MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA DI... · Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla: • Acquisizione di conoscenze sulle complessive

MEDICINA DI LABORATORIO:MICROBIOLOGIA CLINICA

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti -Pescara

CL Medicina e ChirurgiaCI MEDICINA DI LABORATORIOAnno Accademico 2012-2013

Università “G. d’Annunzio” di Chieti -Pescara

Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livellotel 0871 3554812Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)tel 0871 541519

e-mail: [email protected]

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA CLINICA

Obiettivo principale del Laboratorio di Microbiologia Clinica è laidentificazione dell’agente patogeno responsabile di unamalattia infettiva, allo scopo di suggerire un appropriatotrattamento terapeutico.Inoltre, la attività di Laboratorio consente anche la valutazione della:Inoltre, la attività di Laboratorio consente anche la valutazione della:- efficacia della terapia (follow-up)- presenza di portatori sani (potenziale fonte di contagio)

Il Laboratorio di Microbiologia fornisce:sostanziale supporto alla diagnosi , al trattamento ed alla prevenzionedella patologia da infezione, sia quella sostenuta da patogeni primari (in soggetti normoreattivi) che quella sostenuta da patogeni opportunisti o condizionati (in soggetti con difese compromesse).

Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla:

• Acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità diagnostiche del Laboratorio di Microbiologia e sulla possibilità che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione .

• Valutazione del/della: – ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella – ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella

eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione; – circolazione dei microrganismi in situazioni ambientali differenti; – capacità dei microrganismi di esibire resistenze ai farmaci

antimicrobici;– circolazione dei determinanti genetici di resistenza , con

acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata (empirica) che eviti, quando non richiesto, il ricorso al Laboratorio, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.

Medicina di Laboratorio:Peculiarità della Microbiologia Clinica

• La diagnostica di laboratorio delle malattie da infezione presenta alcuni aspetti di peculiarità nell’ambito delle discipline di laboratorio che possono essere così riassunte:– forte influenza della fase pre-analitica– determinazione dell’agente causa della malattia (patogeno)– interazione tra due sistemi biologici– interazione tra due sistemi biologici

• Nella Microbiologia Clinica ci si trova di fronte all’unico esempiodiagnostico che ci consenta di “isolare, coltivare e conservare” l’agente responsabile di una patologia e di poterlo successivamente studiare per ragioni tassonomiche, epidemiologiche, di monitoraggio della terapia.

• L’aspetto peculiare più rilevante della diagnostica microbiologica è che il risultato contenuto nel referto non è un numero, un valore, una cifra, una quantità ma assume un significato biologico derivante dal rapporto tra due sistemi biologici: il microrganism o e l’uomo .

ITER DIAGNOSTICO

• Fase PRE-analitica– Richiesta di indagine– Prelievo del campione– Raccolta del campione– Conservazione e trasporto del campione– Accettazione

• Fase ANALITICA :• Fase ANALITICA :– Esecuzione dell’esame– Validazione del risultato

• Fase POST-analitica :

– Refertazione del risultato– Elaborazione statistica

Il turn-around-time (TAT) degli esami di laboratorio è definito come il tempo che intercorre tra il momento in cui il Clinico prescrive l’indagine ed il momento in cui egli prende visione del referto (risposta). Altra definizione (“laboratoristica”) di TAT: tempo che intercorre tra accettazione del campione e refertazione indagine.Comunemente utilizzato come indice di performance di un laboratorio.

FASE PRE-ANALITICA

Virtualmente, la fase pre-analitica per la diagnostica delle malattie da infezione inizia con la raccolta dell’anamnesi a letto del malato e la formulazione del sospetto etiologico (ipotesi etiologica) da parte del Clinico.

La Fase pre-analitica“… ha inizio, in ordine cronologico, con la richiesta dell’esame da parte del

Clinico, prosegue con la preparazione del paziente, la raccolta del campione primario, il trasporto al laboratorio e termina all’avvio delle procedure analitiche” [Norma ISO (International Standard Organization) 15189]procedure analitiche” [Norma ISO (International Standard Organization) 15189]

• In Microbiologia clinica, la fase pre-analitica è, quindi, un momento diagnostico di estrema importanza in quanto:– cruciale nell’ambito del processo di Laboratorio, dal momento che in

questa fase si registra circa il 50% degli errori diagnostici;– rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il Laboratorio e

le altre parti interessate al processo (stakeholders);– indirizza la ricerca microbiologica, condizionando le modalità di

processo del campione e la scelta delle tecniche.

