12
07/10/62 1 02738451 Applied Biochemistry 1 st Semester 2019 Mon 7 Oct 2019 Medical Biochemistry I การประยุกต์ชีวเคมีทางด ้านการแพทย์ - Physiology สรีรวิทยา: การเปลี่ยนแปลงทาง ชีวเคมีภายในร่างกาย พยาธิวิทยาของโรคต่าง ๆทเก ดจากการเปลยนแปลงทางชวเคมทเกดจากการเปลยนแปลงทางชวเคม - Pathology พยาธิวิทยา: เมื่อผู ้ป ่ วยบรรยาย อาการของโรคให้แพทย์ฟัง แพทย์นําไปวินิจฉัย การเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมี จากนั้นก็ตรวจ รักษา เช่น โรคเกาท์ Medical Biochemistry I การประยุกต์ชีวเคมีทางด ้านการแพทย์ - Nutrition deficiency ความบกพร่องทาง โภชนาการ หน ้าที่และบทบาทของวิตามิน อาหารเสร มในรางกาย อาหารเสรมในรางกาย - Hormonal deficiency ความผิดปกติหลาย อย่างเกิดจากความไม่สมดุลของฮอร์โมน โดยเฉพาะในสตรีและเด็ก แพทย์ต ้องศึกษา บทบาทของฮอร์โมนเพื่อหาทางรักษา Medical Biochemistry I การประยุกต์ชีวเคมีทางด ้านการแพทย์ - Postmortem biochemistry ชีวเคมีหลังการ เสียชีวิต เพื่อประยุกต์ทางด ้านนิติวิทยาศาสตร์ ในการหาสาเหตของการเสยช(การชนสตร ในการหาสาเหตของการเสยชวต (การชนสตร พลิกศพ) Postmortem biochemistry มีบทบาทในการ วินิจฉัยสาเหตุการเสียชีวิตบางประการ เช่น เบาหวาน แอลกอฮอล์ ภูมิแพ ้ อุณหภูมิตํ่า กล ามเนอหวใจตาย กลามเนอหวใจตาย การตรวจสอบทางพิษวิทยา ช่วยวิเคราะห์ว่า ผู้เสียชีวิตได ้รับสารบางอย่างหรือไม่ อย่างไร โดยดูจากปริมาณสารต่าง ที่พบในร่างกาย เชน ไอออน Na + K + กลโคส แลกเตท เชน ไอออน Na K กลโคส แลกเตท ของเหลวในเนื้อเยื่อ (matrix) ที่ใช ้บ่อย คือ ปัสสาวะ วุ ้นลูกตา เลือด นํ้าเลี้ยงสมองและไข สันหลัง

Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

  • Upload
    others

  • View
    1

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

07/10/62

1

02738451Applied Biochemistrypp y

1st Semester 2019Mon 7 Oct 2019

Medical Biochemistry I

• การประยกุตช์วีเคมทีางดา้นการแพทย์- Physiology สรรีวทิยา: การเปลีย่นแปลงทางชวีเคมภีายในรา่งกาย พยาธวิทิยาของโรคตา่ง ๆ ทีเ่กดิจากการเปลีย่นแปลงทางชวีเคมีๆ ทเกดจากการเปลยนแปลงทางชวเคม

- Pathology พยาธวิทิยา: เมือ่ผูป่้วยบรรยายอาการของโรคใหแ้พทยฟั์ง แพทยนํ์าไปวนิจิฉัยการเปลีย่นแปลงทางชวีเคม ีจากนัน้ก็ตรวจรักษา เชน่ โรคเกาท์

Medical Biochemistry I

• การประยกุตช์วีเคมทีางดา้นการแพทย์- Nutrition deficiency ความบกพรอ่งทางโภชนาการ หนา้ทีแ่ละบทบาทของวติามนิ อาหารเสรมิในรา่งกายอาหารเสรมในรางกาย

- Hormonal deficiency ความผดิปกตหิลายอยา่งเกดิจากความไมส่มดลุของฮอรโ์มน โดยเฉพาะในสตรแีละเด็ก แพทยต์อ้งศกึษาบทบาทของฮอรโ์มนเพือ่หาทางรักษา

Medical Biochemistry I

• การประยกุตช์วีเคมทีางดา้นการแพทย์- Postmortem biochemistry ชวีเคมหีลังการเสยีชวีติ เพือ่ประยกุตท์างดา้นนติวิทิยาศาสตร ์ในการหาสาเหตของการเสยีชวีติ (การชนัสตรในการหาสาเหตขุองการเสยชวต (การชนสตูรพลกิศพ)

• Postmortem biochemistry มบีทบาทในการวนิจิฉัยสาเหตกุารเสยีชวีติบางประการ เชน่ เบาหวาน แอลกอฮอล ์ภมูแิพ ้อณุหภมูตํิา่ กลา้มเนือ้หัวใจตายกลามเนอหวใจตาย

• การตรวจสอบทางพษิวทิยา ชว่ยวเิคราะหว์า่ผูเ้สยีชวีติไดรั้บสารบางอยา่งหรอืไม ่อยา่งไร โดยดจูากปรมิาณสารตา่ง ๆ ทีพ่บในรา่งกาย เชน่ ไอออน Na+ K+ กลโคส แลกเตทเชน ไอออน Na K กลโูคส แลกเตท

• ของเหลวในเนื้อเยือ่ (matrix) ทีใ่ชบ้อ่ย คอื ปัสสาวะ วุน้ลกูตา เลอืด น้ําเลีย้งสมองและไขสนัหลัง

Page 2: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

lable at ScienceDirect

Journal of Forensic and Legal Medicine 41 (2016) 49e57

Contents lists avai

Journal of Forensic and Legal Medicine

journal homepage: www.elsevier .com/locate/ jflm

Review

Postmortem biochemistry: Current applications

S.L. Belsey a, *, R.J. Flanagan a, b

a Toxicology Unit, Department of Clinical Biochemistry, King's College Hospital NHS Foundation Trust, London SE5 9RS, UKb Toxicology Unit, Dept of Pathology, Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, Northern General Hospital, Herries Road, Sheffield S5 7AU, UK

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 25 February 2016Received in revised form31 March 2016Accepted 10 April 2016Available online 19 April 2016

Keywords:Forensic biochemistryPostmortemDeath investigationVitreous humourAlternative matricesKetoacidosis

* Corresponding author. Toxicology Unit, DepartmThird Floor, Bessemer Wing, King's College Hospital, DUK. Tel.: þ44 0203 299 5887; fax: þ44 0203 299 588

E-mail address: [email protected] (S.L. Belsey)c Postmortem biochemistry is sometimes termed

Greek qάnatο2, Thanatos, the personification of death

http://dx.doi.org/10.1016/j.jflm.2016.04.0111752-928X/© 2016 Elsevier Ltd and Faculty of Forens

a b s t r a c t

The results of biochemical analyses in specimens obtained postmortem may aid death investigationwhen diabetic and alcoholic ketoacidosis is suspected, when death may have been the result ofdrowning, anaphylaxis, or involved a prolonged stress response such as hypothermia, and in the diag-nosis of disease processes such as inflammation, early myocardial infarction, or sepsis. There is oftencross-over with different disciplines, in particular with clinical and forensic toxicology, since someendogenous substances such as sodium chloride, potassium chloride, and insulin can be used as poisons.The interpretation of results is often complicated because of the likelihood of postmortem change inanalyte concentration or activity, and proper interpretation must take into account all the availableevidence. The unpredictability of postmortem changes means that use of biochemical measurements intime of death estimation has little value.

