MARKERI TUMORALI. RECOMANDARI PRIVIND UTILIZAREA LOR IN PRACTICA CLINICALector Dr. Chim. ADINA STANCIU Formator Acreditat de Ministerul Sanatatiiadinaelenastanciu@yahoo.com

Ce i propune cursul !1. 2.

Notiuni generale despre markerii tumorali Clasificare markeri tumorali. Semnificatia clinica a markerilor: CEA AFP, CA 19-9, CA 72-4, CA 125, PSA / fPSA, CA 15-3, TPA, CYFRA 21-1, SCC, NSE, TK, TG, B2M, S-100, TA-90, Feritina, HCG, Calcitonina etc. Determinarea markerilor tumorali Recomandari privind utilizarea markerilor tumorali de prima linie in diverse neoplazii Evaluarea clinica a markerilor tumorali

3. 4. 5.

ANTIGENE TUMORALETSA-Tissue Specific Ag - Antigene care aparin doar celulelor tumorale TAA-Tissue Associated Ag - Antigene care aparin i celulelor normale Antigenele retrogenetice: sunt exprimate numai pe suprafaa celulelor embrionare: antigene oncofetale (-fetoproteina - AFP i antigenul carcinoembrionar CEA) Antigenele de difereniere: apar numai ntr-o faz determinat a maturaiei unor serii celulare (elementele imature din leucemii).

ANTIGENE TUMORALE IDENTIFICATE PN ACUMANTIGENE TUMORALE Antigene virale:HPV E6 i E7 EBNA-1 Antigene de hepatit B i C HTLA-1

NEOPLAZIACol uterin Limfom Hodgkin/Burkitt Hepatom Leucemie/limfom T

Antigene proteice nemutate:MAGE-1, -3* BAGE GAGE RAGE LAGE-1 Tirozinaz* TRP-1/gp75 (tyrosinase related protein), TRP-2, gp100*, MELAN-A / MART-1 GAG-3 / NY-ESO-1 CEA PAP, PSA, PSMA HER-2 / neu SCP-1 (synaptonemal complex protein) / HOM-TES-14

Melanom, cancer pulmonar, mamar, cap i gt Melanom, cancer vezical Melanom, cc. pulmonar, mamar, cap i gt, sarcom Cancer renal i alte cancere Melanom Melanom Melanom Cancer esofagian, vezical, pulmonar etc Cancere gastro-intestinale, pulmonare, mamare Cancer de prostat Cancer mamar, ovarian etc Cancer testicular, mamar, ovarian, gliom etc

ANTIGENE TUMORALE IDENTIFICATE PN ACUMANTIGENE TUMORALE Autoantigene mutate:MUM-1 (melanoma-ubiquitous mutated) -catenina ESO-1 TPI* (triosephosfate isomerase) CDC 27* (MHC II) CDK4 (Cyclin-dependent kinase) CASP-8 (caspase-8) p21 ras p53

NEOPLAZIAMelanom Melanom, cancer de colon Cancere de cap i gt, tumori scuamoase Melanom Melanom, adenocarcinoame Tumori scuamoase Adenocarcinoame Adenocarcinoame

Proteine anormal glicozilate:MUC-1 M-TAA U-TAA

Cancere de pancreas, mamare Melanom Melanom

Proteine de fuziune:Bcr-abl (p120) Pax3-fkhr Ews-fli-1 LDFP (Low density-lipid receptor fusion protein)*

Leucemie cronic mieloid Rabdomiosarcom alveolar Sarcom Ewing Melanom

Glicolipide:De grup sangvin (T, Tn, siali-Tn) Ganglioside (GM2, GD2, GD3)

Carcinoame Melanom, sarcom, neuroblastom, gliobalstom

1. NOIUNI GENERALE DESPRE MARKERII TUMORALImarkerii tumorali apar ca urmare a alterrii metabolismului celular; markerii tumorali sunt substane, care reflect sinteza, creterea i rspunsul la terapie a tumorilor maligne, fiind produi fie de celulele tumorale, fie de celulele gazd stimulate de tumora; markerii tumorali sunt produi asociai tumorilor (factori genetici, oncogene, proteine, etc.).

MARKERI TUMORALI - ISTORICa) b)

1846 - proteina Bence Jones a fost descris ca marker pentru mielomul multiplu 1930 - gonadotropina chorionic (hCG) a devenit un test standard, iniial n diagnosticul i apoi n monitorizarea choriocarcinomului 1963 - AFP a fost identificat ca marker pentru carcinomul hepatoceluar (Tatarinov) 1965 - CEA a fost identificat ca antigen oncofetal i exploatat clinic (Gold i Freedman). din 1975 tehnica anticorpilor monoclonali este folosit pentru a descoperi noi markeri tumorali (Kohler si Milstein)

c) d) e)

CARACTERISTICILE MARKERULUI TUMORAL IDEALspecificitate ct mai apropiat de 100 % (s nu fie detectabil n tumori benigne sau n alte afeciuni organice); specificitate de organ foarte mare (s fie secretat de o singur entitate tumoral); sensibilitate ct mai apropiat de 100 % (s poat fi detectat la o cantitate foarte mic de celule tumorale).

