MECCANISMI DI SILENZIAMENTO GENICO

Sistema del Mating Typedi lievito dove inizialmenteè stato scoperto il fenomenodel Silenziamento

Le cassette HML ed HMRapur contenendo le informazionicomplete per il tipo coniugativovengono mantenute silenziatee normalmente non si esprimonodurante la vita della cellula.Esse sono necessarie solamentecome donatori di informazionedurante lo Switching da un tipo all’altro.

SILENZIAMENTO GENICO IN LIEVITO

COME VENGONO MANTENUTI SILENZIATI I GENI HM?

HMRa a1a2

x z1

A E B

E I

ARS RAP1 ABF1

HMR-E

260bp 85bp

wtAEBA EA BE Brap1-

abf1-

rap1- abf1-

ssa (ars-)ssb (abf1-)sil. sint.

+++/-+---+/-+---+

Allele HMR-ERepressione

Vale sia comedelezioni che come mutazionipuntiformi

FUNZIONIRIDONDANTI

SILENCER

E’ così definito per analogia con gli elementi Enhancer:

• Può funzionare a distanze variabili dal suo gene bersaglio

• La sua attività è indipendente dall’orientamento della sequenza

Delezioni di HMR-E : TOTALE DEREPRESSIONE

Delezioni di HMR-I : MINORE DEREPRESSIONE

Delezioni di HML-E ed HML-I : singolarmente non hanno forti effetti ma INSIEME danno TOTALE DEREPRESSIONE

La sostituzione dell’intera regione codificante di HM con altri geni, sia dellaRNA PolII (URA, LEU), sia della RNA PolIII (tRNA), comporta la completa REPRESSIONE dei geni sostituiti.

PROTEINE RESPONSABILI DEL SILENZIAMENTO GENICO IN LIEVITO

Rap 1*Istoni H3 ed H4Sir 1**/ORCSir 2/3/4**

Delezioni in questi fattori, da sole o in combinazione dereprimono i loci silentiin maniera parziale o, più frequentemente, totale.Mutazioni negli istoni che dereprimono i loci HM sono sia delezioni delle codeN-Terminali, sia mutazioni puntiformi nelle Lisine presenti nelle code. Questoimplica anche un coinvolgimento dell’acetilazione in questi residui.

*Rap 1 = Repressor Activator Protein

**Sir1/2/3/4 = Silent Information Regulator

SIR3 SIR3

REGIONESILENZIATRICE

REGIONESILENZIATRICE

LOCUS SILENTE HM

Prova genetica dell’interazione tra SIR3 e H4

Delezione degli aa. 15-19 della coda N-terminale induce derepressione deiloci silenti e fa diminuire la capacità coniugativa del lievito.

Sono state trovate mutazioni in SIR3 che compensano questa situazione.Ciò indica che esiste una interazione fisica tra la proteina Sir3 e l’istone H4.La mutazione compensativa ripristina l’interazione e quindi il silenziamento.

Genetic evidence for an interaction between SIR3 and histone H4 in the repression of the silent mating loci in Saccharomyces cerevisiae.

L.M. Johnson, P.S. Kayne, E.S. and M. Grunstein

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), Vol. 87, 6286-6290

SILENZIAMENTO TELOMERICOSILENZIAMENTO TELOMERICO

•In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo.•Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae•Gli elementi Y’ possono essere presenti in numero da 0 a 4.•Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla conservazione delle estremità.

IL SILENZIAMENTO GENICO AVVIENE ANCHE IN PROSSIMITA’ DELLE REGIONI TELOMERICHE

URA 3 TEL

Trascrizione di URA3

+/-

---

+++

Sir3++ = Completa Repressione

sir3 = Forte Derepressione

Mutanti nei geni Sir 2/3/4 Rap1 Istoni (code N-Terminali)portano a derepressione dei geni posti in posizione subtelomerica.

Overespressione di Sir3 espande il silenziamento fino a molte Kb dall’estremità:Effetto a distanza mediato dalla cromatina

Sir3 (wt)

SilenziamentoVeriegatoMetastabile

MAT gene TELE IHMR

Sir2, Sir3, Sir4Istoni H3, H4

Rap1

C

Trascrizione Repressione Repressione

Sir1ORC

Fattori comuni nelsilenziamento dei loci HM e dei Telomeri

• Sir1 è fondamentale per stabilire il silenziamento in HM ma non serve per il suo mantenimento.• Sir1 non partecipa al silenziamento telomerico.

