Embed Size (px)
Citation preview
RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E PATOGÊNIC A DE
ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT.) WEI.
MARINGÁ – PARANÁ – BRASIL
FEVEREIRO – 2005
RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E PATOGÊNIC A DE
ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT.) WEI.
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Maringá, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, para
obtenção do título de Mestre.
MARINGÁ – PARANÁ – BRASIL
FEVEREIRO – 2005
ii
A Deus
Por tudo,
dedico.
Ao meu pai, Juracy Aparecido de Oliveira, a minha mãe, Arlete Ribeiro de
Oliveira e aos meus irmãos Adriano Antonio de Oliveira e Juracy Junior de
Oliveira
Pelo amor, apoio e carinho durante esta etapa da minha vida,
dedico.
A minha namorada e amiga, Bárbara de Melo Aguiar e a toda sua família
Pelo apoio nos momentos de dificuldade e amor que sentem por mim,
dedico.
Ao Professor Dr. João Batista Vida
Mais que orientador foi um amigo,
dedico.
iii
AGRADECIMENTOS
Aos amigos Márcio Ueda e Eleni Sayuri Eto e a toda família, que me acolheram
como se eu fizesse parte de sua família.
Aos amigos Junior, Mauro, Alcides e Rudimar, pelo incentivo, apoio e
momentos de descontração no período de realização deste trabalho.
Ao Professor Dr. Dauri José Tessmann pela co-orientação e conselhos durante
a execução deste trabalho.
Ao Dr. Nelson Sato e a toda equipe da Med Line que me acolheram na
empresa durante o primeiro ano de Mestrado, período este em que não fui
contemplado com bolsa de estudos.
Aos professores e pesquisadores: Dr. Robert W. Barreto, da Universidade
Federal de Viçosa, Dr. Gilson Soares da Silva, da Universidade Estadual do
Maranhão, Dr. Luiz Sebastião Poltronieri, pesquisador do Centro de Pesquisa
Agropecuária do Trópico Úmido-CPATU e ao Dr. Álvaro Manoel Rodrigues
Almeida pesquisador do Centro Nacional de Pesquisa de Soja-CNPSo, pela
concessão dos isolados de C. cassiicola utilizados neste trabalho.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização
deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão de bolsa de estudos.
iv
BIOGRAFIA
RICARDO RIBEIRO DE OLIVEIRA, filho de Juracy Aparecido de
Oliveira e Arlete Ribeiro de Oliveira, nascido em Mandaguari, Estado do
Paraná, aos 26 dias do mês de abril de 1976.
Em 1994, formou-se em Técnico em Agropecuária pela Escola
Agrotécnica Federal de Muzambinho, no Estado de Minas Gerais.
Iniciou o curso de Agronomia na Universidade Federal de Viçosa,
Minas Gerais, em 1996, graduando-se em setembro de 2002.
Em março de 2003, iniciou o curso de Mestrado em Agronomia na área
de Proteção de Plantas na Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá,
Paraná.
v
ÍNDICE
RESUMO............................................................................................................ vii
ABSTRACT......................................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1
1.1. Objetivos................................................................................................. 2
2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 3
2.1. O patógeno.............................................................................................. 3
2.2. Corynespora cassiicola no Brasil............................................................ 4
2.3. Danos econômicos no Brasil................................................................... 4
2.4. Crescimento, esporulação e métodos de inoculação............................. 6
2.5. Sobrevivência e disseminação............................................................... 7
2.6. Sintomatologia........................................................................................ 9
2.7. Variabilidade morfológica x ambiente..................................................... 10
2.8. Patogenicidade....................................................................................... 12
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 14
3.1. Local dos experimentos.......................................................................... 14
3.2. Obtenção dos isolados de Corynespora cassiicola................................ 14
3.3. Espécies de plantas utilizadas nos experimentos de patogenicidade.... 16
3.4. Obtenção de isolados............................................................................. 16
3.5. Culturas monospóricas............................................................................ 17
3.6. Avaliação das características culturais................................................... 18
3.6.1. Avaliação do crescimento micelial e da coloração das colônias............................................................................................ 18
3.6.2. Avaliação da esporulação................................................................ 19
3.6.3. Avaliação da formação de clamidósporos....................................... 19
3.6.4. Caracterização morfológica de conídios.......................................... 20
3.6.4.1. Caracterização morfológica de conídios produzidos in vitro..... 20
3.6.4.2. Caracterização morfológica de conídios produzidos in vivo..... 20
3.7. Patogenicidade........................................................................................ 21
3.7.1. Produção de mudas......................................................................... 22
3.7.2. Preparo do inóculo, inoculação e avaliações................................... 22
vi
3.7.3. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a híbridos de pepino tipo “japonês”.................................................................. 24
4. RESULTADOS............................................................................................... 26
4.1. Avaliação das características culturais................................................... 26
4.1.1. Avaliação do crescimento micelial e da coloração das colônias............................................................................................ 26
4.1.2. Avaliação da esporulação................................................................ 26
4.1.3. Avaliação da formação de clamidósporos....................................... 27
4.1.4. Caracterização morfológica de conídios.......................................... 31
4.1.4.1. Caracterização morfológica de conídios produzidos in vitro..... 31
4.1.4.2. Caracterização morfológica de conídios produzidos in vivo..... 32
4.2. Patogenicidade........................................................................................ 37
4.2.1. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a híbridos de pepino tipo “japonês”.................................................................. 38
5. DISCUSSÃO................................................................................................... 45
6. CONCLUSÕES............................................................................................... 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 54
8. APÊNDICE..................................................................................................... 61
vii
RESUMO
OLIVEIRA, Ricardo Ribeiro de. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E PATOGÊNICA DE ISOLADOS DE Corynespora cassiicola (BERK. & CURT) WEI. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de 2005. Professor Orientador: João Batista Vida. Professor Co-orientador: Dauri José Tessmann
O patógeno Corynespora cassiicola, anteriormente relatado como de
menor importância, nos últimos anos, vem assumindo maior destaque para
algumas culturas de interesse econômico. Culturas como soja, pepino,
tomateiro e mamoeiro têm sofrido danos expressivos. O objetivo deste trabalho
foi avaliar e identificar diferenças morfológicas e patogênicas de 15 isolados de
C. cassiicola originados de diversos hospedeiros e regiões do Brasil. Os
isolados foram avaliados quanto às características das colônias, taxa de
crescimento micelial, esporulação, formação de clamidósporos, dimensões de
conídios (comprimento, largura e número de pseudo-séptos), bem como a
forma e curvatura destes. Além disso, a patogenicidade dos isolados foi
avaliada através de inoculações em 12 diferentes hospedeiros. A severidade
de diferentes isolados de C. cassiicola em quatro híbridos de pepino tipo
“japonês” também foi avaliada. As colônias apresentaram coloração que
variaram de cinza-claro a oliváceo e diferenças significativas na taxa de
crescimento micelial e esporulação. Dentre os isolados analisados, sete foram
capazes de produzir estruturas de resistência (clamidósporos) em meio de
cultura artificial. Os conídios dos diferentes isolados de C. cassiicola
apresentaram dimensões de 48,1-125,4 x 5,8-8,1µm, números médios de
pseudo-septos de 2,9-9,7, forma cilíndrico a obclavado e curvatura reto a
curvado, quando produzidos em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar).
Os conídios de um isolado quando produzidos “in vivo” foram caracterizados.
Esses apresentaram dimensão média de 9,2-181,8µm, número médio de
pseudo-septos de 10,5, forma cilíndrico a obclavado e curvatura reto a curvado.
De acordo com as características de conídios, todos os isolados se
enquadraram na espécie C. cassiicola. A grande maioria dos conídios
viii
apresentou a base arredondada e poucos com base truncada quando
produzidos em meio de cultura BDA. A patogenicidade dos isolados foi
avaliada através de inoculações de suspensão de conídios (1 x 104
conídios/mL). Todos os isolados foram capazes de infectar seu hospedeiro de
origem; no entanto, a maioria dos isolados demonstrou elevada
inespecificidade. Isolados de cucurbitáceas apresentaram maior gama de
hospedeiros (9 espécies), enquanto os isolados de alface e trapoeraba as
menores (2 espécies). Isolados de pepino “japonês” não diferiram quanto à
capacidade de infectar outros hospedeiros, ao contrário dos isolados de soja.
Isolados originados de pepino “japonês” foram significativamente mais
agressivos aos híbridos de pepino “japonês” testados, sendo, o híbrido
tsuyataro que apresentou maior suscetibilidade aos isolados. Os híbridos de
pepino, hokushin e samurai, foram suscetíveis a quatro dos sete isolados
testados, enquanto os híbridos natsubayashi e samurai foram suscetíveis a
todos. Devido às diferenças na agressividade dos isolados aos híbridos de
pepino, uma maior adaptação dos isolados de pepino para os híbridos é
sugerida, uma vez que foram significativamente mais agressivos que os demais
isolados. Dois padrões de lesões foram observados em quatro híbridos de
pepino inoculados com sete isolados de C. cassiicola. Lesões com
encharcamento só foram causadas por isolados de pepino “japonês” e lesões
com aspecto áspero (ausência de tecidos encharcados) por isolados originados
de outras espécies hospedeiras.
ix
ABSTRACT
OLIVEIRA, Ricardo Ribeiro de. MORPHOLOGYCAL, PHYSIOLOGYCAL AND PATHOGENIC CHARACTERIZATION OF Corynespora cassiicola (BERK. & CURT) WEI. ISOLATES . Universidade Estadual de Maringá, february 2005. Adviser: João Batista Vida. Co-adviser: Dauri José Tessmann
Corynespora cassiicola, a fungal plant pathogen initially having minor
importance to agriculture in Brazil, has increased his damages to several crops,
such as soybean, cucumber, tomato and papaya, in the last decade. The
objective of this study was to characterize the morphology and pathogenic
variability among 15 isolates of C. cassiicola originated from several hosts and
collected in several regions of Brazil. The morphological characterization was
based on colony morphology, mycelial growth, sporulation in vitro, formation of
chlamydospores, and shape, size and septation of conidia. For evaluating
pathogenicity, the isolates were inoculated on 12 different hosts under
controlled conditions, through a conidial suspension (1 x 104 conidia/mL).
Additionally, the severity of isolates was evaluated on four cucumber hybrids.
The morphology and cultural features of isolates were evaluated on potato-
dextrose-agar medium. The colonies of C. cassiicola showed variation on
colony color ranging from gray-clear to olivaceous, and significant differences
on mycelial growth and sporulation. Only seven isolates produced
chlamydospores in culture. The size of conidia were 125-48 x 8-5µm, with
average numbers of pseudo-septa of 9,7-2,9. The conidial shape varied from
cylindrical to obclavate, and from straight to curved. Conidia of one isolate were
also characterized when produced “in vivo”. These showed the size of 181 x
9µm, 10 pseudosepta, and shape ranging from cylindrical to obclavade, straight
to curved. Based on the characteristics of conidia, all isolates were identified as
C. cassiicola. The majority of conidia had the base cell rounded, not truncate.
All fungal isolates were pathogenic to their original hosts; however, the
pathogenicity of most of isolates were not specific to their hosts of origin. The
Isolates from cucurbits showed larger host range, while isolates from lettuce
x
and Commelina bengalensis had minor host range. All isolates from cucumber
were pathogenic to the same hosts. The Isolates from cucumber were
significantly more aggressive to the cucumber hybrids that the isolates from
other hosts. The hybrid ‘Tsuyataro’ showed larger susceptibility to the cucumber
isolates (P=0.05%). The cucumber hybrids ‘Hokushin’ and ‘Samurai’ were
susceptible only to four among the seven isolates evaluated; while the hybrids
‘Natsubayashi’ and ‘Samurai were susceptible to all tested isolates. Based on
the fact that the aggressiveness of isolates from cucumber were greater than
the other isolates, it may be possible that such isolates are more adapted to
their hosts than the other isolates. The cucumber hybrids showed two typical
symptoms: wet necrosis, caused only by isolates from cucumber, and non-wet,
or dried necroses, caused by the isolates not from cucumber.
1
1. INTRODUÇÃO
O patógeno Corynespora cassiicola foi relatado em associação com
mais de 70 espécies de plantas hospedeiras, freqüentemente causando
manchas foliares, distribuídas em diversas regiões de clima tropical e
subtropical. Devido a ampla gama de hospedeiros e sua distribuição ao longo
de todo mundo, C. cassiicola passou a ser considerada uma espécie
cosmopolita e inespecífica (Ellis, 1971; Onesirosan et al., 1974; Silva, et al.,
1995).
O patógeno vem assumindo grande importância, causando danos em
culturas extensivas e também em ambientes protegidos. Em 1989, Yorinori
relatou que C. cassiicola, agente causal da mancha alvo e da podridão
radicular em soja, vem assumindo uma posição de maior destaque para a
cultura, principalmente naquelas regiões com elevadas precipitações e que
praticam o plantio direto. Verzignassi et al. (2003) constataram a ocorrência de
C. cassiicola em estufas plásticas na região Norte do Estado do Paraná em
culturas de pepino tipo “japonês”. Segundo os autores, o patógeno
anteriormente relatado como de pouca importância para a cultura em ambiente
protegido, veio a se tornar um dos mais importantes e destrutivos para esta
cultura nesta modalidade de cultivo, onde, estimativas de perdas mostraram
uma redução na produção de em torno de 60%. Os autores ainda relataram
que fungicidas utilizados para outras doenças foliares, bem como outras
práticas de manejo da cultura, não têm apresentado resultados eficientes no
controle desta doença.
A taxonomia de C. cassiicola é baseada em características
morfológicas de conídios e conidióforos (Ellis, 1971). O autor ainda descreve
uma ampla variação para as estruturas e colorações de colônias, que podem
variar de cinza ao marrom. Diferenças nas dimensões estabelecidas pelo autor
acima citado foram constatadas por Gasparotto et al. (1988) e Ferreira &
Alfenas (1980). Os autores atribuíram essas diferenças às mudanças nas
condições ambientais, citando a umidade relativa como um dos fatores
principais.
2
Quanto à patogenicidade, isolados de C. cassiicola, em algumas
regiões do Brasil, têm causado perdas significativas na produtividade através
de danos em caules, folhas, flores e frutos, tornando este patógeno uma
preocupante ameaça para várias espécies de interesse agronômico. Espécies
cultivadas a céu aberto, tais como soja (Gycine max), mamoeiro (Carica
papaya), seringueira (Hevea brasiliensis) e aceroleira (Malpighia glabra), e, em
ambiente protegido, pepino (Cucumis sativus) e tomateiro (Lycopersicon
esculentum), têm sofrido perdas na produtividade e depreciação de frutos.