The use of vitreous humour is beneficial for many analytes as the eye is in a physically protectedenvironment, this medium may be less affected by autolysis or microbial metabolism than blood, and theassays can be performed with due precaution using standard clinical chemistry analysers. However,interpretation of results may not be straightforward because (i) defined reference ranges in life are oftenlacking, (ii) there is a dearth of knowledge regarding, for example, the speed of equilibration of manyanalytes between blood, vitreous humour, and other fluids that may be sampled, and (iii) the effects ofpost-mortem change are difficult to quantify because of the lack of control data. A major limitation is thatpostmortem vitreous glucose measurements are of no help in diagnosing antemortem hypoglycaemia.

© 2016 Elsevier Ltd and Faculty of Forensic and Legal Medicine. All rights reserved.

1. Introduction

Postmortem biochemistryc has a role in investigating someapparently natural deaths, including diabetes- and alcoholicketoacidosis-related deaths, anaphylaxis-related deaths, deathsthat may have involved a prolonged stress response such as hy-pothermia, and in the diagnosis of disease processes such as earlymyocardial infarction. There is also clearly much overlap withclinical and forensic toxicology in that some endogenous sub-stances can be used as poisons. Sodium chloride, potassium chlo-ride, and insulin are obvious examples. Indeed, in some instances

ent of Clinical Biochemistry,enmark Hill, London SE5 9RS,8..thanatochemistry (from thein Greek mythology).

ic and Legal Medicine. All rights re

suspicion of poisoning may be aroused by abnormal biochemicalresults (Table 1).

Postmortem biochemistry has been an active area of researchfor many years. Detection of acetone and measurement of b-hydroxybutyrate (3-hydroxybutyrate; BHB) in blood, or in vitreoushumour, urine, pericardial fluid, or cerebrospinal fluid (CSF) may bevaluable in the diagnosis of alcohol- or diabetes-related deaths, forexample.1 Likewise, measurement of D-glucose,2 and of urea andcreatinine in vitreous humour and other specimens,3 may give in-formation on the presence of hyperglycaemia and of renal impair-ment, respectively, before death. Vitreous humour is an importantspecimen in this context as in life the concentrations of low mo-lecular weight, non-protein bound solutes such as ethanol andelectrolytes in blood equilibrate with the respective concentrationsin vitreous humour. However, at present few other measurementsare undertaken routinely (Table 2), in part because the necessarysamples, not only vitreous humour, but also CSF, and pericardialand synovial fluids (Table 3), may not be collected. The aim of thisreview is to summarise considerations important in undertaking

served.

Page 3: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Table 1Some laboratory investigations in life that may arouse or confirm a suspicion of poisoning.

Investigation Fluid Possible cause of increase Possible cause of decrease

Anion gap ([Naþ] þ [Kþ])� ([HCO3

e] þ [Cle])Plasma Ethanol, ethylene glycol, iron salts, isoniazid, methanol,

metformin, paraldehyde, salicylates, toluene (chronic)e

Calcium Plasma or serum e Ethylene glycol, fluorides, magnesium saltsChloride Plasma Bromide or organobromines (actually interference in method) e

D-Glucose Blood or fluoride/oxalate plasma

Salicylates, theophylline Ethanol (especially children), insulin, salicylates,sulfonylureas, valproate

International normalised ratio(INR, prothrombin time)

Blood Anticoagulant rodenticides (warfarin, brodifacoum), paracetamol(early marker of hepatic damage)

e

Lactate Plasma Glycolate (from ethylene glycol, artefact on some blood gas andother analysers)

e

Magnesium Plasma or serum Magnesium salts e

Osmolar gapb Plasma Acetone, ethanol, ethylene glycol, methanol, 2-propanol,hypertonic i.v. solutions (e.g. mannitol)

e

Potassium Plasma Digoxin, potassium salts Diuretics, laxatives (both chronic), insulin,salbutamol, sulfonylureas, theophylline

Sodium Plasma or serum MDMA (malignant hyperthermia),a sodium salts Diuretics, water intoxication (acute and chronic),MDMA (very rare)

a Methylenedioxymethamphetamine.b Measured osmolality (freezing point depression) � calculated osmolality. Calculated osmolality ¼ 2([Naþ] þ [Kþ]) þ urea þ glucose (all mmol/L).

Table 2Postmortem biochemistry: Some little used/unvalidated tests.

Analyte Matrix Suggested diagnostic role [references]

Adrenaline:noradrenaline ratio Urine Hypothermia4

Ammonia Vitreous humour Liver failure; time of death estimation5

Calcium Vitreous humour No clear role; does not relate to antemortem serum calciumCarbohydrate-deficient

transferrin (CDT)Blood, vitreoushumour

Chronic alcohol use6,7

Chymase activity Blood Anaphylactic shock8

Chromogranin A Serum,cerebrospinalfluid

Hypothermia9

C-Reactive protein (CRP) EDTA blood, liver Recent infection (bacterial, viral, fungal, mycobacterial), trauma, burns, ketoacidosis, tissue necrosis (myocardialinfarction, pancreatitis), inflammatory diseases, malignancy. Suggested role in diagnosis of sepsis if measured soonafter death10,11

Creatine kinase brain (CK-BB) CSF Diffuse brain injury/cerebral hypoxiaCreatine kinase-muscle brain

(CK-MB)Pericardial fluid Myocardial damage

Ethyl glucuronide (EtG) andethyl sulphate (EtS)

Vitreous humour,urine

Antemortem ingestion of ethanol12,13

Free fatty acids Blood Hypothermia14

Fructosamine Vitreous humour Diabetic ketoacidosis15,16

Glucocorticoids Blood Hypothermia17

Hypoxanthine Vitreous humour Time of death18

L-Lactate Vitreous humour If very high may indicate lactic acidaemia, but may be formed perimortem19 and increases after deathMyoglobin Blood, urine Hyperthermia20

Neurone specific enolase CSF Diffuse brain injury/cerebral hypoxiaOsmolality Vitreous humour No clear role; increases with postmortem intervalThyroglobulin, free

triiodothyronine (T3)Blood Neck trauma, e.g. strangulation21,22

Troponin Pericardial fluid Myocardial damage present prior to microscopic changes23

S.L. Belsey, R.J. Flanagan / Journal of Forensic and Legal Medicine 41 (2016) 49e5750

postmortem biochemical analyses, including sample collection andthe interpretation of results. In all cases of course the results canonly be properly interpreted in the light of all the available infor-mation as to the case under investigation.2

