Master Rad Konacan Tekst

1. UVOD

1.1. Ateroskleroza, lipidi i ishemijska bolest srca

Bolesti srca i krvnih sudova spadaju u vodeća masovna, hronična i nezarazna

oboljenja savremene civilizacije i na žalost, vodeći su uzrok smrtnosti i invaliditeta

savremenog čoveka. Broj obolelih ljudi od ishemijske bolesti srca poprimio je razmere

epidemijskog karaktera.

Angina pektoris, infarkt miokarda, poremećaji srčanog ritma, srčana

insuficijencija i iznenadna srčana smrt poznati su klinički oblici ishemijske bolesti srca.

Akutni infarkt miokarda definiše se kao nekroza srčanog mišića, nastala kao posledica

smanjenja, a najčešće potpunog prekida protoka krvi kroz koronarne arterije.

Ireverzibilna ishemija miokarda progredira do nekroze miokarda, a dovodi do

funkcionalnih, kasnije i patoanatomskih promena odnosno gubitka srčanog tkiva.

Akutni infarkt miokarda karakteriše trajno oštećenje, za razliku od stabilne i nestabilne

angine pektoris kod kojih je ishemija reverzibilna (Manojlović, 2000).

Akutni infarkt miokarda je najčešće uzrokovan rupturom aterosklerotskog plaka,

što uzrokuje agregaciju trombocita, akutnu intravaskularnu trombozu i opstrukciju

protoka krvi. Uzrok naglog prekida koronarne cirkulacije najčešće je aterosklerotična

lezija koronarne arterije, sa rupturom endotela. Endotel ima centralno mesto u regulaciji

odgovora krvnog suda na različite supstance i nadražaje, a jedna od najvažnijih je

sprečavanje agregacije trombocita i stvaranje tromba. Veličina infarkta, odnosno

nekroze i klinička slika ove bolesti određeni su veličinom arterije koja snabdeva

odgovarajući deo miokarda (Nešković i sar., 2000).

Angina pektoris je klinički sindrom koji je jedna od manifestacija ishemijske

bolesti srca. Najčešća klasifikacija angine pektoris je na stabilnu i nestabilnu anginu

pektoris kao i nekoliko drugih varijacija npr. vazospastična angina, mikrovaskularna

angina pektoris itd. U patogenezi angine pektoris najvažniju ulogu imaju

aterosklerotičan izmenjen zid koronarne arterije, veliko lipidno jezgro i tanak fibrozni

prekrivač ateromske ploče, fizički, psihički i metabolički stres, i vazokonstrikcija

(Stožinić i sar., 1996).

Ateroskleroza je bolest mišićnih i elastičnih arterija koja dovodi do kliničkih

posledica kao što su infarkt miokarda, angina pektoris, srčana insficijencija itd.

Ateroskleroza je osnovna patološka promena u ishemijskoj bolesti srca, ona je

multifaktorijalne prirode, posledica je kompleksnog višećelijskog, hroničnog,

1

zapaljensko-reparativnog odgovora zida arterije na brojne faktore i uzroke i univerzalan

je proces kod ljudi (Hadži-Pešić, 2006).

Do danas je definisano preko 250 činilaca rizika za ishemijsku bolest srca.

Američko društvo kardiologa (American Heart Association) vrednuje 7 bitnih faktora

rizika za ishemijsku bolest srca i to: poremećaj metabolizma lipida u serumu, povišen

arterijski krvni pritisak, pušenje, povišene vrednosti šećera u krvi, prekomernu telesnu

težinu u odnosu na pol i godine starosti, povišene vrednosti mokraćne kiseline i fizičku

neaktivnost. Uz ove, Svetska zdravstvena organizacija (WHO) dodaje starost, pol i

genetičku predispoziciju. Postoji više vrsta podela faktora rizika za nastanak

kardiovaskularnih bolesti. Jedna od njih je podela na faktore na koje se ne može

delovati (uzrast, pol i nasleđe) i faktore na koje se može delovati (povišen krvni pritisak,

pušenje, povišen LDL-holesterol, nizak HDL-holesterol, diabetes mellitus, gojaznost,

ishrana, fizička neaktivnost) (Stožinić i sar., 1996).

Iako nasleđe pripada grupi faktora rizika za nastanak ishemijske bolesti srca na

koje se ne može delovati, skriningom populacije na prisustvo polimorfizma apoE gena

može se na vreme sprovesti prevencija i smanjiti rizik od razvoja ovog

multifaktorijalnog oboljenja, delovanjem na ostale faktore rizika (Hadži-Pešić, 2006).

Klinički oblici aterosklerotske koronarne bolesti srca su vezani za genetičke

činioce, oksidaciju LDL lipoproteina i zapaljenske procese. Genetičke varijacije apoE

gena su jedan od faktora koji utiču na progresiju ateroskleroze u opštoj populaciji.

Utvrđeno je da je ateroskleroza manje izražena u osoba koje u krvi imaju izoformu

apolipoproteina E2 (alel e2 u genotipu) u odnosu na nosioce primarne izoforme E3, ili

mutirane izoforme E4 apolipoproteina E. Sa druge strane, u bolesnika sa

hiperlipoproteinemijom III utvrđeno je upravo prisustvo alela e2 u genotipu, najčešće u

homozigotnoj formi, a ređe u formi heterozigota. Takođe, ustanovljeno je prisustvo e4

alela u genotipu udruženo sa višim nivoima ukupnog holesterola i LDL-holesterola,

odnosno sa povećanom predispozicijom za ishemijsku bolest srca (Stožinić i sar., 1996;

Lepšanović i Lepšanović, 2000).

Apolipoprotein E (ApoE) predstavlja glikoprotein molekulske težine 34kDA

koji je čvrsto povezan sa hilomikronima, hilomikronskim ostacima, lipoproteinima

veoma male gustine (VLDL) i sa lipoproteinima velike gustine (HDL). ApoE

predstavlja normalan konstituent lipoproteina bogatih trigliceridima (TRL) i HDL

čestica, gde ima funkciju liganda u procesu vezivanja za lipoproteinske receptore.

Takođe, ApoE ima krucijalnu ulogu u transportu i redistribuciji lipida između

lipoproteina. Transport holesterola iz perifernih tkiva u jetru (reverzni transport) je

2

najverovatnije posredovan vezivanjem ApoE u kompleksu sa HDL česticama za

katabolički ApoE receptor. ApoE se sintetiše u većini organa i tkiva organizma, a

naročito u jetri, mozgu, slezini, bubrezima i magrofazima.

Humani apoE gen je dužine 3,7kb, sastoji se od četiri egzona i lociran je na

hromozomu 19q13.2 u okviru familije gena koja još obuhvata dva strukturna gena

apoC-I i apoC-II i jedan pseudogen apoC-I'. Do danas su detektovana tri alela u okviru

ovog gena (e2, e3 i e4) koja kodiraju tri izoforme apolipoproteina E u plazmi E2, E3 i

E4, kao i nekoliko retkih varijanti sekvence ovog gena, koje se razlikuju prema afinitetu

vezivanja za apo-B/E receptor. Ova tri alela definišu šest mogućih genotipova u

humanoj populaciji. Ova genetička varijabilnost rezultuje cistein-arginin izmenama na

dve pozicije 112 i 158 u okviru aminokiselinske sekvence proteina ApoE. Pokazano je

da su ove izmene posledica baznih substitucija u okviru četvrtog egzona apoE gena.

Alel e3 predstavlja najčešći alel humane populacije i kodira izoformu koja se

karakteriše cisteinom na poziciji 112 (112cys) i argininom na poziciji 158 (158arg). Ova

izoforma ApoE praćena je povišenim nivoom ukupnog holesterola i betalipoproteina.

Izoforma E2 apolipoproteina E (112cys i 158cys) je u korelaciji sa smanjenim

afinitetom vezivanja za ćelijske receptore i sa sniženim nivoom holesterola i

betalipoproteina. Alel e4 karakteriše se kombinacijom 112arg i 158arg, i prisustvo ovog

alela u genotipu je u korelaciji sa povećanim koncentracijama LDL holesterola u

serumu kao i sa povećanim rizikom od infarkta miokarda (Hixon i Vernier, 1990; Paik i

sar., 1989; Reymer i sar., 1995; Kontula i sar., 1990).

Genetička varijabilnost apoE lokusa kod ljudi je važna determinanta nivoa lipida

plazme i rizika od ateroskleroze. Pored dokazane činjenice o ulozi ApoE u patogenezi

ateroskleroze, veliki broj studija ukazao je na povezanost ovog gena sa Alchajmerovom

bolesti i dijabetesom tip 2. Mnogobrojne studije o značajnom uticaju apoE genotipa na

bolesti srca ukazuju na značaj definisanja apoE genotipa. Nekoliko studija ukazalo je na

veću incidencu i prevalencu kardiovaskularnih oboljenja u subjekata koji su nosioci e4

alela, dok su neke slične studije ukazale na povezanost e4 alela sa povećanim rizikom

od infarkta miokarda. Takođe, obimna populaciona istraživanja ukazuju na postojanje

interetničke varijacije apoE polimorfnosti (Davignon i sar., 1988; Araki i sar., 2003;

Lahoz i sar., 2001; Brscic i sar., 2000; Singh i sar., u štampi).

1.2. Apolipoproteini

Obzirom da su lipidi uglavnom nerastvorljivi u vodi, oni se u vodenoj sredini

plazme vezuju za određene proteine koji se zovu apolipoproteini. Apolipoproteini imaju

3

tri osnovne uloge. Prvo, obezbeđuju stabilnost transporta lipida u vodenoj sredini

stvarajući stabilne komplekse. Drugo, deluju kao kofaktori pojedinih enzima koji su

učesnici metabolizma lipoproteina. I treće, jeste vezivanje apolipoproteina za specifične

receptore na ćelijskim membranama, čime obezbeđuju ulazak lipoproteina iz plazme u

ćelije. Postoji preko 10 klasa različitih apolipoproteina: A, B, C, D, E, F, G, H, J, M, od

kojih pojedini imaju i podklase (Lepšanović i Lepšanović, 2000; Christofferson i sar.,

2006).

1.3. Ishemijska bolest srca

Ishemija miokarda nastaje usled neravnomernosti između potreba i

snabdevenosti miokarda krvlju. Snabdevanje može biti nedovoljno usled smanjenog

volumena krvnog suda ateromatoznim promenama ili zbog koronarnog vazospazma kao

i kombinacijom oba usled čega dolazi do smanjenja koronarnog protoka. Do ishemije

može doći i zbog povećanih potreba hipertrofičnog miokarda pri normalnom protoku.

Ishemijska bolest srca je najčešći uzrok mortaliteta i morbiditeta kod muškaraca posle

35 godine a kod oba pola posle 45 godine.

Najčešći uzrok ishemijske bolesti srca je ateroskleroza. Postoji više teorija koje

objašnjavaju mehnizam nastanka ateroskleroze. Izdvajaju se „lipidna teorija“ po kojoj je

početni korak u nastanku ateroskleroze nakupljanje viška lipida u zidu krvnog suda i

teorija o „odgovoru na oštećenje“ po kojoj je početak nastanka ateroskleroze oštećenje

endotela na posebnim mestima arterija. Uzroci oštećenja su različiti od mehaničkih,

toksičnih, imunoloških do holesterola (Slika 1). Ateroskleroza je zadebljanje intime

zbog nakupljanja lipida koji dovode do stvaranja atroma. Vremenom aterom se

povećava što sledstveno smanjuje lumen krvnog suda. Smatra se da je kod osoba bez

faktora rizika u 85 godini 60% arterija prekriveno ateromskim pločama, kod pušača u

65 godini, a kod hipertenzičara i pušača u 52 godini. (Lambić i Stožinić, 1990;

Manojlović, 2000; Žigić i sar., 2003).

Ishemijska bolest srca može da se klasifikuje na:

1. anginu pektoris ( stabilna i nestabilna)

2. akutni infarkt miokarda

3. nagla srčana smrt

4. ishemijska kardiomiopatija

4

Slika 1. Patofiziologija, međustanja i kandidat geni koji učestvuju u nastanku ishemijske

bolesti srca (preuzeto i modifikovano iz Stephens i Humphries, 2003). (LDLR – LDL

receptor; LPL – lipoprotein lipaza; FIB – fibrinogen; FVII – faktor VII; PAI1 – platlet aktivator 1; Lp(a)

– lipoprotein a; COL1A1 – kolagen 1 polipeptid alfa; PON1 – paraoksonaza 1; IL6 – interleukin 6;

MTHFR – metilen tetrahidrofolat reduktaza)

1.4. ApoE gen i apolipoprotein E

Kod čoveka se ApoE primarno sintetiše u jetri i mozgu, ali i u drugim tkivima,

uključujući monocite/makrofage. ApoE se takođe sintetiše u bubrezima i u tkivima koja

sintetišu steroide kao što je nadbubrežna žlezda i granulocite jajnika. U jajnicima, kao

tkivu kojem je neophodan jak metabolizam holesterola, lokalno sintetisan ApoE je

uključen u distribuciju holesterola između ćelija organa. Ovaj holesterol se zatim koristi

u različitim biosintetičkim putevima, uključujući sintezu membrana i steroidnih

hormona. Produkcija ApoE u jajnicima je pod kontrolom gonadotropina i holesterola.

Pokazano je da se ApoE sintetiše podjednako i sekretuje na sličan način u humanim

ćelijama horiokarcinoma u kulturi i u placenti, što ukazuje na činjenicu da ApoE, koji

omogućava receptor-zavisni transport lipoproteina, biva sekretovan iz trofoblasta da bi

omogućio preuzimanje majčinih lipoproteina. Keratinociti, koji predstavljaju

protektivnu barijeru kroz formaciju skvamoznog epitela u epidermisu, sposobni su da

sintetišu i sekretuju ApoE. In vitro ApoE se sintetiše samo u malim ćelijama koje

odgovaraju bazalnim ćelijama keratinocita. Ova ćelijska lokalizacija ApoE sekrecije

obezbeđuje mehanizam za usvajanje lipida i njegovu redistribuciju unutar epidermisa.