Nella fase pre-analitica bisogna (pre)occuparsi di come il Laboratorio sia in grado di rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge

FASE PRE-ANALITICA

1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami; fornire informazioni cliniche)2. Informazione e Preparazione del Paziente3. Raccolta del campione4. Identificazione del campione5. Trasporto del campione in laboratorio6. Accettazione campioni (check-in)

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FASE ANALITICA FASE POST-ANALITICA

Il rapporto di interdipendenza tra le fasi di pre- e post-analitica collega in una catena di qualità chi fornisce il prodotto in entrata (le modalità di prelievo vanno definite in rapporto al tipo di campione e alla sua conservazione) e chi lo fornisce in uscita verificandone il buon utilizzo (l’interpretazione dei dati è influenzata non solo dalla correttezza della risposta ma anche dalla congruità della richiesta). Ne consegue una ottimizzazione del flusso di lavoro orientato ad una maggiore efficacia diagnostica.

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Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualità nella fase pre-analitica?

• Per una diagnosi accurata ed attendibile la richiesta deve essere congrua rispetto al quesito diagnostico ed il campione biologico deve essere appropriato rispetto alla richiesta di esami

• A causa della difficoltà di integrare le caratteristiche del campione e la congruità della richiesta, la scelta della prestazione in microbiologia è condizionata dalla conformità del prodotto in entrata, definita in relazione a requisiti standard;

• La conformità si realizza attraverso l’utilizzo di prot ocolli – redatti a seguito di stretta collaborazione tra Microbiologo e Clinico - sulle modalità di prelievo, trasporto e conservazione del campione, l’utilizzo di profili di esami per materiale e l’uso di protocolli diagnostici, in relazione alla patologia.

Appropriatezza della fase pre-analitica

Appropriatezza : Il grado con cui una procedura, un test o servizio è efficace e fornito in qualunque situazione clinica risponde al meglio ai bisogni del paziente (College of American Pathologists, 1996)

L’appropriatezza di tutta la fase pre-analitica si traduce in maggiore qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore.

Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure (Microbiologo, Clinico, Parasanitari) coinvolte a diverso titolo nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato, per terminare con la visione del referto) ed il rispetto in tutte le fasi delle malato, per terminare con la visione del referto) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può assicurare la piena valorizzazione dell’indagine microbiologica.

Dr. Paul Schreckenberger Dr. Paul Schreckenberger

Responsabilità della U.O. di degenza

La UO di degenza o la struttura che effettua il prelievo è direttamente responsabile della:• corretta raccolta del campione • adeguata identificazione del campione • corretta compilazione del modulo di richiesta • corretta compilazione del modulo di richiesta • tempestivo invio del campione al Laboratorio. Qualora ciò non

fosse possibile:• conservazione del campione secondo modalità indicate nei

protocolli redatti e forniti dal Laboratorio di Microbiologia

Responsabilità del Laboratorio di Microbiologia

• Predisporre istruzioni scritte specifiche per la raccolta corrett a e la manipolazione dei campioni (per ogni tipologia di campione).

• Raggrupparle in un MANUALE DI RACCOLTA DEI CAMPIONI PRIMARI per renderle disponibili ai Responsabili dei prelievi:

a. COPIE di:• Lista degli esami effettuati• Modulo di consenso informato (dove richiesto)• Informazioni e istruzioni da fornire al paziente per la preparazione prima della

raccolta

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raccolta• Informazioni per gli utilizzatori sulle indicazioni cliniche e sulla appropriatezza nella

scelta delle procedure analitiche disponibilib. PROCEDURE per:

• Preparazione dei pazienti (istruzioni per infermieri e prelevatori)• Identificazione del campione primario• Raccolta del campione con descrizione dei contenitori ed eventuali additivi

necessaric. ISTRUZIONI per:

• Compilazione della richiesta cartacea o elettronica• Tipo e quantità del campione da prelevare• Timing di raccolta (se richiesto)• Tutte le manipolazioni necessarie tra il momento del prelievo e consegna in

laboratorio (es. refrigerazione, riscaldamento, consegna immediata)

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c. ISTRUZIONI per:• Etichettatura del campione• Registrazione dell’identità del prelevatore• Conservazione dei campioni esaminati• Limiti di tempo per richiesta di esami aggiuntivi• Possibili esami aggiuntivi

• Monitorare la osservanza ed applicazione delle proced ure/istruzioni .• Essere disponibili a fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di

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• Essere disponibili a fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta, si dovessero rendere necessarie. In particolare:

– indicazioni nella scelta delle indagini– modalità di raccolta– interpretazione dei risultati– informazioni epidemiologiche

• Il personale del Laboratorio è responsabile della segnalazione di “non conformità” relative al prelievo .

• Il Responsabile della Microbiologia deve organizzare la formazione e l’aggiornamento del personale relativamente al presente documento, nonché la verifica e l’aggiornamento del Manuale per la raccolta e la conservazione dei materiali per le ricerche microbiologiche.In

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ESAMI URGENTI• Il Laboratorio deve predisporre una procedura scritta per le modalità di

richiesta e di trasmissione al servizio degli esami urgenti , nel rispetto dei criteri di rintracciabilità .

• La procedura deve includere dettagli sulla specifica evidenza nel modulo di richiesta e sul campione primario, le modalità di trasferimento del campione all’area analitica del laboratorio, del processamento rapido e dei criteri particolari di refertazione da seguire.

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e dei criteri particolari di refertazione da seguire.

• Campioni considerati “urgenze microbiologiche” :– liquor cefalo-rachidiano per sospetta meningite– tamponi per sospetta difterite– infezioni di tessuti molli: mionecrosi, fascite necrotizzante– coprocoltura per sospetto colera– campioni aspirati in soggetti sottoposti a TAC o prelevati i n sede

operatoriaI campioni urgenti avranno la precedenza nell'iter diagnostico e saranno

quindi processati prima rispetto a quelli “routinari”.

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FASE PRE-ANALITICA1. Richiesta degli esami di laboratorio

• Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica .• Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato .

– Nella pratica clinica è, in particolare, indispensabile procedere alla preliminare formulazione del sospetto diagnostico , considerando preliminare formulazione del sospetto diagnostico , considerando che:

• non è sempre possibile ricercare routinariamente tutti i microrganismi in un determinato materiale

• è possibile limitare la spesa sanitaria (ridotto numero di test di laboratorio, minore ospedalizzazione)

• La limitazione delle risorse economiche condiziona attualmente (e condizionerà sempre più, in futuro) gli interventi medici.

• La valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere quindi tenuta in sempre maggiore considerazione dal Medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso all’ausilio del Laboratorio.


La richiesta (prescrizione) di accertamenti microbiologici è giustificata:• nella patologia infettiva ad etiologia definita , per diagnosi di

forme clinicamente atipiche od iniziali, per la determinazione della sensibilità ai farmaci.

• nelle sindromi polieziologiche , per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche).

• nella patologia infettiva del paziente immunocompro messo , per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie).

• in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, l’adozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.


Identificazione univoca del paziente (ISO 1518B9):• Nome del Medico richiedente• Data e ora della raccolta del campione• Tipo di campione e sito anatomico di provenienza (o ve è

necessaria la precisazione)necessaria la precisazione)• Esami richiesti• Sesso e data di nascita del paziente• Informazioni cliniche rilevanti per il paziente

RICHIESTE VERBALI (NORME ISO 1518B9)Il Laboratorio deve predisporre una procedura scritta per le richieste verbali di esami.Occorre definire se, in casi particolari, vengono accettate richieste telefoniche e con quali specifiche modalità, che possono essere giustificate dall’urgenza dell’esame o dalla necessità di ulteriori approfondimenti diagnostici. Dovrebbero comunque essere valutate ed accettate da un Dirigente del laboratorio.La richiesta deve, in qualsiasi caso, essere documentata appena possibile.


