuticos no tratamento
de diversas enfermidades (VIEIRA et al., 2006). O gênero Eugenia é bastante rico em
34
compostos fenólicos, como taninos e flavonoides, devido ao alto teor de compostos
fenólicos, as espécies do gênero Eugenia apresentam atividade antioxidante relacionada
a estes compostos (LUNARDIet al., 2001; EINBONDet al., 2004).
Pertencente ao gênero Eugenia, a espécieEugenia klotzschiana Berg(Pera-do-
Cerrado) se destaca por apresentar distribuição geográfica bastante restrita, sendo uma
espécie quase rara e pouco estudada(ANDERSEN & ANDERSEN, 1989; ALMEIDA et
al., 1998).Eugenia klotzschiana, ocorre em regiões de cerrado restrito, cerrado ralo,
campo sujo e campo limpo, é uma espécie de clima tropical, com melhor adaptação em
solos drenados e permeáveis, encontrada em Goiás, no Distrito Federal, Mato Grosso,
Mato Grosso do Sul, em Minas Gerais, no Sudoeste da Bahia (ALMEIDA et al., 1998),
e novos estudos relatam ocorrência da espécie na Bolívia (VILLARROEL &
PROENÇA, 2013). As flores da espécie são brancase aromáticas, assim como na
maioria das espécies da família das mirtáceas(Figura 5) (LORENZI et al., 2006).
Figura 5.Flor de Eugenia klotzschiana (Pera-do-Cerrado)
(Fonte:LGBio, 2012).
Seus frutos apresentam casca amarela, polpa branca, mole e ácida (Figura 6),
utilizados no consumo in natura e como matéria-prima para produção de doces, geleias
e sucos (ANDERSEN & ANDERSEN, 1989; SILVA et al., 2001). Em ambiente
natural,a planta produz de seis a dezoito frutos (ALMEIDA et al., 1998). Os frutos
amadurecem de outubro a dezembro (ALMEIDA etal., 1998; SILVA et al., 2001),tendo
35
sabor variável de acordo com a distribuição geográfica da espécie.Algumas plantas
encontradas no Distrito Federal produzem frutos muito ácidos, não muito aromáticos e
maiores, já plantas do extremo sul do Estado de Minas Gerais apresentaram frutos
menos ácidos, aromáticos com sabor agradável (ANDERSEN & ANDERSEN, 1989).
Figura 6.Fruto de Eugenia klotzschiana (Pera-do-
Cerrado)(Fonte:LGBio, 2012).
A planta pode atingir até 1 metro de altura em seu ambiente natural e chegar até
3 metros aos 12 anos de idade, quando cultivada, podendo ser encontrada em jardins ou
quintais como planta ornamental(FARIA et al., 2006). A planta Eugenia
klotzschianacresce em moitas, e caracteriza-se por touceiras (RIBEIRO et al., 1986),
sendo suaprincipal forma de exploração o extrativismo (FARIA et al., 2006).
As diferentes áreas de coleta da espécie apresentam uma grande variação
genética, sugerindo que a espécie seja altamente endogâmica e tenha fluxo gênico
restrito, podendo ter como causa a marginalidade na distribuição geográfica da espécie,
o que consequentemente levaria à menor diversidade genética (RODRIGUES, 1999).A
variação genética existente na espécie também pode ser explicada pelo sistema
reprodutivo que é desconhecido, tendo suspeitas de reprodução assexual (reprodução
vegetativa ou apomítica), o que segundo Koltunow & Grossniklaus (2003) levaria a
populações de indivíduos clonais.
36
Inúmeras espécies endêmicas do Cerrado se encontram sujeitas à perda da
variabilidade genética, incluindo espécies do gênero Eugenia devido à forma de
exploração acontecer por extrativismo e a constante degradação que vem acometendo o
bioma Cerrado, o que deixa essas espécies vulneráveis e com poucas possibilidades de
manutenção da variabilidade genética. Mesmo que pesquisadores já estejam avaliando à
variabilidade genética presente em algumas espécies de Eugenia, ainda existem espécies
em risco como é o caso de Eugenia klotzschiana que não há publicações sobre sua
variabilidade genética até o momento.
Dos poucos trabalhos desenvolvidos para a espécie Eugenia klotzschiana,
destacam-se de Oliveiraet al. (1999) que desenvolveu um trabalho de caracterização e
relato de ocorrência da espécie e do ambiente de ocorrência da espécie na região
fisiográfica dos Campos das Vertentes em Minas Gerais.Lage et al. (2005) com um
trabalho de transferibilidade de seis marcadores SSR de Eucalyptuspara E. klotzschiana,
publicado em congresso. Costa et al. (2010)caracterizaram regiões repetitivas do
genoma da espécie para desenvolvimento de primers, publicado também em anais de
congresso. Evidenciando a necessidade de estudos de genética de populaçõescom o
intuito de conhecer a diversidadegenética contida na espécie Eugenia klotzschiana para
fins de manejo e conservação.
37
4.0 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram utilizados 102 indivíduos da espécie Eugenia klotzschiana, coletados nas
áreas onde foram encontradas populações naturaisno Brasil, uma vez que a espécie é
naturalmente rara e se encontra em solos férteis que estão sendo transformados em
lavoura. Foram coletadas oito populações distribuídas nos Estados de Goiás e Minas
Gerais (Anexo I e Tabela 2). As folhas coletadas foram armazenadas em sílicaem um
saco plástico e identificadas com o número e localização do indivíduo. As amostras
foram transportadas ao laboratório de Genética & Biodiversidade (LGBio) da
Universidade Federal de Goiás, onde foram retiradas da sílica e armazenadas em freezer
-80ºC.
Tabela 2. Localidade, código da população,número de indivíduoscoletados de Eugenia
klotzschiana com suas respectivas georeferências.
População Localidade Código da População
N° de Indivíduos
Latitude (S)
Longitude (W)
1 Portelândia/GO EKLPOTGO 30 17° 17'8,80" 52°38'45,5"
2 Santo Antônio do Rio
Verde/GO EKLSARGO 06 17° 33' 59.0" 50° 40' 27.0"
3 Senador Canedo/GO EKLSCNGO 45 16°37'32,197" 49°4'22,696"
4 Rio Verde/GO EKLRIVGO 07 17°19'28,773" 51°33'26,062"
5 Silvânia/GO EKLSILGO 08 16°43'8,393" 48°35'14,530"
6 Ponte Funda /GO EKLPOFGO 04 16°48'15,879" 48°17'26,955"
7 Anápolis/GO EKLANAGO 01 16°27'5,001" 48°51'46,219"
8 Candeias/MG EKLCANMG 01 20º41'21.1" 45º12'58.8"
TOTAL ____ ____ 102 ____ ____
4.2 OBTENÇÃO DOS DADOS MOLECULARES
O DNA foi extraído a partir de tecido foliar empregando o protocolo de CTAB
(brometo de cetil-trimetil amônio) descrito por Doyle & Doyle (1987) otimizado para a
espécie Eugenia klotzschiana(Anexo II). Após o procedimento de extração foi realizada
uma eletroforese horizontal em gel de agarose, contendo brometo de etídeo, para
verificar a concentração de DNA obtida em cada amostra, utilizando análises
comparativas com o marcador de massa molecular λ, nas concentrações de50ng, 100ng
38
e 200ng, para prosseguir com a diluição do DNA para uma concentração de trabalho de
aproximadamente2,5ng/µL.
Na etapa do teste de amplificação cruzada, foram utilizados DNA de três
indivíduos de E. klotzschiana para testar 120 pares de primersdesenvolvidos para
Eucalyptus (BRONDANI et al., 1998; FARIA et al., 2010; FARIA et al.,
2011)seguindo o protocolo padronizado para a espécie (Tabela 3).A amplificação dos
fragmentos de DNA foi realizada utilizando termociclador (Applied Biosystems
Califórnia, USA), a partir do teste de diferentes temperaturas de anelamento dos
primers(Apêncide I). A termociclagem foi programada conforme descrito a seguir:
desnaturação do DNA por aquecimento à 94ºC por cinco minutos; 35 ciclos de
amplificação que ocorreu a 94°C por um minuto, um minuto para o anelamento dos
primers (temperatura específica para cada primer), extensão da molécula de DNA a
72ºC por um minuto, seguido de uma extensão final de 72°C por 45 minutos. O ajuste
da temperatura de anelamento dos locos foi realizado com o aumento ou diminuição da
temperatura, até que a visualização das bandas no gel apresentasse a melhor resolução
possível.
Tabela3.Protocolo para reações de PCR demonstrando os reagentes utilizados e suas
respectivas concentrações de uso para um sistema de 10µL.
Reagentes Concentração Volume (µL) Concentração final
H2O ultrapura - 1,25 -
DNA 2,5ng/µL 3 7,5ng
Primer (F+R) 0,9µM 2,4 0,216 µM
Tampão da enzima c/ MgCl2 10 x 1 1 x
BSA 25mg/ml 1,3 3,25mg
dNTP’s 2,5µM 0,9 0,225µM
Taq-polimerase 5 U 0,15 1 U
TOTAL - 10 -
Os fragmentos de DNA produzidos durante as PCRs foram avaliados
primeiramente em eletroforese horizontal em gel de agarose 3%, imerso em TBE 1X,
submetido a uma corrente elétrica de 70V, por aproximadamente 1 hora. A visualização
dos fragmentos amplificados foi realizada por meio das bandas em um
fotodocumentador de imagem exposto à luz ultravioleta.
39
A segunda etapa foi analisar os produtos de amplificação de todos os pares de
primers da etapa anterior, em eletroforese vertical em gel de acrilamida a 6%. O sistema
de coloração do gel de acrilamida seguiu o protocolo de Creste et al. (2001), que utiliza
um sistema de coloração com nitrato de prata (Anexo III). Posteriormente a secagem do
gel foi feita a análise do gel, sob luz branca, utilizando os marcadores de peso
molecular, 10pb e/ou 50pb (InvitrogenTM), dependendo da amplitude de variação do
tamanho dos alelos nos locos.
A terceira etapa foi elaborar conjuntos de primers para compor multiplexes de
aplicação com bom padrão de amplificação. Nessa etapa, osprimers foward decada
marcador transferido foi marcado com fluorocromos HEX (verde), NED (amarelo) ou 6-
FAM (azul), para ser validado no analisador automático de DNA ABI3500 (Applied
Biosystems). Em cada amostra acrescentou-se 8,75µL de formamida Hi-Di (Applied
Biosystems) e 0,25µL de marcador interno fluorescente de tamanho padrão (size
standard) ROX500TM marcado com fluorescência vermelha, em 1µL de amostra. Os
critérios utilizados para montagem das multiplexs foram:fluorescências
diferentes/tamanhos dos alelos diferentes, e aqueles primers que apresentaram bandas
mais fracas no gel de agarose (empregado para verificar se os produtos de PCR
amplificaram) foram utilizados de 2 a 3µL do produto de PCR e os primers com bandas
mais fortes utilizou-se 1µL. Os locos com bandas mais fracas ficaram juntos com
aqueles que tinham bandas mais fortes, respeitando os primeiros critérios estabelecidos,
para que uma maiorquantidade de produto de PCR pudesse ser colocada na mesma
multiplex, assim, foi padronizada a melhor visualização dos eletroferogramas na etapa
de obtenção dos genótipos. A obtenção dos genótipos foi realizada pelo programaGene
Scan, e analisadas no programa GeneMapper.
Depois de padronizadas as multiplexs de aplicação, o DNA de todos os indivíduos
foi utilizado para obtenção dos genótipos e caracterização da variabilidade genética nas
populações.Para a confirmação de todos os alelos foi elaborada uma escada alélica, na
qualforamutilizados 8 indivíduos para representar todos os alelos para cada loco.
Posteriormente, a matriz de genótipos que foi gerada no GeneMapper foi exportada para
uma planilha no Microsoft Excel, e analisada nos respectivos programas citados a
seguir, para obtenção dos dados requeridos na análise.