Além das plantas cultivadas, plantas daninhas comumente associadas às áreas
de produção comercial, como trapoeraba, assa-peixe e lantana, também foram
reportadas como possíveis hospedeiras e fonte de inóculo do patógeno, uma
vez que plantas de trapoeraba e assa-peixe foram consideradas suscetíveis a
isolados de C. cassiicola originados do tomateiro (Gasparotto et al.,1988; Leroy
e Lourd, 1989; Siviero et al., 1995; Silva, et al., 1997; Yorinori & Bidóia, 1998;
Rêgo & Carrijo, 2000; Cutrim & Silva, 2003; Verzignassi et al., 2003; Viana et
al., 2003). Somando esses relatos à possibilidade de um isolado infectar
diferentes hospedeiros de interesse econômico (Olive, et al., 1945; Spencer &
Walters, 1969; Duarte et al., 1983; Cutrim & Silva, 2003), faz do estudo de
patogenicidade uma fundamental ferramenta para se estabelecer estratégias
de controle visando o manejo integrado de doenças causadas por C. cassiicola.
1.1. Objetivos
a) Avaliar a variabilidade morfológica e fisiológica de 15 isolados de C.
cassiicola originados de diferentes espécies de hospedeiros
cultivados e de plantas daninhas.
b) Verificar a patogenicidade de 15 isolados de C. cassiicola para
diferentes espécies hospedeiras.
c) Avaliar a severidade da doença em quatro híbridos comerciais de
pepino tipo “japonês”, quando inoculados com sete diferentes
isolados de C. cassiicola.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O patógeno
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei, uma espécie de fungo
tradicionalmente classificada no Filo Deuteromycota, classe Hyphomycetes e
família Dematiaceae. A literatura mais recente considera a espécie no grupo
dos fungos Mitospóricos (Hawksworth et al. 1995). As sinonímias para a
espécie são: Helminthosporium cassiicola Berk. & Curt., H. papayeae, H.
sydow, H. vignae Olive, Cercospora melonis Cooke, C. vignicola Kawamura,
Corynespora manzei Gussow e C. melonis (Cooke) Lindau (Wei, 1950; Ellis,
1971; Holliday, 1980, citado por Santos et al., 1997). A fase teleomórfica para
C. cassiicola ainda é desconhecida (Hawksworth et al., 1995).
Este patógeno atualmente se encontra associado a mais de 70
espécies de diferentes hospedeiros distribuídos em diversos países de clima
tropical e subtropical (Silva et al., 1995). Devido a sua ampla gama de
hospedeiros e distribuição ao longo do mundo, em 1971, Ellis descreveu C.
cassiicola como sendo uma espécie cosmopolita e inespecífica, comum e
abundante em regiões tropicais. Este autor relata ainda as seguintes plantas
reconhecidamente hospedeiras do patógeno: feijão-de-corda (Vigna sinensis),
pepino (Cucumis sativus), meloeiro (Cucumis melo), gergelim (Sesanum
indicum), soja (Glycine max), mandioca (Manihot esculenta), mamoeiro (Carica
papaya), seringueira (Hevea brasiliensis) e tomateiro (Lycopersicon
esculentum). Outros autores relataram outras espécies como hospedeiras de
C. cassiicola: algodão (Gossypium spp.) (Jones, 1961), berinjela (Solanum
melongena) (Onesirosan et al., 1974), fumo (Nicotiana tabacum) (Fajola &
Alasoadura, 1973), cacaueiro (Theobroma cacau L.) (Silva, 2000) e pepino (C.
sativus) (Blazquez, 1967, citado por Silva et al., 1998).
4
2.2. A espécie Corynespora cassiicola no Brasil
No Brasil, C. cassiicola foi relatado causando danos em diversas
espécies de plantas, algumas com maior destaque, como culturas de grande
interesse comercial, algumas ornamentais, hortaliças e plantas daninhas, como
por exemplo: culturas como soja (Kiihl, 1974, citado por Yorinori & Homechin,
1977; Almeida et al., 1976), pepino (Verzignassi et al., 2003; Martins, et al.,
2003), tomateiro (Leroy & Lourd, 1989; Poltronieri, et al., 1994), seringueira
(Gasparotto et al., 1988), cacaueiro (Duarte et al., 1978), mamoeiro (Duarte et
al., 1983), aceroleira (Malpighia glabra L.) (Silva et al., 1997), gergelim (Wulff &
Pascholati, 1997), pimenta longa (Piper hispidinervium C. DC.) (Poltronieri et
al., 1997), alface (Lactuca sativa L.) {(Poltronieri (comunicação pessoal)1},
falso-boldo (Coleus barbatus) (Fernandes & Barreto, 2003) e hortênsia
(Hydrangea sp.) (Leite & Barreto, 1997). C. cassiicola ainda é citado como
patógeno em algumas plantas daninhas, tais como, trapoeraba (Commelina
benghalensis), assa-peixe (Vernonia cinerea) e lantana (Lantana camara) e,
nestes casos, quando não devidamente bem manejado, poderá servir como
fonte de inóculo para outras culturas agronômicas (Pereira & Barreto, 2000;
Souza & Silva, 2001;.Cutrim & Silva, 2003).
2.3. Danos econômicos no Brasil
Em lavouras de soja, o patógeno foi identificado pela primeira vez no
Estado de Mato Grosso (Kiihl, 1974, citado por Yorinori & Homechin, 1977). No
Estado de São Paulo, foi identificado por Almeida et al. (1976), que
constataram também a presença de possíveis danos causados pelo patógeno.
Durante a safra de 1995/96, essa doença foi observada por Yorinori (1996) em
diversas propriedades nos municípios de Cascavel, Castro, Ponta Grossa e
Pitanga, no Estado do Paraná. O autor ainda relata que a cultivar FT-Estrela foi
a mais afetada e que, no Município de Pitanga, apresentou desfolha prematura
aos 25 dias após a emergência e perda de rendimento estimada entre 40 e
45%. Em levantamentos realizados nas safras de 1996/97 e 1997/98, foram
1 Comunicação pessoal em Novembro/2003.
5
constatados danos significativos causados por C. cassiicola (Yorinori & Bidóia,
1998). Segundo os autores, a mancha alvo, até então uma doença sem
importância econômica para a soja, naquelas safras as perdas somaram cerca
de 50.000t e 125.000t de grãos, respectivamente.
Um dos principais problemas associados à cultura do pepino reside no
fato dela ser assolada por diversos patógenos, entre os quais se pode destacar
C. cassiicola, principalmente quando ocorrem cultivos sucessivos na mesma
área. O cultivo subseqüente, somado à adoção de práticas inadequadas de
manejo, tem favorecido o surgimento progressivo da doença, anteriormente
reconhecida como de menor importância econômica para a cultura (Verzignassi
et al., 2003). Os autores, em 2003, identificaram o fungo em estufas plásticas
no Norte do Paraná cultivadas com pepino tipo “japonês” no período de
primavera-verão de 2002, causando epidemias de manchas foliares e
acarretando perdas quantitativas, de até 60%, e qualitativas na produção. O
patógeno também foi constatado causando danos em folhas de pepino do
híbrido “Hishi Nari” na região de Indaiatuba-SP (Martins et al.; 2003). Segundo
Rêgo & Carrijo (2000), o patógeno pode ser encontrado em diversas espécies
de cucurbitáceas, embora seja mais severo em pepino.
Perdas significativas na cultura do tomateiro e seringueira na região
Norte do Brasil também foram relatadas por Poltronieri et al. (1994) e
Gasparotto et al. (1988), respectivamente, causando danos às folhas e,
conseqüentemente, perdas de produtividade. Em tomateiro, a mancha alvo é
apresentada como a principal doença foliar do tomateiro na região de Manaus
e tem preocupado os tomaticultores e técnicos responsáveis pelo
desenvolvimento da cultura na Região (Leroy & Lourd, 1989; Siviero et al.,
1995).
Em 1972, Duarte et al. (1978) constataram, em plantas de cacaueiro
em viveiro, a presença do patógeno causando danos nas folhas.
Posteriormente, os danos passaram a serem evidentes em condições de
campo (plantios definitivos). Os autores destacaram que este foi o primeiro
relato da enfermidade, em caráter endêmico, em regiões produtoras de cacau
no mundo.
No Norte do Espírito Santo, a mancha de Corynespora em mamoeiro
tem se tornado preocupante, devido à alta severidade da doença nas folhas e
6
nos frutos, depreciando-os comercialmente (Andrade et al., 2002). Em 2001, no
Estado do Ceará, também foram observados danos causados por este
patógeno na cultura, caracterizados por apodrecimento do caule, com posterior
queda dos frutos e morte das plantas. A incidência da doença na região afetou
mais de 80% das plantas, com significativo comprometimento da produção
(Viana et al., 2003). Duarte et al. (1983) citaram o patógeno como de grande
importância em condições de viveiro de mudas de mamoeiro, causando danos
em folhas e hastes.
Silva et al. (1997), realizando levantamentos de doenças em frutíferas
em São Luiz (MA), identificaram C. cassiicola infectando folhas de plantas de
aceroleria. Os autores relatam que a doença tem progredido rapidamente nesta
cultura e manifestaram preocupação com a possibilidade de epidemias futuras
e risco para o cultivo de aceroleiras no Estado. Generoso et al. (2002)
identificaram a doença no Município de Junqueirópolis (SP), em cultivos
comerciais de aceroleiras com sistema de irrigação. Os autores ainda relataram
a ocorrência de severa desfolha, que refletiu na produção da safra 2001/02,
sendo 38% menor que a safra anterior.
2.4. Crescimento, esporulação e métodos de inoculaç ão
Condições para crescimento e esporulação de C. cassiicola já foram
discutidas por alguns autores. Almeida e Yamashita (1976), estudando a
interferência de seis meios de cultura (alimento infantil Gerber®, V-8, extrato de
soja, BDA (batata-dextrose-ágar), Czapek-ágar e malte-ágar) e dois regimes de
luminosidade (luz contínua e escuro contínuo), sobre o crescimento e a
esporulação de um isolado do patógeno oriundo de folhas de soja, concluíram
que os meios de cultura V-8 e alimento infantil induziram maiores
esporulações, 3,3 x 105 esporos/mL e 3,4 x 105 esporos/mL, respectivamente,
sugerindo que fatores de crescimento e vitaminas estejam presentes em maior
dosagem nestes meios. Desenvolvendo o mesmo tipo de trabalho, Olive et al.
(1945) constataram maior esporulação de C. cassiicola em meio BDA e
Czapek-ágar. Jayasinghe & Silva (1992), citados por Silva et al. (1998),
relataram que o melhor meio para crescimento e esporulação de C. cassiicola
foi BDA. Almeida e Yamashita (1976) destacaram que a presença de luz
7
contínua favoreceu o crescimento micelial e a esporulação, concordando com
os resultados obtidos por Onesirosan et al. (1975). Roim (2001) relatou que a
esporulação de isolados de C. cassiicola de raízes e de folhas de soja foi
favorecida sob condições de fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de
escuro. O autor ainda constatou que o crescimento micelial de isolados de
folha foi maior em condições de fotoperíodo 12 horas de luz e 12 horas de
escuro e de isolados de raízes o maior crescimento na ausência de
luminosidade.
Awoderu (1969) trabalhando com dois isolados de seringueira e um de
mamoeiro, e Duarte et al. (1983), dois isolados, sendo um de mamoeiro e outro
de cacaueiro, avaliaram a interferência de meios de cultura na esporulação e
obtiveram resultados semelhantes. Ambos autores relataram que a produção
de esporos foi mais abundante nos meios Czapek Dox e BDA + 0,1% de
extrato de levedura e que a esporulação foi favorecida pela presença de luz
contínua.
Almeida (1977), avaliando a influência do pH em meio BDA, sobre o
crescimento e esporulação de isolados de soja, em diferentes períodos de
incubação, constatou que os valores máximos de crescimento micelial e de
esporulação ocorreram na faixa de pH de 6,5 a 7,5 após 4, 8 e 16 dias de
incubação.
Spencer & Walters (1969), em estudos para a determinação da faixa
ideal de temperatura para o crescimento micelial de isolados de C. cassiicola
em meio BDA, observaram que o crescimento máximo ocorreu à temperatura
de 28°C e o mínimo a 40°C.
Almeida e Yamashita (1978) determinaram que a técnica de
inoculação, por atomização, com suspensão de conídios, numa concentração
de 5,0 x 104 esporos/mL, em 3 cultivares de soja, apresentou os melhores
resultados, quando comparado com a técnica de verter junto ao hipocótilo a
suspensão de esporos.
2.5. Sobrevivência e disseminação
Em função dos relatos de ocorrência de C. cassiicola infectando
plantas daninhas, tais como trapoeraba, assa-peixe e lantana (Pereira &
8
Barreto, 2000; Souza & Silva, 2001; Cutrim & Silva, 2003), e da comprovação
da suscetibilidade de plantas de trapoeraba e de assa-peixe a isolados de
tomateiro (Souza & Silva, 2001), sugere-se que estas possam servir, não
apenas como fonte de inóculo, como também potenciais hospedeiros
alternativos do patógeno. Diferenças na patogenicidade de isolados e
severidade da doença, ou seja, a capacidade de infectar diferentes
hospedeiros com diferentes níveis de agressividade pode ser de grande
importância quando se objetiva o controle de doenças causadas por C.
cassiicola em espécies agronômicas suscetíveis.
Em um levantamento em sementes de gergelim, armazenadas em
diferentes regiões do Brasil, por longo período, através do teste de papel filtro,
foi identificado a presença de Corynespora sp. (Faiad et al., 1988). No trabalho,
os autores concluíram que as sementes podem servir como veículo de
disseminação do patógeno. Roim (2001) verificou que o fungo pode ser
disseminado através de sementes de soja, constituindo-se, portanto, uma
alternativa viável de fonte de inóculo e de veiculação do patógeno. Em
trabalhos realizados no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Estadual
de Maringá (UEM), Vida et al. (2004) (Comunicação pessoal)2, através do teste
de papel de filtro e do teste de transmissão em areia, relataram a presença do
patógeno em sementes e a transmissão para plântulas de quatro híbridos de
pepino tipo “japonês”. Segundo os autores, o nível de contaminação chegou a
35% nas sementes do lote do híbrido tsuyataro. Semelhantemente, Hasama et
al. (1993), no Japão, verificaram que C. melonis (C. cassiicola) encontrava-se
associado interna e externamente às sementes de pepino. Os tipos de
associações encontrados foram o ectoparasitismo ou adesão simples
(patógeno na superfície de semente) e endoparasitismo, onde o fungo estava
presente internamente à semente na forma de micélio dormente. As sementes
infectadas foram responsáveis por baixa germinação nos lotes e damping-off
em plântulas. Os autores concluíram que a transmissão por semente deve ser
considerada quando se objetiva o controle da doença no campo.