2. CLASIFICARE MARKERI TUMORALIDup localizarea lor: Markeri tumorali celulari: sunt detectati n esutul tumoral (p53, receptori hormonali etc.) Markeri tumorali umorali: sunt detectai n lichidele biologice (ser, plasm, LCR, urin, saliv, lichid de ascit, lavaj bronhoalveolar etc.)

CLASIFICARE MARKERI TUMORALI2.1 Peptide non-hormonale: CEA, AFP, CA19-9, CA 72-4,CA125, CA15-3, PSA, TPA, BTA etc. (NSE),Timidin Kinaza (TK), Fosfataza Acida etc.

2.2 Enzime i izoenzime: Enolaza Neuron Specifica 2.3 Proteine serice speciale: Tiroglobulina (TG), Beta-2-

microglobulina (B2M), Proteina S-100, Proteina TA-90, Feritina etc.

2.4. Produi hormonali ai sistemului endocrin difuz - hormoni eutopici (paratiroide PTH, cancer tiroidian medular calcitonina, gastrinom gastrina, feocromocitom catecolaminele, insulinom insulina, choriocarcinom HCG etc.). hormoni ectopici (APUD-oame: cancer bronsic cu celule mici - ACTH, carcinoid - LPH etc. si Non APUD-oame: cancer mamar - HCG, PTH, ACTH etc.)

2.5 Produi hormonali ai tumorilor non-endocrine

2.1 PEPTIDE NON-HORMONALE 2.1.1 Antigenul carcino-embrionar (CEA)Este o glicoprotein cu o greutate molecular de 180 kD. 45-60% din molecul este alctuit din carbohidrai, iar partea proteic este un lan polipeptidic. Au fost descrii cel puin 6 epitopi. n timpul dezvoltrii embrionului se formeaz n pancreas i n tractul gastrointestinal ca un antigen de suprafa celular. Chiar i la adult, sinteza nu nceteaz complet Timpul de njumtire: 1-2 sptmni Interval de referin: 0-5 ng/mL (Fumtori < 10 ng/mL) urinar este exclus) poate indica un carcinom al vezicii urinare !!! S-a observat c tumorile colonului, prostatei i rinichilor sunt nsoite de valori crescute ale CEA numai dup invadarea tractului urinar !!! Valori crescute ale CEA n LCR apar n primul rnd n metastaze cerebrale !!!

In urin, concentraii de peste 35 ng/mL (dac infecia

Sensibilitatea CEA n tumorile primareTumori primare Carcinom colorectal pre-operator Carcinom colorectal post-operator Cancer mamar pre-operator Cancer mamar post-operator Carcinom pulmonar cu celule mici Carcinom pulmonar altul dect cel cu celule mici Cancer cap, gt Carcinom pancreatic Carcinom ovarian Sensibilitate [%] 10-50 75-85 10-40 75-85 20-60 70-80 60-70 30-40 20-30

Limite si interferenteCEA nu poate fi folosit in scop de screening. Cresteri usoare sau moderate (rar peste 10 ng/mL) sunt intalnite la fumatori si in unele afectiuni benigne ale intestinului (colita ulceroasa, boala Crohn, polipoze), pancreasului (pancreatite), ficatului (ciroza hepatica, hepatita cronica), rinichilor (insuficienta renala), plamanilor (emfizem pulmonar) si glandelor mamare. Pot exista interferente cu unele componente ale kit-ului: - tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare; - titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu; - anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic.

2.1.2 Alfa-fetoproteina (AFP)Este o glicoprotein cu masa molecular 70 kD, sinteza ei fiind suprimat la adult. n cursul vieii intrauterine se formeaz n sacul vitelin, iar mai trziu n ficat. n ficatul ftului sinteza maxim are loc n sptmnile 14-20. n serul mamei concentraia maxim este atins n sptmnile 35-38 de sarcin. - Screening-ul prenatal pentru depistarea afectiunilor de tip anencefalie, spina bifida, boala Langdon Down, trisomie 21, trisomie 18 etc. presupune recoltarea serului matern intre saptamanile 16-18 de sarcina. Daca se obtine o valoare crescuta pentru AFP, determinarea se va repeta dupa 1 saptamana.

ser fetal : lichid amniotic : ser matern = 10.000 : 100 : 1Postnatal sinteza de AFP este minim.

Interval de referin: < 5 ng/mL (ELISA) < 7 ng/mL (ECLIA) < 6 ng/mL (CLIA) Limita de detectie 0.2 U/mL (0.24 ng/mL) Factor de conversie: U/mL x 1.21 = ng/mL; ng/mL x 0.83 =U/mL Timpul de njumtire: 5 zile Stabilitate ser: - 7 zile la 2-8C; - timp indelungat la -20C sau la -70C. AFP este un marker de mas tumoral, nivelul seric crescnd cu mrimea tumorii.

2.1.3 Antigenul gastro-intestinal

(CA 19-9)

CA 19-9 este un gangliozid (glicolipid). IMPORTANT! Apare numai la persoanele cu antigenele de grup sanguin Lewis prezente Persoanele cu grup sanguin relativ rar negativ pentru antigenele Lewis (3-5% din populaie) nu dispun de enzima sialyl-transferaza necesar pentru sinteza CA 19-9. La aceste persoane CA 19-9 rmne la valori foarte sczute, chiar dac este prezent o neoplazie. Pentru astfel de persoane markerul tumoral indicat: CA 50 sau CA 242.