40
4.3 CARACTERIZAÇÃO DA VARIABILIDADE NOS LOCOS
MICROSSATÉLITES
A matriz de genótipos foi utilizada para as análises de caracterização da
variabilidade genética considerando os marcadores microssatélites transferidos para o
genoma de E. klotzschiana.
A frequência de alelos nulos e dropout foram calculadas segundo Brookfield
(1996), assumindo panmíxia e que toda deficiência de heterozigotos relativa às
proporções de Hardy-Weinberg foi devida aos alelos nulos e não à subdivisão de
populações. Nesta análise foi utilizado o programa MICRO-CHECKERv2.2
(OOSTERHOUT et al., 2004).
A variabilidade genética nas populações foi avaliada a partir das estimativas dos
seguintes parâmetros genéticos: número médio de alelos por loco (A), frequências
alélicas e genotípicas, heterozigosidade esperada sob condições do equilíbrio de Hardy-
Weinberg (He), heterozigosidade observada (Ho) (NEI, 1973) e índice de fixação (f),
conforme sugerido por Alfenaset al.(1991) utilizando o programa FSTAT 2.9.3
(GOUDET, 2002).
A probabilidade de exclusão de paternidade (Q), que se refere à probabilidade de
se excluir uma falsa paternidade foi calculada conforme sugerido por Weir (1996). A
probabilidade de identidade (I), que é a probabilidade de dois indivíduos amostrados ao
acaso em uma população exibir o mesmo genótipo, foi calculada segundo Paetkau et al.
(1995). Estas análises foram realizadas com o programa Identity 1.0 (WAGNER &
SEFC, 1999).
O índice de fixação (FIS ou f) foi estimado com base na heterozigosidade
observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He) considerando o sistema reprodutivo da
espécie (WEIR, 1996). O Theta-θ foi estimado para medir a diferenciação entre
subpopulações e é consequência da correlação entre genes de diferentes indivíduos na
mesma subpopulação (WEIR & COCKERHAM, 1984), a proporção da variabilidade
genética medida pelo θ foi estimada par-a-par entre as subpopulações.As estatísticas-F
(FISeθ)foram calculadas utilizando o programa FSTAT 2.9.3 (GOUDET, 2002).
A fim de verificar se os locos seguem as proporções esperadas pelo equilíbrio de
Hardy-Weinberg foi realizado o Teste Exato de Fisher, empregado o programa GDA -
Genetic Data Analysis (LEWIS & ZAYKIN, 2001).
41
5.0 RESULTADOSE DISCUSÃO
5.1 TRANSFERIBILIDADE
Do total de pares de primers testados, 67 (55,83%)foram excluídos, por não
apresentarem produtos de amplificação. Para os 53 (44,16%)restantes foi possível
verificar produtos de amplificação cruzada. Dentre esses 53,42(35%)apresentaram
muitos produtos de amplificação inespecíficos e foram descartados da análise. Assim,
11 (9,2%) apresentaram um bom padrão de amplificação (Figura 7) e, portanto, foram
considerados transferidos com sucesso (Figura 8).
Figura 7.Padrão de amplificação de alguns pares de
primers no genoma de três indivíduos de
Eugenia klotzschiana em gel de acrilamida a
6% (Amplificação cruzada). Marcador de
peso molecular 10pb.
Aporcentagem de marcadores transferidos do genoma de espécies de Eucalyptus
para o genoma de Eugenia klotzschiana (9,2%), está dentro do esperado,por se tratar de
espécies diferentes da mesma família botânica. Segundo Kalia et al. (2011), quanto
mais relacionadas filogeneticamente as espécies, maior é a chance
conservadas entre elas.
Figura 8.Porcentagem de locos microssatélites ESTs
inespecífica,não amplificados
de Eugenia klotzschiana
O número de marcadores transferidos é similar ao encontrado em outros
trabalhos já desenvolvidos com espécies do Cerrado, que buscaram a tran
de marcadores moleculares para uso em estudos de genética de populações
Tabela 4. Trabalhos de transferibilidade de marcadores microssatélites
Espécie/marcadores desenvolvidos
marcadores transferidos
Espécies de Eucalyptus (Myrtaceae)
dysenterica (Myrtaceae)
Centrosema pubescens (Fabaceae)
Espécies de Centrosema
Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) (Euphorbiaceae)
Glycine (Fabaceae)
Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae)
Anacardium
(Anacardiaceae)
Espécies de Eucalyptus (Myrtaceae)
Espécies deCampomanesia
(Myrtaceae)
55,8%
mais relacionadas filogeneticamente as espécies, maior é a chance de
Porcentagem de locos microssatélites ESTs com padrão de amplificação
não amplificadose com bom padrão de amplificaçãoem três indivíduos
Eugenia klotzschiana avaliados em gel de acrilamida.
O número de marcadores transferidos é similar ao encontrado em outros
trabalhos já desenvolvidos com espécies do Cerrado, que buscaram a tran
moleculares para uso em estudos de genética de populações
Trabalhos de transferibilidade de marcadores microssatélites.
Espécie/ marcadores transferidos
Número de marcadores
testados
Porcentagem de marcadores transferidos
Eugenia dysenterica (Myrtaceae)
365 2,8%
Espécies de Centrosema (Fabaceae)
26 73%
Jatropha (Euphorbiaceae)
9 67%
Phaseolus (Fabaceae)
48 41,6%
Anacardium humile
(Anacardiaceae) 14 86%
Espécies de Campomanesia
(Myrtaceae) 120 10%
35%
9,2%
Primers que apresentaram inespecificidade
Primers que não amplificaram
Primers otimizados
42
de haver regiões
ão de amplificação
lificaçãoem três indivíduos
O número de marcadores transferidos é similar ao encontrado em outros
trabalhos já desenvolvidos com espécies do Cerrado, que buscaram a transferibilidade
moleculares para uso em estudos de genética de populações (Tabela 4).
Porcentagem de Referências
Zucchi et al., 2002
Sousa, et al., 2009
Bressan et al., 2012
Nascimento et al., 2013
Soares et al., 2013
Miranda, 2014
Primers que apresentaram inespecificidade
Primers que não amplificaram
Primers otimizados
43
A partir desses resultados foi possível estabelecer 4 sistemas multiplex de
eletroforese (Tabela 5). Na figura 9 pode-se observar o perfil dos eletroferogramas dos
alelos nas diferentes multiplexes. Não foi verificado nenhum indicador de erro de
genotipagem (presença de alelos nulos ou dropout).
Tabela 5. Sistemas de multiplexes de eletroforese estabelecido para Eugenia klotzschiana.
Os marcadores transferidos são compostos por motivos de repetição que variam
de dois (di) a seis (hex) nucleotídeos. Na tabela 6 estão demonstradas as condições de
amplificação de cada um dos 11 marcadores, assim como suas respectivas amplitudes
dos tamanhos dos alelos. A faixa de variação do tamanho dos alelos foi de 114 a 314
pares de bases (pb). A partir de uma escada alélica foi confirmada a existência de cada
um dos alelos para cada loco transferido.
Multiplex Loco Fluorescência/cor Amplitude de tamanho do alelo (pb)
Temperatura de anelamento
(ºC)
Quantidade Utilizada
(µL)
01
EMBRA 12 NED/amarelo 123 - 127 54 2
EMBRA 1335 HEX/verde 314 50 2
EMBRA 1811 NED/amarelo 203 62 1
02
EMBRA 1362 HEX/verde 152 - 274 56 2
EMBRA 1363 HEX/verde 309 - 317 55 2
EMBRA 1341 FAM/azul 226 - 230 50 3
03
EMBRA 2002 FAM/azul 224 - 236 56 2
EMBRA 1639 HEX/verde 114 - 150 56 2
EMBRA 1753 NED/amarelo 158 - 160 54 3
04 EMBRA 1868 NED/amarelo 280 - 282 62 1
EMBRA 1960 HEX/verde 140 58 3
44
Figura 9.Perfil em eletroforese capilar dos locos transferidos. Organizados em
sistemasmultiplex de genotipagem. Visualização dos sistemas multiplex 1, 2, 3 e 4.
45
Tabela 6. Relação dos pares de primers de regiões microssatélites transferidos de Eucalyptus para Eugenia klotzschiana.
LOCOS SEQUÊNCIA DO PRIMER MOTIVO DE REPETIÇÃO*
TA (°C)
AMPLITUDE DO ALELO (pb)
REFERÊNCIA/ ACESSO
EMBRA 12 F: 5'AGGATTTGTGGGGCAAGT3'
(AG)22 54 123-127 BV682011 R: 5'GTTCCCCATTTTCATGTCC3'
EMBRA 1335 F: 5'TTGCTCCCATGATTACTCCC3'
(GTT)5 50 314 GF101881 R: 5'GTCTTCATCCTGGCAAGAGC3'
EMBRA 1341 F: 5'CAAGAGAGGAAGGATGACGC3'
(AGC)6 50 226-230 Não publicado R: 5'CCCAACTGGTTTTGCACTTT3'
EMBRA 1362 F: 5'ACTTGATGGGTTCTCATCGC3'
(TGC)6 56 152-274 GF101955 R: 5'GGAAATCCTTACCACCAGCA3'
EMBRA 1363 F: 5'CCATAGCCCTCTGCTGATTC3'
(GCC)15 55 309-317 Faria et al., 2010 R: 5'AATGGAAAATGGGTTCCTCC3'
EMBRA 1639 F: 5'CCATGGACTCATCCACCTCT3'
(CTC)6 56 114-150 Não publicado R: 5'GTGCCTCCATTTTGACTGGT3'
EMBRA 1753 F: 5'GAGAGCTTGGACATGAAGGG3'
(CT)6 54 158-160 Não publicado R: 5'CTCCTCCTCCTCCTCCACTC3'
EMBRA 1811 F: 5'GTCGAGTTGAGTTCGCTTCC3'
(CTCCTG)26 62 203 Faria et al., 2011 R: 5'AGTGAATCGGGAGAGGAGGT3'
EMBRA 1868 F: 5'TGTGGAGCATGGAGTAGCAG3'
(TC)36 62 280-282 Faria et al., 2010 R: 5'CAAATCTCAGAGACGCCACA3'
EMBRA 1960 F: 5'GTCGAGGCAGGTGGAGTAGA3'
(GAG)7 58 140 Não publicado R: 5'TCTCATCAATGGCTTCCTCC3'
EMBRA 2002 F: 5'CGTGATACCCGTGATGTACG3'
(CCA)26 56 224-236 Faria et al., 2010 R: 5'ATCAAACCCTGAAGCACCAC3'
* Motivo de repetição observado em espécies de Eucalyptus.
46
5.2 VARIABILIDADE GENÉTICA NOS LOCOS
Dos 11 locos analisados na população foram verificados oito polimórficos e três
monomórficos, com uma média de 1,90 alelos, variando de um a três alelos nos locos
(Tabela 7). Embora o número de locos polimórficos tenha sido alto, o número de alelos
por loco foi baixo, levando em consideração que locos microssatélites são
potencialmente multialélicos (ELLEGREN, 2004), sendo que a alta capacidade de
mutação dos locos microssatélites sugere um efeito significativo na sua variabilidade
(TAUTZ &SCHÖTTERER, 1994; GAOet al., 2013).
O número reduzido de alelos encontrados parece não estar relacionado com o
tamanho das regiões microssatélites, já que motivos de repetição maiores como é
esperado para as regiões transferidas tendem a apresentar taxa de mutação maior
(ELLEGREN, 2004). No trabalho de Telles et al. (2013) foi observado um maior
número de alelos para a espécie Eugenia dysenterica, onde as regiões microssatélites
observadas tinham entre 10 e 16 repetições.