In death investigations, although specimens collected post-mortem are all that are usually available for biochemical andtoxicological analysis, in general it is information on analyte con-centration or other physiological parameter prior to, or at the timeof, death that is required. Gradients that are maintained by activeprocesses in life such as that between intra- and extra-cellularpotassium begin to break down soon after the occurrence of hyp-oxic or anoxic damage. Thus, the possibility of both terminal andpostmortem change has to be evaluated when interpreting results.Since most deaths that become the subject of further investigation

occur outside hospital, it may be some days before a body is found.Therefore blood samples are often haemolysed, there is the possi-bility of sample contamination during collection, and the likelihoodof other changes such as loss of labile analytes (for example glucose,insulin) is high. It should be remembered that most clinical refer-ence values are established for plasma or serum, and not haemo-lysed whole blood even for stable analytes such as many drugs.Moreover, since samples such as vitreous humour are, for practicalpurposes, rarely available during life except from laboratory ani-mals, reference ranges are by definition difficult to establish.Method validation is also compromised by this same lack of refer-ence material. Furthermore, the time needed for analyte equili-bration between plasma and, for example, vitreous humour duringlife remains unknown.

Page 4: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Table 3Sample requirements: General postmortem biochemistry and toxicology.a

Sample Notesb

Heart whole blood (rightventricle)

20 mL unpreserved (qualitative toxicology only)

Jugular vein whole blood 20 mL unpreserved (qualitative toxicology only)Peripheral whole blood 20mL from femoral or other peripheral site ensuring no contamination from urine or from central or cavity blood. Collect one portion into 2%

w/v sodium fluoride and another into a plain tubeUrine 20e50 mL if available (plain tube, no preservative unless a portion required for ethanol measurement)Gastric contentsc 25e50 mL (plain bottle, no preservative)Vitreous humour Maximum available, plain tube, separate specimens from both eyes if feasible. Collect one portion into 2% w/v sodium fluoride if for ethanol

measurementCerebrospinal fluid 5e10 mL, plain tubePericardial fluid Maximum available, plain tubeSynovial fluidd Maximum available, plain tubeLiver and other tissues Liver 10 g (deep inside right lobe), other tissues 10 g as appropriateScene residuese As appropriate

a See Dinis-Oliveira et al.24 for detailed discussion on samples and sampling with especial reference to forensic toxicology.b Smaller volumes may often be acceptable, for example in the case of young children.c Includes vomit, gastric lavage (stomach washout, first sample), etc.d Alternative if vitreous humour not available.e Tablet bottles, drinks containers, aerosol canisters, etc. e pack entirely separately from biological samples, especially if poisoning with volatiles is a possibility.

S.L. Belsey, R.J. Flanagan / Journal of Forensic and Legal Medicine 41 (2016) 49e57 51

1.1. Use of vitreous humour

The above considerations notwithstanding, vitreous humour ispreferred to blood for most postmortem biochemistry (Table 4)since it is thought far less susceptible to autolytic change, is lesslikely to be subject to postmortem contamination by diffusion ofmicrobes or of drugs or other poisons that may be present at highconcentration in the thorax or abdomen at death, and lies withinthe relatively protected environment of the eye socket.25,26 Afurther practical point is that the sample if uncontaminated withblood is amenable to analysis using standard clinical chemistrysystems and as such the cost of routine measurements (Table 4) isminimal.2 Note however that vitreous humour is viscous, hencemay require pre-treatment such as centrifugation, heating, dilu-tion, or addition of hyaluronidase to facilitate accurate pipet-ting.16,27,28 There is also the likelihood of loss of water from the eye

Table 4Postmortem biochemistry: Interpretation of results.

Analyte Matrix Typical reference range

Acetonea Blood <2.5 mg/L

Chloride Vitreous humourb 105e135 mmol/L

Creatinine Vitreous humourb <115 mmol/L

D-Glucose Vitreous humourb After death vitreous humour (andfalls rapidly therefore any detectabrequires investigation

Haemoglobin A1c (HbA1c) Blood <39 mmol/mol Hbb-Hydroxybutyrate (BHB) Blood,

vitreous humourb0.1e1.0 mmol/L (pathologicallysignificant >2.5 mmol/L)

L-Lactate Vitreous humourb <10 mmol/L

Potassium Vitreous humourb After death vitreous potassium incConcentrations > 15 mmol/L suggedecomposition

Sodium Vitreous humourb 135e145 mmol/L

Tryptase Blood <100 mmol/LUrea Vitreous humourb <10 mmol/L

a Acetone not often measured; normally detected sometimes with other ketones andchromatography.

b See Rose and Collins.31

with time since death and body storage conditions, leading to notonly increased vitreous humour viscosity, but also increased ana-lyte concentrations.

Vitreous samples should be collected without preservative un-less for a specific requirement such as ethanol measurement sinceeven dipotassium EDTA contains sufficient sodium to invalidatevitreous sodium measurement. Vitreous humour may not beavailable if the body has suffered severe trauma, and the possibilityof concurrent vitreous disease confounding the results must beremembered.29 In cases where bodies have been immersed inwater then either dilution (fresh water), or concentration (saltwater) as well as microbial contamination are possible. Synovialfluid may represent an alternative if vitreous humour is notavailable.30

When collecting vitreous humour, ideally both eyes should besampled independently and the results reported separately,

Interpretation of raised concentration

Fasting, prolonged alcohol abuse, diabetic ketoacidosis,stress response (e.g. hypothermia)Sodium chloride poisoning; salt water drowning; dehydration(interpret in conjunction with creatinine and urea)Poor renal function; high protein intake; large musclemass; heat shock

CSF) glucosele glucose

(Drug induced) hyperglycaemia, diabetic ketoacidosis, stressresponse (interpret in conjunction with lactate)

Poor long term (8e12 weeks) blood glucose controlFasting, prolonged alcohol abuse, diabetic ketoacidosis,stress response (e.g. hypothermia)Interpret in conjunction with vitreous glucoseand postmortem interval

reases rapidly.st postmortem

Postmortem decomposition, little interpretative value

Sodium chloride poisoning; salt water drowning; dehydration(interpret in conjunction with vitreous creatinine and urea)Anaphylactic shockRenal function; upper GI haemorrhage

alcohols such as butanone and propanol during blood/urine ethanol analysis by gas

Page 5: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

S.L. Belsey, R.J. Flanagan / Journal of Forensic and Legal Medicine 41 (2016) 49e57 53

patients do not usually produce acetone or other biochemicalmarkers that can be tested for postmortem, and the only clue as tothe presence of hyperglycaemia in life may be a raised vitreousglucose concentration (Fig. 1).