• Un aspetto importante della richiesta è quella che ci permette di ottenere una buona tracciabilità del campione (ISO 1518B9)

• Tutti i campioni primari (ovvero aliquote di campione) devono essere accompagnati da una richiesta rispetto alla quale devono essere rintracciabili.

• I campioni non correttamente identificati non debbono essere • I campioni non correttamente identificati non debbono essere accettati o processati dal Laboratorio.

• In caso di materiali difficili da ottenere od instabili (es. liquor, biopsie), il Laboratorio può processare il campione ma non produrre il referto fino a che il Clinico richiedente, od il prelevatore, non si assuma la responsabilità dell’identificazione, apponendo la propria firma sulla richiesta (cartacea od elettronica).

FASE PRE-ANALITICA2. Informazione e preparazione del Paziente

• Il Paziente deve essere informato sulle procedure per la raccolta del campione, che deve avvenire in rispetto della privacy. Solo in tal modo si otterrà il consenso e la collaborazione del Paziente.

In caso di raccolta domiciliare del campione (e comunque in assenza di personale sanitario), il Paziente deve essere adeguatamente istruito non soltanto sulle corrette modalità di adeguatamente istruito non soltanto sulle corrette modalità di prelievo, ma anche sulla conservazione e trasporto dello stesso .

Esempi di raccolte domiciliari “critiche”:� urine, tecnica del “mitto intermedio”� urine, raccolta delle 24 h� feci

FASE PRE-ANALITICA3. Raccolta del campione clinico

Campione clinico : porzione di materiale biologico da esaminare per verificare la presenza o assenza di specifici microrganismi a significato patogeno.

Ogni campione biologico deve essere considerato come potenzialmente arischio biologico per la salute degli operatori sanitari. Utilizzo di dispositivi per protezione individuale (DPIs) (guanti, camice, occhiali, visiera, etc.)per protezione individuale (DPIs) (guanti, camice, occhiali, visiera, etc.)

Perchè la risposta microbiologica sia significativa è innanzitutto necessario che il materiale biologico (campione), dal quale inizia l’iter diagnostico, sia appropriato, ossia rappresentativo della patologia sulla quale si indaga.

In particolare, il campione dovrebbe essere:A. di adeguata tipologia ;B. raccolto nel momento giusto ;C. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della malattia;D. prelevato in quantità sufficiente per l’esecuzione dei tests diagnostici;E. raccolto in asepsi , ossia in maniera da evitarne la contaminazione.

APPROPRIATEZZA del campione.

A. Il campione dovrebbe essere di tipologia adeguata .- L’attuale limitata disponibilità di risorse impone che le indagini

microbiologiche siano unicamente indirizzate verso quelle ricerche in grado di fornire notizie clinicamente utili e non richiedere esami con valore diagnostico improbabile o discutibile (ossia non confermato dalla letteratura).



APPROPRIATEZZA del campione.B. Il campione dovrebbe essere prelevato nel momento giusto :

– nella fase acuta della malattia;– prima dell’inizio di una terapia antimicrobica , quando

possibile, od a seguito di sospensione della stessa da almeno 48-72 h:

• gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica ed interferiscono sull’esito dei tests di laboratorio.

• se il paziente è sottoposto a trattamento antimicrobico per un'altra forma morbosa concomitante o se non è possibile interrompere la terapia (empirica) in corso, è necessario avvertire il Laboratorio segnalandolo sull’impegnativa, indicandone anche lo schema (antibiotico, posologia) .


APPROPRIATEZZA del campione.C. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo rappresentativo dell’area infetta.

Esempi: Esempi: • La febbre tifoide ha un caratteristico decorso bimodale: i) una fase precoce (I e II settimana), febbrile, con emocoltura positiva nel 90-100% dei casi, e coprocoltura frequentemente negativa; ii) una seconda fase (III settimana), spesso diarroica, durante la quale Salmonella typhi può essere isolata più frequentemente dalle feci e con minore frequenza dal sangue.Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla c onoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca del microrganismo nel sangue durante la I e II settimana, nelle feci (e nel sangue in III settimana, nel 30% dei casi) in III e IV settimana.• Ricerca Chlamydia/gonococco: nel canale endocervicale (non in vagina!)