Segundo Wulff & Pascholati (1997), tratando de doenças do gergelim,
relataram que o patógeno C. cassiicola pode sobreviver em restos de cultura
2 Comunicação pessoal em Março/2004.
9
por até 10 meses e em hospedeiros alternativos. A sobrevivência do patógeno
em restos culturais, por no mínimo dois anos, em cucurbitáceas e em plantas
daninhas, também foram relatadas por Rêgo & Carrijo (2000). Os autores ainda
citaram que a disseminação dos esporos do fungo ocorre por correntes de ar,
dentro e entre culturas. Avaliando a sobrevivência de patógenos em restos de
culturais de soja, em sistemas de plantio direto e convencional, Almeida et al.
(2001) relataram a ocorrência de C. cassiicola sobrevivendo nestas condições.
Olive et al. (1945) relataram a formação abundante de clamidósporos,
intercalares e terminais, em colônias velhas e em transferências sucessivas
para meios de cultivo. Clamidósporos, de acordo com Amorim (1995), podem
sobreviver por longos períodos de tempo no solo na ausência do hospedeiro.
2.6. Sintomatologia
Breton et al., em 2000, na França, através de estudo histológico,
verificaram penetração rápida de C. cassiicola (12 horas após a inoculação)
através da epiderme inferior, em plantas de seringueira. Resultados análogos
foram obtidos por Oluma & Amuta (1999), os quais observaram que a infecção
pelo patógeno foi mais rápida e severa quando as folhas de mamoeiro foram
inoculadas na face abaxial, quando comparadas com inoculações na face
adaxial.
Os locais de ocorrências de sintomas nas plantas são variáveis, bem
como o padrão de lesão apresentado. Essas características são particulares
para cada patossistema formado. Lesões em folhas são descritas para maioria
das interações positivas, variando de coloração marrom a marrom-escura, com
centro claro, de formato circular com presença de círculos concêntricos,
irregular a angular, com ausência ou presença de halos (cloróticos, marrom-
avermelhado ou marrom-escuro), e presença de áreas com aspecto
encharcado, podendo abranger um a 20mm de diâmetro. Em alguns casos,
podem ocorrer manchas no caule de até 15cm de diâmetro e no pecíolo,
podendo evoluir para cancros de tamanhos variados. Os sintomas ainda
podem ocorrer em frutos de mamoeiro (podridão carpelar) e de tomateiro, em
vagens de soja e em flores de tomateiro e de hortênsia, sendo ainda, as
podridões radiculares descritas em soja (Duarte et al., 1978; Gasparotto et al.,
10
1988; Leroy & Lourd, 1989; Almeida et al., 1997; Silva et al., 1997; Trindade &
Furtado, 1997; Wulff & Pascholati, 1997; Santos & Freire, 1998; Oluma &
Amuta, 1999; Verzignassi et al., 2003).
2.7. Variabilidade morfológica x ambiente
As estruturas reprodutivas do patógeno (conidióforos e conídios),
segundo Ellis (1971), são muito variáveis quanto às dimensões. Os
conidióforos apresentam comprimentos que variam de 110-850µm e larguras
de 4-11µm e os conídios apresentam-se solitários ou em cadeias de 2 a 6,
sendo muito variáveis quanto ao formato, podendo ser obclavados ou
cilíndricos e ainda retos ou curvados, com 4-20 pseudo-septos. Quanto às
dimensões, os conídios podem variar de 40-220µm de comprimento e largura
de 9-22µm. Em meio de cultura artificial, o comprimento dos conídios pode
alcançar 520µm. Assim, essa variabilidade morfológica observada para as
estruturas reprodutivas do patógeno pode ser influenciada não somente por
fatores nutricionais, como também pelas condições ambientais, como umidade
relativa, que pode alterar as dimensões estabelecidas acima. Sob condições
naturais, com alta umidade relativa e submetida à câmara úmida, conidióforos
e conídios podem ter seus formatos alterados, sendo por vezes difícil a
observação dos pseudo-septos dos conídios. O fungo, quando cultivado em
meio de cultura artificial, pode também sofrer variações das dimensões
estabelecidas para a espécie, podendo ser diferente daquelas produzidas in
vivo. Ainda em meio de cultura artificial, os conidióforos podem mostrar-se
poucos distintos das hifas e dos conídios, freqüentemente em cadeias, com
ampla variação morfológica individual (Olive et al., 1945; Wei, 1950; Ferreira &
Alfenas, 1980; Gasparotto et al., 1988).
Em 1945, Olive et al. observaram diferenças morfológicas entre
conídios de isolados de feijão-de-corda e soja produzidos em diferentes
condições, como meio de cultura artificial, folhas dos hospedeiros em
condições naturais e folhas dos hospedeiros colocadas em câmara úmida. Eles
atribuíram essa variabilidade às condições de cada ambiente.
Realizando estudos comparativos entre três isolados de C. cassiicola,
dois de seringueira e um de mamoeiro, Awoderu (1969) também observou
11
diferenças nas dimensões das estruturas reprodutivas dos isolados. Duarte et
al. (1978), estudando as características morfológicas das estruturas
reprodutivas do patógeno em cacaueiro, encontraram dois pseudo-septos
como número mínimo para conídios, diferente do descrito na literatura que é de
quatro.
Roim (2001), estudando as características morfológicas de conídios, de
isolados de folhas e de sementes de soja produzidos em meio BDA, também
verificou diferenças daquelas estabelecidas por Ellis (1971). Isolados de folhas
e de raízes apresentaram, respectivamente, larguras médias de 7,85µm e
7,13µm, enquanto que os valores médios de pseudo-septos para estes
isolados foram de 2,45 e 1,66. Também estudando estas características, em
dois isolados, originados de mamoeiro e de cacaueiro, em meio BDA, Duarte et
al. (1983) observaram, respectivamente, que os valores mínimos mensurados
de comprimento (28 e 32µm), largura (8 e 4µm) e número de pseudo-septos (2)
para ambos isolados estavam fora dos limites estabelecidos para a espécie.
Semelhantemente, Leroy & Lourd (1989), caracterizando um isolado de
tomateiro, em meio BDA, constataram o número mínimo de pseudo-septos de
1 e o menor valor de largura de 6µm, cujos valores encontram-se fora dos
padrões para a espécie. Caracterizando morfologicamente 27 isolados de C.
cassiicola, Silva et al. (1998) encontraram valores para o comprimento de
conídios que variaram de 20 a 250µm, estando o valor menor fora dos padrões
descritos por Ellis (1971). Caracterizando um isolado originado de pepino na
Coréia, Kwon et al. (2003) observaram valores de comprimento (22-300µm) e
largura (5-10µm) para conídios que, em parte, estão fora do padrão para a
espécie. Diferenças na morfologia e nas características culturais também foram
observadas por Roim (2001), caracterizando isolados originados de soja.
Casos de variabilidades morfológicas de conídios e de conidióforos
podem ser observadas em outros trabalhos (Volin & Pohronezny, 1989;
Poltronieri et al., 2003). Entretanto, essas diferenças, para nenhum dos autores
citados, foram suficientes para que os isolados estudados fossem considerados
espécies diferentes ou novas.
12
2.8. Patogenicidade
A patogenicidade de C. cassiicola a dezenas de espécies de plantas é
citada por outros autores (Ellis, 1971; Silva et al., 1995; entre outros). A
capacidade de um isolado do patógeno em infectar diferentes hospedeiros
evidencia diferenças de patogenicidade dentro da espécie. Essas diferenças
foram utilizadas por Olive et al. (1945) na proposição de duas raças para a
espécie, baseando-se nos tipos de lesões produzidas nos hospedeiros: a raça
1 isolada de feijão-de-corda e a raça 2, de soja. Spencer e Walters (1969),
confirmaram os resultados obtidos por Olive et al. (1945), testando 14 isolados
de quatro diferentes hospedeiros, em 24 espécies de plantas. Semelhante a
esta situação, Duarte et al. (1983), em estudos com dois isolados de C.
cassiicola, um de cacaueiro e outro de mamoeiro, observaram diferenças
quanto à patogenicidade em inoculações sobre plantas de mamoeiro,
cacaueiro, caupi e seringueira. Estes autores também sugerem a existência de
duas raças, baseado na capacidade de infectar diferentes hospedeiros. Ainda,
segundo os autores, o isolado originado de mamoeiro foi capaz de infectar
plantas de mamoerio, caupi e seringueira. Já, o isolado de cacaueiro infectou
apenas plantas de cacaueiro. O termo “raça”, utilizado pelos autores acima
citados, não condiz com a concepção da terminologia, pois populações de
fungos fitopatógenos semelhantes na morfologia e separados pela
especificidade que apresentam, em nível de espécie ou de gênero de
hospedeiros, são tratadas como formae specialis (Camargo, 1995). Isolados de
soja mostraram-se desiguais quanto à patogenicidade em soja, admitindo-se a
possibilidade da existência de biótipos ou de espécies diferentes de C.
cassiicola (Roim, 2001).
Visando testar um isolado de C. cassiicola de lantana no controle
biológico da planta invasora L. camara, Pereira et al. (2003), em testes de
patogenicidade do isolado e de outros três isolados (hortênsia, trapoeraba e
tomateiro), observaram que, a exceção do isolado de tomateiro, todos foram
patogênicos apenas a seus hospedeiros originais. O isolado de lantana, não foi
capaz de infectar todos “biótipos” de lantana utilizados nos testes. A
especificidade do isolado pelo seu hospedeiro original, observado pelos
13
autores, não foi constatada em outros trabalhos envolvendo diversos outros
isolados (Olive et al., 1945; Spencer & Walters, 1969; Duarte et al., 1983).
Diferenças na patogenicidade de isolados de C. cassiicola também
foram observadas por Cutrim & Silva (2003), que utilizaram dois isolados de
folhas de tomateiro para inocular diferentes espécies de plantas, entre elas
duas espécies de plantas daninhas. Os dois isolados de tomateiro inoculados
reagiram de forma diferente quanto à patogenicidade, causando danos na
maioria das espécies. O fato de isolados de tomateiro infectarem diferentes
espécies de plantas corroboram, em parte, com os resultados obtidos por
Pereira et al. (2003), em que um isolado de tomateiro infectou, além de plantas
de tomate, duas plantas de lantana originadas de diferentes localidades e uma
de Vitex trifolia. A avaliação da patogenicidade de um isolado de C. cassiicola,
originado de trapoeraba, inoculado em 54 espécies de plantas pertencentes a
30 famílias botânicas, foi realizado por Lustosa (2000). O isolado, além de
trapoeraba, também infectou plantas de soja, cultivar UFV-16.
Silva et al. (1998), estudando a patogenicidade de 21 isolados de C.
cassiicola, dos quais cinco eram procedentes da Austrália, sendo três de
mamoeiro, um de mimosa e outro de tomilho, e 16 isolados procedentes do Sri
Lanka, coletados de diferentes clones de seringueira, constataram diferenças
entre eles, quando inoculados em plantas de feijão-de-corda, berinjela,
tomateiro e três clones de seringueira. Todos isolados foram patogênicos ao
tomateiro (var. Hayslip); porém, foram observadas diferenças na virulência
desses isolados. Somente alguns isolados foram patogênicos à berinjela, e
aqueles isolados mais virulentos em tomateiro também o foram para berinjela.
Todos isolados de Sri Lanka foram patogênicos ao feijão-de-corda, enquanto
os isolados da Austrália não foram patogênicos a esta espécie. Além disso,
todos isolados da Austrália e Sri Lanka foram patogênicos aos três clones de
seringueira (RRIC100, RRIC52 e RRIC104); contudo, a agressividade de cada
isolado foi variável para cada patossistema estabelecido. Em 2003, Silva et al.,
utilizando análises de RAPD-PCR em 42 isolados de C. cassiicola, de
diferentes plantas hospedeiras, identificaram cinco grupos genéticos. Os
resultados indicaram a existência de variação genética entre isolados de C.
cassiicola coletados de diferentes plantas.
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Departamento de Agronomia,
(Laboratório de Proteção de Plantas e casas-de-vegetação), localizado no
Campus da Universidade Estadual de Maringá (UEM), em Maringá, PR, no
período de janeiro a novembro de 2004.
O delineamento estatístico adotado para todos os experimentos foi do
tipo inteiramente casualizado (DIC), com o número de repetições variando de
cinco a seis por tratamento. Os resultados obtidos em cada experimento,
quando necessário, foram submetidos à análise estatística pelo programa
SISVAR, versão 4.6. As médias das repetições dos tratamentos foram
comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância.
3.2. Obtenção dos isolados de Corynespora cassiicola
Os isolados do patógeno utilizados nos experimentos foram obtidos
através de isolamentos do próprio hospedeiro, efetuados no Laboratório de
Proteção de Plantas da Universidade Estadual de Maringá, ou por cessão
realizada por Centros de Ensino e Pesquisa.
Os isolados do fungo provenientes do pepino foram obtidos a partir de
folhas de híbridos de pepino tipo “japonês” da Região de Norte do Estado do
Paraná, em áreas de produção comercial, em cultivo protegido. As folhas de
pepino apresentando sintomas de mancha alvo foram coletadas e levadas para
o laboratório, onde foram realizados os isolamentos e obtidas as culturas puras
do patógeno.
Os isolados de C. cassiicola de lantana, trapoeraba e falso-boldo foram
cedidos pelo professor Dr. Robert W. Barreto, da Universidade Federal de
Viçosa. Os isolados de mamoeiro e de assa-peixe, pelo professor Dr. Gilson S.
da Silva, da Universidade Estadual do Maranhão. Os isolados de alface,
15
tomateiro, aceroleira, abóbora e de pimenta-longa, pelo Dr. Luiz Sebastião
Poltronieri Pesquisador da EMBRAPA (Centro de Pesquisa Agropecuária do
Trópico Úmido-CPATU. Os isolados de soja, pelo Dr. Álvaro M. R. Almeida,
Pesquisador do Centro Nacional de Pesquisas de Soja-CNPSo. Todos os
isolados foram mantidos em geladeira 8±2ºC para serem utilizados durante os
experimentos (Quadro 1).
Quadro 1 – Isolados de Corynespora cassiicola obtidos de diversos hospedeiros e localidades utilizados nos experimentos. UEM, Maringá, PR, 2005
Isolados Hospedeiros Procedência
IA Pepino “japonês” Paraná
PB Pepino “japonês” Paraná
JQ Pepino “japonês” Paraná
493AA Soja Paraná
777AA Soja Paraná
JMP220 Lantana camara Minas Gerais
CP03 Trapoeraba Minas Gerais
RWB321 Falso-boldo Minas Gerais
GS01 Mamoeiro Maranhão
GS02 Assa-peixe Maranhão
LP01 Alface Amazonas
LP02 Tomateiro Amazonas
LP04 Aceroleira Amazonas
LP05 Abóbora Amazonas
LP07 Pimenta longa Amazonas
16
3.3. Espécies de plantas utilizadas nos experimento s de patogenicidade
Foram utilizadas durante os experimentos diversas espécies de plantas
(Quadro 2), que foram selecionadas por serem relatadas como hospedeiras do
fungo, como culturas de importância econômica para a Região, por estarem
constantemente associadas em cultivos consecutivos, consorciadas ou
cultivadas em áreas próximas. No caso das plantas daninhas, por estarem
sempre presentes nos cultivos ou nos arredores. Estas plantas foram utilizadas
nos experimentos de patogenicidade com os diversos isolados citados no item
3.2.