O número de alelos observados em E. klotzschianaé contrastante com o que
normalmente é encontrado em locos microssatélites para outras espécies do Cerrado,
como em Collevatti et al. (2001), que obteve de 20 a 27 alelos por loco para a espécie
Caryocar brasiliense, utilizando 10 locos SSR, onde foi analisado 10 populações com
uma média de 300 indivíduos. Solanum lycocarpum apresentou um total de 16 a 22
alelos nos locos e Solanum crinitum apresentou um total de 11 a 17 alelos nos locos
analisando 235 indivíduos em um total de 4 populações, utilizando 3 locos SSR
(MOURA et al., 2009). Em Lychnophora ericoides foi encontrado de 1 a 13 alelos por
loco analisando 18 locos de 36 indivíduos (RABELO et al., 2011). Em Tibouchina
papyrus, obteve 1 a 6 alelos por loco, onde foi avaliado 12 locos em 96 indivíduos
(TELLES et al., 2011), Dipteryx alata, 1 a 10 alelos por loco em 8 locos, utilizando 94
indivíduos de 3 populações (SOARES et al., 2012).Eugenia dysenterica apresentou de 3
a 11 alelos tendo avaliado 5 locos SSR, para 3 populações com 97 indivíduos (TELLES
et al., 2013).
A heterozigosidade esperada (He) média da população foi igual a 0,28 (Tabela
7), ou seja,a população de E. klotzschiana amostrada apresentou 0,28 de diversidade
genética, valor considerado razoável levando em conta o baixo número de alelos por
loco. A heterozigosidade observada (Ho) média da população foi igual a 0,44 (Tabela
7), sendo maior do que a heterozigosidade esperada, o que sugere um excesso de
heterozigotos em relação ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg. No entanto,
47
os valores não foram significativos.Moura et al. (2009), obtiveram valores parecidos
com o presente trabalho, apresentandoHo maior do que o esperado, em duas populações
de Solanum lycocarpum, com uma média de 0,42 de Ho, entretanto, obteve um valor de
diversidade genética maior (0,37) do que o encontrado neste trabalho.
Valores maiores de diversidade genética também foram encontrados em outros
trabalhos com espécies do Cerrado, em Caryocar brasiliense a média da diversidade
genética foi de 0,87, analisando 10 marcadores microssatélites em 101 indivíduos
(COLLEVATTI et al., 2010). Myracrodruon urundeuva FR. ALL. apresentou
diversidade genética variando de 0,83 a 0,96, utilizando 8 locos microssatélites em 2
populações com 978 indivíduos (VIEGAS et al., 2011).
A probabilidade de identidade (I) que é a probabilidade de dois indivíduos
amostrados aleatoriamente em uma população exibir o mesmo genótipo foi alta,
variando de 0,38 a 1,00, com um valor combinado igual a 2,02 x 10-3, ou seja, a
probabilidade de amostrar dois indivíduos aleatoriamente na população com genótipos
iguais é alta(Tabela 7). Segundo Collevatti et al. (1999) a probabilidade de identidade
combinada deve ser praticamente nula, para que um marcador microssatélite seja um
ótimo marcador para discriminar indivíduos.
A probabilidade de exclusão de paternidade (Q) foi baixa, no qual variou de
0,00 a 0,19, com um valorcombinado de 0,74, ou seja, a probabilidade de se excluir uma
falsa paternidade foi de 0,74,o que demonstra um baixo poder de exclusão de
paternidade. (Tabela 7).Quando se leva em consideração a bateria de locos, o poder de
exclusão é moderado. Para uma melhor segurança nas análises a probabilidade de
exclusão de paternidade ideal deve ser ≥ 0,99999 (COLLEVATTI et al., 2001, BRAGA
et al., 2007).Segundo Waits & Leberg (2000), quanto maior o número de locos
analisados menor será o erro de identificação de indivíduos associado à genotipagem.
Braga et al. (2007) obtiveram valores de I=1,03x10-37e Q=0,99 para 21 locos
microssatélites de Tabebuia aurea avaliado em36 indivíduos, corroborando com o
trabalho deMoreira et al. (2009), que encontrou valores de Q=0,91 e I=7,65 x 10-22para
7 locos microssatélites avaliados em 138 indivíduos de Tabebuia ochracea, sendo
possível verificar uma bateria de locos adequada para análises de genética de
populações. Em Telles et al. (2010) a probabilidade de identidade foi de 0,003 e a
probabilidade de exclusão de paternidade foi de 0,86, valores parecidos com o
encontrado neste trabalho.
48
As frequências dos alelos por loco analisado variaram de 0,03 a 1,00 (Figuras 10
e 11). Tais valores apresentados demonstram que o conjunto de locosnão produz um
bom poder de discriminação individual, o que não permite avaliar com precisão
aspectos relacionados com a dispersão de pólen e o sistema reprodutivo da espécie E.
klotzschiana.
Tabela 7. Caracterização genética dos 11 locos microssatélites na população de Eugenia
klotzschiana. Número de indivíduos analisados (n); número de alelos por loco (NA);
heterozigosidade esperada (He); observada (Ho); probabilidade de identidade (I) e
probabilidade de exclusão de paternidade (Q).
Loco n NA He Ho I Q Embra12 102 3 0,29 0,34 0,53 0,14 Embra1335 102 1 0,00 0,00 1,00 0,00 Embra1811 102 1 0,00 0,00 1,00 0,00 Embra1868 102 2 0,43 0,63 0,42 0,17 Embra1960 102 1 0,01 0,01 0,98 0,00 Embra1341 102 2 0,45 0,69 0,40 0,17 Embra1362 102 2 0,50 1,00 0,38 0,19 Embra1363 102 2 0,07 0,07 0,87 0,03 Embra1753 102 2 0,50 1,00 0,38 0,19 Embra2002 102 2 0,34 0,30 0,49 0,14 Embra1639 102 2 0,48 0,78 0,39 0,18
GLOBAL 102 1,90 0,28 0,44 2,02x10-3 0,74
.
Figura 10. Histograma das frequências alélicas de seis
klotzschiana. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos
0,0
0,5
1,0
123 125127
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA12
0,0
0,5
1,0
280282
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1868
ma das frequências alélicas de seis locosmicrossatélites transferidos, estimadas para 102 indivíduos da espécie
as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos em pares de bases (pb).
0,0
0,5
1,0
140
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1960
0,0
0,5
1,0
Fre
qu
ên
cia
Loco EMBRA 1811
0,0
0,5
1,0
314
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA1335
0,0
0,5
1,0
Fre
qu
ên
cia
Loco EMBRA 1341
49
indivíduos da espécie Eugenia
203
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1811
226230
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1341
Figura 11. Histograma das frequências alélicas de cinco
klotzschiana. O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos
0,0
0,5
1,0
152274
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1362
0,0
0,5
1,0
224236
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 2002
ma das frequências alélicas de cinco locosmicrossatélites transferidos, estimadas para 102 indivíduos da espécie
O eixo Y indica as frequências alélicas e o eixo X indica os alelos em pares de bases (pb).
0,0
0,5
1,0
309317
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1363
0,0
0,5
1,0
Fre
qu
ên
cia
Loco EMBRA 1341
0,0
0,5
1,0
114150
Fre
qu
ên
cia
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1639
50
indivíduos da espécie Eugenia
226230
Alelo (pb)
Loco EMBRA 1341
5.3 VARIABILIDADE GENÉTICA NAS SUBPOPULAÇÕES
O número médio de alelos por subpopulação va
A média da heterozigosidade observada (
os valores de heterozigosidade esperada
uma média variando de 0,18 a
transferidos a proporção de locos polimórficos nas subpopulações
Santo Antônio do Rio Verde e Silvânia, 54,54% em Senador Canedo e 63,63% em
Portelândia e Rio Verde (Figura 12
Figura 12.Proporção de locos
(SAR), Silvânia (SIL), Portelândia (POT), Senador
(RIV).
Entre as subpopulações
foram diferentes dos valores encontrados na população, variando
no qual demonstrou ser maior na subpopulação de Portelândia com 30 indivíduos e na
população de Rio Verde com 7 indivíd
Os valores encontrados
algumas espécies do Cerrado, no entanto, esses valores podem variar muito, como em
Dipteryx alata, a diversidade genética
Anacardium humile A. St. Hil
altos(0,87)valores semelhantes de
36,36% 36,36%
SAR SIL
Proporção de locos polimórficos
VARIABILIDADE GENÉTICA NAS SUBPOPULAÇÕES
O número médio de alelos por subpopulação variou entre 1,36 e 1,64 (Tabela 8
heterozigosidade observada (Ho) variou de 0,36 a 0,53, sendo maior do que
os valores de heterozigosidade esperada (He), que foram de baixos a moderados,
0,18 a 0,27 nas subpopulações (Tabela 8). Dos 11 marcadores
transferidos a proporção de locos polimórficos nas subpopulações foi
Santo Antônio do Rio Verde e Silvânia, 54,54% em Senador Canedo e 63,63% em
rtelândia e Rio Verde (Figura 12).
Proporção de locos polimórficos nas subpopulações. Santo Antônio do Rio Verde
(SAR), Silvânia (SIL), Portelândia (POT), Senador Canedo (SCN) e Rio Verde
Entre as subpopulações, os valores de diversidade genética encontrados não
foram diferentes dos valores encontrados na população, variando de baixa a moderada,
demonstrou ser maior na subpopulação de Portelândia com 30 indivíduos e na
população de Rio Verde com 7 indivíduos.
Os valores encontrados de diversidade genética são menores do que o obtido por
algumas espécies do Cerrado, no entanto, esses valores podem variar muito, como em
a diversidade genética variou de0,10 a 0,86 (SOARES
A. St. Hil obteve valores de diversidade variando de baixo
valores semelhantes de D. alata(SOARES et al., 2013)
36,36%
63,63%54,54%
SIL POT SCN
Proporção de locos polimórficos
51
riou entre 1,36 e 1,64 (Tabela 8).
variou de 0,36 a 0,53, sendo maior do que
baixos a moderados, com
Dos 11 marcadores
foi de 36,36% em
Santo Antônio do Rio Verde e Silvânia, 54,54% em Senador Canedo e 63,63% em
Santo Antônio do Rio Verde
Canedo (SCN) e Rio Verde
os valores de diversidade genética encontrados não
de baixa a moderada,
demonstrou ser maior na subpopulação de Portelândia com 30 indivíduos e na
são menores do que o obtido por
algumas espécies do Cerrado, no entanto, esses valores podem variar muito, como em
SOARES et al., 2012).
obteve valores de diversidade variando de baixo (0,06) a
2013). Em Eugenia
63,63%
RIV
52
dysenterica os valores de diversidade encontrados variaram demoderado (0,31) a alto
(0,88)(TELLES et al., 2013).
O índice de fixação (f) nas subpopulações apresentou valores variando de -1,00 a
1,00, e foram significativos para p ≤ 0,00091 (Tabela 8).Moura (2007) encontrou
resultados diferentes do presente trabalho, no qual o índice de fixação (f) não foi
significativamente diferente de zero, o que sugere ausência de endogamia nas
populações de Solanum lycocarpum A. St.-Hil. estudadas. Já em Podocarpus sellowii,o
índice de fixação foi negativo e estatisticamente diferente de zero, o que demonstra que
as populações não se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg(GONÇALVES,
2008).
No Teste Exato de Fisherfoi evidenciado que as subpopulações não apresentam
desvios significativos das proporções esperadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg
(Tabela 9). A subpopulação de Portelândia apresentou o menor valor, com 0,45 e o
maior valor foi observado em Santo Antônio do Rio Verde, com 0,67. As proporções
encontradas para o desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (Teste de Fisher) foram
parecidas com o encontrado em Tabebuia ochracea, em que a heterozigosidade
observada foi menor do que o esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (MOREIRA
et al., 2009).
O θ apresentou valor igual a0,20, ou seja, a medida de divergência genéticaentre
as subpopulações apresentou diferenciação genética relativamente alta e
significativamente diferente de zero. Os valores de θ podem variar de 0 a 1, sendo que
valores de 0,15 a 0,25 evidenciam diferenciação moderada (WRIGHT, 1951).