CA 19-9 este prezent n celule epiteliale i mucoase din: pancreas, ci biliare, colon, stomac, ficat etc. Dei, a fost descoperit ca marker pentru cancerul colorectal, CA 19-9 este markerul de prim linie n carcinomul pancreatic Indicatii absolute: diagnosticul si monitorizarea adenocarcinomului pancreatic, gastric si a tumorilor hepatobiliare; Indicatii relative: diagnosticul si monitorizarea cancerului colorectal (al doilea marker dupa CEA) si ovarian (al doilea marker dupa CA 125). CA 19-9 nu poate fi utilizat pentru screening-ul carcinomului pancreatic.

Interval de referin: < 37 U/mL (ELISA) < 27 U/mL (ECLIA) Interval de grani: 30 65 U/mL Valori > 65 U/mL (probabilitatea ca boala s fie de natur malign este de 95%) - CA 19-9 se poate pozitiva si in afectiuni benigne (37-65 U/mL), in special boli inflamatorii ale intestinului, ciroza, dar si in boli autoimune: poliartrita reumatoida (33%), lupus eritematos sistemic (32%) si sclerodermie (33%). Timp de njumtire: 4 6 zile Stabilitate proba - serul separat este stabil: 30 zile la 2-8C; trei luni la -20C sau la -70C;

2.1.4 Antigenul gastric (CA 72-4)CA 72-4 este un marker, care a fost identificat cu doi anticorpi monoclonali (CC49, B72.3). Este o glicoprotein cu masa molecular de 400 kD. Este considerat a fi o molecula asemanatoare mucinei. Este prezent n: stomac, ovare, celule epiteliale pulmonare. Dei, CA 72-4 a fost destinat monitorizrii cancerului ovarian, se pare c rezultatele au fost mai bune pentru cancere ale tractului digestiv, n special pentru cel de stomac. Indicatii absolute: marker de prima linie in monitorizarea tratamentului si evolutiei bolii in cancerul pancreatic, gastric (sensibilitate = 85%) si a tumorilor hepatobiliare (in asociere cu CEA sau CA 19-9 ca markeri secundari). Indicatii relative: - in tumorile ovariene mucinoase: sensibilitate de 82%, - in cancerele pulmonare (altele decat cele cu celule mici) sensibilitatea este de 75%.

Exist o foarte bun corelaie ntre CA 72-4 i stadiul bolii. CA 72-4 poate fi folosit pentru monitorizarea carcinomului gastric postoperator pentru c indic recidiva bolii. Interval de referin: < 8 U/mL (ELISA) < 6.9 U/mL (ECLIA)

Timp de njumtire: 4 6 zile Limita de detectie 0.2 U/mL CA 72-4 se poate pozitiva in afectiuni benigne mamare sau hepatice si in sarcina. Stabilitate ser: - 30 zile la 2-8C; - timp indelungat la -20C sau la -70C

2.1.5 Antigenul ovarian (CA 125)CA 125 este o glicoprotein cu masa molecular de 220 kD. CA 125 a fost identificat cu un anticorp monoclonal. CA 125 II de a doua generaie a fost identificat cu un alt anticorp (M II), care a crescut semnificativ specificitatea acestui marker (specificitate 95%). Este prezent n epiteliul urmtoarelor organe: ovar, pancreas, vezic biliar, stomac, rinichi, colon etc. CA 125 se gsete n cantiti mari n lichidul amniotic, laptele i serul femeilor nsrcinate. Interval de referin: < 37U/mL (ELISA) < 35 U/mL (ECLIA)

Interval de grani: 35 65 U/mL (fibroame uterine, endometrite etc.) Cresteri usoare ale CA 125 se pot intalni in timpul menstruatiei, primul trimestru de sarcina, diferite afectiuni benigne ale sferei genitale (endometrioza, fibromatoza, boli inflamatorii pelvine), dar si in alte afectiuni benigne non-ginecologice (pancreatita acuta sau cronica, hepatita, ciroza, insuficienta renala, boli autoimune etc.)

Timpul de njumtire: 2 6 zile Limita de detectie 0.6 U/mL Stabilitate ser: - 5 zile la 2-8C; - 3 luni la -20C. Indicatii absolute: - monitorizarea carcinoamelor ovariene epiteliale seroase i nedifereniate (cel mai comun tip de cancer ovarian). Sensibilitatea n stadiile I i II = 65%; Sensibilitatea n stadiile III i IV = 85%. n cazul tumorilor mucinoase, care reprezint 10% din carcinoamele ovariene, sensibilitatea este mai mic. Indicatii relative: - suspiciune de adencarcinom pancreatic CA 125 nu poate fi utilizat pentru screening-ul cancerului ovarian in populatia generala, datorita lipsei sale de sensibilitate pentru stadiul precoce al bolii.

