Matériels et Méthodes HCV

5/17/2018 Mat riels et M thodes HCV - slidepdf.com

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Matériels

Appareillage :

-Agitateur magnétique

-Bain marie agitateur-Centrifugeuse réfrigérée-Congélateur (-80°C et -20°C)-Etuve-Néphélemètre-PH mètre-Pipette électronique-Spectrophotomètre-Vortex

Les équipements :-Balance.-Chronomètre.-Cupules.-Embouts.-Eppendorfs.-Gants à usage unique.-Glace pilée.-Micropipettes réglables de 0,5 à 1000μl. -Portoirs.

-Tubes coniques.-Tubes en verre et en plastique de 5ml.

La Verrerie :

-Bécher.-Eprouvettes graduées de 1ml à 1000ml.-Erlenmeyer.-Pipettes pasteur.-Pissette.-Tube à essai.

-Tube à visse.

Méthodes :

1- Recrutement des patients :

Les patients ont été recrutés au niveau : du service de gastro-entérologie de l’hôpital MohamedLamine DEBAGHINE, et de l’hôpital Mustapha BACHA, service de néphrologie de l’hôpitalParnet, d’hémodialyse de Rouiba ainsi que le centre de transfusion sanguine de Ain-Taya ainsi

qu’à l’institut pasteur.



Après trois mois de recrutement, 70 échantillons sanguins de patients infectés par le virus del’hépatite C avec en parallèle trente individus sains servant de temoin ont pu être récolté.

Tous les participants de l’étude ont signé un consentement après avoir été informé du but de la

recherche et du devenir des prélèvements.

2- Collecte du sang et séparation des plasmas et sérums :

Le sang est récolté dans un tube Falcon et dans un tube sec. Les tubes Falcon contiennent del’anticoagulant EDTA qui est un chélateur d’ions (Ca

2+), afin d’empêcher l’inactivation spontanée

du complément ; pour la technique du CH50. Les tubes sont maintenus à +4°C jusqu’à

l’acheminement vers le laboratoire.

Les tubes EDTA sont centrifugé à 2000 rpm pendant 10 minutes à +4°C, le plasma obtenu est

aliquoté dans des Eppendorfs à l’aide d’une micropipette ; et stocké à -80°C afin de conserverl’activité du complément.

Le sérum est récupéré à partir des tubes secs après décantations puis centrifugation à 2000Rpm/min pendant 10min à +4°C, et conservé à -20°C.

3- Dosage du complexe hémolytique (CH50) :

Principe :

Le test CH50 est un dosage hémolytique fonctionnel, qui consiste à utiliser des érythrocytes de

mouton sensibilisés par des anticorps de lapin anti-érythrocytes (hémolysine). Le complexeimmun formé active la voie classique du complément.On définit alors le CH50 comme la quantité de sérum donnant 50% d’hémolyse, et on l’exprime

en pourcentage d’un témoin constitué d’un pool de sérums normaux qui est le plasma humainnormal (PHN).

Mode opératoire :

A-Préparation des globules rouges sensibilisés :

-Des globules rouges de mouton (GRM) sont successivement lavés avec un tampon de lavageGVB-EDTA et centrifugé à 2000 Rpm/min 10minutes à +4°C.

-Une suspension à 5% de ces GRM dans le même tampon est ensuite préparée (v/v).

-La concentration des cellules est équilibrée à 109/ml, en ajustant la concentration de 100µlde ces derniers dans 2900 ml d’eau distillé sur une longueur d’onde de 541 nm pour une

densité optique de 0,37.

-La suspension est sensibilisé avec un volume de GVB-EDTA, en ajoutant 2V d’hémolysine (Ac

de lapin anti-hématies de mouton) dans un bain marie agitateur pendant 30 minutes.



-Des lavages des GRM sensibilisés sont effectués avec du GVB-EDTA puis du GVB++, qui est untampon riche en Ca2+ et Mg2+, afin d’activé la voie classique du complément.

-Le culot est resuspendu dans un volume de GVB++ égale au volume de la premièresuspension avec le GVB-EDTA.

B-Dilution et répartition des plasmas :

-Les plasmas des patients et le PHN sont dilués au 1/30ème, puis la série de dilution suivanteest effectuée :

Tube

1

Tube

2

Tube

3

Tube

4

Tube

5

Tube

6

Tube

7

T0 T100 BLANC

GVB++

(µl)

400 350 300 250 200 150 100 450 450 450

Plasmadilué (µl)

50 100 150 200 250 300 350 0 0 300

EA (µl) 300 300 300 300 300 300 300 300 300 0

*T0= lyse spontanée des hématies

*T100= lyse totale des hématies

-Les dilutions sont ensuite déposés pendant 30 minutes dans le bain marie agitateur.-La réaction est stoppée avec 1,7 ml d’eau physiologique, sauf pour le T 100 l’arrêt de la

réaction se fait par l’eau distillée, afin d’avoir un maximum de lyse.