ORC = Origin Recognition Complex •Agisce sulla sequenza ARS (origine di replicazione)•E’ un complesso multiproteico in cui alcune subunità interagiscono con Sir1•Mutazioni in ORC inducono derepressione di HM•Esperimenti con mutanti condizionali che dereprimono HM necessitano di almeno un passaggio in fase S per restaurare la repressione.

Il ruolo degli istoni H3 ed H4 è fondamentale per il mantenimento del silencingsia dei loci HM sia ai Telomeri.

Mutazioni che influiscono sul silenziamento sono:• Delezioni delle code N-Terminali• Mutazioni puntiformi nelle Lisine acetilabili presenti nelle code.

Recentemente è stato scoperto anche un coinvolgimento di residui amminoacidiciche possono essere metilati sull’N-terminale degli istoni.

Il Silenziamento è quindi un fenomeno prettamente EPIGENETICO

Il silenziamento avviene a causa della formazione di una struttura fortementeeterocromatizzata che si organizza secondo schemi precisi sulla base di interazionitra tutti i componenti coinvolti.

Tecniche genetiche (uso di mutanti, sistema dei due ibridi) e biochimiche (immunofluorescenza, uso di anticorpi, ChIP) hanno permesso nel tempo di definire quali sono queste interazioni.

Rap1 lega direttamente il DNARap1 interagisce con le proteine SIRLe proteine SIR formano un complesso Sir2/3/4Le proteine SIR interagiscono con le code N-Terminali degli istoni H3 ed H4

Sui loci silenti HM la proteina Sir1 interagisce con componenti del complesso ORC

Modelli proposti per l’eterocromatizzazione dei loci HM e dei Telomeri

Eterocromatina in lievito:•Non visibile al microscopio•Resistente alle nucleasi•Replicazione tardiva•Ipoacetilazione generalizzata

HM•Silenziamento obbligatorio.•Funzioni ridondanti.•E’ una forma di regolazione genica.

TELOMERISilenziamento non obbligatorioma VARIEGATO e METASTABILE

Funzione del silenziamento telomericonon chiarita, Ha un valore funzionale oÈ solamente una conseguenza?

•In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo.•Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae•Gli elementi Y’ possono essere presenti in numero da 0 a 4.•Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla conservazione delle estremità.•In lievito mutanti est1- sono letali a causa dell’estremo accorciamento dei telomeri, ma possono essere recuperati tramite multiple inserzioni di elementi Y’.

SILENZIAMENTO IN CONTESTI NATURALI

•Geni inseriti in diversi telomeri di lievito sono variamente soggetti a silencing

•Alcune sequenze presenti negli elementi Y’ ed STR di X hanno attività STAR: SubTelomeric Anti-silencing Region

•La sequenza core X e un particolare tratto di Y’ facilitano il silencing e sono quindi chiamate Sub-Telomeric Silencing Elements

Nel complesso:La cromatina sub-telomerica su cromosomi naturali è una regione di repressione trascrizionale inframmezzata da sottodomini che permettono la trascrizione

Il silenziamento interessa anche altri organismi: 1) Schizosaccharomyces pombe

Effetti di posizione sono stati inizialmente scoperti in Drosophiladove il silenziamento interessava geni traslocati in prossimitàdell’eterocromatina centromerica.

Anche in S. pombe i loci per il mating type sono silenti, con modalità simili a quelle di S. cerevisiae. In questo caso il silenziamento dipende dai fattori

Clr1-4, Clr6, Swi6, Rik1

In S. pombe è stato ben caratterizzato anche il fenomeno del silenziamento centromerico (analogo a quello della Drosophila).Gli stessi fattori che sono responsabili del silencingsui loci del mating type, sono coinvolti anche in questi due casi.Taz1, presente sui telomeri, è omologa di Rap1 di S. cerevisiae.