2.1.6 Antigenul mamar (CA 15-3)CA 15-3 este o glicoprotein de tip mucinos cu masa molecular de 300 - 400 kD. CA 15-3 de ultim generaie a fost identificat cu 2 anticorpi monoclonali diferii: 115D8 i DF3. Anticorpul 115D8 a fost obinut prin imunizare cu lipide din laptele uman, iar anticorpul DF3 prin imunizare cu membrana celulelor de carcinom mamar. CA 15-3 este o glicoproteina transmembranara a carei sinteza este codificata de gena MUC1. Principala utilitate a determinarii acestui marker este monitorizarea tratamentului si a evolutiei bolii in cancerul mamar. CA 15-3 este prezent n celulele epiteliale secretorii i n secreii. 25mg /24 ore (atenie la recoltarea Urinei: paracetamol, banane, alune - 5 HO-Indol).

2.4.1Human Chorionic Gonadotropin - hCG

Este un hormon GP heterodimeric (cu dou subuniti: a i ) produs n mod normal de ctre trofoblatii placentari; este detectabil dup aprox 1 sptmn de la nidare i crete exponenial (dublndu-i concentraia la 1,5-2,5 zile).

Determinarea hCG este utilizat de obicei pentru confirmarea sarcinii i evaluarea tumorilor trofoblastice.

A fost introdus n screening-ul matern (Triplu test: HCG + AFP + E3 neconjugat) valori crescute - risc crescut de sindrom Down, Eduards

Valori normale: la brbai la femei la femei n menopauz

< 1 U/L < 5 U/L < 10 U/L.

Valori crescute: Identificarea n afara sarcinii este caracteristic tumorilor trofoblastice, n particular choriocarcinomului i tumorilor cu celule germinale ale testiculului (seminoame) i ovarului, rareori n carcinoame mamare, pulmonare, adenocarcinomul gastric i pancreatic (uneori nsoite de ginecomastie). Exist o corelaie destul de bun ntre nivelul acestui marker i masa tumoral, determinarea putnd fi utilizat pentru a monitoriza rspunsul la tratament i eventualele recderi. Determinarea este util i pentru screening-ul femeilor cu mol hidatiform, n sensul depistrii transformrii acesteia n choriocarcinom.

2.4.2 CALCITONINACalcitonina este secretat de celulele parafoliculare C ale tiroidei. Efectul principal este de scdere a calciului seric, prin inhibarea resorbiei osoase i stimularea eliminrii urinare a calciului. Creterea concentraiei serice a calcitoninei apare n sindroamele mieloproliferative. Una dintre cele mai importante proliferri maligne nsoite de sinteza exagerat de calcitonin este carcinomul medular tiroidian. CALCITONINA = markerul de prima linie in screeningul Carcinomului Medular

MARKERI GENETICIONCOGENELE sunt gene care atunci cnd sunt exprimate anormal de intens sau cnd sufer mutaii, contribuie la transformarea unei celule normale ntr-o celul canceroas (angajat n mitoz necontrolata) GENE SUPRESOARE TUMORALE - inhib sau frneaz creterea celular i ciclul celular, prevenind dezvoltarea tumorilor

ROLUL MARKERILOR TUMORALI IN ONCOLOGIEscreening stabilirea diagnosticului valoare prognostic monitorizarea tratamentului valoare predictiv indice de supraveghere

PROBLEMA!!Markerii tumorali nu au valoare absoluta!

3. DETERMINAREA MARKERILOR TUMORALI3.1 Recoltarea si StocareaRecoltarea i stocarea corect a materialelor biologice este esenial pentru ca rezultatele analizelor s fie corecte. Se poate lucra pe ser, plasma, lichid cefalorahidian (LCR), urin, saliv etc. a. Ser Recoltarea se face dimineaa pe nemncate Sngele se recolteaz ca atare, fr aditivi Se recolteaz 10 ml de snge din venele cubitale. Trebuie evitat aplicarea prelungit a garoului nainte de recoltarea sngelui Sngele poate fi stocat nainte de centrifugare la temperatura camerei 1-2 ore, dac este vorba despre markeri tumorali utilizai ca analize curente. Pentru teste mai speciale sngele va fi centrifugat la 30 minute dup recoltare Sngele coagulat trebuie centrifugat la 1000 x g timp de 15 minute Serul trebuie transferat n 2-3 criotuburi, care obligatoriu vor avea dop. n ser nu trebuie s rmn hematii Serul poate fi pstrat la frigider (4C) timp de 4-5 zile (pentru analize curente) sau la temperaturi -20C, timp nelimitat

b. Plasm Recoltarea se face dimineaa pe nemncate Sngele se recolteaz folosind un anticoagulant ca citrat, EDTA sau heparin Se recolteaz 10 ml de snge din venele cubitale Sngele trebuie centrifugat la 1000 x g timp de 15 minute Plasma trebuie transferat n 2-3 criotuburi Plasma poate fi pstrat la frigider (4C) timp de 4-5 zile sau la temperaturi -20C c. Urina Recoltarea se face dimineaa ntr-un vas steril respectndu-se condiiile de la urocultur. Se efectueaz, n prealabil, o toaletare a organelor genitale exterioare cu ap i spun. Prelevarea se efectueaz din jetul mijlociu, direct ntr-un vas steril cu gtul larg (volumul necesar unei examinri uzuale este de 10-15 ml). Dozarea biomarkerilor se va efectua numai din urin steril pentru a nltura eventualele interferene care ar putea aprea (prezena germenilor patogeni n urin influeneaz calitatea dozrii markerilor tumorali, conducnd la valori fals pozitive) Urina, astfel recoltat, trebuie centrifugat la 1000 x g timp de 15 minute Urina poate fi pstrat la frigider (4C) timp de 7 zile (?) sau la temperaturi -20C timp nelimitat. Pentru determinarea markerilor tumorali, probele de ser, plasm, urin etc. sunt decongelate la temperate camerei (1-2 h mai puin la urin) i omogenizate. Proba odat decongelat nu mai poate fi recongelat. De aceea, este necesar fracionarea probei n 2-3 eantioane, care vor fi congelate. Dup decongelare, proba poate fi stocat 4-5 zile la frigider (4C). Important! Analizele nu pot fi efectuate din probe biologice cu hemoliz i/sau lipemie