Measurement of ketones in blood or vitreous humour is alsorecommended in unexplained deaths in chronic alcoholics as wellas in diabetics.65 Prolonged use of alcohol and poor nutrition(common in chronic alcoholics) promote the accumulation of ke-tones (acetone, butanone) and BHB, and often elevated blood ke-tone concentrations (acetone > 20 mg/L, BHB > 2.5 mmol/L) are theonly notable postmortem findings. It has been suggested that bloodacetone concentrations > 90 mg/L can indicate a fatal ketoacidoticcoma, but interpretation of an acetone concentration alone is un-wise as endogenous acetone accounts for only 2% of total ketonebodies and there are extrinsic sources of acetone such as ingestionof either acetone itself, or of 2-propanol.66

Blood ethanol measurement postmortem may aid in dis-tinguishing alcoholic ketoacidosis from starvation or diabeticketoacidosis. However postmortem production, or indeed loss, ofethanol can complicate interpretation of results. There is said to bea lower likelihood of ethanol production by microbes in vitreoushumour as compared to blood. In this context, it has been suggestedthat measurement of ethyl glucuronide (EtG) and of ethyl sulfate(EtS) in vitreous humour may help distinguish between ante-mortem ethanol ingestion and postmortem ethanol production.12,13

EtG and EtS are reported to have high sensitivity and specificity incorpses without signs of putrefaction. EtS may be more stable thanEtG in putrefied corpses and measurement of these compounds inurine rather than in vitreous humour may also help as urinaryconcentrations will usually be higher.13,67,68

An additional complication when diagnosing alcoholic ketoaci-dosis is that some 50% of all alcoholics die with a negligible bloodalcohol concentration.69 In these cases, use of chronic alcohol

No

No

Y

No Yes

Blood HbA1c >67

Vitreous glucose

Blood acetone/B

Non-diabe c hyper-glycaemia or hypothermia ?

Hypoglycaemia due to e.g. insulin or acute ethanol

poisoning?

No

* Requires confirmation from vitreous humour sodiu

Blood acetone/BHB elevated

Fig. 1. Interpretation of raised vitreous humour glucose

markers, in particular carbohydrate-deficient transferrin (CDT),may aid a diagnosis. Measurement of CDT using capillary zoneelectrophoresis or high-performance liquid chromatography isrecommended due to the low specificity of some immunoassaymethods. CDT is reported to be stable in postmortem blood for upto 7 days after death, and does not appear to be subject to redis-tribution after death.7 However, haemolysed samples are unsuit-able for CDT analysis at present, and thus investigation intomeasurement of CDT in other matrices less prone to postmortemchange is needed. Preliminary studies measuring CDT in vitreoushumour have been conducted,6,70,71 but further research isrequired.

Diagnosis of hypoglycaemia may involve detection of drugs thatmay cause hypoglycaemia such as insulin or ethanol. Calculation ofthe insulin to C-peptide ratio in blood has been used to differentiateendogenous production from exogenous administration of insulin,which lacks C-peptide.72 However, murder or suicide by means ofinsulin, even if suspected, is difficult to prove. Immunohisto-chemical demonstration or measurement of an elevated insulinconcentration in tissue around an injection site compared to acontrol site can support the diagnosis.73

Haemolysed postmortem blood is not the ideal matrix for in-sulin measurement since release of insulin-degrading enzyme (EC3.4.24.56) from erythrocytes may give falsely low insulin concen-trations.74 On the other hand, haemolysis could in theory increaseplasma insulin and hence falsely elevated insulin concentrationscould also be encountered. The use of vitreous humour, bile, andcerebrospinal and pericardial fluids as alternative matrices for in-sulin measurement has been suggested.75,76 Finally, analyticalmethods for insulin used clinically may give different results withthe same sample. Many different insulin analogues are availableand different analogues may cross-react differently to the antibodyused in an immunoassay. There may also be interference from

Yes

es

YesNo

Yes

mmol/mol Hb

detectable

Blood acetone/BHB elevated

HB elevated

Hyperosmolar hyperglycaemic

syndrome (HSS)*

Non-diabe c ketoacidosis, but cannot exclude hypoglycaemia

or hypothermia

m and urea/creatinine

Diabe c hyperglycaemia/

ketoacidosis

and blood b-hydroxybutyrate (BHB) concentrations.

Page 6: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Table 5Some biological samples required when investigating Sudden Unexpected Death in Infancy.120

Sample (volume) Handling Test

Blood or serum (1e2 mL) Centrifuge, store serum at �20 �C ToxicologyUrine (20 mL if possible) Store �20 �C Toxicology and specialised tests for inherited metabolic diseasesBlood from Guthrie card Normal (ensure circle is filled). Do not put in plastic bag Tests for inherited metabolic diseasesSkin biopsy After discussion with paediatrician Tests for inherited metabolic disease, e.g. fibroblast enzyme activityMuscle biopsy After discussion with paediatrician If history suggests mitochondrial disorder

S.L. Belsey, R.J. Flanagan / Journal of Forensic and Legal Medicine 41 (2016) 49e57 55

CK-MB activity has been said to be independent of themorphological severity of myocardial damage and not to be raisedsignificantly after acute or recurrent myocardial infarction,22

although this assay is no longer widely available after being su-perseded by other markers of myocardial damage. Elevated CK-MBactivity has been reported after asphyxia, carbon monoxidepoisoning, and metamfetamine abuse. CK-MB may be used as amarker of persistent hypoxic myocardial damage before death,whereas cTnT and cTnI are said to be more useful in assessing theprogress and duration of myocardial damage.104

2.7. Time of death estimation

Attempts to employ the rate of rise of vitreous humour potas-sium in order to calculate the time of death have largely beenabandoned because of the inherent uncertainty of this methodeven when vitreous humour hypoxanthine and urea are also ana-lysed.105e107 Use of CSF98 and of synovial fluid108 as alternatives tovitreous humour for potassium measurement have also been sug-gested, but to no avail. There are reports of immunochemicaldetection of glucagon in pancreatic cells and of calcitonin in thyroidc-cells being used to indicate time of death, but these methods areexperimental at best.109,110 The rate of loss of albumin from CSF hasalso been suggested for use in time of death estimation,111 but thisapproach would seem impractical.

2.8. Sepsis

Sepsis is complex condition that is often difficult to diagnoseand treat, reflecting in part the lack of universally-applicable bio-markers for early diagnosis.112 After death the clinical history andanalysis of any specimens obtained in life is of course important inestablishing the diagnosis. However, such information may beeither incomplete, or unavailable. In such cases serial monitoring ofserum C-reactive protein (CRP), procalcitonin, interleukin-6 (IL-6),interleukin-1b, soluble interleukin-2 receptor (sIL-2R), and lipo-polysaccharide binding protein in the hours after death has beensuggested as an aid to the postmortem diagnosis of sepsis, but hasnot been widely adopted.113,114 Procalcitonin has a longer plasmahalf-life (25e30 h) and is more stable when compared to pro-inflammatory cytokines.115 Recent preliminary studies have sug-gested that endocan (endothelial cell-specific molecule-1) andsoluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (sTREM-1)in serum derived postmortem from femoral blood and in pericar-dial and pleural fluid could be used in conjunction with procalci-tonin, CRP, and sIL-2R as additional sepsis markers.116,117