Keratinociti takođe indukuju sistemski efekat putem sekrecije faktora u krvotok – ova

hipoteza je izvedena iz činjenice da keratinociti koji sekretuju apoE u sistemsku

5

cirkulaciju kod miša čuvaju graftove humanih keratinocita. Kod čoveka, pacova i

kunića, mozak predstavlja drugo najvažnije mesto sinteze ApoE posle jetre, i gde je

količina iRNK za apoE 1/3 količine ove iRNK u jetri. Astrociti su primarne ćelije

sinteze ApoE. Osnovna uloga ApoE u mozgu je redistribucija lipida između ćelija čime

se održava homeostaza holesterola u mozgu. Druga pretpostavka kaže da je uloga ApoE

u nervnom sistemu da služi kao target protein za lokalnu redistribuciju holesterola, u

smislu prolaženja kroz procese remodeliranja i popravke. Ova hipoteza je bazirana na

zapažanju da kod nerava pacova koji prolaze regeneraciju i remijelinaciju postoji ovaj

mehanizam.

Obzirom da je ApoE lokalizovan i u tumorima mozga, može biti korišten i kao

marker za glijalnu neoplazmu. Visoke koncentracije ApoE u tumorima nisu

iznenađujuće, proliferacija ovih ćelija je brža i zbog toga je veća koncentracija lipida za

sintezu membrana ćelija. Visok stepen sinteze u tumoru može biti odgovor na povećanu

potrebu za holesterolom (Li i sar., 2003).

Dakle ApoE se nalazi u velikom broju tkiva gde ima opštu ulogu u transportu i

distribuciji holesterola. Takođe sekrecija ApoE se povećava nakon povrede i upale

tkiva. Sve ovo ukazuje na važnu ulogu ApoE koja nije do kraja jasna.

Humani apoE gen je polimorfan sa tri uobičajena alela (e2, e3 i e4) koje kodiraju

tri izoforme apolipoproteina E (E2, E3 i E4). Ove izoforme se međusobno razlikuju u

jednoj amino kiselini i u afinitetu vezivanja za apoE receptor.

Apolipoprotein E u humanoj plazmi ima dužinu 299 aminokiselina i Mr= 34200

i sastoji se od jednog polipeptidnog lanca. Primarna struktura je određena direktnim

sekvenciranjem aminokiselina ApoE proteina prečišćenog iz VLDL čestice. Kasnije je

sekvenca potvrđena sekvenciranjem celokupne cDNK apoE iRNK. Ova iRNK kodira

prekursor proteina koji sadrži signalni peptid od 18 aminokiselina koji biva odstranjen u

toku premeštanja ApoE proteina kroz endoplazmatični retikulum. Prva hipoteza o apoE

heterogenosti javila se iz rezultata koji su pokazivali različite zrele proteine u česticama

lipida ili tkivima. Kod čoveka apoE poseduje genetički polimorfizam. Ovo je prvo

pokazano izoelektričnim fokusiranjem ApoE, a kasnije potvrđeno direktnim

sekvenciranjem cDNK. Alel e3 je najčešći alel opšte populacije. Molekularna osnova

apoE polimorfizma jesu cistein/arginin promene. Izoforma E3 sadrži cistein na poziciji

112 i arginin na poziciji 158. E2 sadrži cistein na obe pozicije, a E4 arginin na obe

pozicije. Ovaj polimorfizam vodi prisustvu 6 fenotipova u humanoj populaciji, 3

homozigota e3e3, e4e4 i e2e2, i 3 heterozigota e3e2, e2e4 i e3e4. Iako je ApoE jedan od

najbolje okarakterisanih apolipoprotina u smislu strukture i funkcije, specifične osobine

6

svake izoforme koje objašnjavaju razlike u reaktivnosti ostale su nerazjašnjene. ApoE se

veoma razlikuje od drugih apolipoproteina po tercijarnoj strukturi. Predpostavlja se da

je ApoE visoko spiralizovan i da ga čine dva fragmenta spojena dugim segmentom

nasumične strukture. Nekoliko dokaza potvrđuje da se ApoE uvija u dva nezavisna

strukturna domena koja odgovaraju dvema funkcionalnim motivima proteina. Jedan

fragment odgovara aminokiselinama od 1 do 191 i težine je 22 kDA, a drugi odgovara

aminokiselinama od 216 do 299 i težine je 10kDA. Ova dva fragmenta su modeli dva

strukturna domena ApoE. N terminalni kraj ApoE proteina pokazuje fizičko-hemijske

karakteristike slične drugim globularnim proteinima i ostaje monomeran u rastvoru.

Ovaj domen sadrži receptor vezujuće mesto ApoE na pozicijama od 136 do 158, kao i

region bogat baznim aminokiselinama lizinom i argininom i predstavlja heparin

vezujući domen. Studije koje determinišu C reaktivan kraj apoE proteina pretpostavljaju

da nakon 191 aminokiseline postoje 3 heliksa od kojih su dva alfa tipa 203-223 i 225-

266, a treći heliks 268-289 je G* tipa. Dokazano je da G* heliks kao i kraj drugog

heliksa imaju osnovnu ulogu u vezivanju lipida i u tetramerizaciji ApoE. Preciznije čini

se da fragment 263-286 je neophodan za vezivanje lipida i vezu ApoE sa VLDL.

Nekoliko dokaza ističu i značaj interdomena za funkciju apoE ali njegova struktura

mora biti razjašnjena (Siest i sar., 1995).

Pored uloge ApoE u transportu holesterola i metabolizmu lipoproteinskih čestica

ApoE ima još funkcija kod čoveka u imunoregulaciji, regeneraciji nerava i aktivaciji

nekih lipolitičkih enzima kao čto su heparin lipaza, lipoprotein lipaza i lecitin holesterol

aciltransferaza. Od velikog je interesa činjenica da je ApoE ligand za nekoliko ćelijskih

receptora. Prihvaćeno je da postoji specifična interakcija između ApoE i LDL-receptora

koja je osnovni mehanizam kontrole uklanjanja ApoE bogatih lipoproteina (VLDL,

hilomikronski ostatci i IDL) i zbog toga ApoE determiniše homeostazu holesterola i

triglicerida. Skorašnje studije pokazuju da LDL-receptori koji postoje u nekoliko tkiva

uključujući i jetru imaju glavnu ulogu u preuzimanju VLDL i hilomikronskih ostataka

iz plazme. Genetički polimorfizam apoE objašnjava 14-18% varijabilnosti koncentracije

holesterola u plazmi. Tri uobičajene apoE izoforme imaju različit afinitet za LDL-

receptore. E3 i E4 imaju isti afinitet dok E2 pokazuje smanjen afinitet. VLDL i ostaci

koji sadrže E2 se sporije uklanjaju iz plazme indukujući više nivoe regulacije jetrenih

LDL-receptora i zbog toga smanjenu koncentraciju holesterola u plazmi. VLDL apoE4

čestice brže se uklanjaju iz plazme od VLDL apoE3 čestica indukujući niže nivoe

regulacije LDLR. VLDL apoE4 fenotip je zbog toga povezan sa višim nivoom

holesterola u cirkulaciji. Novije studije pokazuju da lipoproteini bogati sa ApoE služe

7

kao ligandi i za druge receptore sem LDL receptora. LRP (receptorni protein sličan

LDL) sintetiše se u nekoliko tkiva uključujući jetru i mozak. Osnovna uloga ovog

proteina je uklanjanje βVLDL i intestinalnih hilomikronskih ostataka. Ovaj receptor je

takođe prijemčiv za druge ligande kao što su α2 makroglobulin čiji doprinos usvajanju

lipoprotina bogatih sa ApoE nije do kraja jasan. In vitro eksperimenti sa fibroblastima

kojima nedostaje LDLR pokazuju prisustvo drugih receptora koji se aktiviraju oleatima.

Ovaj kompleks građen od dve subjedinice pokazuje afinitet za hilomikrone, VLDL i

lipozome bogate sa ApoE. Ovaj receptor se zove lipoliza stimulišući receptor i ne

vezuje ligande LRP-a i pokazuje samo mali afinitet za LDL apoB i VLDL apoE2.

Lipoliza stimulišući receptor je lokalizovan u glavnom u membrani hepatocita a njegova

fiziološka uloga u preuzimanju lipiproteina bogatih trigliceridima je u direktnoj vezi sa

aktivnošću lipoprotein lipaze. VLDL apoE intereaguje sa 4 receptorom koji se zove

VLDLR. Njegova fiziološka uloga se slabo razume ali je dokazano da iRNK koja kodira

ovaj receptor ima visoku ekspresiju u tkivima sa pojačanim metabolizmom masnih

kiselina kao što su mišići, adipocite, srce, mozak i placenta (Yamamoto, 2000; Nabel,

2003).

Važno polje istraživanja metabolizma lipoproteina je determinacija doprinosa

svakog ApoE receptora u odstranjivanju lipoproteina koji sadrže ApoE, kao i efekta

polimorfizma apoE na ovaj fenomen in vivo. Struktura apoE izoformi možda može da

objasni razlike u afinitetu ovog apolipoproteina za njegove različite receptore u

fiziološkim i patološkim stanjima. (Nabel, 2003).

1.5. Povezanost ishemijske bolesti srca i apoE alelnih varijanti

Za apoE gen i za njegovu veza sa kardiovaskularnim bolestima se zna preko 30

godina. Istorijski gledano, veza polimorfizma apoE i ateroskleroze je prvi put potvrđena

u analizama pacijenata sa tip III hiperlipoproteinemijom i sa e2e2 genotipom koji je bio

dominantan u ovih pacijenata (Mahley, 1988). Zbog toga se krenulo u intenzivna

istraživanja apoE, i gomilanjem podataka došlo se do zaključka da je apoE genotip

jedna od osnovnih determinanti u inicijaciji i progresiji ateroskleroze.

ApoE polimorfizam je važna determinanta rizika za razvoj ishemijske bolesti

srca, gde je dokazano da je u grupi bolesnika u poređenju sa kontrolom povećana

frekvencija e4 alela. Ova činjenica je ukazala da je u toku dijagnostičkih procedura

neophodno uvesti genotipizaciju i fenotipizaciju u kliničkoj laboratoriji (Siest i sar.,

1995; Day i Wilson, 2001). Prilikom analiza apoE treba voditi računa da postoji etnička

varijabilnost apoE gena, koji je visoko varijabilan između različitih populacija.

8

Frekvencija e4 alela u Evropi opada u pravcu sever – jug (Mahley, 1988). Interesantno

je da frekvencija e4 mala u Azijskoj populaciji, dok je u populaciji Afrike i Papua Nove

Gvineje velika (Eto i sar., 1988).

Takođe, moraju se uzeti u obzir i različite metode koje su korišćene u različitim

populacijama za utvrđivanje apoE genotipa odnosno fenotipa kao i način evaluacije

prevalence kardiovaskularnih oboljenja pre donošenja konačnog zaključka. Kontula i

sar. (1990) pokazali su da fenotipizacija ApoE izoformi izoelektričnim fokusiranjem

potpuno odgovara RFLP-PCR analizi primenom HhaI endonukleaze. Ovim radom je

otvoreno polje molekularne detekcije apoE polimorfizma. Istovremeno su veoma sličan

metod detekcije apoE genotipa objavili Hixon i Vernier (1990) primenom RFLP-PCR

analize egzona 4 apoE gena sa HhaI restrikcionim enzimom i detekcijom fragmenata

8% poliakrilamidnim gelovima. Reymer i sar. (1995) unapredili su ovaj metod

genotipizacije u smislu ubrzanja procesa i analize produkata digestije apoE gena sa

izošicomerom CfoI na 5% agarozim gelovima.

Brojne populacione studije dokazale su efekat apoE alela na koncentraciju lipida

u plazmi. Prosečan doprinos e4 alela u značajnom povećanju koncentracije totalnog

holesterola u zdravoj populaciji je dokazan, te je ovaj alel postavljen za predisponirajući

alel ateroskleroze. Suprotno njemu, prosečan efekat e2 alela jeste da snižava

koncentraciju ukupnog holesterola i to dva do tri puta manju u odnosu na onu u

prisustvu alela e4.

Rana istraživanja ukazala su da postoji razlika u nivou holesterola u plazmi i

apoE varijante genotipa. (Kontula i sar., 1990). Primenom novih metoda u genotipizaciji

apoE, Eggertsen i sar. (1993) uočili su pozitivnu korelaciju alela e3 i e4 sa nivoom

holesterola u serumu, kao i pozitivnu korelaciju e4 sa LDL holesterolom. Nije utvrđena

veza polimorfizama apoE i HDL holesterola i nivoa triglicerida u analiziranoj populaciji

Švedske. Pored toga, uočena je povećana frekvencija e4 alela u toj populaciji 20.3%, u

odnosu na druge populacije belaca. Značajno veća učestalost alela e4 i to u formi e3e4

genotipa nađena je u grupi pacijenata sa ishemijskom bolešću srca i insulin nezavisnim

tipom dijabetesa, u odnosu na grupu pacijenata sa insulin nezavisnim tipom dijabetesa i

bez istorije ishemijskog oboljenja srca (Guangda i sar., 1999). U populaciji muškaraca

Finske starijih od 65 godina utvrđen je statistički veći mortalitet od ishemijskih

oboljenja srca u grupi e3e4 genotipa u odnosu na grupu e3e3 (Stengård i sar., 1999).

Pored toga, pušenje i BMI su značajni prediktori za IBS u grupi e3e4 genotipa, dok su u

e3e3 grupi to ukupni holesterol i BMI. Time je pokazan različit odgovor drugačijih

genotipova na faktore spoljašnje sredine. U mlađoj populaciji muškaraca Finske,

9

pokazano je da osobe genotipa e2e3 imaju značajno manju koncentraciju ukupnog i

LDL holesterola i manju debljinu intima media, u odnosu na e3e3 genotip i nosioce e4

alela. Korelacija sa parametrima HDL holesterol, krvni pritisak, i pušenje nije mogla

biti dokazana (Ilveskoski i sar., 2000). Analiza apoE polimorfizama u okviru

Framingham Heart Study sa druge strane otkrila je da prisustvo alela e4 i alela e2 kod

muškaraca pokazuje pozitivnu korelaciju sa pojavom koronarnih vaskularnih oboljenja,

dok ova povezanost nije detektovana u grupi žena (Lahoz i sar., 2001). Yamada i sar.