3.2 Metode de AnalizaPentru determinarea markerilor tumorali sunt folosite metode radioimunochimice, imunochimice i cromatografice. Metodele de analiza a markerilor tumorali trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: specificitate; sensibilitate; reproductibilitate; variatia in timpul determinarii: < 5%; variatia intre determinari: < 10%. Principiul acestor metode - reacia antigen-anticorp (Ag-Ac). Cantitatea de complexe imune poate fi determinata daca Ac sau Ag din complex este marcat cu o substanta care emite un semnal, ce urmeaza a fi masurat. Substanta folosita pentru marcare trebuie sa indeplineasca conditiile: sa emita un semnal stabil, usor de masurat; sa lege atat molecule mari, cat si mici; sa nu modifice in nici un fel legatura Ag-Ac In prezent, metodele radioimunochimice (RIA) folosesc pentru marcare izotopii radioactivi 125I, iar metodele imunochimice folosesc enzime (EIA), substante fluorescente (FIA), substante luminescente (LIA)

MetodaRIA: competitie intre Ag ce se dozeaza si Ag marcat, pentru legare la acelasi anticorp specific.

MarkerIzotopi radioactivi:125 I, 131 I, 3 H

AvantajeSensibilitate: mare Specificitate: mare Pret/kit: mic Sistem: deschis

DezavantajeTimp de viata: scurt Produs: radioactiv Deseuri: radioactive Costuri analizor (gammacounter): mari Conditii de lucru: speciale (autorizatie CNCAN) Timp de viata: scurt Produs: radioactiv Deseuri: radioactive Costuri analizor (gammacounter): mari Conditii de lucru: speciale( autorizatie CNCAN)

IRMA: in general metoda in faza solida tip sandwich; primul anticorp este fixat pe o faza solida (bila, tub,etc.), dupa incubarea cu proba de dozat, se adauga un exces de anticorp marcat.

Izotopi radioactivi:125 I, 131 I, 3 H

Sensibilitate: mare Specificitate: mare Pret/kit: mic Sistem: deschis

RIA

MetodaENZIMATICA EIA : competitie intre Ag ce se dozeaza si Ag marcat enzimatic pentru legare pe acelasi anticorp specific

MarkerEnzima: (cromogen) : Fosfataza alkalina Peroxidaza Glucoza oxidaza Substrat: PNPP, H2 O2

AvantajeTimp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Costuri pt.analizor ( fotometru): mici Conditii de lucru: obisnuite Sistem: deschis/inchis Pret/test: mic/mediu

DezavantajeSensibilitate: medie Specificitate: medie Pret/kit: mediu/mare

IEMA: metoda in faza solida tip sandwich; primul anticorp este fixat pe o faza solida (bila, tub,godeu), dupa incubarea cu proba de dozat, se adauga un exces de anticorp marcat

Enzima: (cromogen) : Fosfataza alkalina Peroxidaza Glucoza oxidaza Substrat: PNPP, H2 O2,

Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Costuri pt.analizor ( fotometru): mici Conditii de lucru: obisnuite Sistem: deschis/inchis Pret/test: mic/mediu

Sensibilitate: medie Specificitate: medie Pret/kit: mediu/mare

ELISAAgELISA indirecta

Imbracare placi

AcELISA directa ELISA competitiva

Proba

Proba

Proba+Ag

Ac sec. - E

Ac sec. - E

Ac sec. - E

Substrat

Detectie si Analiza

Metoda

Marker

Avantaje

DezavantajeCosturi pt.cititor probe (fluorimetru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis Costuri pt.cititor probe (luminometru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis Costuri pt.cititor probe (luminometru) si accesorii: mari Pret/kit: mediu/mare Sistem: inchis

LUMINISCENTE Isotiocianat de Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Fluorescente (FIA) fluoresceina Fosforescente (PhIA) (492nm/520 nm) Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: Isotiocianat de obisnuite in orice laborator clinic rhodamina (550nm/585nm) Sensibilitate: medie CHEMILUNISCENTE luminol, isoluminol Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: obisnuite in orice laborator clinic Sensibilitate: mare Specificitate:mare Timp de viata: lung Produs: neradioactiv Deseuri: neradioactive Conditii de lucru: obisnuite in orice laborator clinic Sensibilitate: mare Specificitate:mare

