7/13/2019 Material Metode

1/3

Material dan Metode

Fabrikasi Chip Plasmapheresis. berbentuk sutu dalam alat separator

plasmapheresis yang merupakan suatu alat pemisah anti bodi dari komponen

plasma yang berada di dalam darah, alat tersebut dibuat dari bahan silikon melalui

prosen fotolitografi sisi ganda dan melalui proses basa-etse yakni menggunakan

KOH untuk membuat sifat anisotropic. Pemisahan saluran dirancang denganresonansi sekitar 2 MHz , dengan lebar saluran sekitar 350 m . saluran disegel

dengan tutup kaca menggunakan ikatan anodic, untuk mengurang korosi . Silicon

tubing menempel pada outlet di bagian belakang yang berfungsi sebagai pengait

pada 1/16 Teflon tubing . Informasi lebih rinci mengenai proses fabrikasi dapat

ditemukan di Nilsson et al.18 2 MHz piezoceramic transduser ( PZ26 , Ferroperm

Piezoceramics , Kvistgard , Denmark ) yang digabungkan ke dalam chip secarabersama-sama melalui hidrogel (Aquasonic Clear Ultrasound Gel, Parker Laboratories

Inc., Fairfield, NJ) dengan kopling akustik yang baik .

Pengaturan eksperimental.Berupa penggerakan Transduser piezoceramic

menggunakan generator gelombang Agilent 33250A dan dan memperkuat daya

dengan menggunakan Amplifierpada penelitian di gunakan 75A250 amplifier.Pemasukan kekuatan pada transduser dipantau menggunakan Bird Model 5000 -

EX yang merupakan pengukur kekuatan secara digital . Darah disedot melalui

pemisah menggunakan jarum suntik berbentuk pompa ( WPI SP210iwz , world

Precision Instrumen , Sarasota , FL ) dan menggunakan Hamilton 5 mL yang

merupakan jarum suntik berbahan kaca ( TLL 1005 , Hamilton Bonaduz AG ,

Bonaduz , Swiss ) . Pemisahan itu secara visual dimonitor menggunakan mikroskop

Nikon SMZ - 2T .

Pengumpulan Sampel. Terdapat dua belas tempat penyuntik( 25.EPC12W ,

Vici , Valco Instruments , Houston , TX ) digunakan untuk memperoleh sampel dari

stopkontak. Teflon tubing ( 0,5 mm i.d. ) , lalu dimasukkan ke dalam tabung silikon,

pada bagain ini berfungsi menghubungkan chip dan penyuntik . setiap samplepenyuntuk yang dikumpulkan dari dua outlet sebanyak 50 uL Teflon tubing ( 0,5

mm i.d. ) putaran.

Sampel darah . Pada sample diperlakukan suatu sitrat yang diperoleh dari

donor darah yang sehat namun tanpa pencantuman identitas. Perbedaan jumlah

hematokrit yang berbeda diperiksa dengan cara mengencerkan seluruh darah serta

di lakukan sentrifugasi plasma dari sampel yang sama . Tingkat hematokrit

diperhatikan menggunakan sentrifus ( Haematocrit 210 , Hettich , Tuttlingen ,

Jerman ) . A Coulter Counter ( Multisizer 3 , Beckman Coulter Inc , Fullerton , CA )

digunakan untuk menentukan efisiensi pemisahan persentase sel yang dilepaskan dari setiap outlet kualitas plasma yang dihasilkan

pada hal ini :

Ukuran partikel dihitung berada di kisaran 4-8 pM Diameter eritrosit adalah sekitar 7 m leukosit umumnya lebih besar atau sama 23 yang

7/13/2019 Material Metode

2/3

Efisiensi pemisahan dihitung sebagai :

Sep. eff. NAQA + NBQB + NCQC + NDQDNAQA + NBQB + NCQC + NDQD + NEQE

dimana Nx adalah jumlah partikel dalam 10 uL sampel berasal dari stopkontak x yangdiukur dengan Coulter Counter dan Qx yang merupakan besarnya tingkatan aliran yang

berasal stopkontak x, sebagaimana fungsi dari pompa jarum suntik.

Protein dan Reagen. Prostat Spesific Antien (PSA) yang berasan dari cairan

semen manusia diperoleh dari Sigma. antibodi monoklonal 2E9 dan H117 diproduksidan di beri tanda seperti sebelumnya 2E9 diberi label dengan isotiosianat fluorescein

(FITC) isomer I-Celite (Sigma St Louis, MO, USA) dan dipisahkan dalam kolom PD10

(Amersham, Uppsala, Swedia).

Pada perempuan Whole Blood Spiked dengan PSA. sampel darah perempuandiperoleh dari donor yang sehat sebagai dijelaskan di atas. yang dimana sampel darah

individu sebelumnya sudah dibubuhi PSA sebelum di lakukan plasmapheresis. seluruhdarah dari perempuan tersebut di ambil terlebih dahulu untuk memastikan bahwa tidak ditemukanya PSA dalam sampel tersebut sebelumnya.