APPROPRIATEZZA del campione.C. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo rappresentativo dell’area infetta.� Se l’infezione può dare manifestazioni sistemiche, è opportuno eseguire

anche una emocoltura (es. meningite, infezioni broncopolmonari od


anche una emocoltura (es. meningite, infezioni broncopolmonari od urinarie).

L’importanza della sede di prelievo:� identifica l’esatto punto della sospetta infezione;� consente la scelta più appropriata dei presidi diagnostici (es. tipologia

dei terreni di coltura, atmosfera di incubazione);� fornisce indicazioni sulla tipologia (specie) di microorganismi che

possono avere, in quella sede, un ruolo eziopatogenetico;� permette di decidere se eseguire indagini aggiuntive.


APPROPRIATEZZA del campione.D. Il campione deve essere prelevato in quantità sufficiente per poter effettuare i tests diagnostici necessari.

Esempio:Le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La sensibilità dell’esame emocolturale è, quindi, influenzata dalla quantità (volume) del campione prelevato. “… Two blood culture sets (10 mL in both aerobic and a nerobicbottles) before administration of antibiotics is 98 % sensitive …”(J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 657-661)


APPROPRIATEZZA del campione.E. Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare contaminazioni

� Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente asettiche, altri microorganismi non responsabili della patologia asettiche, altri microorganismi non responsabili della patologia (contaminazione endogena, da flora “autoctona”; contaminazione esogena od ambientale) potrebbero contaminare i campioni e “falsare”, in tal modo, il risultato delle indagini microbiologiche

Esempi:• La ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe.• Nella raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la contaminazione con la flora vaginale..

Distretti anatomici “sterili” vs “non-sterili”

� Distretti “sterili ”:– normalmente (in condizioni fisiologiche) non contengono

microrganismi• sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor), liquido pleurico,

pericardico, peritoneale, liquido articolare, vie respiratorie inferiori, urine.

– ogni isolamento ha significato eziologico; segue identificazione– ogni isolamento ha significato eziologico; segue identificazione

� Distretti “non sterili ”:– generalmente in comunicazione con l’ambiente circostante e, quindi,

già “contaminati” da una flora autoctona (residente)• feci, espettorato, secrezioni uretrali e vaginali

– danno luogo a risultati che vanno, di volta in volta, interpretati– richiesta “mirata” del Clinico volta alla ricerca di uno o più specifici

patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante

Flora microbica “residente”

Tutte le superfici corporee “esposte” (a contatto con l’ambientecircostante) (bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili, uretra) sono colonizzate da flora batterica

– Svantaggi• può contaminare i campioni• può causare malattia

– Vantaggi• è in grado di proteggere dalle infezioni prevenendo la

colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni(resistenza alla colonizzazione)

• la riduzione (o rimozione) della flora “normale” medianteimpiego di antibiotici può causare superinfezioni, generalmentesostenute da microrganismi resistenti

FASE PRE-ANALITICA4. Identificazione del campione

Il contenitore recante il campione deve essere opportunamente contrassegnatoe confezionato prima del suo trasporto verso il laboratorio.

I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati da un modulo di richiesta (in assenza di accettazione telematica) indicante:– Identificativo del paziente (nome , cognome , età, sesso )– Identificativo del paziente (nome , cognome , età, sesso )– Nominativo del prelevatore– Data ed ora di campionamento– Tipologia del campione– Presunta diagnosi– Mirata ricerca microbiologica

• soprattutto nel caso si sospetti la presenza di patogeni infrequenti” (anche per evitare l’esecuzione di indagini diagnostiche inutili …)

– Infos cliniche (utili nella fase pre- e post-analitica): • precedenti esami microbiologici, terapia antibiotica pregressa od in

atto (specificandone lo schema)

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione

� In questi ultimi anni, la necessità di disporre di sistemi per il trasporto dei campioni è aumentata ulteriormente a causa di un maggior ricorso alle attività ambulatoriali in seguito alla riduzione del numero dei giorni di degenza ed alla progressiva centralizzazione dei laboratori imposta da nuovi assetti organizzativi.

� Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deve� Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il campione deveessere trasportato:� in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle indagini

microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione del campione;� rapidamente, per evitare: i) la riduzione della vitalità dei microrganismi (false

negatività); ii) di favorire la crescita dei “contaminanti” (false positività); iii) ridurre la esposizione a sostanze che, utilizzate nelle procedure di raccolta (es. anestetici locali), potrebbero avere attività antibatterica

� a temperatura “controllata” : generalmente a +4°C, occasionalmente a temperatura ambiente

� in adeguati terreni di trasporto , se necessario (es. ricerca di anaerobi, tamponi, etc.), al fine di mantenere inalterata la “facies” microbica del campione, conservandone le caratteristiche possedute al momento del prelievo

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: contenitore

• Nelle linee guida generali per la raccolta di diversi campioni biologici viene indicato l’utilizzo di un contenitore sterile , o provetta sterile, con tappo a vite .

• Prima dell’uso di contenitori e/o provette è necessaria un’ispezione visiva per accertarne l’integrità.

• In generale, il contenitore sterile serve per la raccolta di campioni biologici liquidi (urine o altri fluidi biologici), escreati, cateteri o biopsie di tessuto.

• La capacità e forma del contenitore può essere diversa a seconda delle necessità (15-200 ml).(15-200 ml).

• Sono contenitori monouso , a volte in confezione singola; la sterilità è dichiarata dal produttore con certificato allegato dove è stabilita la data di scadenza ed il metodo utilizzato (irraggiamento, ossido di etilene).

• Per facilitare la raccolta del materiale sono preferibili contenitori ad apertura larga .• Il coperchio non deve creare aerosol quando rimosso pertanto sono preferibili i

contenitori con tappo a vite.

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: temperatura

� I campioni vanno generalmente refrigerati (2 - 8°C)� Tuttavia, nei seguenti casi è opportuno conservare il campione a

temperatura ambiente:� sangue in brodocoltura , che va incubato a 35-37°C oppure mantenuto a

temperatura ambiente� campioni (liquor) che possono contenere microrganismi termosensibili

(S.pneumoniae, N.gonorrhoeae, N.meningitidis, H.influenzae)� campioni per la ricerca di batteri anaerobi (utilizzare sempre un sistema

di trasporto specifico)� campioni di feci per l’esame colturale : usare un terreno di trasporto (Cary

Blair medium o Buffered Glycerol Saline)� campioni di feci per l’esame parassitologico : mescolare il campione con

un conservante

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: conservazione

CAMPIONE CONSERVAZIONEEMOCOLTURA RT (max 24h)

ESSUDATI, DRENAGGI, LIQUIDI (pleurici, asciti articolari, dialisi peritoneale), PERICARDICI

Inoculare parte del materiale nei flaconi per emocoltura e conservare a RT.

Conservare il restante materiale nel contenitore sterile a +4°C (max 24h)

PUNTA CATETERE VASCOLARE +4°C (max 24h)

Qualora fosse impossibile inviare immediatamente il campione al Laboratorio, la sua conservazione deve avvenire secondo le indicazioni fornite dal Laboratorio:

ESPETTORATO e/o BRONCOASPIRATO+4°C (max 2h), altrimenti a RT in tampone con

terreno di trasporto (max 24h)

TAMPONI (faringeo, nasale, auricolare, vaginale, congiuntivale, cutaneo, etc.) con terreno di trasporto

RT (max 24h)

URINE +4°C (max 24h)FECI +4°C (max 24h)

LIQUOR contattare il Laboratorio di Microbiologia

RICERCA MICOBATTERI +4°C (max 24h)

ESSUDATO ULCERE, PIAGHE, FERITE CHIRUR. +4°C (max 24h )

PRELIEVI BIOPTICI E AGOASPIRATI +4°C, in fisiologica (max 24h)

+4°C: conservazione in frigo; RT: temperatura ambient e

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto del campione: terreno di trasporto

• Sono disponibili diversi terreni di trasporto, liquidi o agarizzati, in grado di prolungare la sopravvivenza batterica al di fuori dell'organismo umano.

