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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Mecanismo de la actividad enzimática
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
� 1. Oxidoreductasas: Oxidación – Reducción
� 2. Transferasas: Transferencia de grupos C, N, o P
� 3. Hidrolasas: Desdoblamiento de enlaces por agua
� 4. Liasas: Separación de enlaces C-C, C-S, y ciertos enlaces C-N
� 5. Isomerasas: Racemización de isómeros geométricos (re-arreglos intra-moleculares)
� 6. Ligasas: Formación de enlaces entre carbono y O, S, N acoplados a la hidrólisis de enlaces fosfato de alta energía
Clasificación de las enzimas
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Glucosa oxidasa
Lactato deshidrogenasa Ciclohexanona monooxigenasa
1. Óxido - reductasas (deshidrogenasas)Catalizan la oxidación o reducción de sustratos
Peroxidasas
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El mayor número de oxidorreductasas llevan a cabo la reacción:
AH2 + B ↔ A + BH2
Donde: B es el aceptor de elctrones: NAD+, NADP+, ferricitocromo, etc.Nota: Esta reacción ocurre bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas
Lactato deshidrogenasa
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Lactato deshidrogenasa [(S)-L-Lactato:NAD+ oxidoreductasa, EC 1.1.1.27]
Contiene cuatro sitios activos por molécula; esto es, cada subunidad polipeptídica contiene el equivalente a un sitio activo. No hay efecto cooperativo entre los 4 sitios activos.
Mecanismo: Bi Bi secuencial ordenado
NAD+ Lactato Piruvato NADH
E-NAD+E
E-NAD+••••L
E-NADH EE-NADH••••P
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2. TransferasasCatalizan la transferencia de un grupo de un compuesto a otro, los grupos que son
transferidos son C, residuos aldehídicos y cetónicos, acil, glicosil, alkil, nitrogenados, fósforo y grupos que contienen azufre.
Most transaminases share a common substrate and product (glutamate and oxoglutarate) with glutamate dehydrogenase, and this permits a combined nitrogen excretion pathway for individual amino acids that is commonly described as "trans-deamination".
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A P B Q
EA-FPE F FB-EQ E
Mecanismo: Bi Bi Ping-PongAlanine transaminase
(EC 2.6.1.2)
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3. HidrolasasCatalizan las reacciones de hidrólisis donde el agua es el aceptor del grupo
transferido
Ejemplos: Amilasas, celulasas, β-galactosidasas, lipasas, Proteasas
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Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai . 2004. Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology, 35 : 488–493
Mediante gráficas de Lineweaver-Burk
Enzima libre:Vmax = 26.2 mol mg-1 min-1
kcat = 29 s-1
KM = 1.35 mol dm-3
Enzima inmovilizada:Vmax = 5.2 mol mg-1 min-1
kcat = 5.7 s-1
KM = 0.2 mol dm-3
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4. LiasasCatalizan la lisis de un substrato, generando un doble enlace en una eliminación no-hidrolítica, no-oxidativa (Sintetasas catalizan la adición a un doble enlace, la
reacción inversa de una liasa)
Pyruvate decarboxylase (EC 4.1.1.1)
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Active site of pyruvate decarboxylase with selected amino acids: Glu-51, Glu-477, Asp-444, and Asp-28. Also displayed are cofactors TPP and Mg2+.
Susane Lowe and J. Gregorzye Ikus. 1992. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina ventriculi. Journal of General Microbiology , 138: 803-807
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5. IsomerasasCatalizan las reacciones de isomerización
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6. Ligasas (sintetasas)Catalizan la formación de enlaces entre dos compuestos usando la energía derivada
del desdoblamiento de un enlace pirofosfato tal como se encuentra en el ATP
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Características de las Enzimas
• Tasas catalíticas extremadamente altas
• Condiciones de reacción suaves
• Especificidad de reacción
• Regulación
� Las enzimas (catalizadores biológicos) son efectivas en pequeñas cantidades� Permanecen sin cambios después de la reacción� No afectan el equilibrio de una reacción reversible, simplemente incrementan la velocidad a la cual el equilibrio se alcanza
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Especificidad de substrato
• El substrato (pequeño) se enlaza a la enzima (grande) vía fuerzas débiles: Enlaces-H, van der Waals, iónicas (algunas veces interacciones hidrofóbicas)• El sitio de enlace de un sustrato es generalmente una hendidura sobre la superficie de la enzima que es complementaria para el substrato
- en forma(geométricamente complementarios)- en características químicas(complementariedad electrónica) al substrato
El resultado del reconocimiento molecular
Especificidad de las enzimas
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Especificidad de las enzimas
• Especificidad absoluta:
• Especificidad relativa:QuimoselectividadRegioselectividad
•Estereoespecificidad:
•Inespecificidad
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Especificidad absoluta
Cataliza la reacción de un substrato único a un producto particular
Existen enzimas que sólo aceptan una molécula como sustrato, ejemplos:
a) Uricasa, la cual actúa solamente sobre ácido úricob) Arginasa, la cual actúa solamente sobre argininac) Carbonic anhidrasa, la cual actúa solamente sobre ácido carbónicod) Lactasa, la cual actúa solamente sobre lactosae) Sucrasa, la cual actúa solamente sobre sucrosaf) Maltasa, la cual actúa sobre maltosag) acetilcolinesterasa que actúa solamente sobre los ésteres de colina
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Especificidad relativaCiertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actúan sobre muchos compuestos que poseen un rasgo estructural común. Por ejemplo, la fosfatasa del riñón cataliza la hidrólisis de ésteres fosfato del ácido fosfórico a diferentes velocidades, la amilasa hidroliza el almidón independiente de su origen. Las proteasas y lipasas hidrolizan proteinas y lípidos.Es decir, catalizan el mismo tipo de reacción con varios sustratos; pero que tienen en común un mismo grupo químico (amino, fosfato, metil), el cual es el directamente modificado en la reacción, ejemplo esterasa que actúa sobre los grupos éster.