(2002) pokazali su komparativnom analizom 112 polimorfizama u 71 genu da

polimorfizam apoE gena ima aditivni efekat u nastanku infarkta miokarda, sa alelom e4

kao rizik faktorom. Kolovou i sar. (2002) su dalje dokazali da je alel e2 oko 5 puta

manje prisutan kod pacijenata sa koronarnom bolesti arterija koji su doživeli infarkt

miokarda u odnosu na pacijente sa koronarnom bolesti arterija koji nisu doživeli infarkt

miokarda, dok je u grupi zdravih kontrola alel e2 bio oko 8 puta prisutniji. Statistički

značajne razlike u frekvenciji e4 alela među ovim grupama nisu nađene. Takođe, među

dve grupe pacijenata nije nađena razlika u lipidnom statusu. Statistički značajna razlika

nije pokazana između prisustva različitih varijanti apoE gena i nivoa glukoze i BMI, ali

je pokazano da nosioci genotipa e2e2 i e2e3 imaju značajno manji procenat masti u

odnosu na ostale genotipove, kao i uticaj na nivo lipidni status kod muškaraca (Raslova

i sar., 2003). U populaciji žena sa stenozom karotidne arterije većom od 20%

signifikantno je veće prisustvo genotipova e3e4 i e4e4 u poređenju sa kontrolom (Chen

i sar., 2003). Pored toga dokazana je povezanost alela e4 i brojem oboljenja krvnih

sudova, kao i sa povećanjem nivoa ukupnog i LDL holesterola u ovoj studiji. U

populaciji dece iz Portugala uočene su slične frekvencije alela apoE gena, kao i u

populaciji odraslih. Pored toga utvrđeno je da kod dece antropometrijski parametri,

procenat masne mase i pritisak, kao ni nivo glukoze i HOMA IR vrednosti, nisu različiti

među grupama e2e3, e3e3 i e3e4. Sa druge strane nivo ukupnog holesterola/HDL i

LDL/HDL, tj. indeksi ateroskleroze, bili su značajno veći kod grupe e3e4 u odnosu na

e2e3 i e3e3 (Guerra i sar., 2003). Poređenjem grupa bolesnika sa ishemijskom bolešću

srca sa kontrolom, utvrđena je signifikantna razlika u biohemijskim parametrima:

ukupni holesterol, LDL holesterol, HDL holesterol, trigliceridi kod žena i muškaraca,

kao i u parametrima godine, BMI i hipertenzija (Frikke-Schmidt i sar., 2004), dok nije

pronađena veza u odnosu na pušenje. Sa druge strane, Rubattu i sar. (2004) potvrdili su

signifikantnu razliku u nivou ukupnog holesterola među pacijentima sa ishemijskom

bolesti srca i kontrolama, ali nisu našli razliku u godinama, pušenju, konzumiranju

alkohola i hipertenziji. Biohemijski parametar nivo CRP bio je signifikantno veći kod

10

pacijenata sa koronarnom bolešću arterija koji su alela e2 ili su homozigoti e3e3, u

odnosu na grupe e3e4 i e4e4, dok nije nađena statistički značajna razlika u nivou

fibrinogena (März i sar., 2004). Takođe, März i sar. (2004) su našli značajne razlike u

nivou krvnog pritiska između pacijenata sa koronarnom bolešću arterija i kontrolama,

ali nisu našli razlike u nivou LDL holesterola, HDL holesterola, trigliceridima, glukozi,

niti pušenju između ove dve grupe. Bossé i sar. (2004) su prikazali da je apoE jedan od

QTL lokusa koji utiču na veličinu LDL čestica. Analizirajući rezultate nekoliko studija,

Bossé i sar. (2004) prikazali su da apoE polimorfizam utiče na veličinu LDL, ali da nije

jasno definisana povezanost određenog alela i veličine, što je verovatno posledice

različitih uzoraka i neujednačenih metoda detekcije. McCarthy i sar. (2004) potvrdili su

signifikantnu povezanost pojave ishemijske bolesti srca i apoE gena u analizi 111

kandidat gena, kao i signifikantnu razliku u krvnom pritisku i BMI između bolesnika i

kontrola. Analiza podataka iz Framinghamske studije pokazala je da ne postoji

povezanost u distribuciji alela apoE gena i rizika od kardiovaskularnih oboljenja u grupi

nepušača, dok je u grupi pušača pokazano da je u pozitivnoj korelaciji veza e4 alela i

kardiovaskularnih oboljenja. Pored toga, u grupi nepušača nije pokazano da postoji veza

sa LDL holesterolom, dok je u grupi pušača sa alelom e4 dokazan viši nivo LDL

holesterola (Talmud i sar., 2005). Topol (2006) je pokazao da infarkt miokarda iako

kompleksan i multifaktorijalan događaj, predstavlja bolji model za detekciju genetičke

osnove infarkta miokarda, u odnosu na složeniji skup odnosno sva stanja obuhvaćena

ishemijskom bolešću srca. Ovakav pristup podržavaju Gonzalez et al. (2006) ukazujući i

na druge poligene, u prvom redu mef2A gen, koji utiču na nastanak infarkta miokarda.

Eiriksdottir i sar. (2006) su pokazali da je e4 alel apoE gena u negativnoj korelaciji sa

nivoom CRP bez obzira na tretman statinima u Reykjavik populacionoj studiji. Elosua i

sar. (u štampi) analizom apoE genotipa u okviru Framinghamske studije nisu našli vezu

između apoE polimorfizama i debljine intima media kod muškaraca, a ova korelaicja je

pokazana kod žena.

Istraživanja polimorfizama apoE gena rađena su i u okviru ispitivanja genetičke

osnove različitih neurodegenerativnih oboljenja. Naime, pored dokazanih asocijacija

alela e4 sa koronarnom bolešću srca, nađena je i veza sa vezivanjem tireoidnog

hormona (Benvega i sar., 1993). Inhibicija rasta neurona takođe je pokazana u prisustvu

alela e4 (Nathan i sar., 1994). Jedan od najznačajnijih i najpoznatijih rezultata ovih

istraživanja jeste asocijacija alela e4 i nastanka Alchajmerove bolesti (Strittmatter i sar.,

1993; Sparks i sar., 2006). Čak je i dokazana povezanost alela apoE gena i kognitivnih

11

sposobnosti kod ljudi, gde nosioci alela e4 imaju smanjenu sposobnost (Bathum i sar.,

2006).

Nije nađena signifikantna veza između alela apoE gena diabetes mellitus tip 2,

iako je potvrđena manja prisutnost e4 alela kod obolelih osoba (Singh i sar., 2006).

Donnelly i sar. (2008) su pokazali da kod pacijenata obolelih od dijabetesa apoE

polimorfizam utiče na efekat statina na nivo LDL holesterola, u smislu da prisustvo e2

alela ubrzano smanjuje LDL holesterol pri uzimanju statina, dok ga e4 usporava.

12

2. CILJ RADA I RADNA HIPOTEZA

Odavno su poznati rezultati čuvene Framinghamske studije i studije Sedam

zemalja. Prema podacima iz MONICA studije (Monitoring of trends and determinants

in cardiovascular diseases), najveće svetske istraživačke studije u oblasti

kardiovaskularnih bolesti, stanovništvo Novog Sada (kao jednog od 38 istraživačkih

centara) je po učešću kardiovaskularnih bolesti u ukupnom mortalitetu u odnosu na

početak istraživanja sada u znatno pogoršanoj situaciji a stopa koronarnih događanja

takođe se znatno pogoršala. U odnosu na većinu drugih centara gde je registrovano

smanjenje stope mortaliteta od koronarne bolesti, Novi Sad spada među one centre kod

kojih je registrovano povećanje prosečnih godišnjih stopa mortaliteta. Što se vrednosti

holesterola na početku istraživanja tiče, Novi Sad se nalazio na 36 mestu po visini

prosečnog nivoa holesterola (muškarci) i 31 mesto (žene) a na kraju istraživanja došao

je na 2 mesto (muškarci) i 3 mesto (žene) (Radak i sar. 2005; Jakovljević i sar., 2005;

Tunstall-Pedoe i sar, 2003).

U populaciji Vojvodine do danas nije rađena studija o polimorfnosti apoE gena,

a što pored ostalog utiče i na nivo holesterola i LDL holesterola, odnosno na povećanu

predispoziciju za nastanak ishemijske bolesti srca.

U svetlu svega navedenog, ciljevi ovog istraživanja su:

1. Da se utvrdi polimorfnost apo E gena u ispitivanim grupama. Kontrolnu grupu

čini 30 zdravih muškaraca starosne dobi od 18-45 godina, koji nisu u srodstvu.

Ispitivanu grupu čini 30 bolesnika sa utvrđenom ishemijskom bolešću srca,

starosne dobi od 18-45 godina, koji nisu u srodstvu i koji nisu na terapiji

hipolipidemicima.

2. Da se utvrdi tip korelacije polimorfizama apo E gena i pojave IBS

3. Da se utvrdi korelacija polimorfizama apo E gena i pojedinih antropometrijskih i

biohemijskih parametara u ispitivanim grupama

Radne hipoteze ovog istraživanja su:

1. Očekuje se da u obe grupe ispitanika najčešća alelna forma apoE gena bude

e3, a da za njim slede e4 i e2, gde bi učestalost e4 alela bila značajno veća u

eksperimentalnoj grupi

2. Unutar svake grupe ispitanika se očekuje da frekvencija e4 alela bude u

pozitivnoj korelaciji sa nivoom LDL holesterola, povišenim arterijskim pritiskom, a u

negativnoj korelaciji sa HDL nivoom holesterola

13

3. U kontrolnoj i ispitivanoj grupi u postupku utvrđivanja korelacije prisustva

apoE alela i svakog pojedinačnog antropometrijskog i biohemijskog parametra, očekuje

se da će se definisati i neki novi odnosi između frekvencije apoE alela i nekih od

parametara

4. U odnosu na antropometrijske parametre očekuje se da u ispitivanoj grupi

bude povećana srednja vrednost arterijskog pritiska, i da indeks telesne mase (BMI)

bude povećan, kao i procenat masne mase.

5. U odnosu na biohemijske parametre očekuje se da srednja vrednost nivoa

LDL holesterola u bolesnika ispitivane grupe bude veća u odnosu na kontrolnu grupu.

14

3. MATERIJAL I METODE RADA

3.1. Materijal

Istraživanje je prospektivno, studija obuhvata dve grupe ispitanika.

Kontrolnu grupu čini 30 zdravih muškaraca starosne dobi od 18-45 godina, koje

nisu u srodstvu, odabrani po principu slučajnosti.

Ispitivanu grupu čini 30 bolesnika muškog pola sa utvrđenom IBS, starosne dobi

od 18-45 godina, koji nisu u srodstvu i koji nisu na terapiji hipolipidemicima.

Kriterijumi za uključivanje u ispitivanu grupu su angina pektoris utvrđena

koronarografijom, MDCT koronarografijom ili testom opterećenja ili pacijenti sa

preležanim infarktom miokarda, da ispitanici nisu na terapiji koja može imati upliva na

metabolizam ugljenih hidrata, lipida i lipoproteina i telesnu kompoziciju (oralni

hipoglikemici, hipolipidemici, beta-blokatori, diuretici...).

Svaka osoba uključena u istraživanje je informisana o cilju i značaju ispitivanja,

a svoju saglasnost za dobrovoljno učestvovanje u istraživanju potvrdila je svojim

potpisom na pripremljeni obrazac. Istraživanje je odobreno od strane Etičke Komisije

Medicinskog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu.

3.2. Metode rada

Istraživanje je sprovedeno u sledećim ustanovama:

1. Institut za kardiovaskularne bolesti Vojvodine, Sremska Kamenica

2. Klinički centar Vojvodina, Institut za interne bolesti, Klinika za endokrinologiju,

dijabetes i bolesti metabolizma, Novi Sad

3. Prirodno-matematički fakultet Novi Sad, Departman za biologiju i ekologiju,

Laboratorija za genetiku

3.2.1. Anamneza i fizički pregled

U obe grupe ispitanika urađena je detaljna anamneza u okviru koje je posebna

pažnja usmerena na porodičnu anamnezu u odnosu na kardiovaskularne bolesti, zatim

na medikamentoznu terapiju i navike pušenja.

Svakoj osobi izvršen je fizički pregled sa merenjem sistolnog i dijastolnog

krvnog pritiska korišćenjem sfingomanometra Riva-Rocci, u sedećem položaju nakon

10-15 minuta mirovanja.

15

Pored uzetih anamnestičkih podataka, kliničkog pregleda, standardnog

elektrokardiograma, bolesnicima je urađen standardan test opterećenjem na pokretnoj

traci ili bicikl ergometru (protokol po Bruce-u) ili invazivno hemodinamsko ispitivanje

srca sa selektivnom koronarografijom ili MDCT koronarografijom (multi-slice detector

computed tomography – coronarography) kojim je nesumnjivo utvrđena angina

pektoris (Julian i sar., 1997; Jones i sar., 2006).

3.2.2. Antropometrijska merenja

Sprovedena su sledeća antropometrijska merenja: telesne mase, telesne visine,

obima struka i izračunavanje indeksa telesne mase (BMI- body mass index). Kod svih

ispitanika izvršeno je određivanje telesne kompozicije pojedinih segmenata tela

metodom bioelektrične impedancne analize. Za merenje telesne mase korišćena je

standardna medicinska decimalna vaga sa preciznošću merenja od 0.1 kg, za merenje

telesne visine korišćen je standardni antropometar sa preciznošću merenja od 0.1 cm.

Indeks telesne mase izračunat je kao odnos telesne mase u kilogramima i kvadrat

telesne visine izražen u metrima (kg/m2). Obim struka meren je fleksibilnom mernom

trakom (preciznost merenja 0.1 cm), u stojećem stavu, na sredini rastojanja najniže

tačke rebarnog luka i najviše tačke bedrenog grebena karlične kosti.

3.2.3. Određivanje biohemijskih parametara

Standardnim laboratorijskim metodama u obe grupe za svaku osobu određeni su

sledeći parametri: lipidski i lipoproteinski status (ukupni holesterol; HDL holesterol;

LDL holesterol; trigliceridi, indeks ateroskleroze), glikemija našte, insulinemija,

fibrinogen i CRP- C reaktivni protein. Procena stepena insulinske rezistencije vršena je

primenom HOMA IR (homeostasis model assessment of insulin resistance) prema

formuli (glikemija x insulin)/22.5. Ukupan holesterol i trigliceridi su određeni

korišćenjem komercijalnog Boehringer Manheim GmbH kita. HDL holesterol određen

je metodom precipitacija sa Na-fosfor-volframatom, dok je LDL holesterol izračunat

korišćenjem formule preme Friedewald i sar. (1972). Nivo glukoze u plazmi određen je

korišćenjem Dialab glucose GOD-PAP metode.