3.4. Obtenção de isolados
Folhas de pepino, apresentando sintomas de mancha de Corynespora,
foram coletadas em propriedades rurais em cultivos protegidos e levadas até o
Laboratório de Proteção de Plantas-UEM. Essas foram incubadas por 48 horas
em câmara úmida contendo folhas de papel filtro umedecidas com água
destilada. Decorrido o período, com o auxílio de um microscópio
estereoscópica, observou-se a formação de estruturas reprodutivas do
patógeno nos locais das lesões e, com o auxílio de estilete esterilizado, foram
coletadas e transferidas para placas-de-Petri contendo o meio de cultura BDA
(batata-dextrose-ágar). Essas placas foram mantidas em câmaras climatizadas
do tipo BOD, numa temperatura de 24±2ºC, durante três dias. Decorrido o
período, foi observado o crescimento fúngico em locais específicos, que foram
repicados individualmente para placas contendo BDA e acondicionados nas
condições anteriormente descritas, por 15 dias, obtendo-se assim culturas
puras.
17
Quadro 2 - Plantas utilizadas nos testes de patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola realizados em casa-de-vegetação. UEM, Maringá, PR, 2005
Plantas Híbridos ou variedades ou espécies
Pepino Hokushin/Cucumis sativus
Pepino Natsubayashi/C. sativus
Pepino Tsuyataro/C. sativus
Pepino Samurai/C. sativus
Meloeiro Sunrise/C. melo
Abóbora Exposição/Cucurbita maxima
Soja FT-estrela/Glycine max
Alface Vera/Lactuta sativa
Tomateiro Santa Clara/Lycopersicon esculentum
Mamoeiro Sunrise-Hawai/Carica papaya
Trapoeraba Commelina benghalensis
Assa-peixe Vernonia sp.
3.5. Culturas monospóricas
As culturas puras dos isolados, obtidas conforme descrito no item 3.4,
com idades variando de 10 a 15 dias, em placas-de-Petri contendo BDA, foram
utilizadas para a obtenção das culturas monospóricas, adicionando-se 8 mL de
água destilada e esterilizada à cultura fúngica e, com o auxílio de alça de
Drigalski, a superfície da colônia foi raspada e a suspensão obtida filtrada em
camada dupla de gaze. O sobrenadante foi coletado em recipiente esterilizado
e a concentração de esporos foi determinada através da câmara de Neubauer
e ajustada para 1 x 104 esporos/mL. Em seguida, uma alíquota de 1 mL foi
retirada e transferida para uma placa-de-Petri contendo ágar-água (2%) e
espalhada com o auxílio de alça de Drigalski.
As placas foram incubadas por três horas em câmara climatizada do
tipo BOD numa temperatura de 24±2ºC. Em seguida, com auxílio de um
microscópio estereoscópico, quatro conídios germinados foram transferidos,
18
com auxílio de pipeta de Pasteur, para placas-de-Petri contendo BDA, de forma
que ficassem distribuídos equidistantemente. As placas foram novamente
incubadas nas condições acima citadas, sob luz fluorescente contínua, por três
dias. Após esse período, foi observado um pequeno crescimento micelial nos
locais para os quais os esporos germinados foram transferidos. Fragmentos
desse crescimento micelial foram transferidos para placas-de-Petri contendo
BDA (um fragmento por placa) e incubados novamente nas condições acima
citadas. Após 10 dias, foi realizada a repicagem dos isolados para tubos de
ensaio contendo BDA e incubados por 10 dias, nas mesmas condições citadas
anteriormente. Posteriormente, os tubos (três tubos originados de um mesmo
esporo por isolado) foram mantidos em geladeira numa temperatura de 8±2ºC
para serem utilizados durante os experimentos.
3.6. Avaliação das características culturais
3.6.1. Avaliação do crescimento micelial e da color ação das
colônias
Os isolados monospóricos de C. cassiicola, acondicionados em tubos e
mantidos em geladeira, como descrito no item 3.5., foram transferidos para
meio de cultivo. Com o auxílio de uma alça, fragmentos de micélio foram
retirados dos tubos e transferidos para placas-de-Petri contendo BDA, que
foram incubadas por cinco dias em câmara climatizada do tipo BOD, sob luz
fluorescente contínua, numa temperatura de 24±2ºC. Após o período, discos de
meio de cultura contendo micélio de 0,5 cm de diâmetro foram retirados e
transferidos novamente para placas-de-Petri contendo BDA, que foram
incubadas nas mesmas condições citadas anteriormente. As mensurações do
crescimento micelial foram realizadas com o auxílio de uma régua milimetrada
a cada 24 horas, em sentidos diametralmente opostos, até o décimo dia,
quando o primeiro isolado atingiu a borda da placa-de-Petri. Neste momento,
considerou-se a avaliação do crescimento micelial encerrada. O experimento
foi instalado em DIC (delineamento inteiramente casualizado), com cinco
repetições por tratamento, sendo que uma placa-de-Petri foi considerada uma
19
unidade experimental. Paralelamente foram realizadas avaliações quanto à
coloração das colônias.
3.6.2. Avaliação da esporulação
Após a última avaliação do ensaio descrito no item 3.6.1., foi procedida
à contagem de esporos de cada repetição e de cada isolado do referido ensaio.
Foram adicionados 8 mL de água destilada e esterilizada por placa e a
superfície do meio de cultivo raspada com o auxílio de uma alça de Drigalski,
obtendo-se, assim, suspensão de fragmentos de micélio e conídios. Em
seguida, a suspensão foi filtrada em camada dupla de gaze.
As suspensões de conídios foram homogeinizadas e, em seguida, uma
alíquota foi depositada na câmara de Neubauer (hemacitômetro), para a
determinação da concentração de conídios (conídios/mL) de cada repetição e
para cada isolado. Foram realizadas duas leituras de concentração para cada
isolado.
3.6.3. Avaliação da formação de clamidósporos
Para a avaliação da formação de clamidósporos, os 15 isolados de C.
cassiicola, citados no Quadro 1, mantidos conforme o item 3.4., foram
transferidos para placas-de-Petri e incubados por cinco dias em câmara
climatizada do tipo BOD, sob luz fluorescente e contínua, numa temperatura de
24±2ºC. Após o período de incubalção, discos de meio de cultura, contendo
micélio, de 0,5 cm de diâmetro, foram transferidos para placas-de-Petri com
BDA e incubadas nas mesmas condições citadas anteriormente, durante 15
dias. Posteriormente, lâminas foram preparadas com fragmentos de micélio
obtidos de diversos pontos das colônias e observadas em microscópio óptico.
Foram mensurados 50 clamidósporos, casualizadamente entre os isolados que
apresentaram as estruturas. O experimento foi instalado em DIC (delineamento
inteiramente casualizado), com cinco repetições por tratamento, sendo que
uma placa-de-Petri foi considerada uma unidade experimental.
20
3.6.4. Caracterização morfológica de conídios
3.6.4.1. Caracterização morfológica de conídios pro duzidos in vitro
Após a última avaliação do experimento descrito no item 3.6.1. (antes
da avaliação da esporulação), com o auxílio de uma alça, fragmentos de
crescimento micelial foram retirados (de quatro diferentes pontos da colônia),
que foram transferidos para lâminas de microscopia. Em seguida, procedeu-se
à fixação com azul de algodão e à observação ao microscópio óptico, dotado
de ocular micrométrica, no aumento de 400-1000x, para a mensuração das
dimensões dos conídios dos diferentes isolados.
Foram mensuradas as seguintes dimensões dos conídios:
comprimento, largura (região mediana) e número de pseudo-septos. Quanto ao
formato, foram divididos quanto à forma (obclavado ou cilindrico) e curvatura
(reto ou curvado). Para cada repetição, foram mensurados 50 conídios,
perfazendo um total de 250 conídios para cada isolado. Somente foram
mensurados conídios soltos dos conidióforos, unitários e com septação bem
definida.
3.6.4.2. Caracterização morfológica de conídios pro duzidos in vivo
Os isolados do patógeno, originados de híbridos de pepino “japonês”,
foram coletados como descrito no item 3.2. na região de Maringá, PR. Para
observar possíveis diferenças entre as características morfológicas de conídios
produzidos em meios de cultura e em hospedeiro vivo suscetível, um isolado
de pepino (JQ) foi utilizado a caracterização. Fragmentos de micélio de cultura
monospórica acondicionados em tubos, conforme o item 3.5., foram
transferidos para placas-de-Petri, contendo meio BDA e incubadas por cinco
dias nas condições anteriormente citadas. Decorrido o período, discos de
micélio foram transferidos para novas placas contendo BDA e, novamente,
incubadas por 15 dias. Passado o período, foi obtida suspensão de esporos do
isolado JQ, que foi ajustada para a concentração de 1 x 104 esporos/mL para
serem inoculadas nas plantas de híbridos de pepino tipo “japonês”. Para a
produção das plantas, sementes de pepino do híbrido Tsuyataro foram
21
semeadas em bandejas de isopor contendo substrato comercial. As plantas
foram transplantadas para sacos plásticos contendo substrato solo:areia na
proporção 1:1 (V/V), uma planta por vaso. Utilizando-se atomizador De Vilbs
nº15, a suspensão de conídios foi atomizada sobre seis plantas de pepino até o
ponto próximo ao escorrimento e em ambas as faces foliares, abaxial e adaxial,
no momento em que estas apresentavam duas folhas definitivas. Em seguida,
as plantas foram incubadas em câmara úmida por 48 horas em casa-de-
vegetação. Em torno de 48 horas após a inoculação, foram observadas várias
lesões nos limbos foliares inoculados, lesões estas características da doença.
As folhas com sintomas foram coletadas após cinco dias, a contar da
inoculação, momento em que as lesões estavam bem desenvolvidas, e foram
acondicionadas em câmara úmida por 48 horas, no Laboratório de Proteção de
Plantas, à temperatura ambiente. Após o período, do centro das lesões,
estruturas do patógeno foram transferidas para lâminas de microscopia, fixadas
com azul de algodão e observadas em microscópio óptico no aumento de
1000x. A grande quantidade de conídios de C. cassiicola formada foi
mensurada conforme item 3.6.4.1. Foram mensurados 50 conídios de cada
planta com sintomas.
3.7. Patogenicidade
Os experimentos foram realizados em casa-de-vegetação no período
de setembro a dezembro de 2004 e foram utilizados os isolados citados no
Quadro 1 e as plantas citadas no Quadro 2.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado
(DIC), com seis repetições para cada tratamento, sendo uma planta
considerada uma unidade experimental. O preparo das mudas foi realizado
conforme descrito no item 3.6.4.2.
Após a inoculação, as plantas foram mantidas sob câmara úmida por
48 horas. A testemunha constituiu de plantas atomizadas somente com água
destilada. A câmara úmida foi formada com o auxílio de um bolsão plástico, no
qual as plantas foram mantidas durante o período de incubação.
Para a confirmação da patogenicidade, folhas exibindo sintomas foram
destacadas e mantidas sob câmara úmida por um período que variou de 48 a
22
72 horas, à temperatura ambiente em laboratório. Decorrido o período, com
auxílio de um microscópio estereoscópico, foi observado a existência de
crescimento micelial sobre o tecido foliar lesionado. Em seguida, a superfície
das lesões foram raspadas e lâminas foram preparadas para a observação em
microscópio óptico das estruturas coletadas. Nas amostras em que foram
observadas lesões com presença de estruturas reprodutivas de C. cassiicola
(conídios e conidióforos), a patogenicidade do isolado foi considerada positiva.
Esses testes foram desenvolvidos em etapas, sendo que para cada
espécie de planta utilizada nos tratamentos foram produzidas mudas nas quais
todos isolados foram inoculados.
3.7.1. Produção de mudas
Para a realização dos ensaios, foi utilizado o substrato solo:areia na
proporção 1:1 (V/V). O solo foi peneirado e misturado à areia e desinfestado
com brometo de metila (150 cm3/m3 de solo) por um período de 72 horas,
dentro de tambores plásticos de 250L de capacidade. Decorrido o período, o
solo permaneceu exposto ao ar livre por mais 24 horas para a volatilização de
resíduos do produto. Em seguida, o substrato foi acondicionado em sacos
plásticos pretos, com capacidade de 1 L, que, posteriormente, receberam as
mudas produzidas em bandejas. Para a produção das mudas, utilizou-se o
mesmo procedimento do item 3.6.4.2. Plantas de abóbora e de soja foram
produzidas através do semeio direto nos sacos plásticos.
3.7.2. Preparo do inóculo, inoculação e avaliações
Tanto para o preparo do inóculo quanto para a inoculação, utilizou-se o
mesmo procedimento do item 3.6.4.2.
As espécies inoculadas, com respectivas idades das mudas, estão
listadas no Quadro 3.
Para a inoculação e incubação das plantas em câmara úmida, adotou-
se o mesmo procedimento citado no item 3.6.4.2. Após o período em câmara
úmida, as plantas foram mantidas em condições de casa-de-vegetação, onde
se procederam as avaliações.
23
Para cada espécie, inocularam-se seis plantas, cada uma foi
considerada uma unidade experimental. O delineamento experimental utilizado
foi do tipo inteiramente casualizado (DIC).
As avaliações foram realizadas diariamente até o 15º dia para a maioria
dos tratamentos, exceto para trapoeraba e assa-peixe, cujo período de
avaliação foi até o 30º dia, e soja, até o 20º dia.
A reação foi considerada positiva (suscetível) ou negativa (resistente)
em função da presença ou ausência de sintomas da doença e de sinais do
patógeno nas plantas inoculadas em cada espécie.
Quadro 3 – Estádios de desenvolvimento das espécies de plantas inoculadas com Corynespora cassiicola. UEM, Maringá, PR, 2005
Espécie vegetal Idade (dias) Número de folhas ou
trifólios definitivos
Cucumis sativus/Hokushin 15-17 2
C. sativus/Natsubayashi 15-17 2
C. sativus/Samurai 15-17 2
C. sativus/Tsuyataro 15-17 2
C. melo/Sunrise 15 2
Cucúrbita maxima/Exposição 15 2
Glycine max/FT-estrela 20-25 3
Lactuca sativa/Vera 20 7
Lycopersicon esculentum/Santa
Clara 25 4
Carica papaya/Sunrise 30 5
Commelina benghalensis 25 3
Vernonia sp. 35 4
24
3.7.3. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a híbridos de pepino tipo “japonês”
Foram realizadas inoculações com sete isolados de C. cassiicola,
oriundos de diversos hospedeiros, citados no Quadro 1 (IA, PB, JQ, LP05,
493AA, 777AA e LP02), em quatro híbridos de pepino tipo “japonês” mais
cultivados em ambiente protegido (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e
Samurai).