A análise de divergência genética (θ) par-a-par mostrou que o menor valor
encontrado foi entre as subpopulações deSanto Antônio do Rio Verde e Silvânia (θ =
0,00), ou seja, não verificou valores significativos de divergência genética,sendo as
mais similares. As subpopulações de Silvânia e Rio Verde apresentaram o maior valor
de divergência genética (θ = 0,34), em que verificou divergência genética significativa
(Tabela 10). Estes resultados não tem relação direta com a distância entre estas
subpopulações, já que Silvânia possui uma distância geográfica considerável, tanto de
Santo Antônio do Rio Verde quanto de Rio Verde (Anexo I).
53
Tabela 8. Caracterização da variabilidade genética em cinco subpopulações deEugenia klotzschiana, sendo elas,Santo Antônio do Rio Verde (SAR), Silvânia
(SIL), Portelândia (POT), Senador Canedo (SCN) e Rio Verde (RIV). Em que, n:número de indivíduos;NA: número de alelos; He: heterozigosidade
esperada; Ho: heterozigosidade observada; f: índice de fixação.
LOCO Pop SAR Pop SIL Pop POT Pop SCN Pop RIV n NA He Ho F n NA He Ho f n NA He Ho f n NA He Ho f n NA He Ho f
EMBRA12 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 2 0,50 0,93 -0,87* 45 1 0,00 0,00 - 7 2 0,50 0,86 -0,71*
EMBRA1335 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 1 0,00 0,00 - 45 1 0,00 0,00 - 7 1 0,00 0,00 -
EMBRA1811 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 1 0,00 0,00 - 45 1 0,00 0,00 - 7 1 0,00 0,00 -
EMBRA1868 6 2 0,50 1,00 -1,00* 8 2 0,50 1,00 -1,00* 30 1 0,00 0,00 - 45 2 0,50 1,00 -1,00* 7 2 0,14 0,14 0,00*
EMBRA1960 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 1 0,00 0,00 - 45 1 0,00 0,00 - 7 1 0,00 0,00 -
EMBRA1341 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 2 0,50 1,00 -1,00* 45 2 0,47 0,73 -0,56* 7 2 0,50 0,86 -0,71*
EMBRA1362 6 2 0,50 1,00 -1,00* 8 2 0,50 1,00 -1,00* 30 2 0,50 1,00 -1,00* 45 2 0,50 1,00 -1,00* 7 2 0,50 1,00 -1,00*
EMBRA1363 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 2 0,03 0,03 0,00* 45 2 0,13 0,14 -0,06* 7 1 0,00 0,00 -
EMBRA1753 6 2 0,50 1,00 -1,00* 8 2 0,50 1,00 -1,00* 30 2 0,50 1,00 -1,00* 45 2 0,50 1,00 -1,00* 7 2 0,50 1,00 -1,00*
EMBRA2002 6 1 0,00 0,00 - 8 1 0,00 0,00 - 30 2 0,50 1,00 -1,00* 45 1 0,00 0,00 - 7 2 0,29 0,00 1,00NS
EMBRA1639 6 2 0,50 1,00 -1,00* 8 2 0,50 1,00 -1,00* 30 2 0,49 0,83 -0,71* 45 2 0,44 0,64 -0,47* 7 2 0,50 1,00 -1,00*
GLOBAL: 6 1,36 0,18 0,36 -1,00* 8 1,36 0,18 0,36 -1,00* 30 1,64 0,27 0,53 -0,92* 45 1,6 0,23 0,41 -0,78* 7 1,64 0,27 0,44 -0,66* *Valores significativos, p ≤ 0,00091; NS: não significativo.
54
Tabela 9.Teste de aderência às proporções esperadas para o equilíbrio de Hardy- Weinberg
(Teste Exato de Fisher).
População Teste exato de Fisher
Santo Antônio do Rio Verde 0,67NS
Silvânia
0,65NS
Portelândia
0,45NS
Senador Canedo
0,55NS
Rio Verde 0,50NS
*Significativo ≤0,05;NS: não significativo.
Utilizando marcadores microssatélites, Moura (2007), encontrou valores de
divergência genética entre populações (RST e θp) diferindo estatisticamente de zero, com
0,08 e 0,09 para Solanum lycocarpum A. St.-Hil. Já as subpopulações de Tibouchina
papyrus foram consideradas altamente estruturadas, tendo uma diferenciação genética
muito alta entre as subpopulações, com θ = 0,71 (LIMA, 2011). Em Martins (2011), o
resultado da AMOVA para dois níveis hierárquicos de Vellozia gigantearevelou
(ΦPT=0,10).
Tabela 10. Divergência genética (θ) entre subpopulações de Eugenia klotzschiana.
População /População Santo Antônio do Rio Verde
Silvânia Portelândia Senador Canedo
Rio Verde
Santo Antônio do Rio Verde 0,00
Silvânia 0,00 0,00
Portelândia 0,25 0,26 0,00
Senador Canedo 0,06 0,06 0,21 0,00
Rio Verde 0,33 0,34 0,10 0,30 0,00
Resultados semelhantes ao presente trabalho foram encontrados em outras
espécies com sistema reprodutivo apomítico: Ranunculus carpaticolaeR. auricomus foi
observado variabilidade em linhagens clonais com alta variação alélica de origem
mutacional (PAUN et al., 2006), em Hymenaea stigonocarpaa diversidade clonal foi
moderada (MORENO, 2009).Populações de apomíticos Potentilla argentea
demonstraram resultados parecidos com Ranunculus, com alta variabilidade dentro do
fenótipo AFLP indicando origem mutacional (PAULE et al., 2011). Em Taraxacum
55
officinale foi obtido baixo número de genótipos e um número de alelos moderado
(MAJESKÝet al., 2012).
Os resultados evidenciados no presente trabalho podem ser melhores explicados
pelo sistema reprodutivo da espécie, por se tratar de uma espécie que se suspeita de
sistema reprodutivo por apomixia, tendo verificado estudos abordando diversidade
genética em plantas clonais em que essas populações possuem variabilidade genética, e
que a diversidade genética não diminui e pode até aumentar com o aumento da
assexualidade se os clones forem heterozigotos (BALLOUX & LEHMANN, 2003).Por
tanto, estudos mais detalhados em relação ao sistema de cruzamento daespécieEugenia
klotzschianase fazem necessários.
56
6.0 CONCLUSÕES
• Houve sucesso na transferibilidade de 11 marcadores microssatélitesde
Eucalyptuspara o genoma de Eugenia klotzschiana;
• Foi possível disponibilizar quatro sistemas multiplex de eletroforese para os 11
marcadores microssatélites transferidos;
• A variabilidade genética é baixa dentro das subpopulações de Eugenia
klotzschiana;
• Não foram verificados desvios significativos para as proporções esperadas para
o equilíbrio de Hardy-Weinberg, no conjunto de marcadores avaliados em E.
klotzschiana;
• A diferenciação genética entre subpopulações de E. klotzschiana é relativamente
alta;
• O presente estudo é um ponto de partida importante para conhecer melhor a
organização da variabilidade genética da espécie. Todavia, ainda há necessidade
de continuar a buscar por novos marcadores polimórficos a fim de possibilitar
ferramentas moleculares mais robustas para elucidar melhor aspectos da biologia
reprodutiva da espécieE. klotzschiana.
57
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGARWAL, M.; SHRIVASTAVA, N.; PADH, H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences.Plant Cell Reports, p. 617–631, 2008. ALFENAS, A. C.; PETERS, I.; BRUNE, W. Eletroforese de proteínas e isoenzimas de fungos e essências florestais. Universidade Federal de Viçosa, p. 242, 1991. ALMEIDA, S. P.; PROENÇA, S. M.; SANO, S. M.; RIBEIRO, J. F. Cerrado: espécies vegetais úteis. Planaltina, DF: Embrapa-CPAC, 1998. ANDERSEN, O.; ANDERSEN, A. As frutas silvestres brasileiras. 3. ed. São Paulo: Globo, 1989, 203 p. APPELS, R.; MORRIS, R.; GILL, B. K.; MAY, C. E. Chromosome biology. United States of America: Kluver Academic Publishers, 1998,cap. 10 e 12. ARMOUR, J. A.; NEUMANN, R.; GOBERT, S.; JEFFREYS, A. J. Isolation ofhuman simple repeat loci by hybridization selection.Human Molecular Genetics, v. 3, p. 599-565, 1994.
ARNAUD-HAOND S.; DUARTE, C. M.; ALBERTO, F.; SERRÃO, E. A. Standardizing methods to address clonality in population studies.Molecular Ecology, v. 16, p. 5115-5139, 2007. ASKER, S. E.; JELING, L. Apomixis in Plants. Boca Raton: CRC Press Inc, USA, Florida, 298p. BAUMANN, U.; JUTTNER, J.; BIAN, X.; LANGRIDGE, P. 2000. Self-incompatibility in the grasses.Annals of Botany, v. 85, p.203-209, 1992. AURICCHIO, M. T. &. BACCHI, E. M. Folhas de Eugenia uniflora L. (pitanga): propriedades farmacobotânicas, químicas e farmacológicas.Revista do Instituto Adolfo Lutz , v. 62, p. 55 - 61, 2003. BALLOUX, F.; LEHMANN, T.The population genetics of clonal and partially clonal diploids.Genetics, v. 164, p. 1635-1644, 2003. BARBARÁ, T.; PALMA-SILVA, C.; PAGGI, G. M.; BERED, F.; FAY, M. F. &pLEXER, C. Cross-species transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations.Molecular Ecology, v. 16, p. 3759–3767, 2007. BARROSO, G. M. Sistemática de Angiospermas do Brasil. Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, v.2, 1991. BATTJES, J.; MENSKEN, S. B. J.; DEN NIJS, J. C. M. Clonal diversity in somemicrospecies of Taraxacumsect.Palustria (Lindb. fil.)Dahlst.from Czechoslovakia. Botanische Jahrbücher, v. 114, p. 315–328, 1992.
58
BERNARDES, V. Isolamento, caracterização e transferibilidade de marcadores microssatélites de byrsonima cydoniifolia a. juss. (Malpighiaceae). Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014. BHARGAVA, A.; FUENTES, F. F. Mutational dynamics of microsatellites.Molecular Biotechnol, v. 44, p. 250-266, 2010. BILLOTE, N.; LAGODA, P.J.L.; RISTERUCCI, A.M.; BAURENS, F.C. Microsatellite-enriched libraries: applied methodology for the development of SSR markers in tropical crops. Fruits 54, p. 277-88, 1999. BLAIR, M.W.; HURTADO, N.EST-SSR markers from five sequenced cDNA libraries of common bean (Phaseolus vulgaris L.) comparing three bioinformatic algorithms. Molecular Ecology Resour, v. 13, p. 688-95, 2013. BOTSTEIN, D.; WHITE, R. L.; SKOLNICK, M.; DAVIS, R. W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, v. 32, p. 314-331, 1980. BRAGA, A. C.; REIS, A. M. M.; LEOI, L. T.; PEREIRA, R. W.; COLLEVATTI, R. G. Development and characterization of microsatellite markers for the tropical tree species Tabebuia aurea (Bignoniaceae). Molecular Ecology Notes, v. 7, p. 53-56, 2007. BRASIL. MINISTERIO DA AGRICULTURA, PECUARIA E ABASTECIMENTO (MAPA). EMBRAPA. Frutas nativas do cerrado brasileiro: aproveitamento Alimentar. Brasília: Embrapa, 2002. BRESSAN, E. D. A; SCOTTON, D. C.; FERREIRA, R. R.; et al. Development of microsatellite primers for Jatropha curcas (Euphorbiaceae) and transferability to congeners. American journal of botany, v. 99, p. 237–9, 2012. BRONDANI, R. P. V.; BRONDANI, C.; TARCHINI, R.; GRATTAPAGLIA, D. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis e Eucalyptus urophylla. New York: Theoretical and Applied genetics, v.97, p. 816- 827, 1998. BRONDANI, C.; RANGEL, P. H. N.; BORBA, T. C. O.; BRONDANI, R. P. V. Transferability of microsatellite and sequence tagged site markers in Orizza species.Hereditas, v. 138, p. 187–92, 2003. BROOKFIELD, J. F. Y. A simple new method for estimating null allele frequency from heterozygote deficiency.Molecular Ecology, v. 5, p. 453-455, 1996. BUSTAMANTE, M. M. C.; NARDOTO, G. B.; PINTO, A. S.; RESENDE, J. C. F.; TAKAHASHI, F. S. C. & VIEIRA, L. C. G. Potencial impacts of climate change on biogeochemical functioning of Cerrado ecossystems. Brazilian Journal of Biology, São Carlos, v. 72, p. 655-671, 2012.