Porous Chip Silicon Protein . Fabrikasi pada silicon berpori dilakukan oleh

pembubaran anodik tipe-p monocrystalline silikon wafer ( Addison Engineering, Inc San

Jose , CA ; resistivitas 1,0-10,0 cm ) . Dalam proses ini , silikon dalam bentuk wafer

ditempatkan di antara dua sel elektrokimia kemudian diisi dengan larutan elektrolit yang

mengandung campuran 1:10 terdiri dari dari 40 % asam fluorida dan 99,8 % dimetil

formamida . elektrolit memberikan kontak pada kedua sisi wafer. Selama anodization ,

bagian belakang wafer diterangi menggunakan lampu halogen 100 W dari 91 mA secarasistematik selama 70 menit, pembentukan pori dimulai dari pembentukan lapisan silikon

berpori di sisi anodik wafer . wafer silikon berpori tersebut selanjutnya potong dadukecil-kecil dari 6 6 mm , membentuk chip silicon berpori .

Microarraying Menggunakan Aliran piezoelectric-melalui Microdispenser.Sebuah microdispenser piezoelektrik dikembangkan secara in-house dan software

tersebut dikendalikan dari suatu stasiun yang digunakan untuk membentuk

microarray(susunan kecil) sebanyak 600 tempat / susunan dari setiap tikus monoklonalyang bersifat anti PSA yang megikat antibodi H117 . microdispenser yang digerakkan

oleh elemen piezoceramic , mampu menghasilkan 100 pL tetesan antibodi untuk

membentuk sebuah susunan dengan jarak 150 m antara masing-masing tempat . H117diizinkan untuk mengikat bagian permukaan melalui adsorpsi fisik .

Sandwich Antibodi Microarray . sandwich silikon berpori antibodi microarray

dilakukan untuk deteksi PSA dalam microchip plasmapheresis yang berasal dari plasmasampel . antibodi H117 di ambil dari PBS ( 0,5 mg / mL ) atelah tersusun ke dalam chipsilikon berpori kemudian di lanjutkan dengan 3 langkah pencucian di PBS ( 0,05 %

Tween 20 di PBS ) untuk menbuang antibody yang telepas . Chip tersusun kemudian

diblokir dengan 5% susu rendah lemak di PBS - Tween selama 30 menit untuk mencegahpeningkatan tidak spesifik pada langkah inkubasi berikutnya . Langkah pencucian ulang

dilakukan sebelum mengekspos chip untuk inkubasi mengunakan 24 uL larutan sampel

selama 70 menit . Setelah inkubasi , chip dicuci lagi 3 kali . Langkah berikutnya adalah

7/13/2019 Material Metode

3/3

menetaskan chip menggunakn 24 uL FITC - label 2E9 monoklonal tikus anti -

PSAantibody . Setelah 1 jam inkubasi , chip dicuci 3 kali dalam 5 ml PBS - Tween ,

dengan cepat dicelupkan ke dalam air suling , dan dikeringkan menggunakan udarabertekanan sebelum di lihat pada mikroskop confocal.

Pembacaan Fluoresensi dan Analisis . deteksi fluoresensi dilakukan dengan

menggunakan mikroskop confocal ( Olympus ) , sebuah minyak di celupkan denganpembesaran lensa objektif 20 , serta dengan penggunaan laser ion ( Melles Griot LaserGroup) dengan panjang gelombang eksitasi 488 nm , serta penggunaan pemindah

menggunakan FluoView ( FluoView , Olympus ) . Analisis citra dilakukan menggunakan

FluoView software 300 . Total intensitas setiap tempat adalah dihitung menggunakanFluoView 300 dan metode lingkaran . l Total intensitas diukur dengan menggunakan

metode yang sama dan kemudian dikurangkan dari total intensitas setiap tempat . setiap

sembilan tempat dan latar belakang diukur untuk analis pencitraan, sehingga

menghasilkan rata-rata intensitas tempat dan disajikan dalam angka-angka .

Analisis Delfia . Delfia Prostatus PSA bebas / total adalah waktu penyelesaian

fluoroimuno kuantitatif yang dikembangkan oleh Perkin -Elmer ( Perkin -Elmer , Turku ,

Finlandia ) untuk mendeteksi total PSA dan PSA bebas secara simultan ( terkomplekskanPSA ) pada serum . Ini adalah immunoassay fase solid berdasarkan tehnik sandwich,

Teknik ini memanfaatkan tiga antibodi monoklonal . penangkapan antibodi PSA antitotal

digunakan untuk mengikat kedua jenis PSA yakni yang bebas dan yang komplek ke

dalam solid fase . Europium antibodi di gunakan sebagai label untuk PSA bebassedangkan samarium antibodi untuk gabungan dua jenis PSA yakni yang bebas dan

complexe ( PSA total ) . fluoresensi tersebut, europium dan samarium dideteksi

menggunakan waktu penyelesaian fluoresensi sebanding dengan konsentrasi PSA bebasdan total dalam sample. Dalam studi ini , Delfia digunakan sebagai acuan untuk uji total

PSA berbasis Chip .