Clr4: omologo di Su(var)3-9 – MetilasiClr3: omologo di Rpd3 – Deacetilasi istonicaClr6: omologo di Hda1 – Deacetilasi istonicaSwi6: omologo di HP1Rik1 e Chp1: proteine a cromodominio – favoriscono la met di K9 da parte di Clr4e la localizzazione centromerica di Swi6

Alcuni precedenti lavori avevano ottenuto evidenze contro l’esistenza di TPEin cellule umane.

Questo lavoro pone le basi per una riconsiderazione della sua esistenza, e per la ricerca di caratteristiche comuni e differenze con il TPE descrittoampiamente in lievito.

2) Cellule umane

Uso di un plasmide lineare contentente:

Luciferasi + sequenze telomeriche umane

Integrazione del plasmide in cellule HeLa in cuisia attiva la Telomerasi Rottura del cromosoma nel punto di integrazione ed estensione delle sequenze telomeriche

Selezione dei cloni in cui si verificano questi eventi

Risultato : inserzione di un gene reporter inposizione subtelomerica.

DISEGNO SPERIMENTALE

1) Il gene Luciferasi presente in posizione subtelomerica viene espresso circa 10 volte meno che lo stesso gene integrato in loci interni al cromosoma.

2) L’espressione del gene torna ad aumentare in seguito al trattamento con Tricostatina A, un inibitore delle deacetilasi (ricordare che l’eterocromatina solitamente è fortemente ipoacetilata).

3) L’espressione della luciferasi diminuisce ulteriormente aumentando l’attività della Telomerasi, cioè inducendo ulteriore allungamento delle sequenze telomeriche.

REGIONI SUBTELOMERICHE UMANE

~ 10-300Kb contenenti blocchi di sequenze ripetute composite.Generati da eventi di copiatura e trasferimento di sequenze tra cromosomi.

Questo genera un pattern di omologia complesso ed estensivo tra cromosomi.Es.: subtelomero 3q è correlato con almeno altre 35 estremità.

MECCANISMI RESPONSABILI:•Ricombinazione •Traslocazione•Conversione genica (sostituzione totale o parziale di una regione subtelomerica con un’altra)•Duplicazione per eventi di trasposizione.

Si tratta di eventi recenti – si identificano differenze individualiEs: trovate due sequenze presenti su 22 cromosomi – L’analisi in individui diversi ha mostrato una diversa distribuzione.

Si può seguire l’evoluzione di molti di questi blocchi.Es: blocco f7501 = su un solo cromosoma nei primati, stabilmente su 3 cromosomi nell’uomo (3q, 15q, 19q). Variabilmente su altri 11. Si è evoluto quindi in breve tempo.

Le regioni subtelomeriche possono contenere geniLa densità genica è comunque bassa.

Nei telomeri umani anche le sequenza telomeriche contengono nucleosomima la loro spaziatura è diversa da quella della normale cromatina.

Questi nucleosomi sono caratterizzati da metilazione come la cromatinapericentrica: contengono H3K9me3 e H4K20me3Sono arricchiti in Hp1Hanno bassi livelli di acetilazione sugli istoni H3 ed H4

Le regioni subtelomeriche sono anche metilate sul DNA.Non risultano fortemente metilate le sequenze telomeriche stesse.

I primi esperimenti di F. Palladino e S. Gasser nel 1993dimostrano, tramite immunofluorescenza, che le proteineRap1 e Sir3 (uso di anticorpi anti-Rap1 e anti-Sir3) si localizzano in regioni discrete alla periferia nucleare.Verosimilmente si tratta di foci in cui si raggruppano estremità telomeriche di vari cromosomi.

Questi dati hanno posto le basi per la formulazione di un’ipotesi di esistenza di TERRITORI NUCLEARIfunzionalmente significativi. Questa ipotesi si è rivelataimportante per la repressione trascrizionale.

Un gene reporter fiancheggiato da due silenziatori di HM e posto a varie distanze dal telomero mostra una diminuzione progressiva della repressione genica con l’aumentare della distanza da esso.

Le regioni telomeriche, i loci silenti HM e le proteine SIR co-localizzano tutti inquesti foci perinucleari.Il modello proposto prevede che regioni telomeriche non silenti si localizzino allaperiferia nucleare tramite yKu. Una volta localizzato il telomero in questa regionericca in proteine SIR, esso può andare incontro a repressione. Il silencing sirafforza ulteriormente grazie all’attività di ancoraggio di Sir4 che interagisce conEsc1, proteina di membrana.