A produção de mudas, a preparação do inóculo, a inoculação, a
incubação em câmara úmida e a manutenção das plantas em casa-de-
vegetação foram desenvolvidas conforme descrito no item 3.6.4.2.
As inoculações foram realizadas no momento em que as plantas de
pepino apresentaram as duas primeiras folhas definitivas completamente
expandidas, as quais foram atomizadas com as suspensões até próximo ao
ponto de escorrimento, em ambas as faces, abaxial e adaxial.
As avaliações de severidade da doença foram realizadas 13 dias após
a inoculação. Logo após, as folhas que apresentaram sintomas foram
coletadas e colocadas em câmara úmida e submetidas aos mesmos
procedimentos descritos no item 3.6.4.2., para a constatação da presença de
sinais do patógeno.
A avaliação da severidade dos isolados foi realizada na primeira folha
definitiva, utilizando, como base, a escala Horsfall-Barratt modificada (Campbell
e Madden, 1990), levando em consideração a porcentagem de área foliar com
sintomas de mancha alvo (Quadro 4).
25
Quadro 4 – Escala de notas utilizada para a avaliação da severidade de Corynespora cassiicola a híbridos de pepino do tipo “japonês”. UEM, Maringá, PR, 2005
Nota Severidade de Isolados de C. cassicola
(% de área foliar com sintomas)
0 Ausência de sintomas
1 < 1
2 1 a 3
3 3,1 a 6
4 6,1 a 12
5 12,1 a 25
6 25,1 a 50
7 > 50,1
26
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação das características culturais
4.1.1. Avaliação do crescimento micelial e da color ação das
colônias
Somente para alguns isolados utilizados houve diferenças significativas
nas taxas de crescimento micelial (Quadro 5). Comparando-se a taxa de
crescimento micelial dos diferentes isolados foi possível a separação dos
isolados em cinco grupos. O primeiro grupo foi composto dos isolados
RWB321, LP07, JQ e LP04, que apresentaram as maiores taxas de
crescimento. O segundo e o terceiro, compreendendo os isolados LP01, GS02,
IA, GS01, PB e 493AA e CP03, respectivamente, apresentaram taxa de
crescimento intermediário. E, finalmente, o quarto e o quinto, envolvendo os
isolados 777AA e JMP220 e LP05 e LP02, respectivamente, apresentaram as
menores taxas de crescimento micelial.
Quanto à coloração, foram observadas diferenças entre os isolados,
com colônias variando de cinza-claro a oliváceo (Quadro 5 e Figura 1). Os
isolados IA, PB, JQ, LP05, LP02, JMP220, LP04 e GS02 apresentaram
coloração de colônia cinza, enquanto que, para os isolados 777AA, GS01 e
LP01, a coloração da colônia foi cinza-claro. Já, os isolados 493AA e LP07
apresentaram diferenças de coloração entre as repetições variando de cinza-
claro a cinza. O isolado RWB321 formou colônias cuja coloração variou entre
cinza-claro a cinza-escuro. O isolado CP03 formou colônias somente com
coloração olivácea.
4.1.2. Avaliação da esporulação
Para a avaliação da esporulação, houve diferenças significativas entre
os isolados (Quadro 5). Todos isolados esporularam no meio de cultivo BDA,
27
sendo possível separá-los em grupos. Os seguintes grupos foram separados
em ordem decrescente de esporulação: 1) 493AA e LP02; 2) LP05; 3) LP07; 4)
RWB321, CP03, 777AA, IA, JQ e JMP220; 5) LP04, GS01, GS02, PB e LP01.
O isolado LP02 apresentou menor taxa de crescimento micelial; no entanto, ele
está entre os dois que apresentaram os maiores valores de esporulação. Já, os
isolados que apresentaram as maiores taxas de crescimento (JQ, LP04 e
RWB321) se comportaram com tendência de menor esporulação, se inserindo
nos grupos 4 e 5.
4.1.3. Avaliação da formação de clamidósporos
Alguns dos isolados formaram clamidósporos em meio de cultura BDA
(Quadro 5). Todos os isolados provenientes de pepino formaram
clamidósporos. Além desses, os isolados originados de lantana (JMP220), de
aceroleira (LP04) e de assa-peixe (GS02) também formaram essas estruturas
de sobrevivência. Já, para os demais isolados, não se observou a presença de
clamidósporos em meio de cultura BDA.
Realizando a mensuração dos clamidósporos, a dimensão média
encontrada foi 13,78µm de comprimento e 13,09µm de largura. A formação das
estruturas ocorreu tanto de maneira intercalar e terminal como também em
cadeia de até cinco clamidósporos (Figura 2). O material citoplasmático das
estruturas aparentemente apresentou condensação, que foi observado em
função da opacidade visualizada na parte central.
28
Quadro 5 – Taxa de crescimento (mm.d-1) e demais características de colônias de isolados de Corynespora cassiicola cultivados em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA), à temperatura de 24±2ºC, aos 10 dias de incubação. UEM, Maringá, PR, 2004
Isolado Origem dos
isolados
Taxa de
Crescimento
(mm.d-1)1
Diâmetro
da
colônia
(mm)
Coloração
da
colônia3
Esporulação1,2
1x104
conídios/mL
Formação de
clamidósporos
IA Pepino 7,36 d 73,60 C 142,38 b +
PB Pepino 6,78 d 67,80 C 79,45 a +
JQ Pepino 8,20 e 82,00 C 127,09 b +
LP05 Abóbora 4,22 a 42,20 C 298,34 d -
493AA Soja 6,18 c 61,80 CC/C 392,15 e -
777AA Soja 5,28 b 52,80 CC 160,49 b -
LP02 Tomateiro 3,50 a 35,00 C 335,89 e -
GS01 Mamoeiro 7,20 d 72,00 CC 96,63 a -
JMP220 Lantana 5,18 b 51,80 C 124,97 b +
LP04 Aceroleira 8,02 e 80,20 C 108,21 a +
LP01 Alface 7,66 d 76,60 CC 56,39 a -
LP07 Pimenta-
longa 8,22 e 82,20 CC/C 233,58 c -
RWB321 Falso-
boldo 8,38 e 83,80 CC/CE 189,86 b -
CP03 Trapoeraba 5,76 c 57,60 O 161,68 b -
GS02 Assa-peixe 7,52 d 75,20 C 93,44 a +
C.V. (%) 8,89 26,23 1 Médias seguidas de mesma letra minúscula nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância. Média de cinco repetições. 2 Dados transformados para (x + 0,5)1/2, onde x representa a esporulação de Corynespora cassiicola 3 Coloração da colônia: CC (cinza claro), C (cinza) CE (cinza escuro), O (oliváceo)
29
Figura 1 – Colorações apresentadas pelas colônias dos isolados de Corynespora cassiicola em meio BDA (CC=cinza-claro, C=cinza, CE=cinza-escuro e O=oliváceo).
30
Figura 2 – Estrutura de resistência (clamidósporos) formada por isolados de Corynespora cassiicola em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA). (A) terminal; (B e C) intercalar; (D) em cadeia.
31
4.1.4. Caracterização morfológica de conídios
4.1.4.1. Caracterização morfológica de conídios pro duzidos in vitro
Os resultados referentes aos limites inferior e superior e média das
dimensões de conídios, bem como forma e curvatura encontrados para cada
isolado, estão apresentados no Quadro 6. Neste Quadro é possível observar os
limites das características mensuradas (comprimento, largura e número de
pseudo-septos) para cada isolado (mínimo – médio – máximo), bem como o
desvio padrão.
Os conídios produzidos pelos isolados LP05 e LP02 apresentaram
limites inferior e superior de comprimento entre 43,75µm e 442,50µm, estando
dentro do padrão descrito por Ellis (1971), cuja variação é de 40µm a 520µm.
Já, para os demais isolados, o limite inferior de comprimento dos conídios foi
inferior ao descrito para a espécie, chegando a 15,0µm para o isolado 493AA.
Os valores dos limites inferiores da largura dos conídios, como também
seus valores médios (máximo de 8,05µm) para todos isolados, estavam abaixo
daqueles descritos por Ellis (1971) para C. cassiicola, que foi de 9,0µm. Para
os isolados IA, GS01, LP07, RWB321 e GS02, também os limites superiores se
encontraram fora do padrão descrito para espécie, sendo o valor máximo
encontrado de 8,75µm.
Para todos isolados, a grande maioria dos conídios apresentou a base
arredondada e poucos truncados (Figura 3-D e E). Ellis (1971) descreve a base
dos conídios de C. cassiicola como sendo uma base truncada, conforme figura
3-E.
Para o número de pseudo-septos, também foram constatadas
variações fora dos padrões descritos para a espécie. Todos os isolados, a
exceção do LP02, apresentaram número de pseudo-septos fora dos padrões
descritos por Ellis (1971) para a espécie em seus limites inferiores, que é de
quatro. Os isolados LP02 e LP01 produziram conídios com número de pseudo-
septos (32 e 21, respectivamente) acima dos descritos para a espécie, que é
de 20.
Quanto à forma, a porcentagem de conídios cilíndricos e obclavados foi
variável entre os isolados. Os isolados JQ e LP01 apresentaram 92,0% e
32
97,6% de conídios cilíndricos, respectivamente, enquanto os isolados LP04,
CP03 e 777AA, 92,8%, 86,0% e 80,4% de conídios obclavados,
respectivamente (Figura 3). Para os isolados originados de pepino tipo
“japonês” (IA, PB e JQ) e de soja (493AA e 777AA), não foram observadas
proporções similares quanto à forma dos conídios, quando comparados quanto
ao hospedeiro de origem. Entretanto, para a curvatura, todos os isolados de C.
cassiicola apresentaram maiores porcentagens de conídios retos. A menor e a
maior porcentagem de conídios retos foram observadas para os isolados LP04
(73,2%) e PB (100%), respectivamente.
4.1.4.2. Caracterização morfológica de conídios pro duzidos in vivo
Os resultados mostraram que os conídios produzidos em hospedeiro
vivo apresentaram dimensões superiores aos conídios produzidos em meio de
cultura BDA (Quadro 7).
Para a variável comprimento, os valores máximo, médio e mínimo para
conídios produzidos in vitro foram 152,50, 73,21 e 21,25µm, respectivamente.
Para conídios produzidos in vivo, foram 291,40, 181,78 e 89,90µm,
respectivamente. Resultados análogos foram obtidos para as variáveis largura
e número de pseudo-septos. Esses resultados mostraram que as maiores
dimensões de conídios foram obtidas quando produzidos em hospedeiro vivo.
Quanto ao formato, a maioria dos conídios produzidos, tanto in vitro como in
vivo, foi cilíndrico, com maior porcentual para conídios produzidos formados em
meio BDA. No entanto, para a curvatura, em meio de cultivo, a maioria dos
conídios (96,4%) foi reta. Já, para conídios formados em hospedeiro vivo, a
maioria dos conídios foi curvada (81,2%).
33
Quadro 6 – Caracterização morfológica de conídios de isolados de Corynespora cassiicola originados de diferentes hospedeiros, cultivados em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA), à temperatura de 24±2ºC após 10 dias de incubação. UEM, Maringá, PR, 2004
Isolado Dimensões (µm) Número de
Pseudo-septos
Forma (%) Curvatura (%)
Comprimento Largura Cilíndrico Obclavado Reto Curvado
IA 73,251 ± 28,09 2
(21,25 – 181,25) 3
6,42 ± 1,05
(3,75 – 8,75)
4,34 ± 1,74
(1,0 – 11,0) 42,8 57,2 98,0 2,0
PB 70,46 ± 24,30
(26,25 – 142,50)
6,50 ± 1,09
(3,75 – 10,0)
4,17 ± 1,71
(1,0 – 9,0) 50,0 50,0 100,0 0,0
JQ 73,21 ± 25,93
(21,25 – 152,50)
6,40 ± 0,94
(5,0 – 10,0)
4,51 ± 1,94
(1,0 – 15,0) 92,0 8,0 96,4 3,6
LP05 100,15 ± 33,87
(43,75 – 231,25)
6,83 ± 1,14
(5,0 – 10,0)
7,45 ± 2,80
(2,0 – 16,0) 36,8 63,2 96,0 4,0
493AA 51,16 ± 17,84
(15,0 – 115,0)
6,66 ± 1,0
(5,0 – 10,0)
3,35 ± 1,68
(1,0 – 10,0) 72,0 28,0 88,4 11,6
777AA 48,1 ± 15,49
(21,25 – 107,50)
7,55 ± 1,04
(4,38 – 11,25)
2,88 ± 1,15
(1,0 – 8,0) 19,6 80,4 96,8 3,2
LP02 125,37 ± 48,93
(45,0 – 442,50)
6,78 ± 0,37
(4,38 – 10,0)
9,66 ± 3,95
(4,0 – 32,0) 35,2 64,8 88,8 11,2
GS01 66,87 ± 18,25
(37,50 – 106,25)
7,03 ± 0,92
(5,0 – 8,75)
3,60 ± 1,16
(2,0 – 6,0) 40,8 59,2 98,0 2,0
JMP220 70,83 ± 27,48
(26,25 – 180,0)
7,47 ± 0,96
(5,63 – 10,0)
4,31 ± 2,0
(1,0 – 14,0) 62,0 38,0 82,8 17,2
34
Quadro 6, Cont.