BIOLUMINISCENTA

luciferinluciferaza

3.3 ASIGURAREA CALITATII- organizare - personal - infrastructura Implementarea msurilor AC conduce la: - un management optim al laboratorului; - mbuntairea eficienei activitilor; - minimizarea erorilor; - stimularea i motivarea personalului; - creterea cotatiei laboratorului.

un set complet de proceduri aplicate in cadrul laboratorului pentru monitorizarea continu a operaiilor i rezultatelor, n vederea stabilirii dac rezultatele sunt suficient de sigure pentru a fi luate n considerare CC se desfoar pe trei nivele: 1. primul nivel de control (control intern) realizat de analist 2. al doilea nivel de control (control intern) realizat de Responsabilul cu calitatea / eful de laborator 3. al treilea nivel de control (control extern) scheme de comparare interlaboratoare

CONTROLUL CALITATII (CC):

CONCEPTUL DE MANAGEMENT AL CALITIIORGANIZARE ORGANIZARE

VERIFICRI VERIFICRI INTERNE INTERNE

ACINFRASTRUCTUR INFRASTRUCTUR

TESTE TESTE INTERINTERLABORATOARE LABORATOARE PERSONAL PERSONAL

CCTESTE DE TESTE DE PERFORMAN PERFORMAN

Fiecare laborator trebuie sa aiba propriul MANUAL al CALITATII: Proceduri specifice de analiza - curbe de etalonare - verificari interne (controale interne de calitate) - scheme de control interlaboratore (controale externe de calitate) etc.

CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori)Factori legati de proba de analizatColectarea, transportul, prelucrarea primara si inregistrarea probelor Recoltarea i stocarea corect a materialelor biologice este esenial pentru ca rezultatele analizelor s fie corecte. Se poate lucra pe ser, plasma, lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, fluid pleural, urin, saliv etc. Timpul de la recoltarea probei proba trebuie prelucrata in cel mult 1-2 ore Hemoliza - gradul de hemoliza va fi specificat in raportul de analiza Lipemia - pentru serurile lactescente determinarile se efectueaza utilizand uneori dilutia cu diluentul din trusa (1:10) prelucrarea primara a probelor efectuarea corecta a dilutiilor A nu se uita de calibrarea periodica a micropipetelor!!! Probele intens hemolizate - NU se lucreaza!!!

CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori)Factori legati de proba de analizat - INTERFERENTE

1. Factori care pot cauza rezultate fals pozitive:boli benigne, in primul rand boli inflamatorii degenerative; boli virale (virus herpetic) (Timidin Kinaza etc.) boli hepatice (AFP, CEA, CA 19-9, TPA, TPS etc.) boli renale (2-mg, calcitonina, CEA, PSA, BTA etc.) tratamente (chimio-terapie, radio-terapie, necroza tumorala, interventii chirurgicale etc.); sarcina (AFP, CA 125, HCG etc.); menstruatia (CA 125 etc.); starea gripala; medicamente (calcitonina, catecolamine, TSH, T4, anticorpi monoclonali proveniti de la soarece, biotina > 5mg/zi etc.)

CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori)Factori legati de proba de analizat - INTERFERENTE

2.Factori care pot cauza rezultate fals negative:viteza crescuta de metabolizare. se formeaza complexe imune cu anticorpi circulanti; numar scazut de celule maligne; markerul tumoral ramane in celula sau pe suprafata celulei (tumora incapsulata); sinteza de biomarker este blocata; vascularizarea slaba a tesutului tumoral markerul tumoral nu ajunge in circulatia sanguina; CA 19-9 apare numai la persoanele cu antigenele de grup sanguin Lewis prezente - persoanele cu antigen Lewis negativ, nu dispun de enzima sialyl-transferaza necesar pentru sinteza de CA 199 (se recomand CA 50 sau CA 242) etc.

CAUZE ALE ERORILOR FAZA PRE-ANALITICA (68% din erori) Factori legati de reactivireceptia si evidenta corecta a reactivilor (reactivii expirati se indeparteaza conform procedurii privind managementul deseurilor) respectarea conditiilor impuse de producator privind conditiile de depozitare (temperatura, lumina, umiditate) pentru a nu afecta stabilitatea si proprietatile chimice reconstituirea si portionarea (cand este cazul) a standardelor si a controalelor, conform indicatiilor din interiorul kit-ului

ATENTIE! Esantioanele de IQC reconstituite se utilizeaza o singura data dupa decongelare si NU se recongeleaza

CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori)Factori legati de materialele de referinta rularea controalelor pe minimum 2 nivele: normal si patologic frecventa rularii controalelor interne: interserie (la inceputul fiecarei serii analitice) sau intraserie (evitarea erorilor aleatorii)

CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori)Calibrarea se efectueaza : la introducerea unei metode noi de determinare a unui analit la schimbarea lotului de reactivi dupa interventia service-ului la echipament cand rezultatele IQC incalca regulile Westgard dupa inlocuirea alicotelor din materialele de control

CAUZE ALE ERORILOR FAZA ANALITICA (13% din erori)verificarea functionarii la parametrii ceruti a sistemului automat de analiza respectarea conditiilor de incubare, agitare si spalare in timpul procedurii de lucru (verificarea temperaturii, a capilarelor spalatorului, a vitezei de rotatie) in cazul sistemelor semiautomate de analiza evitarea contaminarii reactivilor IMPORTANT! La sfarsitul zilei de lucru este esentiala efectuarea operatiunilor de intretinere a echipamentului (spalare ace, tubulatura, cuve) in scopul evitarii contaminarii si interferentelor.