59
CAIXETA, T. E.; OLIVEIRA, A. C. B.; BRITO, G. G.; SAKIYAMA, N. S. Tipos de Marcadores Moleculares. In: BORÉM, A.; CAIXETA, E. T. (Org.). Marcadores Moleculares. 1.Ed. Viçosa, 2006.307-374 p. CARAMORI, S. S.; LIMA, C. S.; FERNANDES, K. F. Biochemical characterization of selected plant species from Brazilian Savannas.Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 47, p. 253-259, 2004. CARDLE, L.; RAMSAY, L.; MILBOURNE, D.; MACAULAY, M.; MARSHALL. D.et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants.Genetics, v. 156, p. 847–854, 2000. CAVAGNARO, P.F.; SENALIK, D. A.; YANG, L. M.; SIMON, P. W.; HARKINS, T. T.; KODIRA, C. D.; HUANG, S. W.; WENG, Y. Q. Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber (Cucumis sativus L.). BMC Genomics, v. 11, p. 569–588, 2010. CAVALLI, S. S. Apomíxia: um método de reprodução assexual. In. FREITAS, L. B.;BERED, F. Genética e Evolução Vegetal,p.41-55, 2003. CHO, R. J.; MINDRINOS, M.; RICHARDS, D. R.; SAPOLSKY, R. J.; ANDERSON, M. et al. Genome-wide mapping with biallelic markers inArabidopsis thaliana. Nature Genetics, v. 23, p. 203–207, 1999. CIPRIANI, G.; LOT, G.; HUANG, W. G.; et al.AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics, v. 99, p. 65–72, 1999. COLLEVATTI, R. G.; BRONDANI, R.V.; GRATTAPAGLIA, D. Development and characterization of Microsatellite markers for genetic analysis of a Brazilian endangered tree species Caryocar brasiliense. Heredity, v. 83, p. 748-756, 1999. COLLEVATTI, R. G.; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J. D. Population genetic structure of the endangered tropical tree species Caryocar brasiliense, based on variability at microsatellite loci. Molecular Ecology, v. 10, p. 349-356, 2001. COLLEVATTI, R. G.; ESTOLANO, R.; GARCIA, S. F.; HAY, J. D. Short-distance pollen dispersal and high self-pollination in a bat-pollinated neotropical tree. Tree Genetics & Genomes, v.6, p. 555-564, 2010. CONSOLINI, A.E.; BALDINI, O.A.N.; AMAT, A.G. Pharmacological basis for theempirical use of Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) as antihypertensive. Journal of Ethnopharmacology, v. 66, p. 33-39, 1999. COSTA, C. F.; BONI, T. A.; RESENDE, L. V.; ALVAREZ, P. A.; TELLES, M. P. C. Caracterização de regiões repetitivas no genoma de Eugenia klotzschiana (BERG). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE GENÉTICA, 56., 2010. Guarujá. Resumos, Rio de Janeiro: SBG, 2010.
60
COSTA, I. R. Estudo cromossômico em espécies de Myrtaceae Juss. no Sudeste do Brasil.2004. Dissertação (Mestrado em Biologia),Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2004. COX, M. M.; DOUDNA, J.A.; O’DONNELL, M. Biologia molecular princípios e técnicas. Arte Mede, Porto Alegre, 2012.943 p. CRESTE, S.; TULMANN NETO, A. & FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeat polymorhisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining.Plant Molecular Biology Reporter,v. 19, p. 299-306, 2001. CZAPIK, R. How to detect apomixis in Angiospermae.Polish Botanic Study,v. 8, p. 13-21, 1994. DESALLE, R. & AMATO, G.The expansion of conservation genetics.Nature, v.5, 702-712, 2004. DIERINGER, D.; SCHLÖTTERER, C. Two distinct modes of microsatellite mutation processes: evidence from the complete genomic sequences of nine species. Genome Research, v. 13, p. 2242–2251, 2003. DOYLE, J. J.& DOYLE, J. L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.Phytochemical bulletin, v. 19, p. 11-15, 1987. DURAN, C.; APPLEBY, N. EDWARDS, D.; BATLEY.Molecular genetic markers: discovery, applications, data storage and visualisation. Current Bioinformatics , v.4, p. 16-27, 2009. EDWARDS, Y. J. & ELGAR, G. The identification and characterization of microsatellites inthe compact genome of the Japanese pufferfish, Fugu rubripes: perspectives infunctional and comparative genomic analyses. Journal Molecular Biology, v. 278, 4, p. 843-854, 1998. EINBOND, L.S.; REYNERTSON, K.A.; LUO, X.D.; BASILE, M.J.; KENNELLY, E.J.Anthocyanin antioxidants from edible fruits. Food chemistry, v.84, p.23-28, 2004. ELLEGREN, H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution.Nature Reviews Genetics, v. 5, p. 435–445, 2004. ELLIS, J.R.; BURKE, J.M. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses.Heredity, v.99, p. 125–132, 2007. FALEIRO, F. G. Marcadores genético-moleculares aplicados a programas de conservação e uso de recursos genéticos. Planaltina: Embrapa Cerrados, p. 102, 2007. FARIA, D. A.; MAMANI, E. M. C.; PAPPAS, M. R.; PAPPAS JR, G. J. & GRATTAPAGLIA, D. A selected set of EST-derived microsatellites, polymorphic and transferable across 6 species of Eucalyptus.Journal of Heredity, v. 101, p. 512-520, 2010.
61
FARIA, D. A.; MAMANI, E. M. C.; PAPPAS JR, G. J. & GRATTAPAGLIA, D. Genotyping systems for Eucalyptus based on tetra-, penta-, and hexanucleotide repeat EST microsatellites and their use for individual fingerprinting and assignment tests. Tree Genetics & Genomes, v.7, p. 63–77, 2011. FARIA, J. P.; COSTA, T. A.; JUNQUEIRA, N. T. V.Pera-do-Cerrado. In: VIEIRA, R. F.; AGOSTINI-COSTA, T. S.; SILVA, D. B.; FERREIRA, F. R.; SANO, S. M. et al.Frutas nativas da região Centro-Oeste do Brasil. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,2006.Cap. 16, p. 289-301. FELFILI, J. M.; SILVA JUNIOR, M. C. Diversidade alfa e beta no cerrado sensu stricto, Distrito Federal, Goiás, Minas Gerais e Bahia. In: SCARIOT, A.; SOUSA-SILVA, J. C.; FELFILI, J. M. (Org.). Cerrado: ecologia, biodiversidade e conservação. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, p. 142-154, 2005. FERREIRA, M. E. & GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: Embrapa. 1998. FIELD, D. & WILLS, C. Abundant microsatellite polymorphisms in Saccharomyces cerevisiae, and the different distributions of microsatellites in eight prokariotes and S. cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of selective forces. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., v. 95, p. 1647-1652, 1998. FISCHER, D.C.H.; LIMBERGER, R.P.; HENRIQUES, A.T.; MORENO, P.R.H.Essential oils from leaves of two Eugenia brasiliensis specimens from southeasternBrazil. Journal of Essential Oil Research, v.17, p. 499-500, 2005. FONTENELLE, G.B.; COSTA, C.G.; MACHADO, R.D. Foliar anatomy andmicromorphology of eleven species of Eugenia L. (Myrtaceae). Botanical Journal of theLinnean Society, v.115, p. 111-133, 1994. FORZZA, R. C.; BAUMGRATZ, J. F. A.; BICUDO, C. E. M. et al.New Brazilian floristic list highlights conservation challenges.Bio Science, v.62, 2012. FRANKHAM, R.; BALLOU, J. D. & BRISCOE, D. A. Introduction to conservation genetics.Cambridge University Press, p. 640, 2002. FRANKHAM, R.; BALLOU, J. D.& BRISCOE, D. A. Genética da conservação. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2008. 262 p. FRANKHAM, R. Challenges and opportunities of genetic approaches to biological conservation. Biological Conservation, v. 143, p. 1919-1927, 2010. FRYXEL, P. Mode of reproduction of higher plants. Botanical Review, v. 23, p. 135-233, 1957. GAO, C.; REN, X.; MASON, A. S.; LI, J.; WANG, W.; XIAO, M.& FU, D.Revisiting an important component of plant genomes: microsatellites.Functional Plant Biology,2013.
62
GOLDSTEIN, D. B. & SCHLÖTTERER, C., Microsatellites: evolution and applications. Oxford: Oxford University Press, 1999. GONÇALVES, F. R. Estrutura genética em populações naturais de Podocarpus sellowii Klotzsch (Podocarpaceae) da região do Alto Rio Grande, Sul de Minas Gerais. 2008. Dissertação (Mestrado em Engenharia Florestal)-Escola de Engenharia Florestal, Universidade Federal de Minas Gerais, lavras, 2008. GOUDET, J. FSTAT: a computer package for PCs which estimates and tests gene diversities and differentiation statistics from codominant genetic markers (version 2.9.3). Lausanne: University of Lausanne, Department of Ecology & Evolution, 2002. Disponível em: <http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm>. Acesso em: 04 abr. 2014. GOVAERTS, R., M. et al. World checklist of Myrtaceae. Royal Botanic Gardens, Kew,2008. 455 p. Disponível em: <http://www.kew.org/wcsp/>. Acesso em: 12 jun. 2014. GRESSLER, E. Polinização e dispersão de sementes em Myrtaceae do Brasil. Revista Brasileira de Botânica, v. 29, p. 509-530, 2006. GRODZICKER, T.;WILLIAMS,J.; SHARP, P.; SAMBROOK, J.Physical mapping of temperature sensitive mutations of adenoviruses.Cold Spring Harbor Symposia Quantitative Biology, v.39, p. 439-446, 1974.
GROVER, A. &SHARMA, P. C. Is spatial occurrence of microsatellites in thegenome a determinant of their function and dynamics contributing togenome evolution? Current Science, v.100, p. 859–869, 2011. HARIDASAN, M. Solos. In: FELFILI, J. M.; REZENDE, A. V.; SILVA JÚNIOR, M. C. (Org.). Biogeografia do Bioma Cerrado: vegetação e solos da Chapada dos Veadeiros.Brasília: Universidade de Brasília, 2007. 27-43 p. HARTMANN, H. D.; KESTER, D. E. Propagación de plantas: principios y prácticas. México: Compañia Editorial Continental, p. 809, 1975. HEYWOOD, V.H. & IRIONDO, J.M. Plant conservation: Old problems, new perspectives. Biological Conservation, v.113, p.321-335, 2003. HOFFMANN, W. A. & FRANCO, A. C. Comparative growth analysis of tropical forest and savanna woody plants using phylogenetically-independent contrasts. Journal of Ecology, v. 91, p. 475-484, 2003. HOFFMANN, W. A.; ORTHEN, B. & FRANCO, A. C. Constrainst to seedling success of savanna and forest trees across the savanna-forest boundary.Ecology, v.140, p. 252-260, 2004. HU, J.; NAKATANI, M.; LALUSIN, A.G.; FUJIMURA, T.New microsatellite markers developed from reported Ipomoea trifida sequences and their application to sweet potato and its related wild species. Scientia Horticulturae, v.102, p.375–386, 2004.