2.9. Sudden unexplained/unexpected death

Sudden Unexpected Death in Infancy [SUDI, also known asSudden Infant Death Syndrome (SIDS)], Sudden Unexplained Deathin Epilepsy (SUDEP), and Sudden Arrhythmic Death Syndrome(SADS, also known as Sudden Adult Death Syndrome) are all rec-ognised occurrences. In SUDI, an acute manifestation of an inbornerror of metabolism, particularly a fatty acid oxidation defect, has to

be excluded. Guidance on biological samples required wheninvestigating such deaths is given in Table 5. Markers of inflam-matory response, including CRP, IL-6, and intercellular adhesionmolecule-1 (ICAM-1) may be elevated in certain tissues afterinfections.118

SADS cases are thought likely often to have a cardiac origin suchas a fatal arrhythmia,119 but a full toxicological analysis is requiredto exclude recent use of not only illicit drugs such as cocaine andother stimulants, but also drugs given in therapy, for example an-tipsychotics and antidepressants, that may increase the risk of afatal arrhythmia. Even if this is done, however, it is often impossibleto state a precise cause of death with any degree of certainty.

SUDEP is the leading cause of seizure-related mortality in peo-ple with epilepsy,121 but is not readily diagnosable except by aprocess of elimination. Factors may be non-adherence with anti-convulsant therapy (antiepileptic drugs, AEDs) or co-prescription ofdrugs such as tricyclic antidepressants and clozapine that maylower the seizure threshold. It has been suggested that plasmaprolactin could indicate recent seizure activity/status epilepticus,but it has been found that this is not a reliable diagnostic marker.122

3. Conclusions

Biochemical analyses using primarily postmortem blood (orserum if available) and vitreous humour are now an accepted partof the investigation of possible alcohol- and diabetes-relateddeaths, and deaths that may have resulted from anaphylacticshock, from drowning, and from hypothermia. In large part this isbecause not only is vitreous humour less affected by postmortemchanges than blood, but also the sample obtained is amenable toanalysis using standard clinical chemistry methods designed foruse with plasma or serum. Nevertheless many problems remain,such as assessing the role of exogenous potassium or insulin in adeath, and estimating the time of death simply from postmortemchanges in body biochemistry. For additional tests to gain wide-spread acceptance not only will there need to be extensive researchand evaluation of the proposed test, but also the necessary meth-odology will need to be readily usable in clinical and/or forensiclaboratories.

Conflict of interestNone declared.

Acknowledgement

We thankMs Lorraine Brunt, Toxicology Unit, Sheffield TeachingHospitals NHS Foundation Trust, for helpful criticism of themanuscript.

References

1. Palmiere C, Mangin P, Werner D. Postmortem distribution of 3-beta-hydroxybutyrate. J Forensic Sci 2014;59:161e6.

2. Mitchell R, Charlwood C, Thomas SD, Bellis M, Langlois NE. An audit of thecontribution to post-mortem examination diagnosis of individual analyte

Page 7: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

65การวินิจฉัยการเสียชีวิตจากเบาหวานภายหลังเสียชีวิตสุภาวรรณ เศรษฐบรรจง

วชิรเวชสารและวารสารเวชศาสตร์เขตเมือง บทความปริทัศน์

บทคัดย่อ

มีการประมาณว่าเบาหวานจะเป็นปัญหาสุขภาพที่รุนแรงที่สุดโรคหนึ่งของโลกในภายหน้า และเป็นสาเหตุ

การเสียชีวิตที่พบได้บ่อยจากภาวะแทรกซ้อนเฉียบพลันของเบาหวานเอง โดยเฉพาะภาวะเลือดเป็นกรดจากระดับ

คีโตนในเลือดสูง และเนื่องจากไม่มีพยาธิสภาพทั้งทางมหภาคและจุลภาคที่เป็นคุณลักษณะจำเพาะ จึงต้องอาศัย

การสืบค้นภายหลังการเสียชีวิตโดยการตรวจสารชีวเคมีที่เกี่ยวข้องในการวินิจฉัยภาวะดังกล่าว โดยเฉพาะการ

ตรวจหาระดับกลูโคสในน้ำลูกตา ระดับบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรตในเลือด และระดับฮีโมโกลบินเอวันซีในเลือด ซึ่งอาจ

ทำการตรวจวิเคราะห์ในศพที่ไม่สามารถอธิบายสาเหตุการเสียชีวิตได้และในศพที่เน่ามากแล้วโดยการใช้ตัวอย่าง

ชีวภาพชนิดอื่น แพทย์ผู้ชันสูตรศพจึงควรทราบชนิดของสารชีวเคมีและชนิดของตัวอย่างชีวภาพที่ใช้ในการตรวจ

วินิจฉัยภาวะดังกล่าวตลอดจนข้อจำกัดของเทคนิคและวิธีการตรวจ

สุภาวรรณ เศรษฐบรรจง พ.บ., น.บ., วท.ม., ว.ว. นิติเวชศาสตร์, อ.ว. เวชศาสตร์ครอบครัว1*

1 ภาควิชานิติเวชศาสตร์ คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพมหานคร ประเทศไทย

* ผู้ติดต่อ, อีเมล์: [email protected]

Vajira Med J 2016; 60(1): 65-78

http://dx.doi.org/10.14456/vmj.2016.24

การวินิจฉัยการเสียชีวิตจากเบาหวานภายหลังเสียชีวิต

Page 8: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Vol. 60 No. 1 January - March 2016

67การวินิจฉัยการเสียชีวิตจากเบาหวานภายหลังเสียชีวิตสุภาวรรณ เศรษฐบรรจง

Vajira Medical Journal: Journal of Urban Medicine

บทนำ เบาหวานเปน็โรคเรือ้รงัทีพ่บไดบ้อ่ย มภีาวะแทรกซอ้น

ที่รุนแรง และมีค่าใช้จ่ายในการรักษาสูง จึงเป็นปัญหา

สุขภาพที่สำคัญและยังเป็นสาเหตุการเสียชีวิตที่พบได้บ่อย

โดยเฉพาะการเสียชีวิตในผู้มีอายุน้อยกว่า 60 ปี ซึ่งในช่วง

30 ปทีีผ่า่นมานีม้จีำนวนผูเ้ปน็เบาหวานทัว่โลกเพิม่ขึน้มากกวา่

2 เทา่ จงึเปน็เรือ่งทา้ทายทางการแพทยท์ีส่ำคญัทีส่ดุเรือ่งหนึง่

ของทกุประเทศ ประชากรผูใ้หญร่าว 382 ลา้นคน (รอ้ยละ 8)