CAUZE ALE ERORILOR FAZA POST-ANALITICA (18% din erori)Procedura de raportare a rezultatelor Raportul de analiz trebuie s indice:-

Aspectul probei, de ex. hemolitic, icteric, lipemic (turbid, opalescent) Dac proba a fost determinata in dilutie, trebuie specificata dilutia Dac interferena nu s-a putut elimina i analiza nu s-a efectuat, n locul rezultatului se noteaz: nu s-a efectuat datorit...

CAUZE ALE ERORILOR FAZA POST-ANALITICA (18% din erori)Se impune repetarea determinarilor pentru: rezultate care nu se coreleaza intre ele si cu diagnosticul (ex. T4, T4 liber, TSH etc.) rezultate neastepatate in cazul monitorizarii tratamentului repetarea determinarii analitului se va efectua intotdeauna pe un alt esantion provenit din acelasi specimen! Se pot efectua determinari aditionale,cu anuntarea clinicianului, daca se obtin valori patologice pentru anumiti analiti (ex. metastaze hepatice cauza necunoscuta clinicianul indica CEA si AFP)

3.4 Criterii de selectie i validareSensibilitatea unei metode reprezint proprietatea acesteia de adetecta o cantitate ct mai mic din substana de analizat (de a nu da rezultate fals negative - FN)

Specificitatea unei metode reprezint proprietatea acesteia de adetecta numai substana de analizat dintr-un sistem (de a nu da rezultate fals pozitive FP sau de a da un rezultat real negativ RN dac substana nu se gsete n sistemul de analizat) Parametrii metodei de analiz a markerilor tumorali Tumora Prezent Rezultatele metodei de analiz a markerilor tumorali Pozitiv Negativ Total RP (Real pozitiv) FN (Fals negativ) RP + FN Absent FP (Fals pozitiv) RN (Real negativ) FP + RN Total RP+FP FN+RN

Criterii de selectie a markerilor tumorali:Sensibilitate cat mai mare capacitatea de a identifica neoplazia in stadiu precoce Specificitate cat mai mare capacitatea de a distinge intre indivizii sanatosi si cei cu neoplazii Specificitate de organ capacitatea de a localiza tumora Corelatie intre concentratia markerului si stadiul tumorii Capacitate de a indica modificarile induse de tratament Valoare prognostica in functie de concentratie

3.5 Determinarea MultimarkerPROBLEMA!!Nu exista marker tumoral ideal! Markerii tumorali nu au valoare absoluta!

SOLUTIASE LUCREAZA CU ASOCIERI DE MARKERI:-

un marker "de prim alegere" (cu cea mai mare specificitate ptr. celula tumoral cercetat); unul sau doi markeri, "de a doua sau a treia alegere", care mbuntesc considerabil sensibilitatea primului.

EXEMPLU: un marker de masa tumorala; unul sau doi markeri de activitate tumorala.

4. RECOMANDARI PRIVIND UTILIZAREA MARKERILOR TUMORALI DE PRIMA LINIE IN DIVERSE NEOPLAZII

4.1 CANCER PULMONAR (NSE, CEA, CYFRA 21-1, SCC)Sensibilitatea a markerilor NSE CEA n cancerul pulmonar TIPUL BOLIICarcinom cu celule mici Alte carcinoame Boli pulmonare benigne Persoane sanatoase

N81 108 79 92

NSE (>13 ng/mL) CEA (>5 ng/mL)74% 15% 5.1% 47% 46% 13.9%

0% ( 7.1 +/- 2.0) 0% ( 1.8 +/- 0.8)

CYFRA 21-1 fragmente solubile de Citokeratina 19 (n NSCLC) Valori normale: < 3,3 ng/mL Valori crescute: carcinom bronic non-parvicelular specificitate 95%.

4.2 CANCER MAMAR (CA 15-3, CEA, CA 27-29, RE/RP, HER2/neu, EGFR, Ki-67)CA 15-3 nu se utilizeaz ca marker de screening Determinarea receptorilor pentru Estrogen / Progesteron este recomandat pentru a aprecia raspunsul la terapie hormonal Determinarea CA 15-3 i CA 27-29 sunt utile pentru detecia precoce a recurenei la pacientele clinic asimptomatice, dup tratament n std II i III Determinarea CA 27-29 este utilizat doar in monitorizarea pacientelor aflate n faz avansat de boal Recomandari ESMO: Receptori RE/RP, status HER2/neu, indicele de proliferare Ki-67, factorul de crestere EGFR