Questo riflette probabilmente la rilevanza del pool delle proteine SIR, che nei foci perinucleari sono molto concentrate e si diluiscono man mano che ci si allontana da queste regioni.Le proteine SIR sono comunque presenti in quantità limitante nelnucleo.

Fattori responsabili della formazione dei territori telomerici perinucleari

Ci sono evidenze per due possibili modelli di formazione di territori nucleari.

B) Questo meccanismo prevedel’ancoraggio alla membrana nucleare tramiteil coinvolgimento di Mlp1/2, che sono yKu-binding proteins. Il complesso siformerebbe al livello dei pori nucleari inquanto mutazioni nelle proteine del poro,Nup60 e Nup145, disgregano i foci(mostrano dispersione di essi) e dereprimonogeni reporter. Questo sembra valido per geni ancorati artificialmente.

A) yKu sarebbe la principaleresponsabile dell’ancoraggio dellacromatina silente alla membrana, in unamaniera indipendente dalla presenza delle proteine del poro nucleare.Questo avviene su regioni naturali,telomeri e loci HM.

Recentemente si hanno evidenze che i telomeri alla periferia nucleare sono altamente mobili. Il modello che ne deriva è quello in cui l’interazione tra cromatina ed involucro nucleare sia altamente dinamico e adattabile a cambiamenti metabolici come i passaggi di fase nel ciclo cellulare.

Le proteine Ikaros sono richieste per il normale sviluppo di cellule T, B ed NK.Attivano l’espressione di geni linfocita-specifici: 5, Vpre-B, Lck, CD8, IL-2R, TCR e TCR ed altri.

Si conoscono due isoforme di Ikaros (1 e 2), le più abbondanti nei linfociti B e T maturi.Ikaros è un fattore che lega il DNA.

Ikaros e L’ETEROCROMATINA

Tramite la tecnica dell’immuno-FISH(fluorescent in situ hybridization),usando anticorpi contro il dominio C-terminale di Ikaros si evidenzia una distribuzione in regioni discrete a ridosso della periferia nucleare.

Questo è evidente in nuclei di cellulepre-B (b e c) e in normali linfociti Bisolati dalla milza (d).Anticorpi contro un fattore non correlato Elf1 (e) non mostrano maiuna simile distribuzione.

Ikaros si localizza sull’eterocromatina centromerica nei nuclei di cellule B:colocalizzazione di Ikaros, HP1 e sequenze -satellite

Colocalizzazione diIkaros (verde) edM31 (rosso).M31 non è altri che HP1 (HeterochromatinProtein 1) umana edè molto abbondante nell’eterocromatina centromerica.

Ibridazione in situcon una sonda peril -satellite delcentromero. Ilsegnale (giallo) si localizza sulle regioni centromeriche.

Ikaros -satellite

In tre differenti sezioni analizzate Ikarose il -satellite mostrano una localizzazionecomune

5

CD2

B3 Bal-17

Geni dipendenti da Ikaros e trascrizionalmente inattivi si localizzano sui focicentromerici di Ikaros

In cellule immature B3 alcuni geni regolati da Ikaros (es. CD2) sono inattivi trascrizionalmente e risultano localizzati negli stessi foci pericentromerici in cui si può rilevare la presenza di Ikaros.

In cellule Bal-17, cellule B mature questi genirisultano attivi trascrizionalmente e mostranoanche una localizzazione più diffusa all’internodel nucleo.

I geni regolati da Ikaros sono per lo piùcoinvolti nel differenziamento dei linfociti B

Per altri geni, ad es. 5, vale il contrario.

Ikaros = rossoSingolo gene = verdeColocalizzazione = giallo

I geni regolati da Ikaros si trovanosu cromosomi diversi e in differenti posizioni rispetto ai centromeri, per cui si può escludere un effetto di posizione classico.

E’ più probabile che questi dominigenetici vengano sequestrati in maniera reversibile in localizzazionepericentromerica e che venganosilenziati in trans.

Ikaros media il silenziamento facoltativo di geni tipo cellulare-specificiattuando la loro giustapposizione con l’eterocromatina pericentromerica.