3.2.4. Određivanje polimorfizama apoE gena

DNK svake osobe uključene u studiju izolovana je iz krvi standardnom

metodom pomoću QIAGENE kita za izolaciju DNK iz krvi prema uputstvu

proizvođača. Genotipizacija svake osobe urađena je anonimno, bez znanja o pripadnosti

16

te osobe kontrolnoj odnosno ispitivanoj grupi. Polimorfizam apoE gena određen je

PCR-RFLP metodom. Standardnim setom prajmera F4 (5' CTA CAG AAT TCG CCC

CGG CCT GGT ACA C 3') i F6 (5' TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A 3')

umnožen je deo četvrtog egzona apoE gena svake osobe. PCR amplifikacija fragmenta

gena urađena je prema modifikovanoj metodi Hixon i Vernier (1990) na Eppendorf

Thermocycler-u. PCR reakcija finalnog volumena 25l sadržala je oko 100 ng

genomske DNK, 0,4M svakog prajmera, 200M svakog deoksinukleotida (dATP,

dTTP, dCTP, dGTP), 1x Taq pufera za PCR, 1,25U Taq polimeraze, 10% DMSO i 2,5

mM MgCl2. Inicijalna denaturacija podešena je na 95oC u toku 5 minuta, a sledilo je 30

ciklusa sa fazama denaturacije na 95oC 1 minut, vezivanja prajmera na 60oC 1 minut i

elongacije na 72oC 2 minuta. Amplifikovani produkti podvrgnuti su restrikcionoj

digestiji sa HhaI endonukleazom u toku 3h na 37oC, nakon čega su produkti restrikcione

digestije razdvojeni na 4% Metaphore agaroznom gelu u postupku elektroforeze na

konstantnoj voltaži 100V. Nakon razdvajanja produkti digestije vizualizovani su

bojenjem etidijum bromidom pod UV transiluminatorom i gelovi su fotografisani

Polaroid kamerom. DNK profil svake osobe u odnosu na apoE gen je određen, i

utvrđeno je da li je osoba homozigot ili heterozigot kao i koje alele nosi u svom

genotipu.

3.2.5. Statistička obrada i prezentacija rezultata

Istraživački pristup u ovom radu, u osnovi kvantitativan i induktivan, zasniva se

na statističkoj analizi prikupljenih podataka. Statistički proračuni su izvedeni upotrebom

softverskog paketa Statistica 8.0. U analizama su korišćeni sledeći testovi: Studentov t

test za poređenje srednjih vrednosti; Principle Coordinate Analiza za detekciju

parametara koji razdvajaju grupe; korelaciona analiza izračunavanjem Pirsonovog

(Pearson) koeficijenta korelacije; Mann Whitney χ² test za komparaciju

neparametrijskih parametara i utvrđivanje razlika u genotipskim i alelskim

frekvencijama među grupama sa korekcijom za male uzorke. Nivo statističke

značajnosti postavljen je na p ≤ 0.05.

17

4. REZULTATI

U radu je ukupno pregledano i opisanim metodama analizirano 60 ispitanika,

podeljenih u dve grupe. Grupu ispitanika činilo je 30 bolesnika sa utvrđenom

ishemijskom bolešću srca. Kontrolnu grupu činilo je 30 zdravih ispitanika. Kod svih

ispitanika uspešno je sproveden fizički pregled i uzeti su neophodni anamnestički

podaci. Svi navedeni biohemijski parametri izmereni su kod svih ispitanika, iako je u

sedam slučajeva analiza zahtevala ponavljanje pojedinih parametara. U grupi ispitanika

uspešno je determinisan genotip apoE gena svake osobe. U kontrolnoj grupi za 5

ispitanika je i pored ponavljane analize amplifikacija apoE gena bila neuspešna kod dve

osobe, a detekcija genotipa kod tri osobe.

U prvom delu statističkih analiza rezultata, ispitanici su podeljeni u dve grupe

prema dizajnu istraživanja. Za određene anamnestičke podatke i biohemijske parametre

predstavljene numeričkim obeležjima, izračunati su osnovni parametri deskriptivne

statistike (Tabela 1). Primenom Studentovog t testa utvrđene su razlike u pojedinim

parametrima između ispitivane i kontrolne grupe (Tabela 1). Pokazana je značajno veća

vrednost dijastolnog krvnog pritiska, BMI i procenta masne mase u ispitivanoj grupi.

Takođe, utvrđena je veoma značajno veća vrednost sistolnog krvnog pritiska, obima

struka, triglicerida, insulina i CRP u ispitivanoj grupi.

Grafički su predstavljene srednje vrednosti merenih parametara zajedno sa

opsegom variranja (Grafik 1 i Grafik 2). Poređenjem prikazanih grafika uočava se pored

navedenih razlika u srednjim vrednostima, i razlika u opsegu variranja pojedinih

parametara, koja postaje očigledna i ukazuje na postojanje ekstrema u obe grupe.

Tabela 1. Poređenje merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara između

ispitivane i kontrolne grupe

parametar vrednost Ispitivana grupa

Kontrolna grupa

p

Uzrast (god) x±SD 39.2±4.5 32.8±6.1 0.06mediana 40 32opseg 25 – 45 23 – 45

Sistolni pritisak** (mmHg)

x±SD 138.2±9.7 125.8±8.9 0.00001mediana 140 125opseg 110 – 160 110 – 140

Dijastolni pritisak* (mmHg)

x±SD 89.5±9.0 84±7.3 0.017mediana 90 80opseg 70 – 100 70 – 100

Telesna masa (kg)

x±SD 96.1±11.3 91.9±13.9 0.223mediana 96.5 90opseg 65 – 123 70 – 125

18

Telesna visina (cm)


obim struka (cm)**


BMI (kg/m2)* x±SD 29.3±2.8 27.3±3.6 0.032mediana 29.2 27opseg 21.5 – 36.5 22.5 – 36.3

% masne mase*

x±SD 25.9±3.8 21.1±5.2 0.0002mediana 25.5 20.6opseg 14.9 – 36.5 12.5 – 30.4

Ukupni holesterol (mmol/l)

x±SD 5.1±0.9 5.6±0.9 0.051mediana 4.95 5.51opseg 3.9 – 9 4.27 – 7.82

Trigliceridi (mmol/l)**


HDL holesterol (mmol/l)


LDL holesterol (mmol/l)


IA x±SD 3.1±1.1 3.5±0.8 0.214mediana 2.86 3.44opseg 1.27 – 5.93 2.36 – 5.35

glikemija (mmol/l)

x±SD 4.9±1.4 4.8±0.8 0.821mediana 4.6 4.8opseg 3.7 – 11 3.3 – 6.1

Insulin (μlU/ml)**

x±SD 30.1±26.5 9.5±4.2 0.0003mediana 21.5 9opseg 2.11 – 103 3.4 – 21.1

HOMA IR ** x±SD 6.5±5.8 2.1±1.1 0.0004mediana 4.42 2opseg 0.43 – 22.37 0.7 – 5.06

Fibrinogen (g/l)


CRP (U/ml)**

x±SD 5.1±5.3 1.5±2 0.003mediana 3.95 0.6opseg 0.36 - 31 0.1 – 8.8

* p<0.05; **p<0.01

19

Grafik 1. Srednje vrednosti, standardna devijacija i opseg variranja antropometrijskih i

biohemijskih parametara u ispitivanoj grupi


biohemijskih parametara u kontrolnoj grupi

PCO analiza merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara u ispitivanoj i

kontrolnoj grupi ukazuje na veliko preklapanje u veličini parametara ove dve grupe,

iako ih u prve dve dimenzije na nivou od 50% razdvajaju obim struka, BMI, % masti,

IA, insulin i HOMA IR (Grafik 3). Navedeni parametri dakle ukazuju na pripadnost

pojedinog subjekta određenoj grupi.

20

sist

olni

prit

isak

tele

sna

mas

a

obim

str

uka

% m

asne

mas

e

trig

licer

idi

LDL

glik

emija

HO

MA

IR

CR

P

sist

olni

prit

isak

tele

sna

mas

a

obim

str

uka

% m

asne

mas

e

trig

licer

idi

LDL

glik

emija

HO

MA

IR

CR

P

dija

stol

nidi

jast

olni

prit

isak

Grafik 3. PCO analiza parametara varijabilnosti u ispitivanoj i kontrolnoj grupi

21

Tabela 2. Korelacija merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara obe grupe ispitanika

god. gornji pritisak

donji pritisak

težina visina SAD BMI % masti

holesterol

TRL HDL LDL IA ŠUK insulin HOMA IR

fibrinogen

CRP

Uzrast 1.00 0.44** 0.15 -0.18 -0.40** 0.03 0.10 0.29* -0.03 0.40** -0.07 -0.10 -0.01 -0.18 0.15 0.10 0.19 0.34*Sistolni krvni pritisak

1.00 0.62**

0.09 -0.38** 0.30* 0.39** 0.47** -0.08 0.37** -0.33* -0.18 0.07 -0.04 0.38** 0.34* 0.21 0.34*

Dijastolni krvni pritisak

1.00 0.12 -0.14 0.23 0.25 0.26* 0.07 0.14 -0.14 -0.04 0.07 0.05 0.11 0.15 0.07 0.25

TM 1.00 0.51** 0.76** 0.74** 0.68** -0.07 0.14 -0.04 -0.17 -0.12 0.17 0.28* 0.31* -0.11 0.07TV 1.00 0.14 -0.17 -0.09 0.04 -0.24 0.26 0.06 -0.13 0.21 -0.11 -0.02 -0.10 -0.29*obim struka 1.00 0.77** 0.77** -0.23 0.31* -0.21 -0.31* -0.11 0.07 0.48** 0.47** 0.04 0.26BMI 1.00 0.86** -0.10 0.35** -0.27* -0.22 -0.01 0.02 0.41** 0.38** -0.03 0.29*% masne mase

1.00 -0.26 0.44** -0.27* -0.37** -0.12 0.01 0.37** 0.33* -0.04 0.26

ukupni holesterol

1.00 0.09 0.18 0.86** 0.58** -0.07 -0.14 -0.14 0.16 0.001

TG 1.00 -0.25 -0.20 -0.04 -0.01 0.39* 0.36** 0.29** 0.23HDL holesterol

1.00 0.20 -0.51** 0.21 -0.19 -0.08 -0.33* -0.01

LDL holesterol

1.00 0.72** -0.13 -0.27* -0.27* 0.17 -0.03

IA 1.00 -0.25 -0.13 -0.20 0.39** 0.001Glikemija 1.00 0.02 0.29* -0.14 0.07Insulin 1.00 0.94** 0.17 0.46**HOMA IR 1.00 0.15 0.54**Fibrinogen 1.00 0.30*CRP 1.00

* p<0.05 **p<0.01

22

Tabela 3. Korelacija merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara u ispitivanoj grupi

godine gornji pritisak

donji pritisak

težina visina SAD BMI % masti holesterol TRL HDL LDL IA ŠUK insulin HOMA IR

fibrinogen CRP

Uzrast 1.00 0.52** 0.22 -0.46* -0.59** -0.34 0.03 0.16 0.07 0.36 -0.21 0.04 0.18 -0.31 -0.16 -0.22 0.30 0.23Sistolni krvni pritisak

1.00 0.53** -0.25 -0.48** -0.05 0.18 0.24 0.03 0.18 -0.41* 0.02 0.30 -0.03 0.20 0.13 0.16 0.19


1.00 -0.13 -0.22 -0.04 0.09 0.006 0.26 0.02 -0.24 0.15 0.31 0.12 -0.04 0.02 0.12 0.22

TM 1.00 0.65** 0.74** 0.60** 0.51** -0.20 -0.04 0.09 -0.17 -0.18 0.01 0.26 0.28 -0.18 0.004TV 1.00 0.10 -0.21 -0.14 0.04 -0.23 0.30 0.02 -0.21 0.23 -0.06 0.06 -0.28 -0.26obim struka

1.00 0.84** 0.70** -0.29 0.11 -0.10 -0.24 -0.09 -0.05 0.40* 0.36* -0.006 0.16

BMI 1.00 0.80** -0.29 0.20 -0.18 -0.24 -0.03 -0.20 0.40* 0.32 0.06 0.27% masne mase

1.00 -0.46* 0.27 -0.17 -0.37* -0.13 -0.22 0.21 0.14 -0.09 0.16

ukupni holesterol

1.00 0.15 0.09 0.81** 0.49** -0.01 -0.05 -0.05 0.46* 0.05

TG 1.00 -0.18 -0.15 -0.05 -0.06 0.25 0.21 0.40* 0.07HDL holesterol

1.00 0.08 -0.63** 0.32 -0.09 0.05 -0.32 0.10

LDL holesterol

1.00 0.69** -0.05 -0.16 -0.17 0.39* 0.07

IA 1.00 -0.23 -0.11 -0.20 0.52* 0.002Glikemija 1.00 -0.01 0.31 -0.12 0.12Insulin 1.00 0.93** 0.07 0.36HOMA IR 1.00 0.05 0.47**Fibrinogen 1.00 0.19CRP 1.00

* p<0.05 **p<0.01

23

Tabela 4. Korelacija merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara u kontrolnoj grupi

godine gornji pritisak

donji pritisak

težina visina SAD BMI % masti holesterol TRL HDL LDL IA ŠUK insulin HOMA IR

fibrinogen CRP

Uzrast 1.00 -0.08 -0.27 -0.21 -0.18 -0.18 -0.12 -0.003 0.18 0.08 0.39 0.20 -0.001 -0.16 -0.35 -0.32 -0.05 0.13Sistolni krvni pritisak

1.00 0.63** 0.27 -0.15 0.25 0.39 0.33 0.15 0.24 0.005 0.06 0.04 -0.17 0.13 0.09 0.04 0.09


1.00 0.32 0.11 0.32 0.28 0.29 0.04 -0.04 0.29 -0.01 -0.22 -0.17 -0.03 -0.04 -0.13 -0.11

TM 1.00 0.48* 0.82** 0.83** 0.82** 0.14 0.43* -0.16 -0.06 0.007 0.46* 0.58** 0.66** -0.14 -0.002TV 1.00 0.44* -0.06 0.11 -0.07 -0.08 0.09 -0.04 -0.10 0.20 0.14 0.18 0.15 -0.31obim struka

1.00 0.68** 0.75** 0.05 0.34 -0.20 -0.07 0.03 0.33 0.52** 0.58** -0.14 -0.02

BMI 1.00 0.89** 0.21 0.53** -0.32 -0.01 0.16 0.37 0.61** 0.66** -0.23 0.14% masne mase

1.00 0.12 0.52** -0.28 -0.10 0.05 0.33 0.45* 0.49* -0.26 -0.02

ukupni holesterol

1.00 0.57** 0.22 0.92** 0.71** -0.20 0.17 0.14 0.06 0.40*

TG 1.00 -0.27 0.29 0.42* 0.12 0.28 0.30 -0.04 0.18HDL holesterol

1.00 0.26 -0.38 -0.09 -0.45* -0.35 -0.32 -0.07

LDL holesterol

1.00 0.78** -0.31 0.15 0.08 0.22 0.43*

IA 1.00 -0.26 0.42* 0.29 0.44* 0.43*Glikemija 1.00 0.35 0.59** -0.24 -0.22Insulin 1.00 0.95** 0.19 0.07HOMA IR 1.00 0.08 0.03Fibrinogen 1.00 0.44*CRP 1.00

* p<0.05 **p<0.01

24

Pokazalo se interesantno utvrđivanje korelacije pojedinih antropometrijskih i

biohemijskih parametara kod ispitanika zajedno, kao i u ispitivanoj i kontrolnoj grupi.