เป็นเบาหวาน และคาดว่าก่อนที่จะถึงปี พ.ศ. 2578 จะมี

จำนวนผู้เป็นเบาหวานเพิ่มขึ้นมากกว่า 592 ล้านคน1

เบาหวานเป็นโรคเกี่ยวกับระบบเผาผลาญที่ผิดปกติ

และมีผลทำให้ระดับกลูโคสในเลือดสูง โดยอาจมีสาเหตุจาก

ความบกพร่องในการหลั่งอินซูลิน อันเนื่องมาจากภูมิแพ้

ตนเองทำให้มีการทำลายเซลล์ตับอ่อนที่เรียกว่า “เบาหวาน

ชนิดที่ 1” ซึ่งพบได้ร้อยละ 5-102,3 หรือมีสาเหตุจากภาวะ

ดื้ออินซูลิน และร่างกายไม่สามารถหลั่งอินซูลิน ในปริมาณที่

มากพอต่อการตอบสนองของร่างกายได้อย่างเหมาะสม

เรียกว่า “เบาหวานชนิดที่ 2” ซึ่งพบบ่อยที่สุดและมากถึง

ร้อยละ 90-954,5 การวินิจฉัยเบาหวานในผู้ที่ยังมีชีวิตอยู่

กระทำโดยการตรวจระดับกลูโคสในเลือดภายหลังจากงด

อาหารเป็นเวลานานอย่างน้อย 12 ชั่วโมง หากมีค่ามากกว่า

หรือเท่ากับ 126 มิลลิกรัม/เดซิลิตร หรือระดับกลูโคสใน

เลือด ณ เวลาใดเวลาหนึ่งมากกว่า 200 มิลลิกรัม/เดซิลิตร

ร่วมกับมีอาการที่เป็นคุณลักษณะจำเพาะของเบาหวาน

เช่น ปัสสาวะบ่อย กระหายน้ำบ่อย น้ำหนักลดอย่างรวดเร็ว

พบคีโตนในเลือดหรือปัสสาวะหรือพบทั้งสองอย่างร่วมกัน

สว่นการวนิจิฉยัเบาหวานในผูท้ีเ่สยีชวีติแลว้มคีวามซบัซอ้นกวา่

และยังคงเป็นประเด็นถกเถียงกันอย่างกว้างขวาง เนื่องจาก

ระดับกลูโคสในเลือดภายหลังเสียชีวิตไม่น่าเชื่อถือและ

ไม่สามารถใช้วินิจฉัยภาวะกลูโคสในเลือดสูงก่อนเสียชีวิตได้

ทั้งนี้เนื่องจากภายหลังเสียชีวิตเซลล์ต่าง ๆ ของร่างกายที่ยัง

ไม่เสียชีวิตสามารถเผาผลาญกลูโคสในเลือดต่อไปได้อีกสัก

ช่วงเวลาหนึ่ง ทำให้ระดับกลูโคสในเลือดลดลงอย่างรวดเร็ว

นอกจากนี้ภาวะเลือดเป็นกรดจากระดับคีโตนในเลือด

สูง (diabetic ketoacidosis, DKA) อันเป็นภาวะแทรกซ้อน

เฉียบพลันของเบาหวานที่ทำให้เสียชีวิตกะทันหันจะเกิดเมื่อ

ร่างกายขาดอินซูลินอย่างสิ้นเชิงในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1

หรือปริมาณอินซูลิน ที่สัมพันธ์กับความเครียดหรือภาวะ

เจ็บป่วยที่รุนแรงไม่เพียงพอต่อผู้เป็นเบาหวานชนิดที่ 1 หรือ

ชนิดที่ 25 และเป็นที่คาดคะเนว่าเกือบ 1/3 ของการเสียชีวิต

ทั้งหมดเกิดในผู้ที่ไม่มีประวัติการเป็นเบาหวานมาก่อน4,6

นอกจากนี้ยังเป็นสาเหตุการเสียชีวิตที่พบบ่อยที่สุดในเด็ก

และวัยรุ่นที่เป็นเบาหวานชนิดที่ 1 และเป็นสาเหตุการเสีย

ชีวิตประมาณ 1/2 ของการเสียชีวิตในผู้เป็นเบาหวานที่มีอายุ

น้อยกว่า 24 ปีด้วย7 ซึ่งการวินิจฉัยภาวะดังกล่าวเด็กที่เป็น

เบาหวานชนิดที่ 1 พบได้ร้อยละ 15 ถึงมากกว่าร้อยละ 778

ส่วนการวินิจฉัยภาวะดังกล่าวภายหลังเสียชีวิตอาจยาก

เนื่องจากไม่มีคุณลักษณะทางมหภาคและทางจุลภาคที่เป็น

ตัวบ่งชี้ อย่างไรก็ตามหากมีการตรวจสารชีวเคมีร่วมด้วย

อาจให้การวินิจฉัยภาวะดังกล่าวได้ง่าย ทั้งศพที่ไม่ทราบ

ประวัติการเป็นเบาหวานมาก่อนและศพที่เน่ามากแล้ว4,9,10

ซึ่ง DKA เป็นผลจากปริมาณอินซูลิน ที่ลดลงหรืออินซูลิน

ทำหน้าที่อย่างไม่มีประสิทธิภาพส่งผลให้เซลล์ต่าง ๆ ขาด

อาหาร ร่างกายจึงตอบสนองด้วยการเพิ่มปริมาณกลูโคสใน

เลือดและขบวนการสลายไขมันในตับทำให้ได้ผลผลิตเป็นองค์

ประกอบคีโตน

ส่วนภาวะ hyperosmolar hyperglycemic state

ซึ่งเป็นภาวะแทรกซ้อนเฉียบพลันของเบาหวานที่ทำให้เสีย

ชีวิตกะทันหันได้นั้นมักสัมพันธ์กับผู้เสียชีวิตที่เป็นเบาหวาน

ชนดิที ่2 โดยมรีะดบักลโูคสในเลอืดสงู มรีะดบัคโีตนในเลอืดตำ่

มีภาวะ hyperosmolarity ไม่พบหรือพบคีโตนในปสัสาวะ

เพยีงเลก็นอ้ย และมภีาวะขาดนำ้อยา่งมาก ซึง่ปรมิาณอินซูลิน

ในพลาสมาอาจเพียงพอที่จะป้องกันขบวนการสลายไขมันได้

แตจ่ะทำใหร้ะดบักลโูคสในเลอืดสงู ปสัสาวะบอ่ย และขาดนำ้

อย่างมากจนกระทั่งรบกวนภาวะสมดุลของอิเล็กโตรไลท์

อย่างรุนแรง หัวใจเต้นผิดจังหวะ ภาวะ rhabdomyolysis

ไตวาย ภาวะช็อก สมองบวม และเสียชีวิตในที่สุด11-13 ซึ่งพบ

ได้น้อยกว่า DKA มากและมีรายงานทางนิติเวชน้อยมาก

บทความนี้จึงขอกล่าวถึงการวินิจฉัยการเสียชีวิตจาก DKA

โดยใช้เครื่องหมายทางชีวเคมีทั้งที่เป็นเครื่องหมายเก่าและ

เครือ่งหมายใหมท่ีอ่าจใชต้รวจเปน็งานประจำ รวมทัง้ประโยชน์

ของการใชต้วัอยา่งชวีภาพทัง้ทีเ่ปน็ตวัอยา่งดัง้เดมิและตวัอย่าง

ทางเลือกในการเก็บส่งตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัย

สาเหตุการเสียชีวิตอันเนื่องมาจากภาวะดังกล่าวด้วย14-18

Page 9: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Legal Medicine 22 (2016) 23–29

Contents lists available at ScienceDirect

Legal Medicine

journal homepage: www.elsevier .com/locate / legalmed

Case Report

Usefulness of postmortem biochemistry in identification of ketosis:Diagnosis of ketoacidosis at the onset of autoimmune type 1 diabetesin an autopsy case with cold exposure and malnutrition

http://dx.doi.org/10.1016/j.legalmed.2016.07.0061344-6223/� 2016 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

⇑ Corresponding author at: Department of Legal Medicine, Osaka City UniversityMedical School, Asahi-machi 1-4-3, Abeno, 545-8585 Osaka, Japan.