-Après une centrifugation de 1500 Rpm/min, pendant 5minutes, on peut voir une dégradationde couleur a l’œil nue.



Le pourcentage de lyse est exprimé en fonction de la quantité de sérum ajoutée qu’on mesure

par lecture spectrophotométrique de la D.O à 541nm du surnageant et qui sera proportionnelleà la quantité d’hématies lysées.

Calcul du titre du CH50 :-Une courbe avec en abscisse les concentrations du sérum et en ordonnée le pourcentage delyse (Y) est tracée.

Y = [(DO Echantillon - DO T 0 )/ (DO T 100 - DO T 0 )] x 100

-La concentration donnant 50% d’hémolyse est extraite du graphe afin de calculer le titre duCH50

CH50 (Unités /ml) =1/ Volume de sérum donnant 50% d’hémolyse

Figure : Schéma générale de la technique du CH50



4- Dosage des fractions C3 et C4 du complément par néphélémétrie:

Principe:

Le dosage antigénique des protéines du complément C3 et C4 par la méthode immunochimiqueest basée sur l’immunoprécipitation en milieu liquide de complexes immuns afin dedéterminer la concentration d’un Ag soluble.

Un faisceau lumineux est dévié par les complexes immuns formés par les antigènes recherchésavec des anticorps monoclonaux spécifiques. La quantité de lumière difractée estproportionnelle à la quantité de protéine recherchée.

Mode opératoire:

- Les sérums des patients sont dilués au 1/11éme avec un tampon de réaction. 40µl de la

dilution est déposé dans une cuvette contenant un barreau magnétique.-La cupule est placée dans le néphélémétre. Puis à l’aide d’une pipette électronique on rajouterespectivement 400µl de tampon et 40µl d’anti sérum spécifique à la fraction recherchée (C3ou C4).

-La concentration de la fraction présente dans l’échantillon est alors indiquée sur l’appareil.

Figure : Courbe représentant le dosage du CH50. (D’après Gorochov et

Papo ; IMMUNOLOGIE, INTER MED)



5-Technique d’immunodiffusion radiale

Principe

Le dosage par immunodiffusion radiale est appliqué pour la quantification d’Ac solubles dansles liquides biologiques. C’est une technique d’immunoprécipitation sur un milieu gélifié. Elle

est basée sur la diffusion d’un Ag à partir d’un puits cylindrique creusé dans un gel d’agarose

contenant des Ac spécifiques.

Au cours de la diffusion, des anneaux de précipitations sont formés autour des puitscorrespondant à des complexes Ag-Ac.

Au point final de diffusion une courbe de calibration linéaire est établie en reportant les

diamètres carrées des annaux de précipitation en fonction de la concentration de chacun des3 calibrateurs.

À partir de la courbe de calibration, la concentration en Ag d’un échantillon sera directementobtenue par extrapolation du diamètre au carrée de l’anneau de diffusion.

Figure : courbe de variation de la quantité de précipité en fonction du

rapport Ag/Ac (D’après Audigié, Dupont et Zonszain, Principes des

méthodes d’Analyse biochimique)



A. Dosage de la protéine C1q : (ELISA, EUROIMMUN, Germany)

Le dosage de C1q nécessite :

-Des calibrateurs avec différentes concentrations (Haut, Moyen, Bas) et un contrôlelyophilisé, sont reconstitués avec un volume d’eau distillée.

-Les sérums des patients et le contrôle sont dilués au ½ avec du BSA 7%.

Après homogénéisation, 10µL de chaque composant est déposé dans un puits de la plaqueIDR, contenant des Ac monospécifiques dirigés contre la protéine C1q.

Au bout de 96 heures d’incubation à 20°C, les diamètres des anneaux de diffusion sontmesurés, et à partir de la courbe de calibration établie, la concentration de C1q pour chaquepatient est extrapolée.

B. Dosage du Facteur B : (ELISA, EUROIMMUN, Germany)

-Un calibrateur lyophilisé est reconstitué avec de l’eau distillé. Ce dernier est dilué à 60% et à

10% avec du BSA7% afin d’obtenir 3 calibrateurs : pure (haut), diluer à 60 %(moyen) à 10%(bas).

Figure : Courbe de calibration linéaire des diamètres au carrées des

calibrateurs en fonction de leurs concentrations. (D’après Gene Mayer;

IMMUNOGLOBULINS- ANTIGEN-ANTIBODY REACTIONS AND SELECTED

TESTS).