Rezultati su prikazani u tabelama 2. , 3. i 4.

Direktnim očitavanjem sa gelova utvrđeni su prisutni genotipovi u ispitivanoj i

kontrolnoj grupi. Statističkom analizom utvrđena je značajna razlika u distribuciji

genotipova između ove dve grupe. Pokazana je statistički značajno veća frekvencija

genotipa e3e4 u ispitivanoj grupi u odnosu na kontrolnu grupu. (Tabela 5).

Tabela 5. Distribucija apoE genotipova u grupi pacijenata i kontrolnoj grupi

n e3e3 e3e4 e2e4 e4e4 e2e3 pispitivana grupa

30 16 (53.33%) 13 (43.33%) 1 (3.34%) 0 0 0.038*

kontrolna grupa

25 19 (76%) 4 (16%) 0 1 (4%) 1 (4%)

*p<0.05

Pored potvrđene statističke značajnosti, na poligonu učestalosti genotipova u

ispitivanoj i kontrolnoj grupi oučava se veći broj genotipa e3e4 u ispitivanoj grupi u

odnosu na kontrolnu grupu (Grafik 4).

Ovakav nalaz se istakao pri analizi razlika u distribuciji alela između ispitivane i

kontrolne grupe. Naime, pokazana je značajna razlika u učestalosti pojedinih alela apoE

gena između ove dve grupe. Bilateralni χ2 test pokazuje da je ova razlika posledica

razlike u učestalosti alela e4. Pokazano je značajno veće prisustvo alela e4 u grupi

pacijenata u odnosu na kontrolnu grupu, p=0.019 (Tabela 6).

Tabela 6. Distribucija apoE alela u ispitivanoj i kontrolnoj grupi

e3 e4 e2 ukupnoispitivana grupa

45 (75%) 14 (23.33%) 1 (1.67%)

kontrolna grupa

43 (86%) 6 (12%) 1 (2%)

p 0.633 0.019* 0.898 0.011** p<0.05

25

Grafik 4. Grafički prikaz distribucije genotipova apoE gena u ispitivanoj i kontrolnoj

grupi

Obzirom da je alelni polimorfizam apoE gena nasledni faktor rizika za razvoj

ishemijske bolesti srca, ispitanike u ovom istraživanju smo podelili u dve grupe u

odnosu na dobijene anamnestičke podatke. Prvu grupu činili su ispitanici koji su imali

pozitivnu porodičnu anamnezu (n=17), a drugu grupu ispitanici sa negativnom

porodičnom anamnezom (n=43). Prema planiranju istraživanja, u kontrolnoj grupi nisu

bili uključeni ispitanici sa pozitivnom porodičnom anamnezom, dok je 13 ispitanika

(43.33%) iz grupe bolesnika imalo negativnu porodičnu anamnezu. Svi izmereni

antropometrijski i biohemijski parametri upoređeni su primenom t testa između ove dve

grupe (Tabela 7). Pokazan je značajno veći BMI i % masne mase kod ispitanika sa

pozitivnom porodičnom anamnezom. Veoma značajno veća starost, sistolni krvni

pritisak, obim struka, insulin i HOMA IR određeni su za grupu ispitanika sa pozitivnom

porodičnom anamnezom (Tabela 7).

%

pacijenti

kontrola

26

Tabela 7. Poređenje merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara među

grupama ispitanika sa pozitivnom i negativnom porodičnom anamnezom

parametar pozitivna (x±SD) negativna (x±SD) pUzrast (god)** 39.7±3.7 34.8±6.4 0.005Sistolni pritisak** (mmHg)

139.7±9.4 129.3±10.5 0.0009

Dijastolni pritisak (mmHg)

90.0±8.3 85.6±8.6 0.080

Telesna masa (kg) 96.3±9.5 93.3±13.8 0.425Telesna visina (cm) 179.8±8.2 183.7±7.9 0.095Obim struka** (cm)

106.7±7.6 98.7±9.9 0.005

BMI* (kg/m2) 29.8±2.6 27.7±3.4 0.028% masne mase* 26.5±3.6 22.4±5.1 0.004Ukupni holesterol (mmol/l)

5.5±1.1 4.9±0.6 0.067

TG (mmol/l) 2.7±1.3 1.9±1.6 0.105HDL-holesterol (mmol/l)

1.0±0.2 1.1±0.2 0.107

LDL-holesterol (mmol/l)

3.6±1.0 2.9±0.7 0.113

IA 3.0±1.1 3.4±1.0 0.298Glikemija (mmol/l) 5.1±1.7 4.7±0.8 0.264Insulin** (μlU/ml) 35.0±30.5 14.6±13.7 0.001HOMA-IR** 7.7±6.5 3.1±3.0 0.0007Fibrinogen (g/l) 3.3±0.5 3.2±0.7 0.811CRP (U/ml) 5.4±6.9 2.6±2.6 0.032* p<0.05 **p<0.01

Analiza distribucije apoE genotipova između grupa ispitanika sa pozitivnom i

negativnom porodičnom anamnezom, pokazala je da postoji značajna razlika u

frekvenciji genotipova između grupa sa pozitivnom i negativnom porodičnom

anamnezom. Uočava se značajno veća frekvencija genotipa e3e3 u grupi ispitanika sa

negativnom porodičnom anamnezom u odnosu na grupu sa pozitivnom porodičnom

anamnezom (Tabela 8).

Tabela 8. Distribucija apoE genotipova u grupama ispitanika sa pozitivnom i

negativnom porodičnom anamnezom

n e3e3 e3e4 e2e4 e4e4 e2e3 p

pozitivna 17 7 (41.18%) 9 (52.94%) 1 (5.88%) 0 0 0.017

negativna 38 28 (73.68%) 8 (21.05%) 0 1 (2.63%) 1 (2.63%)

* p<0.05

27

Grafik 5. Grafički prikaz distribucije genotipova apoE gena u grupama ispitanika sa

pozitivnom i negativnom porodičnom anamnezom

Ovakav nalaz je veoma očigledan u grafičkom prikazu distribucije genotipova

apoE gena ove dve grupe (Grafik 5). Istom analizom nije pokazana statistički značajna

razlika u distribuciji alela apoE gena unutar ove dve grupe (Tabela 9).

Tabela 9. Distribucija apoE alela u grupama ispitanika sa pozitivnom i negativnom

porodičnom anamnezom

e3 e4 e2 ukupnopozitivna 23 (67.65%) 10 (29.41%) 1 (2.94%)negativna 65 (85.53%) 10 (13.16%) 1 (1.31%)p 0.461 0.097 0.564 0.097

U nekim istraživanjima pokazano je da je apoE genotip faktor rizika samo kod

osoba koje puše, tako da su u narednim analizama svi ispitanici podeljeni u dve grupe:

pušači i nepušači. Među ispitanicima bilo je 33 pušača (55%), i 27 nepušača (45%).

Poređene su srednje vrednosti merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara

između ove dve grupe. Utvrđena je značajno veća starost, BMI, % masne mase, i CRP u

grupi pušača u odnosu na nepušače. U grupi nepušača utvrđene su statistički značajno

veće vrednosti za parametre: telesna visina i LDL holesterol. Veoma značajno više

vrednosti sistolnog krvnog pritiska, triglicerida, insulina i HOMA IR nađene su u grupi

pušača (Tabela 10).

pozitivna

negativna

%

28


grupama ispitanika pušača i nepušača

parametar pušači (x±SD) nepušači (x±SD) pUzrast (god)* 38.0±4.8 34.1±7.0 0.017Sistolni pritisak** (mmHg)

136.6±9.0 127.3±11.7 0.001

Dijastolni pritisak (mmHg)

87.6±8.3 86.2±9.2 0.578

Telesna masa (kg) 94.2±9.3 94.1±16.1 0.965Telesna visina (cm)*

180.1±5.5 185.7±9.9 0.010

Obim struka (cm) 102.1±9.8 100.1±10.1 0.470BMI* (kg/m2) 29.2±2.9 27.4±3.6 0.044% masne mase* 25.0±4.6 22.0±5.1 0.025Ukupni holesterol (mmol/l)

5.2±1.0 5.4±0.9 0.485

TG (mmol/l) ** 2.7±1.8 1.5±0.7 0.004HDL-holesterol (mmol/l)

1.0±0.2 1.1±0.2 0.801

LDL-holesterol (mmol/l) *

3.1±1.0 3.7±0.8 0.045

IA 3.1±1.1 3.4±0.8 0.147Glikemija (mmol/l) 4.8±1.3 4.8±0.9 0.999Insulin** (μlU/ml) 27.7±26.4 12.1±10.7 0.009HOMA-IR* 5.9±5.7 2.7±2.7 0.012Fibrinogen (g/l) 3.3±0.6 3.1±0.6 0.279CRP (U/ml)* 4.6±5.6 1.9±1.8 0.025

* p<0.05 **p<0.01

Tabela 11. Distribucija apoE genotipova u grupama ispitanika pušača i nepušača

n e3e3 e3e4 e2e4 e4e4 e2e3 pda 31 18 (58.06%) 12 (38.71%) 1 (3.22%) 0 0 0.988ne 24 17 (70.83%) 5 (20.83%) 0 1 (4.17%) 1 (4.17%)

Analiza distribucije apoE genotipova u grupama pušača i nepušača, nije

pokazala značajne razlike u frekvencijama pojedinih genotipova između ove dve grupe

(Tabela 11). Ovakav nalaz se uočava i na poligonu distribucije genotipova apoE gena u

grupama ispitanika koji puše i koji ne puše (Grafik 6).

Statistički značajna razlika u distribuciji alela apoE gena u grupi pušača i grupi

nepušača takođe nije nađena na analiziranom uzorku (Tabela 12).

Tabela 12. Distribucija apoE alela u grupama ispitanika koji puše i koji ne puše

e3 e4 e2 ukupnoda 48 (77.42%) 13 (20.97%) 1 (1.61%)ne 40 (83.33%) 7 (14.58%) 1 (2.08%)p 0.798 0.472 0.857 0.473

29

Grafik 6. Grafički prikaz distribucije genotipova apoE gena u grupama ispitanika koji

puše i koji ne puše

U cilju što sveobuhvatnijeg sagledavanja uticaja polimorfizama apoE gena na

određene antropometrijske i biohemijske parametre, i na razvoj ishemijske bolesti srca,

svi ispitanici su podeljeni u dve grupe. Prvu grupu činili su ispitanici genotipa e3e3, a

drugu grupu ispitanici genotipa e3e4 (Slika 2). Obzirom da su se genotipovi e2e3, e2e4

i e4e4 javili samo u pojedinačnim slučajevima, karakteristike ovih genotipova su

opisane kao prikaz slučaja i oni su izuzeti iz daljih statističkih analiza (Slika 2 i Slika 3).

Osoba genotipa e2e3 pripadala je kontrolnoj grupi. Uzrasta je 45 godina, krvni

pritisak 130/80mmHg. BMI 22.5 kg/m2, procenat masne mase 16.8%. Ukupni holesterol

4.69 mmol/l, trigliceridi 1.31 mmol/l, HDL holesterol 1.12 mmol/l, LDL holesterol 2.97

mmol/l, IA 2.66, glikemija 4.6 mmol/l, insulin 3.4 μlU/ml, HOMA IR 0.7, fibrinogen

3.26g/l, CRP 0.1U/ml.

Osoba genotipa e2e4 pripadala je grupi ispitanika, uzrasta 43 godine, krvni

pritisak 140/80 mmHg. Ima pozitivnu porodičnu anamnezu i pušač je. BMI 32.9kg/m2,

% masne mase 31.7, ukupni holesterol 4.6 mmol/l, trigliceridi 5 mmol/l, HDL holesterol

0.97 mmol/l, LDL holesterol 3.5 mmol/l, IA 3.65, glikemija 4.2 mmol/l, insulin 24.4

μlU/ml, HOMA-IR 4.55, fibrinogen 3.6 g/l, CRP 9.1 U/ml.

Osoba genotipa e4e4 je pripadala kontrolnoj grupi, uzrasta 35 godina, krvni

pritisak 140/100 mmHg. Nema pozitivnu porodičnu anamnezu i nije pušač. BMI

25.5kg/m2, % masne mase 17.3, ukupni holesterol 7.01 mmol/l, trigliceridi 1.18 mmol/l,

HDL holesterol 1.37 mmol/l, LDL holesterol 5.1 mmol/l, IA 3.73, glikemija 3.3 mmol/l,

insulin 4.8 μlU/ml, HOMA IR 0.7, fibrinogen 2.67 g/l, CRP 0.2 U/ml.

da

ne

%

30

e3e3 e3e4 e4e4

Slika 2. RFLP profil genotipa e3e3, e3e4 i e4e4

e2e4 e2e3 neuspešno

Slika 3. RFLP profil genotipa e2e4, e2e3 i neuspešna analiza

Poređenjem merenih antropometrijskih i biohemijskih parametara među

grupama ispitanika genotipova e3e3 i e3e4, pokazano je da je u grupi ispitanika

genotipa e3e4 statistički značajno veći obim struka, BMI, insulin i HOMA IR (Tabela

13). Za ostale parametre nije nađena statistički značajna razlika.


grupama ispitanika genotipova e3e3 i e3e4

parametar vrednost e3e3 e3e4 pUzrast (god) x±SD 35.8±5.7 36.5±7.0 0.701

mediana 37 38opseg 24-45 23-45

Sistolni krvni pritisak (mmHg)

x±SD 130.7±10.8 135.6±12.1 0.149mediana 130 140opseg 110-150 110-160

Dijastolni krvni pritisak (mmHg)


Telesna masa (kg)

x±SD 92.8±12.2 98.7±12.6 0.112mediana 94 96.5opseg 65-118 81-125

31

Telesna visina (cm)


Obim struka (cm)*


BMI (kg/m2)* x±SD 27.9±3.08 29.7±3.2 0.048mediana 27.8 28.4opseg 21.5-36.3 24.5-36.5

% masne mase*

x±SD 23.0±5.0 25.5±4.3 0.087mediana 24.5 25.2opseg 12.5-30.6 16.1-36.5

Ukupni holesterol (mmol/l)

x±SD 5.3±1.0 5.3±0.8 0.920mediana 5 5.3opseg 3.9-9.0 4.0-7.1

Trigliceridi (mmol/l)


HDL holesterol (mmol/l)


LDL holesterol (mmol/l)


IA x±SD 3.3±1.1 3.1±1.0 0.397mediana 3.3 2.76opseg 1.49-5.93 1.27-4.96

Glikemija (mmol/l)


Insulin (μlU/ml)**

x±SD 15.7±19.3 33.3±25.0 0.007mediana 9 23.1opseg 2.11-103 4.72-79.9

HOMA IR ** x±SD 3.4±3.8 7.3±6.0 0.006mediana 2 4.62opseg 0.43-17.85 1.05-22.37

Fibrinogen (g/l)


CRP (U/ml) x±SD 2.9±2.5 4.5±7.1 0.258mediana 3.29 2.7opseg 0.1-10.9 0.30-31.0

Parametri deskriptivne statistike za grupu pacijenata genotipa e3e3 (Grafik 7) i

grupu ispitanika genotipa e3e4 (Grafik 8) prikazani su i grafički.