E-mail address: [email protected] (T. Ishikawa).

Naoto Tani a,b, Tomomi Michiue a,b, Jian-Hua Chen a,b, Shigeki Oritani a, Takaki Ishikawa a,b,⇑aDepartment of Legal Medicine, Osaka City University Medical School, Asahi-machi 1-4-3, Abeno, 545-8585 Osaka, Japanb Forensic Autopsy Section, Medico-legal Consultation and Postmortem Investigation Support Center, c/o Department of Legal Medicine, Osaka City University Medical School,Asahi-machi 1-4-3, Abeno, 545-8585 Osaka, Japan

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:Received 12 February 2016Received in revised form 4 July 2016Accepted 25 July 2016Available online 26 July 2016

Keywords:Autoimmune type 1 diabetesPostmortem biochemistryImmunohistochemistryKetone bodyGlucose

A severely malnourished, Japanese female in her twenties was found dead in her apartment. On autopsy,most of the findings from the internal examination were suggestive of hypothermia. Postmortem bio-chemistry, however, showed severely increased levels of glycated hemoglobin (HbA1c) and blood andurine glucose levels. Levels of acetone, 3-hydroxybutyric acid, and acetoacetate in various body fluidswere also highly increased, indicating ketosis. The serum insulin and c-peptide levels were severelylow, and subsequent testing was positive for anti-GAD antibodies. Immunohistochemical examinationof the pancreatic islet cells revealed few insulin-positive cells but many glucagon-positive cells on stain-ing. Furthermore, slight invasion of CD8-positive lymphocytes in the pancreatic islets of Langerhans wasobserved. Results of immunostaining of the pancreatic and bronchial epithelial tissues were partlypositive for the Influenza A virus. We concluded that severe ketoacidosis associated with rapid-onsethyperglycemia due to autoimmune type 1 diabetes (AT1D) had occurred shortly before death.However, the ketosis was accompanied by hypothermia and malnutrition as well as diabetic ketoacidosis(DKA). Therefore, we retrospectively collected biochemical data on cases of hypothermia andmalnutrition and compared them with the present case. Serum glucose, acetone, 3-hydroxybutyric acid,and acetoacetic acid can be used for screening and diagnosis to distinguish DKA from ketosis due tohypothermia and malnutrition. Therefore, in the present case, we diagnosed that the natural cause ofdeath was due to AT1D. In conclusion, screening investigations for relevant biochemical markers canprovide essential information for the diagnosis of metabolic disturbances, which fail to demonstratecharacteristic autopsy findings.

� 2016 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Diabetes mellitus (DM) may cause severe metabolic distur-bances, which that can be fatal. These can be difficult to diagnosebased on macroscopic and histological findings alone at autopsy[1–3]. In such cases, postmortem biochemical markers can providesupporting information [1]. When investigating on metabolic andendocrin disorders, a number of postmortem biochemical labora-tory procedures have been reported to be useful for autopsy diag-noses [1,4,5]. Particularly in the postmortem diagnosis of DM, acommon metabolic disease, the main evidence for the diagnosiscan be derived from postmortem biochemical parameters [3,6,7].

Diabetic ketoacidosis (DKA) at the onset of autoimmunetype 1 diabetes (AT1D) is a complication of DM characterizedby extreme and rapid progression of hyperglycemia andketoacidosis due to the destruction of the pancreatic b cells[8,9]. The clinical diagnosis of DKA at the onset of AT1D canbe made when the following biochemical parameters are found:(1) elevation of urinary and/or serum ketone bodies; (2) highplasma and urinary glucose levels (>250 mg/dL and >100 mg/dL,respectively); (3) an anion gap of >12 mEq/L and arterial bloodpH of <7.3; and (4) elevation of plasma blood urea nitrogen(BUN) and creatinine levels [8]. Patients diagnosed with DKAat the onset of AT1D are likely to die within 24 h of the onsetof hyperglycemia unless they receive immediate treatment forDKA [8]. In forensics, DKA at the onset of AT1D has becomemore widely recognized as a cause of sudden death [2,10].However, methods for the postmortem diagnosis of DKA at the

Page 10: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

a b

Fig. 3. This figure shows the difference between the color of the blood in the bilateral parts of the heart (bright red in the left side of the heart and dark red in the right side ofthe heart) depending on the blood oxyhemoglobin saturation (a) and cherry-red emphysematous lungs with mild edema suggesting cold air inhalation (b). (For interpretationof the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

a b

Fig. 2. Plain CT images of the lungs in Case 1. (a) HU values in the reconstructed axial two-dimensional (2D) images of the bilateral lungs, as demonstrated by colorcontrasting using risk Pointer� (Hitachi Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan). (b) The colors indicating these areas as follows: �2000 < HU < �800 in yellow, �799 < HU < �500 inblue, and �499 < HU < �400 in red. In this case, the blue image indicating the area of edema was 80.1 cm2, the yellow image indicating the gas/air area was 62.8 cm2, and thered image indicating the remaining area (area with/without aeration or edema) was 6.2 cm2. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader isreferred to the web version of this article.)

N. Tani et al. / Legal Medicine 22 (2016) 23–29 25

(RS) (abcam, Japan), and Cytomegalo (Dako, Denmark) virus.Influenza A virus was the sole partly immuno-positive reaction inthe pancreatic cells, bronchial epithelial cells, and bronchiolarmacrophages (Fig. 5a, b).

2.5. Biochemical findings

There was a mild elevation in serum C-reactive protein (CRP:1.19 mg/ml); however, this was lower than the standard forensiccut-off level [14,15]. The serum neopterin level (15 pmol/ml),which is a systemic inflammatory marker, was within the standardforensic level [15]. In the blood of the right heart, comparisons ofthe concentrations of acetone, 3-hydroxybutyric acid and acetoac-etate as total ketone bodies were made between the present DKAcase and cases of hypothermia and malnutrition, as summarizedin Fig. 6 and Table 1. The urine dipstick was positive for ketonebodies (approximately 5 mg/dl) and sugar was +3 (approximately600 mg/dl). The cardiac blood glucose and HbA1c levels were597 mg/dl and 16.4%, respectively. Glucose and lactate in the right

and left vitreous humor showed a high concentration (left:481.0 mg/dl and 83.80 mg/dl; right: 496.0 mg/dl and 88.6 mg/dl,respectively) in comparison with forensic references [16–19]. Theplasma insulin level was 0.61 lIU/ml, and the plasma c-peptidelevel was severely low (<0.3 ng/ml). Plasma concentrations ofautoantibodies associated with the pancreatic islets of Langerhans,specifically anti-GAD antibody, anti-IA2 antibody, and anti-insulinantibody were 19.9 U/mL (normal range <1.5 U/mL), 0.4 U/mL(normal range <0.4 U/mL), and <125 nU/mL (normal range<125 nU/mL), respectively. The GH level (32 ng/ml) fell withinthe standard forensic level [20], and the immunoglobulin (Ig) Glevel (661 mg/ml) was slightly lower than the clinical standardlevel.