-Les sérums des patients ne nécessitent pas de dilution. 5µl de chaque composant est alorsdéposé dans un puits, de la plaque IDR, contenant des Ac monospécifiques dirigés contre lefacteur B.

Au bout de 72 heures d’incubation à 20°C, après avoir établie une courbe de calibration

linéaire, la concentration en Facteur B de chaque échantillon est alors obtenue après mesuredes diamètres.

5- Extraction de l’ADN par la méthode phénol chloroforme

Principe

Cette méthode consiste à extraire les acides nucléiques à partir du sang total prélevé dans unanticoagulant, en utilisant le couple phénol/chloroforme .Dans un premier temps le culotleucocytaire est préparé, en éliminant les globules rouges par une solution de lyse. Puis dans

un deuxième temps la libération de l’ADN des leucocytes dans le milieu, et la digestion desprotéines qui lui étaient associées. Cette technique nécessite l’extraction phénolique qui est

basée sur la solubilité différentielle des acides nucléiques entre deux phases non miscibles, etl’extraction chloroformique qui complète l’action du phénol en dénaturant les protéines

insolubles et en séparant la phase aqueuse de la phase organique.

Mode opératoire

A- Lyse des globules rouges

Dans un tube Falcon, 45ml de la solution de lyse des globules rouges (SLR) est ajoutée à 10ml

du sang prélevé dans de l’EDTA.

Le mélange est ensuite agité et déposé à -20°C pendant 20minutes en agitant toutes les 5minpour accélérer la lyse.

Après centrifugation à 4000 Rpm/min pendant 20minutes et élimination du surnagent,l’opération est refaite avec des lavages successifs jusqu’à l’obtention d’un culot blanc qui peut être soit conservé à - 20°C, soit directement extraire l’ADN.

B- Lyse des globules blancs

Ajouter au culot blanc obtenu 3ml de solution de lyse (SLB), 600µl de SDS 10% et 35µl deprotéinase K (10mg/ml), homogénéiser et incuber la suspension une nuit à 37°C.

C- Précipitation de l’ADN

Après une nuit d’incubation, un volume de phénol, et de chloroforme est ajouté au culotcellulaire. Le mélange est ensuite agiter par retournement pendant 5minutes, et cenrifuger à4000 Rpm/min pendant 20 min

Par la suite, la phase aqueuse est récupérer dans un tube, puis ajouter 300µl de NaCl et 2Vd’éthanol pur, afin de précipiter l’ADN, et agiter délicatement par retournement jusqu'à

apparition de la méduse d’ADN.



Transférer la méduse dans un Eppendorf et éliminer complètement l’alcool sous une hotte.Resuspendre l’ADN dans 500µl de tampon (TE 10/1), et faire dissoudre l’ADN sous un

agitateur rotatif à température ambiante jusqu’à dissolution complète de la méduse et enfin

conserver à 4°C.

D- Estimation de la concentration d’ADN

La quantité d’ADN extraite est déterminée par spectrométrie, en mesurant l’absorbance à 260nm sachant qu’une unité de DO à 260 nm est équivalente à 50 µg/ml d’ADN monobrin.

Il est indispensable de mesurer la DO à 280 également afin d’estimer le degré de pureté

d’ADN, en calculant le rapport R = DO 260/ DO 280 et qui est compris entre: 1,5<R< 2.

Par la suite la quantité de l’ADN d’un échantillon est calculer par la formule suivante :« Facteur de dilution X 50 X (DO 260nm –DO 280nm) »

*Si R< 1,8 => Présence de protéines, ce qui nécessite un nouveau traitement à la protéinase Ket au phénol chloroforme.

*Si R> 2 => Présence d’ARN.

Figure : Les principales étapes de l’extraction d’ADN par la méthode phénol

chloroforme.



ANNEXES

1. Les produits et tampons utilisées pour le dosage du CH50 :

Produit utilisés :

-NaCl (Chlorure de sodium).-NaOH.-MgCl2.-CaCl2.-Diethy barbital sodique.-Barbitone.

-Gélatine.-EDTA (Acide ethylène diamine tétracétique) dissodique 2H2O.

Réactifs : -Globules rouges du mouton.-Hémolysine (Ac de lapin anti globule rouge du mouton).-Pool de plasma humain normal.