32


biohemijskih parametara u grupi ispitanika genotipa e3e3 (x-osa: 1-uzrast; 2-sistolni

krvni pritisak; 3-dijastolni krvni pritisak; 4-telesna masa; 5-telesna visina; 6-obim

struka; 7-BMI; 8-% masne mase; 9-ukupni holesterol; 10-TG; 11-HDL holesterol; 12-

LDL holesterol; 13-IA; 14-glikemija; 15-insulin; 16-HOMA IR; 17-fibrinogen; 18-

CRP)


biohemijskih parametara u grupi ispitanika genotipa e3e4 (x-osa: 1-uzrast; 2-sistolni

krvni pritisak; 3-dijastolni krvni pritisak; 4-telesna masa; 5-telesna visina; 6-obim

struka; 7-BMI; 8-% masne mase; 9-ukupni holesterol; 10-TG; 11-HDL holesterol; 12-

LDL holesterol; 13-IA; 14-glikemija; 15-insulin; 16-HOMA IR; 17-fibrinogen; 18-

CRP)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

33

Primenom PCO analize, u nivou 50%, definisani su odnosvni faktori koji

razdvajaju grupe genotipova e3e3 i e3e4 u dve zasebne grupe i to su: obim struka, BMI,

% masne mase, IA, insulin, HOMA IR (Grafik 9).

Grafik 9. PCO analiza parametara varijabilnosti u grupi ispitanika genotipa e3e3 i e3e4

34

5. DISKUSIJA

Polimorfizam apoE gena ispitan je kod 60 osoba, od kojih trideset pripada grupi

bolesnika sa utvrđenom ishemijskom bolešću srca, a trideset ispitanika čine kontrolnu

grupu. Pored utvrđivanja genotipa svake osobe, urađen je fizički pregled, uzeti su

anamnestički podaci i izmereni pojedini biohemijski parametri. Genotip apoE gena

svake osobe uspešno je određen kod 55 (91.7%) ispitanika.

Uzrok neuspešne analize kod 5 ispitanika (8.3%) može biti različit. Naime,

neuspešna amplifikacija, koja je bila prisutna u dva slučaja, i pored ponavljanja i

modifikacije programa se može objasniti prisustvom mutacije u prajmer vezujućem

regionu gena, čime je onemogućena PCR reakcija i dobijanje produkta. U tri slučaja

produkt PCR reakcije je dobijen, ali su nakon restrikcione digestije, dobijeni RFLP

profili koji nisu mogli biti očitani, što može da ukaže na prisustvo novih restrikcionih

mesta u amplifikovanom regionu egzona 4 apoE gena. Ovakav nalaz ukazuje da se apoE

gen tih subjekata mora dalje analizirati primenom molekularnih analiza veće rezolucije,

npr. sekvenciranjem, čime bi se utvrdilo prisustvo i priroda mutacija.

Day i Wilson (2001) su ukazali da prilikom dijagnostičkih procedura treba

uvesti i genotipizaciju i fenotipizaciju apoE gena u kliničku praksu, zbog

modifikovanog odgovora organizma na ostale faktore rizika za razvoj IBS zavisnog od

genotipa. Od ranije poznate metode fenotipizacije ApoE proteina, trebalo bi ujednačiti

primenom fenotipizacije ApoE izoformi izoelektričnim fokusiranjem, koje potpuno

odgovara RFLP-PCR analizi primenom HhaI endonukleaze (Kontula i sar., 1990).

Dakle, zavisno od kapaciteta i opremljenosti laboratorije jedna od ove dve tehnike je

dovoljna za analizu apoE varijanti. Sa razvojem metoda molekularne genetike i

smanjivanjem troškova analiza, kao i na osnovu rezultata ovog istraživanja, detekcija

apoE genotipa primenom RFLP-PCR analize egzona 4 apoE gena sa HhaI restrikcionim

enzimom i analiza fragmenata na 4% agaroznom gelu predstavlja jednostavan,

elegantan i pouzdan metod detekcije apoE genotipa. Reymer i sar. (1995) su u procesu

genotipizacije imali nemogućnost detekcije u 8.33% slučajeva što je u saglasnosti sa

rezultatima ove studije, iako su Reymer i sar. (1995) koistili poliakrilamidne gelove za

vizualizaciju profila.

Poređenjem grupe ispitanika sa kontrolnom grupom pokazano je više statistički

značajnih razlika. U ispitivanoj grupi nađena je značajno veća vrednost sistolnog i

dijastolnog krvnog pritiska, obima struka, BMI i procenta masne mase, kao i nivoa

35

triglicerida, insulina (HOMA IR) i CRP. Iako nije utvrđena statistički značajna razlika

za većinu parametara, pa i za neke očekivane kao što je nivo LDL holesterola i ukupnog

holesterola, PCO analiza ukazuje da parametri obim struka, BMI, % masne mase, IA i

insulin (HOMA IR) predstavljaju osnovne diskriminante ove dve grupe.

Frikke-Schmidt i sar. (2004) pokazali su da postoji signifikantna razlika u nivou

ukupnog holesterola, LDL holesterola, HDL holesterola i triglicerida kod žena i

muškaraca, kao i u parametrima BMI i hipertenzija između pacijenata obolelih od IBS i

kontrola. U našem istraživanju nije pronađena razlika između ove dve grupe u nivou

ukupnog, HDL i LDL holesterola, dok je potvrđena veća vrednost krvnog pritiska, BMI

i nivoa triglicerida u grupi pacijenata. McCarthy i sar. (2004) su našli signifikantnu

razliku u krvnom pritisku i BMI između bolesnika obolelih od ishemijske bolesti srca i

kontrola. Takođe, März i sar. (2004) su našli značajne razlike u nivou krvnog pritiska

između pacijenata sa koronarnom bolešću arterija i kontrolama, ali nisu našli razlike u

LDL holesterolu, HDL holesterolu, trigliceridima, glikemiji, niti pušenju između ove

dve grupe. Kolovou i sar. (2002) takođe nisu utvrdili razlike u lipidnom statusu između

pacijenata sa IBS i kontrolne grupe. Činjenica je da je u istraživanjima u kojima je

nađena signifikantna razlika u lipidnom statusu bio uključen veći broj ispitanika 1309

(März i sar., 2004) i 9238 (Frikke Schmidt i sar., 2004) u odnosu na studije gde ova

veza nije determinisana (267 ispitanika kod Kolovou i sar. (2002)). Pored analiza

razlika u lipidnom statusu, Rubattu i sar. (2004) potvrdili su signifikantnu razliku u

nivou ukupnog holesterola među pacijentima sa ishemijskom bolesti srca i kontrolama,

ali nisu našli razliku u godinama, pušenju, konzumiranju alkohola i hipertenziji. I u

ranijim studijama na populaciji Vojvodine ustanovljena je značajna korelacija obima

struka i BMI sa nastankom kardiovaskularnih oboljenja (Ivanov, 2006). Dakle, može se

zaključiti da detektovane razlike delimično zavise i od same ispitivane populacije, kao i

od veličine ispitivanog uzorka u različitim studijama. Očitana p vrednost od p=0.06 za

nivo LDL holesterola nam ukazuje da bi povećanjem broja ispitanika u obe grupe

verovatno se ispoljila i statistički značajna razlika u ovom parametru.

Korelaciona analiza pojedinih antropometrijskih i biohemijskih parametara kod

svih ispitanika zajedno pokazala je nekoliko očekivanih korelacija kao što su pozitivna

korelacija uzrasta i sistolnog krvnog pritiska, BMI i procenta masne mase, triglicerida i

procenta masne mase itd.

Analiza istih parametara u ispitivanoj grupi pokazala je i neke nove korelacije.

Statistički značajna pozitivna korelacija nađena je između nivoa LDL holesterola i

fibrinogena, kao i indeksa ateroskleroze i fibrinogena.

36

Analiza svih merenih parametara u kontrolnoj grupi, pokazala i korelacije

sledećih parametara: pozitivnu korelaciju između težine i TG, težine i glikemije, visine i

obima struka, procenta masti i CRP, nivoa holesterola i TG, TG i indeksa ateroskleroze,

indeksa ateroskleroze i insulina, IA i CRP, a negativna korelacija između HDL

holesterola i insulina.

U grupi pacijenata uočava se statistički značajno veći broj osoba genotipa e3e4 u

odnosu na kontrolu. Analiza distribucije apoE alela u ispitivanoj i kontrolnoj grupi,

prema očekivanju otkriva statistički značajno veću frekvenciju alela e4 u ispitivanoj

grupi. I u drugim studijama nađena je slična korelacija prisustva alela e4 apoE gena i

nastanka ishemijske bolesti srca. U populaciji muškaraca Finske starijih od 65 godina

utvrđen je statistički veći mortalitet od ishemijskih oboljenja srca u grupi e3e4 genotipa

u odnosu na grupu e3e3 (Stengård i sar., 1999). Druge studije ukazuju na veću

učestalost alela e4 kod pacijenata sa IBS koji pored toga imaju još neki od faktora

rizika. Na primer, Guangda i sar. (1999) našli su veću učestalost alela e4 i to u formi

e3e4 genotipa u grupi pacijenata sa ishemijskom bolešću srca i insulin nezavisnim

tipom dijabetesa, u odnosu na grupu pacijenata sa insulin nezavisnim tipom dijabetesa i

bez istorije ishemijskog oboljenja srca. Framingham Heart Study analiza otkrila je da

prisustvo alela e4 kod muškaraca pokazuje pozitivnu korelaciju sa pojavom koronarnih

vaskularnih oboljenja, dok ova povezanost nije detektovana u grupi žena (Lahoz i sar.,

2001). Sa druge strane, analizom istih podataka nije nađena veza između apoE

polimorfizama i debljine intima media kod muškaraca, a ova korelacija je pokazana kod

žena (Elosua i sar., u štampi). U populaciji žena sa stenozom karotidne arterije većom

od 20% takođe je signifikantno veće prisustvo genotipova e3e4 i e4e4 u poređenju sa

kontrolom (Chen i sar., 2003). Takođe, analiza podataka iz Framinghamske studije

pokazala je da ne postoji povezanost u distribuciji alela apoE gena i rizika od

kardiovaskularnih oboljenja u grupi nepušača, dok je u grupi pušača pokazana veza e4

alela i kardiovaskularnih oboljenja (Talmud i sar., 2005). McCarthy i sar. (2004)

potvrdili su signifikantnu povezanost pojave ishemijske bolesti srca i apoE gena u

analizi 111 kandidat gena. Yamada i sar. (2002) pokazali su komparativnom analizom

112 polimorfizama u 71 genu da polimorfizam apoE gena ima aditivni efekat u

nastanku infarkta miokarda, sa alelom e4 kao rizik faktorom. Topol (2006) je pokazao

da infarkt miokarda iako kompleksan i multifaktorijalan događaj, predstavlja bolji

model za detekciju genetičke osnove infarkta miokarda, u odnosu na široki spektar

stanja obuhvaćena ishemijskom bolešću srca. Pojedine studije sa druge strane nisu našle

vezu alela e4 i nastanka infarkta miokarda. Kolovou i sar. (2002) su našli da je alel e2

37

oko 5 puta manje prisutan kod pacijenata sa koronarnom bolesti arterija koji su doživeli

infarkt miokarda u odnosu na pacijente sa koronarnom bolesti arterija koji nisu doživeli

infarkt miokarda, a statistički značajne razlike u frekvenciji e4 alela među ovim

grupama nisu nađene.

Poređenje ispitanika sa pozitivnom i negativnom porodičnom anamnezom za

ishemijsku bolest srca, nađena je značajno veća starosna dob, vrednost sistolnog krvnog

pritiska, obima struka, BMI, % masne mase, insulina i HOMA IR. Obzirom da je

ishemijska bolest srca multifaktorijalno oboljenje, očekivane su nađene korelacije.

Naime, podaci da je obim struka, BMI i % masne mase veći u grupi sa pozitivnom

porodičnom anamnezom ukazuje i da gojaznost kao jedan od faktora rizika za IBS,

predstavlja takođe multifaktorijalno oboljenje sa genetičkom osnovom, koja još uvek

treba da se do kraja otkrije (Stokić i sar., u štampi). Pored navedenog u grupi ispitanika

sa negativnom porodičnom anamnezom nađeno je statistički značajno veće prisustvo

genotipa e3e3 u odnosu na ispitanike sa pozitivnom porodičnom anamnezom. Iako

statistički značajne razlike u distribuciji alela e4 između ove dve grupe nisu nađene,

povećanjem analiziranog broja subjekata možda bi se ispoljila i ovakva korelacija

(p=0.097).

Talmud i sar. (2005) pokazali su da je alel e4 prisutan u većoj frekvenciji u grupi

pušača, i da je u toj grupi u pozitivnoj korelaciji sa nivoom LDL holesterola. U grupi

nepušača u istoj studiji nije pokazana veza apoE polimorfizama sa LDL holesterolom.