LP04 79,44 ± 24,08
(37,50 – 198,75)
7,40 ± 0,89
(5,0 – 10,0)
5,18 ± 1,52
(2,0 – 10,0) 7,2 92,8 73,2 26,8
LP01 102,36 ± 56,34
(37,20 – 403,0)
8,05 ± 1,36
(5,0 – 12,40)
6,38 ± 3,50
(1,0 – 21,0) 97,6 2,4 95,2 4,8
LP07 70,55 ± 22,76
(31,25 – 121,25)
5,75 ± 0,81
(3,75 – 7,50)
4,35 ± 1,69
(2,0 – 9,0) 24,0 76,0 83,2 16,8
RWB321 77,61 ± 27,27
(30,0 – 182,50)
6,34 ± 0,84
(5,0 – 8,75)
4,94 ± 2,20
(2,0 – 14,0) 69,2 30,8 82,4 17,6
CP03 66,03 ± 14,53
(38,75 – 123,75)
6,99 ± 1,08
(5,0 – 10,0)
3,62 ± 1,11
(2,0 – 6,0) 14,0 86,0 75,2 24,8
GS02 65,36 ± 22,44
(27,50 – 127,50)
5,75 ± 0,70
(4,38 – 7,50)
3,90 ± 1,62
(1,0 – 9,0) 60,0 40,0 97,2 2,8
1 Média de 250 conídios, 2 Desvio Padrão da média, 3 Menor e maior valor
35
Quadro 7 – Caracterização morfológica de conídios do isolado JQ produzidos em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) e em plantas do híbrido de pepino Tsuyataro. UEM, Maringá, PR, 2004
Substrato Dimensões (µm) Número de
Pseudo-septos
Forma (%) Curvatura (%)
Comprimento Largura Cilíndrico Obclavado Reto Curvado
Meio BDA 73,21 1 ± 25,93 2
(21,25 – 152,50) 3
6,40 ± 0,94
(5,0 – 10,0)
4,51 ± 1,94
(1,0 – 15,0) 92,0 8,0 96,4 3,6
Pepino* 181,78 ± 36,61
(89,90 – 291,40)
9,21 ± 1,12
(6,20 – 12,40)
10,54 ± 2,39
(5 – 18) 76,4 23,6 18,8 81,2
1 Média de 250 conídios, 2 Desvio Padrão da média, 3 Menor e maior valor, * isolado: JQ, produzido em folhas do híbrido Tsuyataro
36
Figura 3 – Morfologia de conídios de isolados de Corynespora cassiicola: (A) conídio cilíndrico e obclavado em um mesmo isolado; (B) conídio cilíndrico; (C) conídio obclavado; (D) base arredondada; (E) base truncada. Fator de correção da ocular micrométrica 1,25µm.
37
4.2. Patogenicidade
Todos os resultados obtidos nos testes de patogenicidade dos isolados
de C. cassiicola estão expressos no Quadro 9.
As reações apresentadas pelas espécies de plantas foram
diferenciadas quanto à suscetibilidade aos diferentes isolados inoculados;
contudo, todas as plantas foram infectadas com seus respectivos isolados.
Os isolados IA, PB, JQ, originados de pepino “japonês”, e o isolado
LP05, originado de abóbora, foram patogênicos aos quatro híbridos de pepino
(Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai), ao mamoeiro (Sunrise), ao
meloeiro nobre (híbrido Sunrise), à abóbora (Cucurbita máxima, híbrido
Exposição), à soja (cultivar FT-Estrela) e ao tomateiro (var. Santa Clara). Além
disso, os três isolados originados de pepino infectaram plantas de alface (var.
Vera). Os quatro isolados de pepino se comportaram semelhantemente quanto
à capacidade de causar doenças aos diferentes hospedeiros.
Diferentemente, os isolados 493AA e 777AA, originados de soja,
apresentaram diferenças quanto à patogenicidade. O isolado 493AA foi
patogênico ao mamoeiro, a dois híbridos de pepino (Natsubayashi e
Tsuyataro), ao meloeiro, à abóbora, à soja, à alface e ao tomateiro. Já, o
isolado 777AA foi patogênico a um número menor de espécies: dois híbridos
de pepino (Natsubayashi e Tsuyataro), soja, alface e tomateiro. Todas as
espécies que apresentaram suscetibilidade ao isolado 777AA também foram
suscetíveis ao isolado 493AA.
Além do tomateiro, o isolado LP02 (originado de tomateiro) também foi
patogênico a dois híbridos de pepino (Natsubayashi e Tsuyataro) e ao
mamoeiro. Os isolados GS01 e RWB321, originados de mamoeiro e falso-
boldo, respectivamente, além de infectar seus próprios hospedeiros, também
infectaram o meloeiro, a soja e a alface, mostrando serem similares entre si
quanto à capacidade de causar doenças a diferentes espécies de plantas.
O isolado de lantana, JMP220, foi patogênico ao mamoeiro, à alface,
ao tomateiro e à planta daninha assa-peixe.
O isolado originado de aceroleira (LP04) infectou, além da aceroleira, o
meloeiro, a abóbora, a soja e a planta daninha trapoeraba.
38
O isolado originado de alface (LP01) foi patogênico à alface e ao
tomateiro. O isolado de trapoeraba (CP03), além da trapoeraba, foi patogênico
à abóbora. Os isolados LP01 e CP03 apresentaram a menor gama de
hospedeiros dentre os isolados avaliados.
O isolado LP07, originado de pimenta-longa, foi patogênico ao
mamoeiro, à abóbora e ao tomateiro.
O isolado de assa-peixe (GS02), além de assa-peixe, foi patogênico ao
mamoeiro, à soja, à alface e à planta daninha trapoeraba.
O mamoeiro (híbrido Sunrise) foi o hospedeiro que apresentou maior
suscetibilidade frente aos isolados inoculados, sendo infectada por 12 dos 15
isolados de C. cassiicola inoculados. Ao contrário, os hospedeiros trapoeraba e
assa-peixe foram os menos suscetíveis, sendo infectados por três e dois
isolados, respectivamente.
As lesões foliares apresentadas pelos diferentes patossistemas
formados variaram quanto ao tempo decorrido da inoculação até o surgimento
dos primeiros sintomas (período de incubação). As reações foram
consideradas positivas (suscetível) ou negativas (resistente) em função da
presença ou ausência de sintomas e de sinais do patógeno. As lesões
apresentadas pelos patossistemas estabelecidos estão evidenciadas na Figura
4.
4.2.1. Agressividade de isolados de Corynespora cassiicola a híbridos de pepino tipo “japonês”
A agressividade de cada um dos sete isolados de C. cassiicola
originados de diferentes hospedeiros (IA, PB e JQ, originados de pepino; LP05,
originado de abóbora; 493AA e 777AA, originados de soja; LP02, originado de
tomateiro), quando inoculados em quatro híbridos de pepino tipo “japonês”
(Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e Samurai), está expresso no Quadro 10 e
na Figura 5.
O período de incubação observado para os patossistemas que
envolveram os isolados de pepino (IA, PB e JQ) e o híbrido Tsuyataro foi
menor do que o apresentado pelos demais patossistemas formados. O período,
39
para o híbrido Tsuyataro, foi inferior a 48 horas e, para os outros patossistemas
formados, esse intervalo foi superior a 72 horas.
Os híbridos de pepino Hokushin e Samurai não foram suscetíveis a
todos os isolados testados, apenas foram infectados pelos isolados IA, PB e
JQ, originados de pepino, e pelo isolado LP05, originado de abóbora.
Houve diferenças significativas entre a agressividade dos isolados
frente aos híbridos de pepino testados. Os isolados de pepino (IA, PB e JQ)
mostraram-se significativamente mais agressivos quando inoculados nos
quatro híbridos de pepino analisados (Natsubayashi, Hokushin, Tsuyataro e
Samurai) em relação aos demais isolados inoculados. Além disso, o híbrido
Tsuyataro mostrou ser mais suscetível entre os híbridos testados.
Entre os patossistemas estabelecidos, foram observadas variabilidades
sintomatológicas (tipo de lesão). Foi possível estabelecer dois tipos de lesões
distintas. O primeiro tipo de lesão foi apresentado pelos isolados originados de
pepino (IA, PB e JQ), que se mostraram, inicialmente, como pequenas
pontuações cloróticas de formato regular (Figura 6-A), que evoluíram para
manchas circulares a irregulares, às vezes, com aspecto de encharcadas,
halos cloróticos e centro de coloração palha (Figura 6-B). Em estádios mais
avançados, as lesões tornaram-se maiores, com discretos halos cloróticos e
bordos encharcados de coloração olivácea; em alguns momentos, as manchas
se encontravam formando extensas áreas necróticas que resultaram no
coalescimento das lesões e seca do limbo foliar (Figura 6-C). O segundo tipo
de lesão foi apresentado pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02, tendo
formato irregular, com aspecto áspero, ausência de tecidos encharcados,
discretos halos cloróticos e coloração palha (Figura 6-D).
40
Quadro 9 – Patogenicidade de isolados de Corynespora cassiicola, originados de diferentes hospedeiros, inoculados à temperatura ambiente em casa-de-vegetação. UEM, Maringá, PR, 2004
Espécie vegetal inoculada
Isolado/hospedeiro de origem/reação1
IA Pepino
PB Pepino
JQ Pepino
LP05 Abóbora
493AA Soja
777AA Soja
LP02 Tomateiro
GS01 Mamoeiro
JMP220 Lantana
LP04 Aceroleira
LP01 Alface
LP07 Pimenta-
longa
RWB321 Falso-boldo
CP03 Trapoeraba
GS02 Assa-peixe
Carica papaya “Sunrise” + + + + + - + + + + - + + - +
Cucumis sativus “Hokushin” + + + + - - - - - - - - - - -
Cucumis sativus “Natsubayashi” + + + + + + + - - - - - - - -
Cucumis sativus “Samurai” + + + + - - - - - - - - - - -
Cucumis sativus “Tsuyataro” + + + + + + + - - - - - - - -
Cucumis melo “Sunrise” + + + + + - - + - + - - + - -
Cucurbita maxima
“Exposição” + + + + + - - - - + - + - + -
Glycine Max “FT-estrela” + + + + + + - + - + - - + - +
Lactuca sativa “Vera” + + + - + + - + + - + - + - +
Lycopersicon esculentum
“Santa Clara” + + + + + + + - + - + + - - -
Commelina benghalensis - - - - - - - - - + - - - + +
Vernonia sp. - - - - - - - - + - - - - - + 1 (-) ausência de sintomas e sinais do patógeno, (+) presença de sintomas e sinais do patógeno
41
Figura 4 – Sintomas apresentados após a inoculação com diferentes isolados de Corynespora cassiicola. Plantas: assa-peixe (A), tomateiro (B), soja (C), pepino (D), trapoeraba (E), alface (F) e mamoeiro (G).
42
Quadro 10 – Severidade da doença em quatro híbridos de pepino tipo “japonês”, inoculados com isolados de Corynespora cassiicola, em condições de casa-de-vegetação. UEM, Maringá, PR, 2004
Isolados Severidade1,2
Hokushin Natsubayashi Samurai Tsuyataro Médias
IA 2,50 Ac 3 2,33 Ab 2,33 Ac 7,0 Bc 3,54 b
PB 5,33 Ce 2,0 Ab 2,83 Bc 6,33 Dc 4,12 b
JQ 3,33 Bd 2,33 Ab 5,17 Cd 6,50 Dc 4,33 b
LP05 1,17 Ab 2,33 Bb 1,50 Ab 3,0 Ba 2,0 a
493AA 0,0 Aa 1,33 Ba 0,0 Aa 3,67 Cb 1,25 a
777AA 0,0 Aa 1,33 Ba 0,0 Aa 4,17 Cb 1,38 a
LP02 0,0 Aa 2,50 Bb 0,0 Aa 2,67 Ba 1,29 a
Médias 1,76 A 2,02 A 1,69 A 4,76 B
C.V. (%) 26,00 1 Escala de notas: 0 = ausência de sintomas; 1 = < 1% de área foliar infectada (afi); 2 = 1% a 3% de afi; 3 = 3,1% a 6% de afi; 4 = 6,1% a 12% de afi; 5 = 12,1% a 25% de afi; 6 = 25,1% a 50% de afi; 7 = > 50,1% de afi 2 Dados não transformados 3 Médias seguidas de mesma letra maiúscula na horizontal e minúscula na vertical não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância
43
Figura 5 – Severidade da doença causada por Corynespora cassiicola, originados de diferentes hospedeiros, inoculados em quatro híbridos de pepino tipo “japonês”, à temperatura ambiente em casa-de-vegetação. UEM, Maringá, PR, 2004
0
1
2
3
4
5
6
7
8
IA PB JQ LP05 493AA 777AA LP02
Isolados
Sev
erid
ade
Hokushin Natsubayashi Samurai Tsuyataro
44
Figura 6 – Padrão sintomatológico de lesões apresentadas por isolados de Corynespora cassiicola quando inoculados em híbridos de pepino “japonês”. (A, B e C) Lesões apresentadas pelos isolados de pepino (IA, JQ e PB) e (D) lesões apresentadas pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02.
45
5. DISCUSSÃO
Este trabalho procurou evidenciar a variabilidade morfológica de
conídios e conidióforos, fisiológica e patogênica de isolados de C. cassiicola e
severidade de sete isolados quando inoculados em híbridos de pepino tipo
“japonês”. Os isolados foram originados de diferentes espécies de plantas,
algumas de grande importância agronômica. Os isolados testados foram
obtidos de diferentes regiões do Brasil: Norte, Nordeste, Sudeste e Sul.
Diferenças significativas na taxa de crescimento micelial e na
esporulação foram observadas entre os isolados, bem como diferenças na
coloração de colônias. Essas diferenças, entre os isolados originados de
diferentes hospedeiros, podem ser justificadas pelas diferenças individuais
quanto à exigência para nutrição, temperatura e fotoperíodo e/ou, também,
pelas características intrínsecas a cada isolado.
Quanto à coloração das colônias, houve diferenças entre os isolados
analisados, que variaram de cinza-claro a oliváceo, o que concordando com a
descrição relatada por Ellis (1971) para a espécie.
A menor taxa de crescimento micelial foi apresentada pelo isolado
LP02, originado de tomate; contudo, ele está entre os dois isolados que
apresentaram os maiores valores de esporulação. Ao contrário, os isolados que
apresentaram as maiores taxas de crescimento (JQ, LP04 e RWB321)
enquadraram-se nos grupos de menores valores de esporulação.
O meio de cultura é, reconhecidamente, um determinante de
crescimento e esporulação, sendo ainda que, um meio que favoreça a
esporulação não necessariamente favorecerá o crescimento micelial (Tuite,
1969; Dhingra & Sinclair, 1995). Diferenças no comportamento de isolados de
C. cassiicola foram relatadas por alguns autores quando cultivados em
diferentes meios de cultura, temperaturas e regimes de luminosidade (Almeida
& Yamashita, 1976; Duarte et al., 1983). Avaliando meios de cultura, Olive et al.
(1945) observaram que os maiores valores para a esporulação do fungo foram
obtidos em meio BDA e Czapek-ágar. Quanto à presença de luz, a esporulação
46
e o crescimento micelial do fungo foram favorecidos na presença de luz
contínua (Onesirosan et al., 1975; Almeida & Yamashita, 1976; Roim, 2001).
Quanto à formação de clamidósporos, observações, utilizando
microscopia óptica, evidenciaram, em alguns isolados, a presença de hifas
diferenciadas e, em alguns pontos dilatações de formato ovalado a circular com
paredes mais espessas. Nesses locais, o material citoplasmático
aparentemente apresentou condensação, que foi observado em função da
opacidade visualizada na parte central.
A formação de clamidósporos foi também relatada por Olive et al.
(1945) em meio de cultura. A exceção desse relato, a formação de
clamidósporos por isolados de C. cassiicola não tem sido mencionada na
literatura. As formas de sobrevivência do inóculo mais freqüentemente citadas
na literatura são através de plantas hospedeiras e de atividade saprofítica.