Retrospective data was collected on 11 hypothermia and 8 mal-nutrition forensic autopsy cases from our department, and theywere compared with the present case in which glucose, CRP, bloodurea nitrogen (BUN), creatinine, and acetone, acetoacetic acid, and3-hydroxybutyric acid as total ketone bodies were analyzed duringthe process of defining the cause of death. In the present case,

Page 11: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

b a

Fig. 5. Immunostaining for Influenza A virus showed positive reaction in pancreatic cells (a), bronchial epithelial cells, and bronchiolar macrophages (b).

a

c d

b

Fig. 4. (a) Histopathological findings in the pancreas (peri-islets): yellow arrow head shows lymphocytic infiltration (hematoxylin eosin staining, magnification �100). (b)Red arrow head shows anti-human CD-8 positive T-cells on immunostaining in the peri-islets (magnification �200). Immunopositivity findings of insulin (c) into islets wasalmost absent, and glucagon (d) was barely present (magnification �200). (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the webversion of this article.)

26 N. Tani et al. / Legal Medicine 22 (2016) 23–29

glucose, acetoacetic acid, 3-hydroxybutyric acid, acetone, and totalketone body levels were all extremely elevated compared withthe cases of hypothermia and malnutrition (Fig. 6 and Table 1)[21–24].

2.6. Blood gas analysis

Postmortem left and right blood gases revealed oxygen partialpressures (PO2) of 93.9% and 41.4%, respectively. It is thought thatshe was placed under low temperature exposure as for this result[25].

2.7. Postmortem microbiology

The mitochondrial (mt) DNA 3243 mutation [26] was notdetected in the whole blood.

2.8. Toxicology findings

No blood alcohol was detected in several body fluids. Drugscreening, including blood screening for amphetamines and psy-chotropic drugs using immunoassay and gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS), was negative [27].

Page 12: Medical Biochemistry I - Kasetsart University · Medical Biochemistry I • การประยุกตช์ีวเคม ีทางด านการแพทย้ ์

Table 1Summary of the ketosis-related markers in the present case compared with cases of hypothermia and malnutrition.

Right heart blood Hypothermia (n = 11) (Male: n = 6, Female:n = 5) (BMI: 12.7–25.3 kg/m2, median:19.1 kg/m2)

Malnutrition (n = 8) (Male: n = 3, Female:n = 5) (BMI: 9.8–18.4 kg/m2, median:14.0 kg/m2)

Present case ForensicCut-off value

Reference No.

Glucose 10.0–484.0 mg/dL (median: 111.0 mg/dL) 1.0–120.0 mg/dL (median: 28.5 mg/dL) 597.0 mg/dL 227.5 mg/dL [21]Acetone 0.0–52.8 lg/mL (median: 2.1 lg/mL 0.0–103.6 lg/mL (median: 16.4 lg/mL) 332.4 lg/mL <50 lg/mL [22]Total ketone

bodies86.0–4410.0 lmol/L (median: 465.0 lmol/L) 115.0–3750.0 lmol/L (median: 1027.5 lmol/L) 15269.0 lmol/L 217.5 lmol/L [21]

Acetoacetic acid 2.0–90.0 lmol/L (median: 2.0 lmol/L) 2.0–26.0 lmol/L (median: 3.5 lmol/L) 376.0 lmol/L 12.0 lmol/L No publisheddata

3-Hydroxybutyricacid

86.0–4320.0 lmol/L (median: 449.0 lmol/L) 110.0–3750.0 lmol/L (median: 1014.5 lmol/L) 14893.0 lmol/L 260.0 lmol/L No publisheddata

Blood urea nitrogen(BUN)

11.4–74.3 mg/dL (median: 41.6 mg/dL) 16.0–206.0 mg/dL (median: 66.2 mg/dL) 20.5 mg/dL 38.48 mg/dL [23]

Creatinine 0.5–2.4 mg/dL (median: 0.8 mg/dL 0.09–5.5 mg/dL (median: 2.8 mg/dL 0.7 mg/dL 3.32 mg/dL [23]C-reactive protein

(CRP)0.05–5.72 mg/dL (median: 0.4 mg/dL) 0.02–14.9 mg/dL (median: 9.4 mg/dL) 1.19 mg/dL <0.1 mg/dL [24]

Hypothermia Malnutrition

Glu

cose

(mg/dL)

Hypothermia Malnutrition

Cre

atin

ine

(mg/dL)

Hypothermia Malnutrition

Blo

od u

rea

nitr

ogen

(BU

N)

(mg/dL)

C-r

eact

ive

prot

ein

(CR

P)

Hypothermia Malnutrition

(mg/dL)

Hypothermia Malnutrition

Ace

tone

(µg/mL)

Hypothermia Malnutrition

Ace

toac

etic

aci

d

(µmol/L)

Hypothermia Malnutrition

Tota

lke

tone

bod

y

(µmol/L)

3-H

ydro

xybu

tyri

c ac

id

(µmol/L)

Hypothermia Malnutrition

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Forensic cut-off value

Fig. 6. We collected retrospective data on 11 hypothermia (cold exposure) and 8 malnutrition forensic autopsy cases and compared themwith the present case (red-circle) inwhich glucose, acetone, total ketone bodies, acetoacetic acid, 3-hydroxybutyric acid, BUN, creatinine, and CRP were analyzed during the process of defining the cause of death.Glucose, acetone, total ketone bodies, 3-hydroxybutyric acid, and acetoacetic acid (red color in the graph) may be useful for the screening and diagnosis of diabeticketoacidosis in order to distinguish it from ketosis due to hypothermia and malnutrition. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader isreferred to the web version of this article.)

N. Tani et al. / Legal Medicine 22 (2016) 23–29 27

3. Discussion

In the present case, most of the macropathological findings oninternal examination suggested possible hypothermia (cold expo-sure) as the cause of death. However, according to the postmortembiochemistry, postmortem HbA1c levels were markedly increased

and the glucose levels in the blood of the right heart and urineglucose levels were extremely elevated. HbA1c levels have beenreported to stabilize within 72 h postmortem [28], while bloodglucose concentrations have been reported to decrease after deathand should not be underestimated [6]. HbA1c is formed whenglucose is non-enzymatically added to hemoglobin. The proportion