Frikke-Schmidt i sar. (2004) sa druge strane nisu našli nikakvu vezu između pušenja

kao faktora rizika i apoE genotipa i zajedničkog uticaja na razvoj ishemijske bolesti

srca. Ilveskoski i sar. (2000) takođe nisu našli korelaciju apoE genotipa i pušenja kao

faktora rizika. U ovoj studiji analizom ispitanika pušača i nepušača, u grupi pušača

nađene su statistički značajno veće vrednosti starosne dobi, sistolnog krvnog pritiska,

BMI, % masne mase, triglicerida, insulina (HOMA IR) i CRP. U grupi nepušača

utvrđene su statistički značajno veće vrednosti za parametre visina i LDL holesterol. Sa

jedne strane očekivano pušenje predstavlja jedan od faktora rizika koji dovodi do

povećanja krvnog pritiska i triglicerida, dok sa druge strane je najverovatnije sasvim

slučajno i pod uticajem samog uzorka činjenica da postoje razlike u visini i da je LDL

holesterol veći kod nepušača. Pored toga nije nađena razlika u učestalosti apoE

genotipova ni alela između ove dve grupe, tako da su se ova dva faktora rizika u ovom

istraživanju pokazali kao nezavisni.

Podela ispitanika na grupe e3e3 i e3e4 genotip otkrila je još korelacija

polimorfizma apoE gena i nekih od merenih antropometrijskih i biohemijskih

38

parametara. Naime, pokazano je da je u grupi ispitanika genotipa e3e4 statistički

značajno veći obim struka, BMI, insulin i HOMA IR, dok za ostale parametre nije

nađena statistički značajna razlika. Parametri koji razdvajaju grupe genotipova e3e3 i

e3e4 u dve zasebne grupe su: obim struka, BMI, % masne mase, IA, insulin, HOMA IR.

Brojne populacione studije dokazale su efekat apoE alela na koncentraciju lipida

u plazmi. Prosečan doprinos e4 alela u značajnom povećanju koncentracije totalnog

holesterola u zdravoj populaciji je dokazan, te je ovaj alel postavljen za predisponirajući

alel ateroskleroze. Prva istraživanja ukazala su da postoji razlika u nivou holesterola u

plazmi i apoE varijante genotipa. (Kontula i sar., 1990). Eggertsen i sar. (1993) uočili su

pozitivnu korelaciju alela e3 i e4 sa nivoom holesterola u serumu, kao i pozitivnu

korelaciju e4 sa LDL holesterolom, dok nije utvrđena veza polimorfizama apoE i HDL

holesterola i nivoa triglicerida u analiziranoj populaciji. Ilveskoski i sar. (2000) takođe

nisu našli korelaciju apoE genotipa sa parametrima HDL holesterol i krvni pritisak.

Chen i sar. (2003) dokazali su povezanost alela e4 i broja oboljenja krvnih sudova, kao i

vezu alela e4 i povećanim nivoom ukupnog i LDL holesterola. U populaciji dece iz

Portugala utvrđeno je da dece antropometrijski parametri, procenat masne mase i krvni

pritisak, kao ni nivo glukoze i HOMA IR vrednosti, nisu različiti među grupama e2e3,

e3e3 i e3e4, supotno našem istraživanju. Sa druge strane nivo ukupnog holesterola/HDL

i LDL/HDL, tj. indeksi ateroskleroze, bili su značajno veći kod grupe e3e4 u odnosu na

e2e3 i e3e3 (Guerra i sar., 2003). U ovom istraživanju, za razliku od drugih studija, nije

utvrđena statistički značajna razlika između grupa ispitanika genotipa e3e3 i e3e4 u

koncentraciji lipida u plazmi. Ukoliko se posmatra parametar nivo LDL holesterola,

uočava se da u grupi e3e3 on iznosi 3.0±0.8 mmol/l, a u grupi e3e4 3.5±1.0 mmol/l

(p=0.098). Interval poverenja u prikazanom istraživanju za analizirani parametar je

veoma širok (OR 2.23, CI 0.78 – 6.33), što pokazuje da sa poređenjem uzoraka od 30

ispitanika, ne može da se ispolji značajnost razlika u ovom parametru. To može biti

jedan od razloga što u ovom istraživanju nije uočena razlika u lipidnom statusu zavisna

od apoE polimorfizama. U istraživanjima drugih autora gde je ova veza dokazana broj

ispitanika se kreće od oko 250 pa sve do 10000. Činjenica da indeks ateroskleroze (koji

je direktno zavisan od nivoa lipidnih i lipoproteinskih parametara) jeste jedan od faktora

koji u PCO analiza razdvaja ove grupe, potvrđuje činjenicu da bi se uticaj apoE

polimorfizma na nivo lipida ispoljio sa povećanjem broja ispitanika.

Za razliku od rezultata ovog istraživanja, Raslova i sar. (2003) nisu našli

statistički značajnu razliku između prisustva različitih varijanti apoE gena i BMI, niti

nivoa glukoze, ali je pokazano da nosioci genotipa e2e2 i e2e3 imaju značajno manji

39

procenat masti u odnosu na ostale genotipove, kao i uticaj na nivo lipidni status kod

muškaraca.

Suprotno uticaju alela e4, iste studije pokazuju da prosečan efekat e2 alela jeste

da snižava koncentraciju ukupnog holesterola i to dva do tri puta manju u odnosu na

onu u prisustvu alela e4 (Alavantić, 1997). Na primer, Ilveskoski i sar. (2000) u mlađoj

populaciji muškaraca Finske, pokazuju da osobe genotipa e2e3 imaju značajno manju

koncentraciju ukupnog i LDL holesterola i manju debljinu intima media, u odnosu na

e3e3 genotip i nosioce e4 alela. U ovoj studiji nađene su samo dve osobe nosioci alela

e2. Kod osobe genotipa e2e3 ukupni holesterol bio je 4.69 mmol/l i LDL holesterol 2.97

mmol/l, a kod osobe genotipa e2e4 ukupni holesterol iznosio je 4.6 mmol/l i LDL

holesterol 3.5 mmol/l. Ove vrednosti kod obe osobe su ispod proseka grupe kojoj

pripadaju, što može da ukaže na delimično protektivnu ulogu alela e2, u smislu sniženja

vrednosti ukupnog i LDL holesterola.

Što se tiče biohemijskog parametra CRP, nivo CRP je signifikantno veći kod

pacijenata sa koronarnom bolešću arterija koji su nosioci alela e2 ili su homozigoti

e3e3, u odnosu na grupe e3e4 i e4e4, dok nije nađena statistički značajna razlika u

nivou fibrinogena (März i sar., 2004). Eiriksdottir i sar. (2006) takođe su pokazali da je

e4 alel apoE gena u negativnoj korelaciji sa nivoom CRP bez obzira na tretman

statinima u Reykjavik populacionoj studiji. U ovoj studiji kod osobe genotipa e2e4

nađen je visok nivo CRP 9.1U/ml u odnosu na ostale pacijente.

Poznato je da postoji razlika u varijabilnosti apoE gena između različitih

populacija. Frekvencija e4 alela u Evropi opada u pravcu sever – jug (Lepšanović i

Lepšanović, 2000). Uočena je povećana frekvencija e4 alela u populaciji Švedske od

20.3%, u odnosu na druge populacije Evrope (Egersten i sar., 1993). U populaciji

zdravih osoba Srbije alel e3 nađen je u 73.6% slučajeva, e2 14.9% i e4 11.5%

(Stanković i sar., 1999). U ovom istraživanju u populaciji zdravih osoba frekvencija e3

alela bila je 86%, e4 12% i e2 2%, gde se uočava smanjena frekvencija alela e2 i

povećana frekvencija alela e3. U grupi pacijenata obolelih od IBS povećana je

frekvencija e4 alela 23.33%, a smanjena e3 75%, a e2 iznosi 1.67%.

40

6. ZAKLJUČAK

U odnosu na postavljene radne hipoteze ovog istraživanja, mogu se izvesti

sledeći zaključci:

1. U grupi ispitanika obolelih od IBS i kontrolnoj grupi najčešći je bio alel e3, a

za njim slede e4 i e2. Učestalost e4 alela je značajno veća u ispitivanoj grupi i to u formi

genotipa e3e4. Time je prva hipoteza ovog istraživanja potvrđena.

2. Nije utvrđena korelacija frekvencije alela e4 ni u jednoj grupi ispitanika sa

parametrima lipidnog i lipoproteinskog statusa pa time ni sa nivoom LDL holesterola.

Time se druga hipoteza ovog istraživanja odbacuje. Ali, na osnovu rezultata statističkih

analiza može se zaključiti da je neophodno analizirati veći broj pacijenata.

3. Između ispitivane i kontrolne grupe nađena je značajna razlika u sledećim

biohemijskim parametrima: nivo triglicerida, insulina i CRP. Treća hipoteza ovog

istraživanja se potvrđuje.

4. Između ispitivane i kontrolne grupe ustanovljena je značajna razlika u

sledećim antropometrijskim parametrima: obim struka, BMI, i procenat masne mase,

kao i u vrednostima krvnog pritiska. Četvrta hipoteza ovog istraživanja se potvrđuje.

5. Srednja vrednost nivoa LDL holesterola u bolesnika ispitivane grupe nije

statistički značajno veća u odnosu na kontrolnu grupu, niti je veća u grupi ispitanika

e3e4 genotipa u odnosu na grupu e3e3. Time se peta hipoteza ovog istraživanja

odbacuje, sa napomenom da je neophodan veći uzorak za definitivnu korelaciju.

6. Pored ovih postavljenih hipoteza, pokazano je da je signifikantno veći

procenat osoba genotipa e3e3 u grupi ispitanika sa negativnom porodičnom anamnezom

u odnosu na ispitanike sa pozitivnom porodičnom anamnezom.

7. Pušenje kao faktor rizika za nastanak IBS i genotip apoE gena pokazali su se

kao nezavisni faktori u ovom istraživanju.

41

7. LITERATURA

Alavantić D. (1997) Genotipizacija apolipoproteina E: metode i značaj. U:

Metabolizam lipoproteina i njegovi poremećaji. Lepšanović L. (ed.), SLD-DLV, Novi

Sad. pp. 181-191

Araki S, Koya D, Makiishi T, Sugimoto T, Isono M, Kikkawa R. APOE

polymorphism and the progression of diabetic nephropathy in Japanese subjects with

type 2 diabetes: results of prospective observational follow-up study. Diabetes Care

2003; 26: 2416-2420

Bathum, L, Christiansen L, Jeune B, Vaupel J, McGue M, Christensen K. (2006)

Apolipoprotein E Genotypes: Relationship to Cognitive Functioning, Cognitive

Decline, and Survival in Nonagenarians JAGS 54:654–658, 2006

Benvenga S, Cahmann HJ, Robbins J. (1993) Characterization of thyroid

hormone binding to apolipoprotein E localization of the binding site in the exon 3

coding domain. Endocrinology 133: 1300-1305

Bossé Y, Pérusse L, Vohl MC. (2004) Genetics of LDL particle heterogeneity.

From genetic epidemiology to DNA-based variations. Journal of Lipid Research 45:

1008-1026

Botet J, Daly J, Ordovas J. Apolipoprotein E genotype and cardiovascular

disease in the Framingham heart study. Atherosclerosis 2001; 154: 529-537

Brscic E, Bargerone S, Gagnor A, Colajanni E, Matullo G, Scaglione L,

Cassander M, Gaschino G Di Leo M, Brusca A, Pagano GF, Piazza A, Trevi GP. Acute

myocardial infarction in young adults: prognostic role of angiotensin-converting

enzyme, angiotensin II type I receptor, apolipoprotein E, endothelial contitutive nitric

oxide synthase and glycoprotein Iia genetic polymorphism at medium-term follow-up.

Am Heart J 2000; 139: 979-984

Christoffersen C, Nielsen LB, Axler O, Andersson A, Johnsen AH, Dahlback B.

(2006) Isolation and characterization of human apolipoprotein M-containing

lipoproteins. Journal of Lipid Research 47: 1833-1843

Chen Q, Reis SE, Kammerer CM, McNamara DM, Holubkov R, Sharaf BL,

Sopko G, Pauly DF, Merz CNB, Kamboh I. (2003) APOE polymorphism and

angiographic coronary artery disease severity in the Women’s ischemia syndrome

evaluations (WISE) study. Atherosclerosis 169: 159-167

42

Davignon J, Gregg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and

atherosclerosis. Arteriosclerosis 1988; 8: 1-21

Day INM, Wilson DI. (2001) Genetics and cardiovascular risk. BMJ 323: 1409-

1412

Donnelly LA, Doney AS, Dannfald J, Whitley AL, Lang CC, Morris AD,

Donnan PT, Palmer CN. (2008) A paucimorphic variant in the HMG-CoA reductase

gene is associated with lipid-lowering response to statin treatment in diabetes: a

GoDARTS study. Pharmacogenet Genomics 18(12):1021-1026

Eggertsen G, Tegelman R, Ericsson S, Angelin B, Berglund L. (1993)

Apolipoprotein E Polymorphism in a Healthy Swedish Population: Variation of Allele

Frequency with Age and Relation to Serum Lipid Concentrations. Clinical Chemistry

vol 39(10): 2125-2129

Eiriksdottir G, Aspelund T, Bjarnadottir T, Olafsdottir K, Gudnason V. (2006)

Apolipoprotein E genotype and statins affect CRP levels through independent and

different mechanisms: AGES-Reykjavik Study. Atherosclerosis 186: 222-224

Elosua R, Ordovas JM, Cupples LA, Fox CS, Polak JF, Wolf PA, D’Agostino

RA, O’Donnell CJ. Association of APOE genotype with carotid atherosclerosis in men

and women: The Framingham Heart Study. APOE genotype and carotid atherosclerosis.

Journal of Lipid Research, u štampi

Eto M, Watanabe K, Ishii K. (1988) Apolipoprotein E alleles and

hyperlipoproteinemia in Japan. Clin Gen 34: 246-251.

Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS. (1972) Estimation of the

concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without use of

preparative ultracentrifuge. Clin Chem 18: 499-502

Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Schnohr P, Tybjærg-Hansen A. (2004)

Single nucleotide polymorphism in the low-density lipoprotein receptors is associated

with a threefold risk of stroke. European Heart Journal 25: 943-951

Gonzalez P, Garcia-Castro M, Reguero JR, Batalla A, Ordóñez AG, Palop RL,

Lozano I, Montes M, Alvarez V, Coto E. (2006) The pro279Leu variant in the

transcription factor MEF2A is associated with myocardial infarction. J Med Genet 43:

167-169

Guangda X, Bangshun X, Xiujian L, Yangzhong H. (1999) ApoE4 allele

increases the risk for exercise-induced silent myocardial ischemia in non-insulin-

dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis 147: 293-296.