63
JEFFREYS, A.J. & NEUMANN, R. Somatic mutation processes at ahuman minisatellite. Human Molecular Genetics, v.6, p. 129–136, 1997. KALIA, R. J.; RAI, M. K.; KALIA, S.; SINGH, R.; DHAWAN, A. K. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica, v. 177, p. 309–334, 2011. KANDPAL, R. P.; KANDPAL, G.; WEISSMAN, S. M. Construction of libraries enriched for sequence repeats and jumping clones, and hybridization selection for region-specific markers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. v.91, p. 88-92, 1994. KARAGYOZOV, L.; KALCHEVA, I. D.; CHAPMAN, V. M. Constructionof random small-insert genomic libraries highly enrichedfor simple sequence repeats.Nucleic Acids Research, v.21, 3911-3912, 1993. KAZAZIAN, H. H. JR. Mobile elements: drivers of genome evolution.Science, v. 303, p. 1626–1632, 2004. KIJAS, J. M.; FOWLER, J. C.; GARBETT, C. A.; THOMAS, M. R. Enrichmentof microsatellites from the Citrus genome using biotinylatedoligonucleotide sequences bound to streptavidin-coatedmagnetic particles. Biotechniques, v.16, p. 656-662, 1994. KIMURA, M.; CROW, J. F.The number of alleles that can be maintained in a finite population.Genetics, v.49, p.725–738, 1964. KOLTUNOW, A. M. Apomixis: embryo sacs and embryo formed without meiosis or fertilization in ovules. The Plant Cell, v.5, p. 1425-1437, 1993. KOLTUNOW, A. M.; GROSSNIKLAUS, U. Apomixis: a developmental perspective. Annual Review of Plant Biology, v.54, p. 547-574, 2003. LAGE, E. A. S.; SILVA, M. N.; BANDEIRA, L. F.; CHAVES, L.; COELHO, A. S. G. O uso de marcadores moleculares SSR para o estudo da diversidade genética de Eugenia klotzschiana BERG. em fragmentos do Cerrado do Estado de Goiás. In: CONGRESSO DE PESQUISA, ENSINO E EXTENSÃO DA UFG,2., 2005. Goiânia. Anais eletrônicos do XIII Seminário de Iniciação Científica.Goiânia: Universidade Federal de Goiás,2005.CD – ROM. LANDRUM, L. R & KAWASAKI, M. L.The genera of Myrtaceae in Brazil – an illustrated synoptic treatment and identification keys.Brittonia , v.49, p. 508-536, 1997. LEWIN, B. Genes IV. Oxford: Oxford University Press, 1990. LEWIS, P. O.; ZAYKIN, D. Genetic data analysis: Computer program for the analysis of allelic data. Version 1.0. Free program distributed by the authors over the internet from http://lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/software.html; 2001.
64
LEWINSOHN, T. M. & PRADO, P. I. How many species are there in brazil? Conservation Biology, v.19, p. 619-624, 2005. LI, Y. C.; KOROL, A. B.; FAHIMA, T.; BEILES, A.; NEVO, E. Microsatellites:genomic distribution, putative functions andmutational mechanisms: a review. Molecular Ecology, v. 11, p. 2453–2465, 2002. LI, Y. C.; KOROL, A. B.; FAHIMA, T.; NEVO, E. Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Molecular Biology Evolution, v. 21, p. 991–1007, 2004. LIMA, J. S. Diversidade genética e estrutura espacial intrapopulacional em Tibouchina papyrus (POHL) Toledo utilizando marcadores microssatélites. 2011.Dissertação (Mestrado em Ecologia e Evolução),Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011. LITT, M. & LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Annual Journal Human Genetics, p. 397-401, 1989. LORENZI, H.; BACHER, L.; LACERDA, M. & SARTORI, S. Frutas brasileiras e exóticas cultivadas. Instituto Plantarum, Nova Odessa.2006. LORENZI, H. & SOUZA, W. C.Botânica Sistemática.Guia ilustrado para identificação das famílias de fanerógmas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II.2. ed.Plantarum, 2008, 640 p. LUNARDI, I.; PEIXOTO, J.L.B.; SILVA, C.C.; SHUQUEL, I.T. A., BASSO, E. A.;VIDOTTI, G. J. Triterpenic acids from Eugenia moraviana. Journal of Brazilian Chemical Society, v.12, p. 180-183, 2001. MAJESKÝ, L.; VASUT, R. J.; KITNER, M.; TRÁVNÍCEK, B.The pattern of genetic variability in apomictic clones of Taraxacum officinale indicates the alternation of asexual and sexual histories of apomicts. Plos One, v. 7, p. 1-14, 2012. MANEL, S.; SCHWARTZ, M.; LUIKART, G. & TABERLET, P. Landscape genetics: combining landscape ecology and population genetics. Trends in Ecology and Evolution, v. 18, p. 189–197, 2003. MARTINOTTO, C.; PAIVA, R.; SOARES, F. P.; SANTOS, B. R.; NOGUEIRA, R. C. Cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.). Lavras: Editora UFLA, 2008, 21 p. Boletim Técnico nº 78. MARTINS, A. P. V. Diversidade genética e estrutura populacional de Vellozia gigantea (Velloziaceae), espécie endêmica dos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço, utilizando marcadores microssatélites. 2011. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal),Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2011.
65
MATHITHUMILAN, B.; KADAM, N. N.; BIRADAR, J.; REDDY, S. H.; ANKAIAH, M.; NARAYANAN, M. J.; KHURANA P.; SHESHSHAYEE, S. M. Development and characterization of microsatellite markers for Morus spp. and assessment of their transferability to other closely related species. BMC plant biology, v.13, p.194, 2013. MES, T. H. M.; KUPERUS, P.; KIRSCHNER, J.; STEPÁNEK, J.; STORCHOVA, H.;OOSTERVELD, P. & DEN NIJS, C. M. Detection of genetically divergent clone mates in apomictic dandelions. Molecular Ecology, v. 11, p. 253–265, 2002. MESQUITA, M. A. M.; NAVES, R. V.; SOUZA, E.; BERNARDES, T. G.; SILVA, L. Caracterização de ambientes com alta ocorrência natural de araticum (Annona crassiflora Mart.) no estado de Goiás. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 29, 2007. MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE – MMA. Programa nacional de conservação e uso sustentável do bioma Cerrado – Programa Cerrado sustentável. Brasília, 2013. MIRANDA, E. A. G. C. Transferibilidade e validação de marcadores microssatélites derivados de EST para duas espécies de Campomanesia(Myrtaceae) do Cerrado. 2014. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014. MITTERMEIER, R. A.; GIL, P. R.; MITTERMEIER, C. G. Megadiversidad-los países biologicamente más ricos del mundo.México: CEMEX, 1997. MITTERMEIER, R. A.; GIL, P. R.; HOFFMAN, M.; PILGRIM, J.; BROOKS, T.; MITTERMEIER, C. G.; LAMOREUX, J. & FONSECA, G. A. B.Hotspots revisited: earth’s biologically richest and most endangered terrestrial ecoregions. 2. ed. Boston: University of Chicago Press, 2005. MOREIRA, P. A.; FERNANDES, G. W.; COLLEVATTI, R. G. Fragmentation and spatial genetic structure in Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) a seasonally dry neotropical tree. Forest Ecology and Management, v.258, p. 2690-2695, 2009. MOREIRA, P. A; SOUSA, S. A S.; OLIVEIRA, F. A; et al. Characterization of nine transferred SSR markers in the tropical tree species Enterolobium contortisiliquum (Fabaceae). Genetics and molecular research, v. 11, p. 3729–34, 2012. MORENO, M. A.; Estrutura genética e diversidade clonal de jatobá-do-cerrado (Hymenaea stigonocarpa mart. ex Hayne) em duas populações no Cerrado do Estado de São Paulo. 2009.Dissertação(Mestrado em Recursos Florestais)Escola Superior de Agricultura ”Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2009. MORGANTE, M.; HANAFEY, M.; POWELL, W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. National Genetic, v. 30, p. 194-200, 2002. MOURA, T. M.Estrutura genética populacional em lobeira (Solanum lycocarpum A. St-Hil., Solanaceae), em ambientes naturais e antropizados no Estado de Goiás.
66
2007. Dissertação (Mestrado em Ecologia Aplicada)-Escola Superior de Agricultura ”Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2007. MOURA, T. M.; SEBBENN, A. M.; CHAVES, L. J.; COELHO, A. S. G.; OLIVEIRA, G. C. X.; KAGEYAMA, P. Y. Diversidade e estrutura genética espacial em populações fragmentadas de Solanum spp.do Cerrado, estimadas por meio de locos microssatélites. Scientia Forestalis, Piracicaba, v. 37, p. 143-150, 2009. MULLIS, K. B.; FALOONA, E.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol, v. 155, p. 335-350, 1987. NADIR, E.; MARGALIT, H.; GALLILY, T.; BENSASSON, S.A. Microsatellite spreading in the human genome: Evolutionary mechanisms and structural implications. National Academy of Sciences, v.93, p.6470-6475, 1996. NASCIMENTO, A. T. B.; SILVA, C. B.; COSTA, M. M. R.; SILVA, R. L. O.; KIDO, E. A. Transferibilidade de marcadores moleculares de soja para aplicação no melhoramento de feijão caupi. In: XII JORNADA DE ENSINO, JEPEX, 2013. Recife. Anais…Recife: UFPE, 2013. NEI, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.70, p. 3321-3323, 1973. NISHIZAWA, M.; NISHIZAWA, K. A DNA sequence evolution analysis generalized by simulation and the Markov chain Monte Carlo method implicates strand slippage in a majority of insertions and deletions. Journal Molecular Evology, v. 55, p. 706–717, 2002. OHTA, T.; KIMURA, M.A model of mutation appropriate to estimate the number of electrophoretically detectable alleles in a finite population.Genetics Research, v. 22, p. 201-204, 1973. OLIVEIRA, E. J.; PÁDUA, J. G.; ZUCCHI, M. I.; VENCOVSKY, R.; VIEIRA, M. L. C. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology, v. 29, p. 294-307, 2006. OLIVEIRA, G. C.; LOPES, P. S. N.; NETO, F. R. C.; CARVALHO, J. G.; GAVILANES, M. L.. Caracterização de plantas de Eugenia klotzschiana Berg (Pera-do-Cerrado) e do ambiente de sua ocorrência na região fisiográfica dos campos das vertentes em Minas Gerais. Review University of Alfenas, v. 5, p. 9-13, 1999. OOSTERHOUT C. V.; HUTCHINSON, W.F.; WILLS, D.P.M.; SHIPLEY, P. MICRO-CHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, v. 4, p. 535-538, 2004.
OSTRANDER, E. A.; JONG, P. M.; RINE, J.; DUYK, G. Construction ofsmall-insert genomic DNA libraries highly enriched for microsatelliterepeat sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v.89, p. 3419-3423, 1992.