A sobrevivência de isolados de C. cassiicola em restos de culturas foi
observada por Almeida et al. (2001) em soja. Wulff & Pascholati (1997) relatam
o patógeno em restos de culturas de gergelim e Rêgo & Carrijo (2000) em
restos de cultura de cucurbitáceas e plantas daninhas como hospedeiras do
patógeno. Plantas daninhas, tais como: trapoeraba, assa-peixe e lantana, são
descritas como hospedeiras do patógeno (Pereira & Barreto, 2000; Souza &
Silva, 2001; Cutrim & Silva, 2003).
A fase que serve para diferenciar o ciclo primário do secundário das
relações patógeno-hospedeiro é a sobrevivência do inoculo, sendo
caracterizada por garantir a sobrevivência do patógeno em condições
adversas. Durante o ciclo evolutivo, cada patógeno desenvolveu forma (s) de
sobrevivência, entre elas, estruturas de especializadas de resistência,
atividades saprofíticas e plantas hospedeiras (Amorim, 1995).
Ellis (1971) relatou os critérios taxonômicos para a caracterização de
isolados de C. cassiicola baseados em características morfológicas de conídios
e conidióforos. No presente trabalho, os conidióforos não foram distintos das
hifas que os produziam e, em função disso, suas estruturas não foram
mensuradas. Ferreira & Alfenas (1980), trabalhando com isolados ipê em meio
de cultura artificial, também constataram que os conidióforos mostraram-se
poucos distintos das hifas que os produziam. Situação semelhante foi também
relatada por Wei (1950).
47
Isolados originados de diferentes hospedeiros de C. cassiicola, quando
cultivados em meio de cultura artificial BDA, variaram quanto à morfologia de
conídios e coloração das colônias. Para a maioria dos isolados analisados, as
estruturas apresentaram valores de comprimento, largura e número de pseudo-
septos, em parte, fora daqueles descritos por Ellis (1971). Para a maioria dos
isolados, foram observados conídios apresentado comprimento, largura e
número de pseudo-septos abaixo de 40µm, 9µm e 4, respectivamente, que
foram os valores mínimos estabelecidos para C. cassiicola pelo autor acima
citado. Os isolados LP02 e LP01 produziram conídios com número de pseudo-
septos (32 e 21, respectivamente) acima dos descritos para a espécie (Ellis,
1971).
Ainda neste trabalho, foi realizada a caracterização morfológica de
conídios do isolado JQ, originado de pepino, produzidos em hospedeiro vivo
(híbrido Tsuyataro). Foi possível a constatação de diferenças morfológicas no
mesmo isolado (JQ) quando produzidos em diferentes condições (meio de
cultura BDA e hospedeiro suscetível). Conídios produzidos em condições
artificiais apresentam dimensões, em parte, fora dos padrões descritos para a
espécie; ao passo que, os conídios do mesmo isolado, quando produzidos in
vivo, os valores foram maiores que quando produzidos in vitro, e dentro dos
limites descritos para a espécie por Ellis (1971), a exceção do menor valor de
largura encontrado.
Situação análoga foi encontrada por Roim (2001), em meio de cultura,
ao caracterizar morfologicamente isolados de C. cassiicola de soja. O autor
relatou que o isolado de semente e a maioria dos isolados de folhas, embora
apresentassem comprimento dos conídios dentro dos limites descritos para a
espécie, a largura e o número de pseudo-septos não corresponderam aos
valores descritos por Ellis (1971). No trabalho de Roim (2001), mesmo os
isolados sendo de hospedeiro comum, ainda foram observadas diferenças
significativas entre os parâmetros analisados (comprimento, largura e número
de pseudo-septos) entre os isolados de folhas, sementes e raízes.
Fatores ambientais, como umidade relativa, são relatados como
possíveis fatores que podem vir a alterar as características morfológicas desse
fungo. Em ambientes com alta umidade relativa, essa alteração pode modificar
o formato de conídios e de conidióforos e também dificultar a visualização de
48
pseudo-septos de conídios. Quando produzidos em meio de cultura artificial, os
parâmetros morfológicos mensuráveis para a espécie podem ser alterados,
quando comparados às estruturas produzidas in vivo (Olive et al., 1945; Wei,
1950; Ferreira & Alfenas, 1980; Gasparotto et al., 1988). Olive et al. (1945)
observaram diferenças morfológicas entre conídios de isolados de feijão-de-
corda e de soja, produzidos em diferentes condições, como meio de cultura
artificial, folhas dos hospedeiros em condições naturais e folhas dos
hospedeiros colocadas em câmara úmida. Eles atribuíram essa variabilidade às
condições de cada ambiente.
Variações morfológicas de conídios, oriundos de diferentes isolados e
hospedeiros e fora dos padrões estabelecidos para a espécie, são relatadas
com certa freqüência; contudo, as diferenças não são suficientes para que os
isolados estudados fossem considerados espécies diferentes.
No teste de patogenicidade, foi demonstrada elevada inespecificidade
para a maioria dos isolados. Foram constatadas diferenças entre os isolados
quanto à capacidade de infectar os diferentes hospedeiros utilizados nos
experimentos. Todos os isolados foram patogênicos a seus hospedeiros de
origem.
Os isolados originados de pepino “japonês” (IA, PB e JQ) não diferiram
quanto à capacidade de infectar outros hospedeiros, ao contrário do que
ocorreu com os isolados de soja (493AA e 777AA). O isolado 493AA foi
patogênico a oito diferentes hospedeiros, enquanto o isolado 777AA foi
patogênico a cinco. Todas as espécies suscetíveis ao isolado 777AA também
foram suscetíveis ao isolado 493AA.
Os isolados de C. cassiicola, originados de pepino “japonês” (IA, PB,
JQ) e abóbora (LP05), apresentaram maior gama de hospedeiros, dez e nove,
respectivamente. Ao contrário, os isolados de alface (LP01) e trapoeraba
(CP03) apresentaram a menor gama de hospedeiros, sendo patogênicos a
apenas duas espécies de plantas. Esse comportamento também variou para os
demais isolados utilizados nos experimentos.
Os híbridos de pepino hokushin e samurai diferiram dos híbridos
natsubayashi e tsuyataro quanto à suscetibilidade, sendo os dois últimos
suscetíveis a um maior número de isolados.
49
A espécie vegetal que apresentou maior suscetibilidade frente aos
isolados inoculados foi o mamoeiro, sendo infectada por 12 dos 15 isolados de
C. cassiicola inoculados. Por outro lado, os hospedeiros trapoeraba e assa-
peixe foram os menos suscetíveis, sendo infectados por três e dois isolados de
C. cassiicola, respectivamente.
A inespecificidade constatada neste trabalho foi também observada por
outros autores. Duarte et al. (1983), em estudos com dois isolados de C.
cassiicola, sendo um de cacaueiro e outro de mamoeiro, observaram
diferenças quanto à patogenicidade. O isolado de mamoeiro foi capaz de
infectar plantas de mamoeiro, caupi e seringueira; já o isolado de cacaueiro,
apenas plantas de cacaueiro.
Cutrim & Silva (2003) relataram diferenças na patogenicidade de dois
isolados de tomateiro. Estes apresentaram reações diferentes quando
inoculados em plantas de caupi (isolado 1 não patogênico e isolado 2
patogênico) e soja (isolado 2 não patogênico e isolado 1 patogênico). Além
disso, os autores relataram as diferenças na patogenicidade dos diferentes
isolados quando inoculados em 12 diferentes espécies de plantas, sendo duas
resistentes a ambos isolados. Silva et al. (1998) encontraram reações
semelhantes às acima relatadas, sendo que 16 isolados de seringueira, três de
mamoeiro, um de mimosa e um de tomilho diferiram quanto à patogenicidade,
quando inoculados em plantas de berinjela. Os isolados de mamoeiro e nove
dos isolados de seringueira não foram patogênicos à berinjela; os demais
foram capazes de infectar a espécie. Quando inoculados em feijão-de-corda,
apenas os isolados originados de seringueira foram capazes de causar doença.
Os resultados alcançados neste trabalho mostraram que o isolado de
C. cassiicola originado de lantana foi patogênico as plantas de mamoeiro,
alface, tomateiro e assa-peixe. Este resultado se opõe aos resultados obtidos
por Pereira et al. (2003), que observaram alta especificidade de um isolado
também originado de lantana por plantas de L. camara de diferentes origens e
consideraram o isolado como uma formae specialis de C. cassiicola.
Os autores ainda relataram que não encontraram reações positivas em
inoculações realizadas em plantas de mamoeiro e tomateiro. Esses resultados
diferem dos observados no presente trabalho.
50
Lustosa (2000), avaliando um isolado de trapoeraba quanto à
especificidade deste para outros hospedeiros, relata que, além da trapoeraba,
o isolado também infectou plantas de soja da cultivar UFV-16. Esse fato
diverge dos resultados obtidos por Pereira (2001) e Pereira et al. (2003) e dos
obtidos neste trabalho.
As diferenças na agressividade apresentadas pelos sete isolados de C.
cassiicola aos híbridos de pepino “japonês” estudados sugerem maior
adaptação dos isolados de pepino para os híbridos testados, uma vez que
foram significativamente mais agressivos, do que os demais isolados utilizados
nos experimentos. Além disso, maior suscetibilidade e menor período de
incubação pôde ser constatado em inoculações no híbrido tsuyataro com os
isolados originados de pepino “japonês” (IA, PB e JQ). Roim (2001) relatou que
isolados originados de raízes de soja foram mais agressivos do que isolados
originados de folhas quando foram inoculados em raízes de soja (o contrário
também foi observado), sugerindo adaptação dos isolados. O autor ainda
sugere a existência de um biótipo ou espécie diferente de C. cassiicola
infectando raízes e folhas de soja. Quanto à agressividade, o mesmo autor,
avaliando 17 isolados de C. cassiicola originados de soja, inoculados na parte
aérea e nas raízes da cultivar FT-Estrela, constatou diferenças significativas de
agressividade entre os isolados testados. Essas diferenças também foram
observadas por Spencer & Walters (1969), onde cinco isolados originados de
feijão-de-corda diferiram em agressividade quando inoculados em feijão-de-
corda.
Em 1998, Silva et al. constataram a existência de diferenças na
agressividade de 16 isolados de seringueira quando inoculados em três
diferentes clones de seringueira (RRIC100, RRIC52 e RRIC104). Ainda
relataram que três isolados de mamoeiro, também patogênicos aos três clones
de seringueira, diferiram quanto à agressividade, quando inoculados nos
referidos clones. Os mesmos autores, correlacionando estudos moleculares
(RAPD-PCR) com os testes de patogenicidade, separaram em dois grupos os
isolados de seringueira (“W” e “X”) quanto à patogenicidade à berinjela. Os
isolados do grupo “W” foram capazes de infectar plantas de berinjela; já os
pertencentes ao grupo “X”, não foram patogênicos. Através dos testes, os
autores sugeriram maior adaptação dos isolados do grupo “X” para infectar
51
berinjela. Em 2000, os mesmos autores, através de análises de RAPD de 42
isolados do patógeno, também correlacionando com testes de patogenicidade,
observaram diferenças genéticas entre os isolados do patógeno de diferentes
plantas.
Os padrões de sintomas para C. cassiicola, observados neste trabalho,
para os híbridos de pepino “japonês”, infectados por isolados originados de
pepino (IA, PB e JQ), também foram observados por Martins et al. (2003) e
Verzignassi et al. (2003). O segundo tipo de lesão constatada neste trabalho,
causada pelos isolados LP05, 493AA, 777AA e LP02 em híbridos de pepino,
pode ser explicado devido às diferentes reações patógeno-hospedeiro.
Diferentes tipos de lesões também foram observados por Duarte et al. (1983)
quando dois isolados, um de cacaueiro e outro de mamoeiro, foram inoculados
em plantas de cacau, mamoeiro, caupi e seringueira. Situação semelhante
também foi observada por Spencer & Walters (1969) e Olive et al. (1945).
52
6. CONCLUSÕES
Embora tenham ocorrido algumas variações quanto à morfologia de
conídios de C. cassiicola, todos os isolados utilizados nos experimentos,
originados de diferentes hospedeiros e regiões do Brasil, foram englobados na
espécie C. cassiicola.
Conídios de diferentes isolados de C. cassiicola, produzidos em meio
de cultura BDA, apresentaram variações nas suas dimensões (comprimento,
largura e número de pseudo-septos), com alguns valores diferentes daqueles
citados em literatura taxonômica para esta espécie fúngica.
Os isolados IA, PB, JQ, JMP220, LP04 e GS02 foram capazes de
produzir estruturas de resistência (clamidósporos); já, os isolados LP05,
493AA, 777AA, LP02, GS01, LP01, LP07, RWB321 e CP03 não produziram.
Dentro da espécie C. cassiicola, diferentes isolados podem se
diferenciar quanto à patogenicidade. Isolados originados de cucurbitáceas
apresentaram maior gama de espécie de hospedeiros e isolados originados de
alface e trapoeraba menor gama de hospedeiros.
Os híbridos de pepino, hokushin e samurai, foram suscetíveis a quatro
dos 15 isolados testados de C. cassiicola. Já os híbridos natsubayashi e
tsuyataro foram suscetíveis a sete isolados.
Os isolados de C. cassiicola, originados de pepino tipo “japonês” (IA,
PB e JQ) foram os mais agressivos aos híbridos de pepino tipo “japonês”
(natsubayashi, hokushin, tsuyataro e samurai).
O híbrido tsuyataro apresentou maior suscetibilidade aos isolados de
C. cassiicola dentre os quatro híbridos testados.
As diferenças na agressividade, apresentadas pelos diferentes isolados
aos híbridos de pepino tipo “japonês” estudados, sugerem maior adaptação dos
isolados de pepino para os híbridos, uma vez que foram significativamente
mais agressivos que os demais isolados.
Dois padrões de lesões foram observados em plantas de pepino
inoculados com isolados de C. cassiicola: lesões com encharcamento, foram
53
causadas apenas por isolados originados de pepino, e lesões com aspecto
áspero (ausência de tecidos encharcados), causadas por isolados originados
de outras espécies hospedeiras.
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, A.M.R. & YAMASHITA, J. Crescimento e esporulação de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei em diferentes meios de cultivo. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.1, n.3, p.203-206, 1976.
ALMEIDA, A.M.R. & YAMASHITA, J. Efeito da técnica de inoculação de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei na reação de três cultivares de soja. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.3, n.1, p.55-58, 1978.
ALMEIDA, A.M.R. Influência do pH sobre crescimento e esporulação de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei em meio de Batata-Dextrose-Ágar em diferentes períodos de incubação. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.2, n.2, p.175-177, 1977.
ALMEIDA, A.M.R., FERREIRA, L.P., YORINORI, J.T., SILVA, J.F.V. & HENNING, A.A. Doenças da soja. In: KIMATI, H., AMORIM, L., BERGAMIN FILHO, A., CAMARGO, L.E.A., REZENDE, J.A.M. Manual de Fitopatologia – doenças das plantas cultivadas , São Paulo, 3ª ed., Agronômica Ceres, 1997. cap.61, v.2, p.642-664.