43

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18815589?ordinalpos=77&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum



Guerra A, Rego C, Castro EMB, Seixas S, Rocha J. (2003) Influence of

apolipoprotein E poymorphism on cardiovascular risk factors in obese children. Annals

of Nutrition and Metabolism 47: 49-54

Hadži-Pešić Lj. Strategija primarne prevencije i rano otkrivanje ishemijske

bolesti srca. U: Prevencija i rano otkrivanje hroničnih bolesti, ed. Đukanović Lj.

Akademija medicinskih nauka Srpskog Lekarskog Društva, Beograd, 21-36, 2006.

Hixon JE, Vernier DT. (1990) Restriction isotyping of human apolipoprotein E

by gene amplification and cleavage with HhaI. Journal of Lipid Research volume

31:545-548

Ilveskoski E, Loimaala A, Mercuri MF, Lehtimäki T, Pasanene M, Nenonen A,

Oja P, Gene Bond M, Koivula T, Karhunen PJ, Vuori I. (2000) Apolipoprotein E

polymorphism and carotid artery intima-media thickness in a random sample of middle-

aged en. Atherosclerosis 153: 147-153

Ivanov Z. (2006) Veličina i specifična distribucija masne mase tela kao faktor

rizika za nastanak kardiovaskularnih obolenja kod radnika. Doktorska disertacija,

Univerzitet u Novom Sadu, Medicinski fakultet, Novi Sad.

Jakovljević Đ, Planojević M. Dvadeset godina Monica projekta u Novom Sadu.

Institut za kardiovaskularne bolesti Sremska Kamenica. Novi Sad 2005.

Jones CM, Athanasios T, Dunne N. Et al. Multi-slice computed tomography in

coronary artery diseases. Eur J Cardiothorac Surg 2006; 30: 443-450.

Julian DG, Bertrand ME, Hjalmarsson K. et. al. Angina pectoris. Guidelines of

the Task force members. Eur Heart J 1997; 18: 394-413

Kolovou G, Yiannakouris N, Hatzivassiliou M, Malakos j, Daskalova D,

Hatzigeorgiou G, Cariolou MA, Cokkinos DV. (2002) Association of Apolipoprotein E

Polymorphism With Myocardial Infarction in Greek Patients With Coronary Artery

Disease. Curr Med Res Opin 18/3: 118-124

Kontula K, Aalto-Setälä K, Kuusi T, Hämäläinen L, Syvänen AC. (1990)

Apolipoprotein E Polymorphism Determined by Restriction Enzyme Analysis of DNA

Amplified by Polymerase Chain Reaction: Convenient Alternative to Phenotyping by

IsoelectricFocusing. Clinical Chemistry 36/12:2087-2092

Lahoz C, Schaefer EJ, Cupples LA, Wilson PWF, Levy D, Osgood D, Parpos S,

Pedro-Botet J, Daly JA, Ordovas JM. (2001) Apolipoprotein E genotype and

cardiovascular disease in the Farmingham Heart Study. Athrosclerosis 154: 529-537

Lambić I.,Stožinić S. Angina pektoris Naučna knjiga 1990

44

Stožinić S., Lambić I., Babić M. Akutni koronarni sindromi. Nauka, Beograd,

1996.

Lepšanović L, Lepšanović Lj. (2000) Klinička lipidologija. Savremena

administracija, Beograd.

Li X, Kypreos K, Zanni EE, Zannis V. (2003) Domains of ApoE required for

binding to ApoE receptor 2 and to phospholipids: Implications for the functions of

ApoE in the brain. Biochemistry 42: 10406-10417

Manojlović M. Interna medicina I i II. Udžbenika za studente Medicinskog

fakulteta. Naučna knjiga, Beograd, 2000.

Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding

role in cell biology. Science 1988; 240: 622-630

März W, Scharnagl H, Hoffmann MM, Boehm BO, Winkelmann BR. (2004) the

apolipoprotein E polymorphism is associated with circulating C-reactive protein (the

Ludwigshafen risk and cardiovscular health study). European Heart Journal 25: 2109-

2119.

McCarthy JJ, Parker A, Salem R, Moliterno DJ, Wang Q, Plow EF, Rao S, Shen

G, Rogers WJ, Newby LK, Cannata R, Glatt k, Topol EJ. (2004) Large scale association

analysis for identification of genes underlying premature coronary heart disease:

cumulative perspective from analysis of 111 candidate genes. J Med Genet 41: 3

Nabel EG. (2003) Cardiovascular disease. The New England Journal of

Medicine 349: 60-72

Nathan BP, Bellosta S, Sanan DA, Weisgraber KH, Mahley RW, Pitas RE.

(1994) Differential effects of apolipoprotein E3 and E4 on neuronal growth in vitro.

Science 264: 850-852

Nešković A, Vlahović A, Otašević P. Ishemijska bolest srca. U: Kardiologija ur.

Bojić M, Mirić M. Univerzitet u Beogradu, Beograd 2000.

Paik YK, Chang DJ, Reardon CA, Davies GE, Mahley RW, Taylor JM.

Nucleotide sequernce and structure of human apolipoprotein E gene. Proc Nat Acad Sci

USA 1989; 82: 3445-3449

Radak Đ. i sar. Prevencija kardiovaskularnih bolesti. Nacionalni vodič za lekare

u primarnoj zdravstvenoj zaštiti. Republička stručna komisija za izradu i

implementaciju vodiča u kliničkoj praksi, Aministarstvo zdravlja Republike Srbije i

Srpsko Lekarsko Društvo, 2005.

Raslova K, Zacharova M, Gasparovic J, Wsolova L, Sivakova D. (2003) Effect

of ApoE gene polymorphism on plasma lipid levels nd markers metabolic syndrome in

45

ethnic groups. XIIIth International Symposium on Atherosclerosis, September 28-

October 2, Kyoto, Japan.

Reymer WA, Groenemeyer BE, Burg R, Kastelein JJP. (1995) Apolipoprotein E

Genotyping on Agarose Gels. Clinical Chemistry 41/7: 1046-1047

Rubbatu S, Stanzione R, Angelantonio ED, Zanda B, Evangelista A, Tarasi D,

Gigante B, Pirisi a, Brunetti E, Volpe M. (2004) Atrial natriuretic peptide gene

polymorphisms and risk of ischemic stroke in humans. Journal of the American Heart

Association 35: 814-818

Siest G, Pillot T, Regis-Bailly A, Leininger-Muller B, Steinmetz J, Galteau MM,

Visvikis S. (1995) Apolipoprotein E: An Important Gene and Protein to Follow in

Laboratory Medicine. Clinicl Chemistry 41/8: 1068-1086.

Singh PP, Naz I, Gilmour A, Singh M, Mastana S. (2006) Association of APOE

(Hha 1) and ACE (I/D) gene polymorphism with type 2 diabetes mellitus in north west

India. Diabetes Research and Clinical Practice 1-7

Singh PP, Singh M, Mastana SS. APOE distribution in world populations with

new data from India and the United Kingdom. Ann Hum Biol, u štampi

Sparks DL, Connor DJ, Sabbagh NM, Petersen RB, Lopez J, Browne P. (2006)

Circulating cholesterol levels, apolipoprotein E genotype and dementia severity

influence the benefit of atorvastatin treatment in Alzheimer’s disease: results of the

Alzheimer’s Disease Cholesterol-LoweringTreatment (ADCLT) trial. Acta Neurol

Scand 114 (Suppl. 185): 3–7

Stanković S, Glišić S, Alavantić D. (1999) Apolipoprotein E gene DNA

polymorphism in Serbian population. Jugoslovenska Medicinska Biohemija 18: 9-15

Stengärd JH, Kardia SL, Tervahauta M, Ehnholm C, Nissinen A, Sing CF.

(1999) Utility of the predictors of coronary heart disease mortality in a longitudinal

study of elderly Finnish men aged 65 to 84 years is dependent on context defined by

Apo E genotype and area of residence. Clinical Genetics 56: 367-377

Stephens JW, Humphries SE. (2003) The molecular genetics of cardiovascular

disease:clinical implications. Journal of Internal Medicine 2003; 253: 120–127

Stokić E, Djan M, Vapa Lj, Djan I, Plećaš A, Srdić B. Polymorphism Val103Ile

of the melanocortin-4 receptor gene in the Serbian population. Molecular Biology

Reports (u štampi)

Strittmatter WJ, Saunders AM, Schmechel D, Pericak-Vance M, Enghild J,

Salvesen GS, Roses A. (1993) Apolipoprotein E: High-avidity binding to betaamyloid

46

and increased frequency of type 4 allele in late-onset Alzheimer disease. Proc Natl Acad

Sci USA 90: 1977 - 1981

Talmud PJ, Stephens JW, Hawe E, Demissie S, Cupples LA, Hurel SJ,

Humphries SE, Ordovas JM. (2005) The significant increase in cardiovascular disease

risk in APOE ε4 carriers is evident only in men who smoke: Potential relationship

between reduced antioxidant status and ApoE4. Annals of Human Genetics 69. 613-622

Topol EJ. (2006) The genetics of heart attack. Heart 92: 855-861

Tunstall-Pedoe H, Kuulasmaa K, Tolonen H. Et al. Monica 1979-2002. World

Health Organization, Geneva 2003.

Yamada Y, Izawa H, Ichihara S, Takatsu F, Ishisara H, Hirayama H, Sone T,

Tanaka M, Yokota M. (2002) Prediction of the risk of myocardial infarction from

polymorphisms in candidate genes. The New England Journal of Medicine 347/24:

1916-1923

Yamamoto T. (2000) Roles of ApoE receptors and their family. XIIth

International Symposium on Atherosclerosis, Stockholm, Sweden.pp. 25-29

Žigić D, Lapčević M, Popović J, Ivanković D. Opšta medicina – Porodična

medicina, sekcija opšte medicine Srpskog lekarskog društva 2003.

47

Prilog I: tekst informisanog pristanka

Medicinski fakultet Novi Sad

Tema: Polimorfizam apoE gena kod bolesnika sa ishemijskom bolešću srca

TEKST INFORMISANOG PRISTANKA ISPITANIKA - BOLESNIKA

Pročitao sam tekst o svrsi i načinu ispitivanja. Razgovarao sam sa voditeljem

ispitivanja. Razjašnjene su mi sve nejasnoće. Objašnjeno mi je da je ulazak u ispitivanje

isključivo na dobrovoljnoj osnovi.

Svestan sam toga da:

DA NE

Mogu slobodno ući, ali isto tako i slobodno napustiti ispitivanje, bez

obrazlaganja moje odluke□ □

Ukoliko donesem odluku da ne učestvujem ili da napustim ispitivanje,

neću snositi nikakve posledice i takva moja odluka neće uticati na dalji

tok i ishod lečenja

□ □

Moja tajnost u ovom ispitivanju je garantovana □ □Istraživanje je u potpunosti odobreno od strane nadležne Etičke komisije

Medicinskog fakulteta u Novom Sadu□ □

Ja, , dobrovoljno dajem pristanak za učestvovanje u

navedenom ispitivanju.

Ispitanik: Ispitivač:

Dr Igor Đan

Novi Sad, _________________

48

Prilog II: tekst informisanja ispitanika

Medicinski fakultet Novi SadTema: Polimorfizam apoE gena kod bolesnika sa ishemijskom bolešću srca

TEKST INFORMISANJA ISPITANIKA - BOLESNIKA

Poštovani gospodine,Poštovani pacijente, Ovim istraživanjem želimo da utvrdimo da li postoje razlike u faktorima rizika između srčanih bolesnika i zdravih ljudi. Na neke faktore rizika može se uspešno delovati, na druge za sada još uvek ne. Upravo otkrivanjem nekih faktora rizika doći će se do značajnih saznanja o njihovom mogućem lečenju i prevenciji. Na nasleđe, kao faktor rizika se za sada još ne može delovati, ali će se otkrivanjem određenih gena steći jasnija slika o zdravstvenom stanju ljudi a što je takođe važno, ova saznanja mogu imati i veliki značaj za Vaše bliže i dalje potomstvo. U istraživanju će se, pored konstatovanja niza faktora rizika za ishemijsku bolest srca (povišen krvni pritisak, gojaznost, pušenje, vrednosti lipida u krvi itd.) ispitati i Vaša DNK odnosno postojanje određenih gena od značaja za karakteristike i visinu vaših masnoća u krvi, posebno holesterola. Ispitivanje ima za cilj unapređenje i sprečavanje bolesti srca, posebno ishemijske bolesti srca kod osoba sa naslednim opterećenjem i sklonošću za ova oboljenja. Putem ovih informacija, Vama je ponuđeno da budete jedan od učesnika u istraživanju. U ovom ispitivanju biće Vam izvađena minimalna količina krvi potrebna za biohemijske i genetske analize što neće ugroziti Vaše zdravlje. Pored osnovnih potrebnih usmenih podataka o Vama i Vašim navikama (npr. pušenje) izmeriće Vam se krvni pritisak, puls, telesna visina i težina, obim struka i kuka, kao i druge antropometrijske mere. Pregledi i merenja se sa pouzdanošću sprovode u svakodnevnoj dijagnostičkoj praksi lekara i ni na koji način ne narušavaju Vaše zdravlje odnosno zdravlje ispitanika. Genetska ispitivanja se u našoj zemlji još uvek rutinski ne rade, prevashodno zbog nedostatka opreme, potrebnih reagenasa i cene analiza. Voleli bismo da se uključite u ovo ispitivanje. U vezi sa ovim ispitivanjem morate biti svesni sledećeg:

Vaše učešće je dobrovoljno. Ako pristanete, osim zdravstvene, ne očekujte nikakvu drugu korist. Nećete snositi troškove pregleda. Troškove dolaska na pregled snosite sami. Ukoliko se uključite u naše ispitivanje, imaćete mogućnost da iz njega istupite u

bilo kojem tremutku bez ikakvih posledica. Tokom ispitivanja od Vas će se zahtevati samo pažljivo praćenje uputstava

ispitivača radi što efikasnijeg sprovođenja ovih ispitivanja. Svi rezultati i podaci dobijeni od Vas biće čuvani u tajnosti od drugih lica, a u

skladu sa Hipokratovom zakletvom lekara o čuvanju lekarske tajne. Vaša odluka o neučestvovanju ili napuštanju ispitivanja ni na koji način neće

uticati na dalji tok i ishod Vašeg lečenja. Ovo ispitivanje će se vršiti i dobijeni rezultati koristiti isključivo u naučne svrhe. Istraživanje je u potpunosti odobreno od strane nadležne Etičke komisije

Medicinskog fakulteta u Novom Sadu. Hvala Vam na odvojenom vremenu i razumevanju. Ispitivač, dr Igor Đan U Novom Sadu, _________________

49

Documents

Master Rad Konacan Tekst