67
OZIAS-AKINS, P.; VAN DIJK, P. J. Mendelian genetics of apomixis in plants.Annual Review Genetics, p. 509-37, 2007. PAETKAU, D.; CALVERT, W.; STIRLING, I.; STROBECK, C. Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears.Molecular Ecology Research, v.4, p. 347-354, 1995. PAETKAU, D. Microsatellites obtained using strand extension: An enrichment protocol. Biotechniques, v.26, p. 690-697, 1999. PARKER, K. C.; HAMRICK, J. L. Genetic diversity and clonal structure in a colummar cactus, Lophocereus schotti. American Journal of Botany, v.79, p. 86-96, 1992. PAULE, J.; SHARBEL, T. F.; DOBES, C. Apomictic and sexual lineages of thePotentilla argentea L. Group (Rosaceae): Cytotype and molecular genetic differentiation. Taxon, v. 60, p. 721–732, 2011. PAUN, O.; GREILHUBER, J.; TEMSCH, E. M.; HORANDL, E. Patterns, sources and ecological implications of clonal diversity in apomictic Ranunculus carpaticola (Ranunculus auricomus complex, Ranunculaceae). Molecular Ecology, v. 15, p. 897–910, 2006. PEIXOTO, N.; SILVA, E. S.; TEIXEIRA, F. G.; MOTA, F. Avaliação do crescimento inicial de populações de gabiroba em Ipameri, Ipameri, GO, 2003. PIZO, M. A. Padrão de deposição de sementes e sobrevivência de sementes e plântulas de duas espécies de Myrtaceae na Mata Atlântica. Revista Brasileira de Botânica, v. 26, p. 371-377, 2003. PROENÇA, C. Myrtaceae da região dos Cerrados. In: ENCONTRO DE BOTÂNICOSDO CENTRO-OESTE, 2., 1993, Brasília, DF. Anais... Brasília: Sociedade Brasileira de Botânica, 1993. PROENÇA, C. E. B. & GIBBS, P. E. Reproductive biology of eight sympatric Myrtaceae from Central Brazil. New Phytol, v. 126, p. 343-354, 1994. RABELO, S. G.; TEIXEIRA, C. F.; TELLES, M. P. C.; COLLEVATTI, R. G. Development and characterization of microsatellite markers for Lychnophora ericoides, anendangered Cerrado shrub species. Conservation Genetics Research, p. 1-3, 2011. RAFALSKI, J. A. Application of single nucleotide polymorphismsin crop genetics. Current Opinion in Plant Biology , v. 5, p. 94–100, 2002. RAI, M. K.; PHULWARIA, M. & SHEKHAWAT, N. S. Transferability of simple sequence repeat (SSR) markers developed in guava (Psidium guajava L.) to four Myrtaceae species. Molecular biology reports, v.40, p. 5067–71, 2013. RATNAM, J.; BOD, W. J.; FENSHAM, R. J.; HOFFMANN, W. A.; ARCHIBALD, S.; LEHMANN, C. E. R.; ANDERSON, M. T.; HIGGINS, S. I. & SANKARAN, M.When
68
is a ‘forest’ a savanna, and why does it matter? Global Ecology and Biogeography, v. 20, p. 653-660, 2011. RAVEN, P. H.; EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. Biologia Vegetal. 7.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. 830 p. REDDY, M. P.; SARLA, N. & SIDDIQ, E. A.Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding.Euphytica, v. 128, p. 9–17, 2002. REN, T. H.; CHEN, F.; ZOU YT, J. Y. H.; ZHANG, H.Q.; YAN, B. J.; REN, Z. L. Evolutionary trends of microsatellites during the speciation process and phylogenetic relationships within the genus Secale. Genome, v.54, p. 316–326, 2011. RIBEIRO, J. F.; PROENÇA, C. E. B. & ALMEIDA, S. P. Potencial frutífero de algumas espécies nativas do cerrado. In:CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 8, 1986, Brasília,Resumo... Brasília: Embrapa-DDT/CNPq, 1986. p. 491-500. RIBEIRO, J. F.; BRIDGEWATER, S.; RATTER, J. A.; SOUSA-SILVA, J. C. Ocupação do bioma Cerrado e conservação da sua diversidade vegetal. In: SCARIOT, A.; SOUSA-SILVA, J. C.; FELFILI, J. M. (Org.). Cerrado: ecologia, biodiversidade e conservação. Brasília: Ministério do Meio Ambiente, p. 384-399, 2005. RIBEIRO, J. F.; WALTER, B. M. T. As principais fitofisionomias do Cerrado. In: SANO, S. M.; ALMEIDA, S. P.; RIBEIRO, J. F. (Ed.). Cerrado: ecologia e flora. 3. Ed. Planaltina: Embrapa Cerrados, p. 153-212, 2008. RICHARD, G. F.; PAQUES, F. Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection. EMBO Reports, v. 1, p. 122-126, 2000. RICHARDS, A. J. Genetic variability in obligate apomicts of the genusTaraxacum.Folia Geobot Phytotax, v. 31, p. 405-414, 1996. RICHARDS, A. J. Plant breeding systems.London: Unwin Hyman, p. 529, 1997. RODRIGUES, A. J. L. Avaliação da variabilidade genética em Eugenia klotzschiana utilizando-se marcadores moleculares RAPD. 1999. Dissertação (Mestrado), Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 1999. RODRIGUES, F, C. Estimativa da variabilidade genética da piramutaba (Brachyplatystoma vaillantii) por meio de marcadores moleculares microssatélites e D-loop de quatro localidades da Amazônia: diferença entre calha e tributário. 2009. Dissertação (Mestradoem Genética, Conservação e Biologia Evolutiva), Universidade de Manaus, Mato Grosso, 2009. ROSE, O.; FALUSH, D.A threshold size for microsatellite expansion.Molecular Biology and Evolution, v. 15, p. 613–615, 1998.
69
RUAS, E. A.; DAMASCENO, J. O.; CONSON, A. R. O.; et al. Isolation and characterization of eleven polymorphic microsatellite loci in Aegiphila sellowiana and their transferability. v. 55, p. 396–399, 2011. SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOEFFEL, S.; SHCARF, S. J.; HIGUCHI, G. HORN, G. T.; MULLIS, K. B. & ERLICH, H. A. Primer – directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, v. 239, p. 487-491, 1988. SANTANA, A. R. Transferibilidade e desenvolvimento de sistema multiplex de genotipagem de marcadores microssatélites para Pterodon emarginatus Vogel(Fabaceae). Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2014. SCHLÖTTERER, C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA.Chromosoma, v.109, p. 365–371,2000. SHARMA, P.C.; GROVER, A.; KAHL, G. Mining microsatellites in eukaryotic genomes.Trends in Biotechnology, v.25, p. 490-498, 2007. SILVA, D. B.; SILVA, J. A.; JUNQUEIRA, N. T. V.; ANDRADE, L. R. M. Frutas do Cerrado. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2001.178 p. SILVERTOWN, J. The evolutionary maintenance of sexual reproduction: evidence from the ecological distribution of asexual reproduction in clonal plants.Chicago, International Journal of Plant Sciences, v. 169, p. 157-168, 2008. SLATKIN, M. A measure of population subdivision based onmicrosatellite allele frequencies. Genetics, v. 139, p. 457-462, 1995. SOARES, T. N.; MELO, D. B.; RESENDE, L. V.; VIANELLO, R. P .; CHAVES, L. J.; COLLEVATTI, R. G.; & TELLES, M. P.C.Development of microsatellite markers for the neotropical tree species Dipteryx alata (Fabaceae). American Journal Botany, v.99, p. 72-73, 2012. SOARES, T. N.; SANTANA, L. L.; OLIVEIRA, L. K.; TELLES, M. P. C. &COLLEVATTI, R. G. Transferability and characterization of microsatellite loci in Anacardium humile A. St. Hil. (Anacardiaceae).Genetics and Molecular Research, v. 12, p. 3146-3149, 2013. SOBRAL, M. et al. Myrtaceae in Lista de espécies da flora do Brasil. Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 2010. Disponível em: <http:// floradobrasil.jbrj.gov.br/2010/>. Acesso em: 12 jun. 2014. SOUZA, V. C.; LORENZI, H. Botânica sistemática.Nova Odessa: Instituto Plantarum de Estudos da Flora Ltda., 2. ed., p. 704, 2008.
70
SOUSA, A. C. B.; CARVALHO, M. A.; BOAVENTURA, L. R.; et al. Microsatellite markers in tropical legume (Centrosema pubescens Benth): development, characterization, and cross-species amplification in Centrosema sp.Conservation Genetics Resources, v. 1, p. 347–352, 2009. TAUTZ, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers.Nucleic Acids Research, p. 6463-6471, 1989. TAUTZ, D. & SCHÖTTERER, C. Simple sequences. Current Opinion in Genetics & Development, p. 832-837, 1994. TELLES, M. P. C.; RESENDE, R. P. V.; BRONDANI, R. G.; COLLEVATTI, M. C.; COSTA & SILVA JÚNIOR, N. J. Isolation and characterization of microsatellite markers in the armored catfish Hypostomus gymnorhynchus (Loricariidae). Genetics and Molecular Research, v. 9, p. 1770-1774, 2010. TELLES, M. P.; PEIXOTO, F. P.; LIMA, J. S.; RESENDE, L. V. et al.Development of microsatellite markers for the endangered Neotropical tree species Tibouchina papyrus (Melastomataceae). Genetics and Molecular Research, v.10, p. 321-325, 2011. TELLES, M. P. C.;SILVA, J. B.; RESENDE, L. V.; VIANELLO, R. P.; CHAVES, L. J.; SOARES, T. N. & COLLEVATTI, R. G.Development and characterization of new microsatellites for Eugenia dysenterica DC (Myrtaceae).Genetics and Molecular Research, v. 12, p. 3124-3127, 2013. TÓTH, G.; GÁSPÁRI, Z.; JURKA, J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, v.10, p. 967-981, 2000. TUCKER, M. R.; ARAÚJO, A. C. G.;PAECH, N.; HECHT, V.;SCHMIDT, E. D. L.; ROSSEL, J-B.; VRIES, S. C.; KOLTUNOW,A. M. G. Sexual and apomictic reproduction in Hieracium subgenus Pilosella are closely interrelateddevelopmental pathways. Plant Cell, v.15, p. 1524-1537, 2003. VAN BAARLEN, P.; VAN DIJK, P. J.; HOEKSTRA, R. F.; JONG, J. H. Meioticrecombination in sexual diploid and apomictic triploid dandelions (Taraxacum officinaleL.).Genome, v. 43, p. 827–835, 2000. VARSHNEY, R. K.; GRANER, A.; SORRELLS, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trends in Biotechnology, v. 23, 2005. VARSHNEY, R.; SIGMUND, R.; BORNER, A.; KORZUN, V.; STEIN, N.; SORRELS, M. E.; LANGRIDGE, P.; GRANER, A. Interspecific transferability and comparative mapping of barley EST-SSR markers in wheat, rye and rice. Plant Science, v. 168, p.195–202, 2005. VICENTE, M. C.; GUZMÁN, F. A.; ENGELS, J.; RAO, V. R. Genetic characterization and its use in decision-making for the conservation of crop germplasm. The Role of Biotechnology, v.5, p. 121-128, 2005.
71
VIEGAS, M. P.; SILVA,C. L. S. P.; MOREIRA, J. P.; CARDIN,L. T.; AZEVEDO, V. C. R.; CIAMPI, A. Y.; FREITAS, M. L. M.; MORAES,M. L. T. E SEBBENN, A. M.Diversidade genética e tamanho efetivo de duas populações de myracrodruon urundeuva FR. ALL., sob conservação ex situ. Revista Árvore, v. 35, p. 769-779, 2011. VIEIRA, R. F.; AGOSTINI-COSTA, T. S.; SILVA, D. B.; FERREIA, F. R.; SANO, S. M. et al. Frutas nativas da região Centro-Oeste do Brasil. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006. 01-322 p. VILLARROEL, D.& PROENÇA, C. E. B.A new species and new records of Myrtaceae from the Noel Kempff Mercado National Park region of Bolivia.Kew Bulletin , v.68, p. 261-267, 2013. WAGNER, H. W.; SEFC, K. M. Identity 1.0. Vienna: Centre for Applied Genetics. University of Agricultural Sciences, 1999. WAITS, J.; LEBERG, P. Biases associated with population estimation using molecular tagging. Animal Conservation, v.3, p. 191–199, 2000. WANG, M. L.; BARKLEY, N. A.; JENKINS, T. M. Microsatellitemarkers in plants and insects.Part I. Applications ofbiotechnology.Genes Genomes Genomics, v.3, p. 54-67, 2009. WEBER, J. L. Informativeness of human (dC-dA)n. (dG-dT)n polymorphisms. Genomics, v. 7, p. 524-530, 1990. WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure.Evolution, v. 38, p. 1358–1370, 1984. WEIR, B. S. Genetic data analysis II: methods for discrete population genetic data. Sunderland, Massachussets: Sinauer Associates Inc, p. 192, 1996. WILDER, J.; HOLLOCHER, H. Mobile elements and the genesis of microsatellites in dipterans. Molecular Biology Evolution, v. 18, p. 384–392, 2001. WILLIAMS, J.G. K.; KUBLELIK, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphism’s amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, v. 18, p.6531-6535, 1990. WILSON, P. G.; O’ BRIEN, M. M.; HESLEWOOD, M. M. & QUINN, C. J. Relationship within Myrtaceae sensu lato based on a matk phylogeny.Plant Systematics and Evolution, v.251, p. 3-19, 2005. WRIGHT, S.The genetical structure of populations.Annual Eugenics, v.15, p. 323-354, 1951. YI, G.; LEE, J. M.; LEE, S.; CHOI, D.; KIM, B. D. Exploitation of pepper EST-SSRs and an SSR-based linkage map. Theoretical and Applied Genetics, v.114, p. 113–130, 2006.