Quimoselectividad
Es la capacidad de catalizar reacciones con otros grupos funcionales como porejemplo hidrólisis o síntesis de un enlace amida (aminólisis).
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Regioselectividad
Es la capacidad para discriminar entre las posiciones externas sn-1,3 ó la posicióninterna sn-2.
Lipasa sn-2 selectiva
Lipasa sn-1,3 selectiva
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EstereoespecificidadEs la capacidad de diferenciar entre moléculas de sustrato que posean enantioisómeros cuando se trata de sustratos quirales.
O
OH
H
O
H
H
O
O
+
O2 ,NADPH, H+ H2O, NADP+
CiclohexanonaMonooxigenasa
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Stereo Specificity
BC
DBC
DBC
D
These two triangles are not identical
A
The tetrahedral structure of carbon orbital has rigid steric strain which makes the basic building unit of protein conformation
Juang RH (2004) BCbasics
sp3
Enzyme surface
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Catalizando un amplio rango de compuestos y reacciones
Amplia especificidad(La excepción a la regla)
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Chymotrypsin Has A Site for Specificity
O ON–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C
R H R’O -
CSer
Active SiteActive Site
Specificity
Site
Specificity
Site Catalytic Site
Juang RH (2004) BCbasics
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Specificity of Ser-Protease Family
COO-
CAsp
COO-
CAsp
Active Site
Trypsin Chymotrypsin Elastasecut at Lys, Arg cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly
Non-polarpocket
Dee
p an
d ne
gativ
ely
char
ged
pock
et Shallow andnon-polar
O O–C–N–C–C–N–
CCCCNH3+
O O–C–N–C–C–N–
C
O O–C–N–C–C–N–
CH3
Juan
g R
H (
2004
) B
Cba
sics
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Algunos otros términos importantes
• Cofactores
– Iones metálicos
– Móleculas orgánicas (coenzimas)—usualmente derivados de vitaminas
• FAD
• NAD/H
• Grupos Prostéticos—Cofactores enlazados covalentemente
• Apoenzima/holoenzima
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Son pequeñas moléculas que se asocian con enzimas para facilitar las reacciones que amino ácidos no pueden hacer solos
Ejemplo: oxidación – reducción
• Iones metálicos que actúan como cofactores - Cu2+, Fe3+, y Zn2+
• Cofactores orgánicos son generalmente referidos como coenzimas - NAD+ y CoA
• Cosubstratos - cofactores que están solamente asociados transientemente con la enzima
• Grupos prostéticos - cofactores que están permanentemente asociados con la enzima
Cofactores y Coenzimas
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• Haloenzima – Una enzima catalíticamente activa con su cofactor
• Apoenzima - enzima sin el cofactor
Apoenzima + cofactor ↔ haloenzima
(inactive) (active)
Con y sin Cofactor/Coenzima
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• Las coenzimas son cambiadas químicamente en la reacción en la cual participan
• Las coenzimas deben ser regeneradas para poder completar el ciclo catalítico
• En las reacciones catalizadas por NADH, NAD+ es reducido a NADH. El NADH debe ser nuevamente oxidado NAD+ para permitir que ocurran múltiples ciclos de la reacciones
• Para los cofactores unidos transientemente, algunas veces la regeneración es realizada por otra enzima
• En el caso de grupos prostéticos, la regeneración ocurre en una fase separada de la misma secuencia de reacciones enzimáticas
Regeneración de Coenzimas
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Adenosine Triphosphate (ATP)
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)
Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Phosphate (NADP +)
Coenzimas
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Metal Ejemplo de enzima Función del metal
Fe Citocromo oxidasa Oxidación reducción
Cu Ácido ascórbico oxidasa Oxidación-reducción
Zn Alcohol deshidrogenasa Facilita la unión de NAD+
Mn Histidina amoniaco liasa Facilita la catálisis mediante la extracción de electrones
Co Glutamato mutasa El Co forma parte de la coenzima cobalamina
Ni Ureasa Lugar catalítico
Mo Xantina oxidasa Oxidación-reducción
V Nitrato reductasa Oxidación-reducción
Se Glutatión peroxidasa Sustituye al S en una cisteína del lugar activo
Metales y oligoelementos importantes como cofactores enzimáticos