Tampons utilisées :

o EDTA anti-coagulant :

-NaOH (5g/125ml de l’ED)……………………………………………………………………………………………...35,5ml -EDTA……………………………………………………………………………………………………………………………..22,25g -ED……………………………………………………………………………………………………………………qsp…….500ml

o Solution du CaCl 2 0,03M

-CaCl2 ………………………………………………………………………………………………………………………………441g-ED…………………………………………………………………………………………………………………………...qsp...1l

o Solution du MgCl 2 0,1M

-MgCl2 (4,9mol/l)……………………………………………………………………………………………………………2ml -ED ………………………………………………………………………………………………………………………………..96ml

o Solution EDTA 0,086M pH=7,5

Dissoudre à chaud-EDTA disodique 2H2O ...………………………………………………………………………………………….…..64,01g-ED………………………………………………………………………………………………………………………………………1,5l

-Ajuster le PH à 7,5 avec du NaOH (environ 15ml). Puis complèter à 2L avec de l’ED.

o Gélatine à 10%

Dissoudre à chaud-Gélatine ………………………………….………………………………………………………………………..……………1g

-ED…………………………………………………………………………………………………………………………qsp……10ml

o VBS 5X

Dissoudre à froid

-ED ……………………………………………………………………………………………………………………………………….1l -NaCl …………………………………………………………………………………………………………………………………85g



-Diethy barbital sodique ………………………………………………………………………………………………… 3,75g-Dissoudre à chaud-Barbital acide ………………………………………………………………………………………………………………5,75g

-Les 2 solutions sont ensuite mélangées, et complétées jusqu'à 2l avec de l’ED, le PH comprisentre 7,4 et 7,6.

o VBS1X

-Dilution du VBS 5X au 1/5ème avec de l’ED. o GVB

- VBS 1X ………………………………………………………………………………………………………………………500ml-Gélatine 10%...................................................................................................................5ml

o GVB++

- GVB ……………………………………………………………………………………………………………………………...250ml- CaCL2 0,03M …………………………………………………………………………………………………………………1,25ml-MgCl2 0,1M …………………………………………………………………………………………………………………1,25ml

o GVB-EDTA 0,01M

- GVB ……………………………………………………………………………………………………………………………250ml-Enlever un volume de 28,75ml de GVB-EDTA……………………………………………………………………………………………………………………………28,75ml

2. Les solutions et réactifs utilisées pour le dosage C1q, facteur B, C3 et C4

le dosage de C1q et facteur B :

-Plaques IDR dirigée contre C1q (14 puits).

-Plaques IDR dirigée contre facteur B (14 puits).-1 flacon d’eau distillée. -1 flacon de solution de sérum albumine bovine (BSA) à 7%.-3 flacons de calibrateurs lyophilisés pour C1q.-1 flacon de calibrateur lyophilisé de facteur B.-1 flacon de contrôle lyophilisé.

le dosage de la protéine C3 et C4 :

-Tampon de dilution-Antisérum minineph dirigé contre C3.

-Antisérum minineph dirigé contre C4.-Tampon minineph C3.-Tampon minineph C4.-Carte magnétique minineph C3.-Carte magnétique minineph C4.(Elles contiennent des détails de la courbe de calibration spécifique de chaque lotd’antisérum).

3. Les produits et solutions utilisées pour l’extraction d’ADN (Méthode

phénol/chloroforme):

Les produits utilisés :



-EDTA 5%.-NaCl 3M.-NaOH.-SDS 10% (Dodécylsulfate de sodium).-Tris 1M à pH=8 (Tris hydroxy méthylamino méthane).

Solution EDTA (0,5M pH=8)

-EDTA…………………………………………………………………………………………………………………………..186,12g -ED………………………………………………………………………………………………………………………….qsp1000ml

Solution NaCl (3M)

-NaCl…………………………………………………………………………………………………………………………….175,32g-ED………………………………………………………………………………………………………………………..qsp 1000ml

Solution Tris

-Tris…………………………………………………………………………………………………………………………………..121g -ED…………………………………………………………………………………………………………………………qsp 1000ml

Solution de lyse des globules rouges (SLB) : Tris-EDTA (1/2)-Tris …………………………………………………………………………………………………………………………………10ml-EDTA ………………………………………………………………………………………………………………………………20ml-H2O……………………………………………………………………………………………………………………………. 1000ml

Solution de lyse des globules blancs (SLR): Tris-EDTA (1/1)-Tris …………………………………………………………………………………………………………………………………10ml -EDTA ………………………………………………………………………………………………………………………………10ml-H2O……………………………………………………………………………………………………………………………. 1000ml

Solution de solubilisation de l’ADN : EDTA (TE 10/1)-Tris …………………………………………………………………………………………………………………………………10ml

-EDTA ………………………………………………………………………………………………………………………………1ml-H2O……………………………………………………………………………………………………………………………. 1000ml

Solution SDS 10% -SDS…………………………………………………………………………………………………………………………………5g -ED…………………………………………………………………………………………………………………………………….qsp 50ml

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