72
ZABEAU, M. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Application, 1993. ZANE, L.; BARGELLONI, L.; PATARNELLO, T. Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology, v.11, p. 1–16, 2002. ZHU, Y.; STRASSMANN, J. E.; QUELLER, D. C. Insertions, substitutions, and the origin of microsatellites.Genetical Research, v. 76, p. 227–236, 2000. ZUCCHI, M. I.; BRONDANI, R. P. V.; PINHEIRO, J. B.; BRONDANI, C. & VENCOVSKY, R. Transferability of microsatellite markers from Eucalyptus spp. to Eugenia dysenterica (Myrtaceae family). Molecular EcologyNotes, v. 2, p. 512–513, 2002.
ANEXOS
ANEXO I
73
Mapa da ocorrência registrada para a espécieEugenia klotzschiana (Fonte: Google
Earth)
ANEXO II
Protocolo de extração de DNA a partir de tecido foliar
BRASIL
Goiás
74
Material biológico: Folhas Data da extração:
Espécie(s):Eugenia klotzschiana População: SAR; POF; SIL; ANA; POT; SCN; RIV - GO e CAN - MG.
1º passo - Preparar o banho Maria a 65ºC, e o tampão CTAB 2%. Adicionar o BME (2-
mercapto-etanol) na hora da extração. (2µL por 1mL de tampão).
2º passo - Utilizar tecido fresco (folhas), quantidade de tecido para macerar
aproximadamente 150mg. Usar tudo de 2ml.
3º passo - Adicionar rapidamente na amostra 700µl de Tampão CTAB 2%com BME e
colocar no macerador se for beads pequena tempo de maceração 2 minutos, se for beads
grande tempo de maceração 20 a 25 segundos. Ressuspenda o tecido no tampão
utilizando vórtex para homogeneizar.
4º passo - Incubar as amostras no Banho Maria a 65ºC por no mínimo 30 minutos,
máximo 1 hora. (Durante a incubação agite os tubos a cada 10 minutos para
homogeneizar). Após o término de 30 minutos, retirar os tubos do banho-maria, deixar
chegar à temperatura ambiente.
5º passo - Adicionar 600µl CIA (24:1) em cada amostra (cada tubo). Agite os tubos no
vórtex e depois inverta durante 5 minutos.
6º passo - Centrifugar as amostras a 14.000rpm por 5 minutos.
7º passo - Retirar o sobrenadante (fase superior)da amostra, transferir para o novo tubo
2ml.
8º passo - Adicionar 50µl CTAB 10%, agite no vórtex e inverta durante 5 minutos.
9º passo - Adicionar 600µl CIA (24:1) em cada amostra, agite os tubos no vórtex e
depois inverta durante 5 minutos.
10º passo - Centrifugar as amostras a 12.000rpm por 5 minutos.
75
11º passo - Retirar o sobrenadante (fase superior) e transferir para o novo tubo de
1,5ml.
12º passo - Adicionar 500µl de Isopropanol gelado (-20°C) em cada amostra e misture
levemente, leve os tubos ao freezer– 20°C por 1 a 2 horas (isso vai depender do tipo de
tecido a ser extraído).
13º passo - Centrifuga a 7.500rpm por 5 minutos.
14º passo - Descartar o sobrenadante (com muito cuidado para não perder o pellet).
15º passo - Lavar o pellet 2 vezes com 1000µl Etanol 70%. Deixar o pellet imerso por
10 minutos.
16º passo - Descartar o sobrenadante (com muito cuidado para não perder o pellet);
17º passo - Lavar o pellet1 veze com 1000µl Etanol 90%. Deixar o pellet imerso por 3
minutos.
18º passo - Descartar o sobrenadante (com muito cuidado para não perder o pellet).
19º passo - Secar o pellet utilizando o Concentrador Plus.
20ºpasso - Ressuspenda o pellet em 50µl de TE com RNAse. Observações: Pode deixar
no banho-maria por 37 ºC por 4 horas, ou deixar over-night na geladeira.
ANEXO III Protocolo de coloração com nitrato de prata (CRESTE et al., 2001)
Etapas Procedimentos Soluções Tempo
76
1ª Fixação Etanol 10%; ácido acético 1% 10'
Lavagem Água destilada deionizada 1'
2ª Pré-tratamento Ácido Nítrico 1,5% 3'
Lavagem Água destilada deionizada 1'
3ª Coloração 0,2% AgNO3 20'
Lavagem Água destilada deionizada 30''
Lavagem Água destilada deionizada 30''
4ª Revelação 500ml de formaldeído 15-20' 5ª Bloqueio Ácido acético 5' Lavagem Água destilada deionizada 1'
1ª etapa – O gel é submerso em uma solução de fixação por 10 minutos, em seguida é
lavado com água destilada por 1 minuto.
2ª etapa – O gel é submerso em uma solução de pré-tratamento por 3 minutos, e
novamente é lavado com água destilada por 1 minuto.
3ª etapa – O gel passa por um processo de coloração com Nitrato de Prata por 20
minutos, e logo a seguir passa por duas lavagens de 30 segundos cada.
4ª etapa – O próximo passo é revelar o gel, processo que demora de 15 a 20 minutos. A
solução de revelação deve ser acrescentada na hora de utilizar (resfriada a 12ºC) e
manter sob lenta agitação.
5ª etapa – E por fim o gel passa por uma solução de bloqueio e lavagem. Depois dessa
etapa o gel é colocado na vertical para secar e posteriormente ser analisado.
OBS: Cada etapa deve ser em um recipiente (bacia) diferente para que não ocorra
contaminação, o que pode interferir na revelação do gel. As bacias devem ser lavadas
cuidadosamente somente com água, a não ser pela bacia de revelação que ao final deve
ser lavada com água sanitária e em seguida com água até estar totalmente limpa (lavar
pelo menos 7 vezes com água).
77
APÊNDICE I Relação das temperaturas de anelamento testadas nos 120 pares de primers otimizados para a espécie Eugenia klotzschiana
Primers Temperaturas de Anelamento Testadas
Resultado 48°C 50°C 51°C 52ºC 54°C 55°C 56°C 57ºC 58°C 60°C 62°C
EMBRA 12 / TN / TN OK / / / / / / OTIMIZADO
EMBRA 13 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 14 / x / x TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 15 / x x TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 16 / x / x TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 809 / x TN TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 813 / x / x x / x / / / / N.A. na agarose
EMBRA 835 / x / x x / x / / / / N.A. na agarose
EMBRA 850 / x / x x / x / / / / N.A. na agarose
EMBRA 870 / x x x x / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 878 / x / x x / x / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 904 / TN / TN x / x / x / / N.A. na acrilamida
EMBRA 914 / x / x x / x / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 915 / TN / x x / x / x / / N.A. na acrilamida
EMBRA 925 / x / x x / x / TN / / N.A. na acrilamida
EMBRA 928 / x TN x x / x / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 941 / x / TN TN / TN / / / / N.A. na agarose
EMBRA 943 / TN TN TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 954 / x / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 975 / TN / TN TN / TN / TN / / N.A. na acrilamida
EMBRA 979 / / / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 949 / TN / x TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1007 / x / x x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1008 x x / x TN / / / / / / N.A. na acrilamida
TN:temperatura testada (primer com bandas inespecíficas); x:Temperatura testada que não apresentou amplificação do primer (sem bandas no gel); /: temperatura não utilizada nos testes; OK:Temperatura ideal de amplificação do primer (primer otimizado); N.A: não amplificou
78
Primers Temperaturas de Anelamento Testadas
Resultado 48°C 50°C 51°C 52ºC 54°C 55°C 56°C 57ºC 58°C 60°C 62°C
EMBRA1039 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1040 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1041 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1056 / TN TN x TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1057 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1071 / x / / x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1076 / x / / x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1081 / x / / x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1122 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1135 / TN / x TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA1139 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1142 / x / / x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1144 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1193 / TN TN TN x / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1211 / x / / x / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1213 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1284 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1307 / TN / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1310 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1314 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1316 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1319 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1320 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1326 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1332 / x / x TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1333 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
TN:temperatura testada (primer com bandas inespecíficas); x:Temperatura testada que não apresentou amplificação do primer (sem bandas no gel); /: temperatura não utilizada nos testes; OK:Temperatura ideal de amplificação do primer (primer otimizado); N.A: não amplificou
79
TN:temperatura testada (primer com bandas inespecíficas); x:Temperatura testada que não apresentou amplificação do primer (sem bandas no gel); /: temperatura não utilizada nos testes; OK:Temperatura ideal de amplificação do primer (primer otimizado); N.A: não amplificou
Primers Temperaturas de Anelamento Testadas
Resultado 48°C 50°C 51°C 52ºC 54°C 55°C 56°C 57ºC 58°C 60°C 62°C
EMBRA 1335 / OK / TN / / / / / / / OTIMIZADO
EMBRA 1341 / OK / TN / / / / / / / OTIMIZADO
EMBRA 1346 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1362 / TN / TN TN / OK TN / / / OTIMIZADO
EMBRA 1363 / / / TN TN OK / / / / / OTIMIZADO
EMBRA 1364 / TN / TN / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1374 / TN / TN TN / x / TN / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1382 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1390 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1398 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1427 / TN / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1428 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1441 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1445 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1450 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1451 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1456 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1463 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1468 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1469 / TN TN TN / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1470 / TN / TN / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1488 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA1492 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1494 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1499 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
80
N:temperatura testada (primer com bandas inespecíficas); x:Temperatura testada que não apresentou amplificação do primer (sem bandas no gel); /: temperatura não utilizada nos testes; OK:Temperatura ideal de amplificação do primer (primer otimizado); N.A: não amplificou
Primers Temperaturas de Anelamento Testadas
Resultado 48°C 50°C 51°C 52ºC 54°C 55°C 56°C 57ºC 58°C 60°C 62°C
EMBRA 1507 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1532 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1551 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1578 / TN / / TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1582 / TN / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1584 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1616 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1625 / TN / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1627 / TN / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1639 / TN / TN TN TN OK TN / / / OTIMIZADO
EMBRA 1643 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1656 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1661 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1722 / TN TN TN / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1752 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1753 / TN TN TN OK / / / / / / OTIMIZADO
EMBRA 1757 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1761 / x / TN TN / TN / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1798 / TN / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1800 / TN / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1805 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1810 / TN / TN / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1811 / / / TN TN / TN TN / TN OK OTIMIZADO
EMBRA 1812 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1825 / TN / x / / / / / / / N.A. na agarose
81
Primers Temperaturas de Anelamento Testadas
Resultado 48°C 50°C 51°C 52ºC 54°C 55°C 56°C 57ºC 58°C 60°C 62°C
EMBRA 1829 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1845 / TN / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1851 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1868 / / / TN TN / TN / / TN OK OTIMIZADO
EMBRA 1875 / x / / / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1924 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1928 / x / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1934 / TN / x / / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1939 / TN / / TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 1944 / TN / TN x / TN / TN / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1945 / TN / TN TN / TN TN / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1960 / TN TN TN TN / TN / OK / / OTIMIZADO
EMBRA 1969 / TN / / TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA1977 / x / x / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1990 / TN / x x / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 1993 / TN / / / / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 2000 / TN / / TN / / / / / / N.A. na agarose
EMBRA 2002 / TN / TN TN TN OK / / / / OTIMIZADO
EMBRA2011 / TN / TN TN / / / / / / N.A. na acrilamida
EMBRA 2014 / TN / TN / / / / / / / N.A. na acrilamida
TN:temperatura testada (primer com bandas inespecíficas); x:Temperatura testada que não apresentou amplificação do primer (sem bandas no gel); /: temperatura não utilizada nos testes; OK:Temperatura ideal de amplificação do primer (primer otimizado); N.A: não amplificou