4.3 CANCER DE PROSTATA (PSA total, PSA liber)INCIDENTA1 caz la 100.000 de barbati n Asia, America de Sud, Africa Este frecvent n America de Nord i n Nord-Estul Europei 100 de cazuri la 100.000 de barbati n rndul persoanelor de culoare din Statele Unite n Romnia, sunt diagnosticate anual 177 de cazuri noi de cancer de prostat i aproximativ 7,3% din brbati mor anual din aceast cauz Cancerul de prostat reprezint a doua cauz de deces prin cancer dup cancerul pulmonar FACTORI DE RISC Barbati cu varsta peste 65 de ani Rasa afro-americana: brbaii de culoare sufer de cancer de prostat cu 37% mai frecvent dect albii Prezenta genei HPC 1 (Hereditary Prostate Cancer 1), predispune brbaii la cancer de prostat atunci cnd sufer mutaii Prezenta moleculei B7-H3 pe suprafata celulelor canceroase prostatice

PSAAntigenul specific prostatic (PSA) este un component esential al plasmei seminale. Este sintetizat in celulele acinare si in epiteliul ductal al prostatei. In mod obisnuit, PSA este prezent in ser in concentratii reduse. In cazurile in care se produce alterarea structurii microscopice a prostatei (cancer, hipertrofie prostatica benigna, prostatita acuta, biopsie prostatica) PSA va difuza in stroma, de unde va ajunge in circulatia generala, pe calea sistemului limfatic si capilar. Antigenul specific prostatic (PSA) circula in sange sub diferite forme moleculare datorita complexelor pe care le formeaza cu inhibitori de proteaze: - PSA complexat cu alfa1-antichimotripsina (PSA-ACT) este principala forma imunoreactiva din ser (60 - 90 %) - PSA complexat cu alfa2- macroglobulina (PSA-AMG) - aceasta forma nu este detectabila (< 0,1 %) - PSA liber este o forma enzimatic inactiva - nu se asociaza cu inhibitori (10 - 40 %) Formarea complexelor cu ACT duce la expunerea unui numar limitat de epitopi ai PSA, pe cand complexele cu AMG incapsuleza practic toti epitopii, din acest motiv fiind imposibil de detectat. Proporiile relative de PSA - ACT i PSA liber difer la pacienii cu cancer de prostat, comparativ cu cei cu BPH

CONCLUZII1. Determinarea prezenei, n esutul tumoral, a PSA total ntr-o anumit concentraie, mai mare sau mai mic, prezint o importan major pentru: alegerea liniei de tratament (n scopul identificrii pacienilor care s beneficieze de radioterapie, chimioterapie sau hormonoterapie); mbuntirea metodologiilor de tratament, atunci cnd determinrile de PSA total se efectueaz postprostatectomie, urmrindu-se evoluia bolii canceroase sub influena terapiei; monitorizarea tratamentului (indic recrudescena i instalarea rezistenei organismului la medicamentul administrat).

MARKERI TUMORALIMASA TUMORALA Bladder Tumor Antigen (BTA Trak) a fost identificat ca fiind o protein din familia Factorului H al Complementului Uman (hCFHrp), similar ca structur, compoziie i form, dar nu identic cu hCFH NMP 22 Proteine de Matrice Nuclear (NMPs) fac parte din structura intern a nucleului sau, mai exact, alctuiesc matricea structural intern a nucleului celular i se asociaz cu funciile de replicare a ADN, sinteza ARN i formarea de hormoni

ACTIVITATE TUMORALA Urinary Bladder Cancer Antigen (UBC) permite msurarea reactivitii epitopilor din fragmentele solubile ale citokeratinei 8 i 18, folosind anticorpii monoclonali 6D7 i 3F3. Cyfra 21-1 marker determinat cu ajutorul a 2 anticorpi monoclonali ndreptai mpotriva unui fragment de citokeratin 19. Tissue Polypeptide Specific Antigen (TPS) permite msurarea reactivitii epitopului M3 din fragmentele solubile ale citokeratinei 18, folosind anticorpi policlonali anti-citokeratin.

4.5 TUMORI TESTICULARE (HCG, AFP)Clasificarea histopatologic a tumorilor germ celulare testiculare i rolul markerilor tumorali hCG i AFP DIAGNOSTICSEMINOM CARCINOM EMBRIONAL (NON-SEMINOM) CHORIOCARCINOM (NON-SEMINOM) TERATOM (NON-SEMINOM) TUMORA SAC YOLK (NON-SEMINOM)

HCG+ + + -

AFP+ +

5. EVALUAREA CLINICA A MARKERILOR TUMORALIRolul markerilor tumorali in oncologie: screening stabilirea diagnosticului monitorizarea tratamentului valoare prognostic valoare predictiv indice de supraveghere

BibliografieHamdan, M., Cancer Biomarkers Analytical Techniques for Discovery, John Wiley & Sons Inc., 2007 Dobreanu, M., Biochimie clinica Implicatii practice, University Press, 2006 Klapdor, R., Tumour Markers in Clinical Oncology, Sorin Biomedica, 1994 Belgun, M., Purice, M., Goldstein, A., Istoricul si evolutia utilizarii radioizotopilor in endocrinologie, 2003 Lothar Thomas.Tumor Markers. In Clinical Laboratory Diagnostics. 1998, 66-970. The National Academy of Clinical Biochemistry. Practice Guidelines and Recommendations for Use of Tumor Markers in the Clinic (Laboratory Medicine Practice Guidelines), 2002. The National Academy of Clinical Biochemistry. Laboratory Medicine Practice Guidelines. Use of Tumor Markers in Liver, Bladder, Cervical and Gastric Cancers, 2010.