ALMEIDA, A.M.R., MACHADO, C.C., FERREIRA, L.P., LEHMAN, P. S. & ANTONIO, H. Ocorrência de Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei no Estado de São Paulo. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.1, n.2, p.111-112, 1976.
ALMEIDA, A.M.R., SARAIVA, O.F., FARIAS, J.R.B., GAUDÊNCIO, C.A. & TORRES, E. Survival of pathogens on soybean debris under no-tillage and conventional tillage systems. Pesquisa agropecuária Brasileira , Brasília, v.36, n.10, p.1231-1238, 2001.
AMORIM, L. Sobrevivência do inóculo. IN: BERGAMIM FILHO, A., KIMATI, H.. & AMORIM, L. Manual de Fitopatologia – princípios e conceitos , São Paulo, 3ª ed., Agronômica Ceres, 1995. cap.13, v.1, p.246-267.
ANDRADE, J.S., COSTA, A.F., TATAGIBA, J.S., VENTURA, J.A. & COSTA, A.F. Avaliação de manchas de Corynespora em diferentes genótipos de mamoeiro. Fitopatologia Brasileria , Brasília, v.27, supl., p.78, 2002. Resumo n.109.
55
AWODERU, V.A. A new leaf spot of Pará rubber (Hevea brasiliensis) in Nigeria. Plant Disease Report, Beltsville, v.53, n.5, p.406-408, 1969.
BRETON, F., SANIER, C. & D' AUZAC, J. Role of cassiicolin, a host-selective toxin, in pathogenicity of Corynespora cassiicola, causal agent of a leaf fall disease of Hevea. Journal of Rubber Research , Montpellier, v.3, n.2, p.115-128, 2000.
CAMARGO, L.E.A. Análise genética da resistência e da patogenicidade. In: Bergamim Filho, A., Kimati, H. & Amorim, L. Manual de Fitopatologia – princípios e conceitos , São Paulo, 3ª ed., Agronômica Ceres, 1995. cap.24, v.1, p.470-492.
CAMPBELL, L.C. & MADDEN, L.V. Introduction to Plant Disease Epidemiology . New York, John Wiley & Sons, 1990. 532p.
CUTRIM, F.A. & SILVA, G.S. Patogenicidade de Corynespora cassiicola a diferentes espécies de plantas. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.28, n.2, p.193-194, 2003.
DHINGRA, O.D. & SINCLAIR, J.B. Basic Plant Pathology Methods , Lewis Publisher. Boca Raton, Florida, 1995. 448p.
DUARTE, M.L.R., ASANO, S. & ALBUQUERQUE, F.C. Estudos comparativos das características morfológicas e fisiológicas de dois isolamentos de Corynespora cassiicola. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.8, n.2, p.205-214, 1983.
DUARTE, M.L.R., ALBUQUERQUE F.C. & PRABHU, A.S. Uma nova enfermidade foliar do cacauerio (Theobroma cacau L.) causado pelo fungo Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.3, n.3, p.259-265, 1978.
ELLIS, M.B. Dematiaceous hyphomycetes . Kew: Commonwealth Mycological institute. 1971. 608p.
FAIAD, M.G.R., WETZEL, M.M.V. DA S. & MIRANDA, A.R. Levantamentos de fungos e sua sobrevivência em sementes de gergelim no armazenamento a longo prazo. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.13, n.2, p.110, 1988. Resumo n.82.
56
FAJOLA, A.O. & ALASOADURA, S.O. Corynespora leaf spot, a new disease of tobacco (Nicotiana tabacum). Plant Disease Reporter , Beltsville, v.57, n.4, p.375, 1973.
FERNANDES, R.C. & BARRETO, R.W. Corynespora cassiicola causing leaf spot on Coleus barbatus. Plant Pathology , Oxford, v.52, n.6, p.786, 2003.
FERREIRA, F.A. & ALFENAS, A.C. Nova mancha de folha do ipê em viveiros causada por Corynespora cassiicola. Revista Árvore , Viçosa, v.4, n.1, p.103-110, 1980.
GASPAROTTO, L., FERREIRA, E.A. & JUNQUEIRA, N.T.V. Mancha de Corynespora cassiicola em folhas de seringueira (Hevea brasiliensis) no Brasil. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.13, n.3, p.278-280, 1988.
GENEROSO, E.C.S., KONRAD, M., HERNANDEZ, F.B.T. & PAPA, M.F.S. Ocorrência de fungos patogênicos na aceroleira irrigada, no município de Junqueirópolis, SP. In: Congresso Brasileiro de Engenharia Agrícola – Conbea , 31., 2002, Salvador, 2002.
HASAMA, W., MORITA, S. & KATO, T. Seed transmission of Corynespora melonis, causal fungus of target leaf spot, on cucumber. Annals of the Phytopathological Society of Japan , Oita, v.59, n.2, p.175-179, 1993.
HAWKSWORTH, D.L., KIRK, P.M., SUTTON, B.C., PEGLER, D.N. Ainsworth & Bisby’s dictionary of the fungi . 8ª ed., Egham: CAB International, 1995, 616p.
JONES, J.P. A leaf spot of cotton caused by Corynespora cassiicola. Phytopathology , St. Paul, v.51, p.305, 1961.
KWON, M.K., KANG, B.H., CHO, B.H. & KIM, Y.C. Occurrence of target spot disease caused by Corynespora cassiicola on cucumber in Korea. Plant Pathology , Oxford, v.52, n.3, p.424, 2003.
LEITE, R.S.V. & BARRETO, R.W. Mancha foliar de hortênsia (Hydrangea sp.) causada por Corynespora cassiicola. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.22, supl., p.276, 1997. Resumo n.255.
57
LEROY, M. & LOURD, M. Doença foliar do tomateiro causada por Corynespora cassiicola em Manaus. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.14, n.1, p.32-36, 1989.
LUSTOSA, D.C. Corynespora cassiicola e Cercospora sp. como agentes potenciais para o controle biológico de Commelina benghalensis L. 2000. 53p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2000.
MARTINS, M.C., FISCHER, I.H., VEIGA, J.S. & LOURENÇO, S.A. Ocorrência de mancha-alvo causada por Corynespora cassiicola em pepino (Cucumis sativus) no Brasil. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.28, supl., p.208, 2003. Resumo n.47.
OLIVE, L.S., BAIN, D.C. & LEFEBVRE, C.L. A leaf spot of cowpea and soybean caused by undescribed species of Helminthosporium. Phytopathology , St. Paul, v.35, n.10, p.822-831, 1945.
OLUMA, H.O.A. & AMUTA, E.U. Corynespora cassiicola leaf spot of pawpaw (Carica papaya) in Nigéria. Mycopathologia , Netherlands, v.145, n.1, p.23-27, 1999.
ONESIROSAN, P.T., ARNY, D.C. & DURBIN, R.D. Host specificity of Nigerian and North American isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology , St. Paul, v.64, p.1364-1367, 1974.
ONESIROSAN, P.T., ARNY, D.C. & DURBIN, R.D. Increasing sporulation of Corynespora cassiicola. Mycopathologia , Netherlands, v.55, n.2, p.121-123, 1975.
PEREIRA, J.M. Prospodium tuberculatum e Corynespora cassiicola como agentes de controle biológico de Lantana camara. 2001. 87p. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2001.
PEREIRA, J.M. & BARRETO, R.W. Additions to the mycobiota of the weed Lantana camara (Verbenaceae) in southeastern Brazil. Mycopathologia , Netherlands, v.151, n.1, p.70-80, 2000.
PEREIRA, J.M., BARRETO, R.W., ELLISON, C.A. & MAFFIA, L.A. Corynespora cassiicola f. sp. lantanae: a potential biocontrol agent from Brazil for Lantana camara. Biological Control , EUA, v.26, n.1, p.21-33, 2003.
58
POLTRONIERI, L.S., ALBUQUERQUE, F.C., TRINDADE, D.R., POLTRONIERI, M.C. & ROCHA NETO, O.G. Incidência de doenças em pimenta longa (Piper hispidinervium) nos estados do Acre e Pará. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.22, n.4, p.563-564, 1997.
POLTRONIERI, L.S., DUARTE, M.L.R., ALFENAS, A.C., TRINDADE, D.R. & ALBUQUERQUE, F.C. Three new pathogens infecting Antilles Cherry in the State of Pará. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.28, n.4, p.424-426, 2003.
POLTRONIERI, L.S., POLTRONIERI, M.C., TRINDADE, D.R. & ALBUQUERQUE, F.C. Ocorrência de Corynespora cassiicola em tomateiro no Estado do Pará. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.19, supl., p.294, 1994. Resumo n.169.
RÊGO, A.M. & CARRIJO, I.V. Doenças das cucurbitáceas. In: ZAMBOLIM, L., VALE, F.X.R. & COSTA, H. Controle de doenças de plantas – hortaliças . Viçosa: Suprema Gráfica e Editora Ltda, 2000. cap.16, p.535-598.
ROIM, F.L.B. Comportamento de cultivares e caracterização cultur al, morfologica e patogênica de isolados de Corynespora cassiicola obtidos de soja [Glycine max (L.) Merrill]. 2001. 72p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2001.
SANTOS, A.A. & FREIRE, F.C.O. Ocorrência da podridão interna do mamão no estado do Ceará. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.23, supl., p.278, 1998. Resumo n.388.
SANTOS, A.F., GASPAROTTO, L. & PEREIRA, J.C.R. SERINGUEIRA. Seringueira (Hevea spp.): controle de doenças. In: VALE, F.X.R. & ZAMBOLIM, L. Controle de doenças de plantas: grandes culturas . Viçosa: UFV, 1997. cap.20, v.2, p.925-952.
SILVA, G.S., RODRIGUÊS, A.A.C. & SOARES JUNIOR, A.C. Mancha de Corynespora em acerola (Malpighia glabra). Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.22, n.3, p.452, 1997.
SILVA, W.P.K. New host of Corynespora cassiicola in Sri Lanka. Plant Disease , St. Paul, v.84, n.2, p.202, 2000. Resumo.
59
SILVA, W.P.K., DEVERALL, B.J. & LYON, B.R. Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka. Plant Pathology , Oxford, v.47, n., p.267-277, 1998.
SILVA, W.P.K., KARUNANAYAKE, E.H., WIJESUNDERA, R.L.C. & PRIYANKA, U.M.S. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relationship between host origin and virulence. Mycological Research , Richmond, v.107, n.5, p.567-571, 2003.
SILVA, W.P.K., MULTANI, D.S., DEVERALL, B.J. & LYON, B.R. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus Corynespora cassiicola. Australian Journal of Botany , Melbourne, v.43, p.609-618, 1995.
SIVIERO, A., NODA, H. & ASSIS, L.A.G. Progresso da mancha alvo do tomateiro. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.20, supl., p.281, 1995. Resumo n.12.
SOUZA, I.M.R. & SILVA, G.S. Fungos associados a plantas daninhas na ilha de São Luiz, Maranhão. Summa Phytopathologica , Botucatu, v.27, n.2, p.266-268, 2001.
SPENCER, J.A. & WALTERS, H.J. Variations in certain isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology , St. Paul, v.59, n.1, p.58-60, 1969.
TRINDADE, D.R. & FURTADO, E.L. Doenças da seringueira. In: Kimati, H., Amorim, L., Bergamin Filho, A., Camargo, L.E.A., Rezende, J.A.M. Manual de Fitopatologia - doenças das plantas cultivadas . São Paulo, 3ª ed., Agronômica Ceres, 1997. cap.60, v.2, p.628-641.
TUITE, J. Plant pathology methods; Fungi and Bacteria. Mineapolis: Burgess Publishing, 1969, 239p.
VERZIGNASSI, J.R., VIDA, J.B. & TESSMAM, D.J. Corynespora cassiicola causando epidemias de manchas foliares em pepino “japonês” sob estufa no Norte do Paraná. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.28, n.5, p.570, 2003.
VIANA, F.M.P., FREIRE, F.C.O., SANTOS, A.A., VIDAL, J.C. & CARDOSO, J.E. Similaridade sintomatológica de duas novas doenças do mamoeiro no Estado do Ceará. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.28, supl., p.234, 2003. Resumo n.163.
60
VOLIN, R.B. & POHRONEZNY, K. Severe spotting of market tomato fruit incited by Corynespora cassiicola after storm-related injury. Plant Disease , St. Paul, v.73, n.12, p.1018-1019, 1989.
WEI, C.T. Notes on Corynespora. Mycological Papers, v.34, n.30, p.1-10, 1950.
WULFF, N.A. & PASCHOLATI, S.F. Doenças do Gergelim. In: KIMATI, H., AMORIM, L., BERGAMIN FILHO, A., CAMARGO, L.E.A., REZENDE, J.A.M. Manual de Fitopatologia - doenças das plantas culti vadas . São Paulo, 3ª ed., Agronômica Ceres, 1997. cap.39, v.2, p.427-435.
YORINORI, J.T. & BIDÓIA, F.L. Reação de cultivares de soja à Corynespora cassiicola e variabilidade de isolamentos do fungo de mancha alvo e podridão de raiz. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.23, supl., p.299, 1998. Resumo n.497.
YORINORI, J.T. & HOMECHIN, M. Doenças de soja identificadas no Estado do Paraná no período de 1971 a 1976. Fitopatologia Brasileira , Brasília, v.2, n.1, p.108, 1977.
YORINORI, J.T. Epidemia de mancha alvo (Corynespora cassiicola) na cultivar FT-Estrela na safra 1995/96. In: Reunião de Pesquisa de Soja da Região Central do Brasil , 18., 1996, Uberlândia, 1996. p.319.
YORINORI, J.T. Levantamento e avaliação da situação de doenças da soja na safra 1987/88. In: Resultados de Pesquisa de soja 1987/1988 , Londrina, Embrapa-CNPSo, 1989, p.158.
61
8. APÊNDICE
62
Apêndice – Esporulação de isolados de Corynespora cassiicola originados de diferentes hospedeiros, cultivados em meio batata-dextrose-ágar, à temperatura de 24±2ºC, após 10 dias de incubação. UEM, Maringá, PR, 2004
Isolado Origem dos isolados Esporulação1
1 x 104 conídios/mL
IA Pepino 2,40
PB Pepino 0,65
JQ Pepino 1,63
LP05 Abóbora 9,58
493AA Soja 15,5
777AA Soja 2,85
LP02 Tomateiro 11,33
GS01 Mamoeiro 0,98
JMP220 Lantana 1,63
LP04 Aceroleira 1,2
LP01 Alface 0,33
LP07 Pimenta-longa 5,98
RWB321 Falso-boldo 3,73
CP03 Trapoeraba 2,68
GS02 Assa-peixe 0,90 1 Dados não transformados