• Il terreno di trasporto mantiene un adeguato pH e previene sia la disidratazione delle secrezioni durante il trasporto, sia l'ossidazione e l'autodigestione enzimatica dei microrganismi presenti.l'autodigestione enzimatica dei microrganismi presenti.

BD™ Bio-BagEnvironmental Chambers, Type A, Anaerobic, Multiple

BBL™ Port-a-Cult Anaerobic System

BBL™ Vacutainer™ Anaerobic Specimen Collector

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Il tampone

• Un sistema di raccolta e trasporto comune a molti campioni è il tampone(swab), costituito da un supporto recante fibre assorbenti naturali (cotone) o sintetiche (nylon, poliestere, dacron, rayon, calcio alginato) talvolta impregnati con carbone, siero o frazioni di albumina per migliorare la sopravvivenza dei microrganismi “esigenti” e per neutralizzare i metaboliti tossici.

• E’ importante sottolineare che la scelta della fibra è un elemento di criticità nella fase pre-analitica e la scelta deve basarsi sulla conoscenza della correlazione esistente tra tipo di fibra e tipologia di materiale o di ricerca da effettuare:effettuare:

– tamponi in cotone , contengono acidi grassi ad azione tossica vs molti microrganismi

– tamponi in calcio alginato , rilasciano prodotti che interferiscono con la crescita di vari microrganismi (Herpes simplex virus, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoeae) e risultano tossici per le colture cellulari. Non idonei per estrazione di acidi nucleici.

• Dacron e rayon sono da considerarsi fibre ideali• Il tampone generalmente richiede l’impiego di un terreno di trasporto. E’

possibile, tuttavia, utilizzare tamponi a secco solamente quando si esegue la coltura subito dopo la raccolta del materiale, oppure tamponi a secco con carbone, albumina o calcio-alginato quando si effettua la coltura entro 4 h

Il sistema “tampone-terreno di trasporto”

Per periodi di tempo maggiori deve essere utilizzat o un sistema dotato di terreno di trasporto .

� Sistemi “ready-to-use” completi per il prelievo, trasporto e mantenimento dei campioni clinici per l’esame batteriologico. Consta di un tampone per la raccolta del materiale su supporto (in plastica o filo metallico; in alcuni casi regolabile) e da una provetta, dove viene inserito il tampone dopo il suo utilizzo, generalmente in polipropilene contenente un terreno di trasporto:di trasporto:

– terreno di Stuart o di Amies (liquido oppure in agar gel, con o senza carbone)

– terreno di Cary-Blair (in agar gel)

� I terreni di trasporto proteggono i microrganismi da: essiccamento, acidi grassi tossici, condizioni sfavorevoli di pH, effetti letali dell’ossigeno atmosferico

� La loro formulazione permette di mantenere la vitalità batterica senzaincrementarne la crescita e la moltiplicazione . Tuttavia è da considerare che:

– alcuni microrganismi patogeni possono non sopravvivere in un terreno povero di elementi nutritivi

– alcune specie batteriche possono duplicarsi in 1 h se nel campione sono presenti fluidi corporei

Valutazione comparativa dei principali terreni di tr asporto

Tipologie di sistemi di trasporto “tampone+terreno”

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “sicuro” del campione

� Ogni campione biologico deve essere considerato come potenzialmente arischio biologico per la salute degli operatori sanitari.

� Pertanto, in accordo con la normativa (legge n. 21 del 20.07.94, circolare n. 3, 8 maggio 2003), le linee-guida del Ministero della Salute e dell’OMS, il trasferimento dei campioni biologici deve avvenire “in sicurezza ”, ossia evitando la dispersione del materiale biologico e la eventuale contaminazione di altri materiali, di attrezzature, dei pazienti e del personale che dovrà manipolare il campione stesso:manipolare il campione stesso:– campione singolo (provetta, tampone, flacone): in busta di plastica

monouso a due scomparti: uno dotato di chiusura a pressione per alloggiare il campione biologico, l’altro per il modulo di richiesta debitamente compilato. Sul fronte del sacchetto sono stampati il simbolo di rischio biologico e le istruzioni.

– campioni multipli : in contenitori rigidi ed a chiusura ermetica.

� L’invio dei campioni in orari non ordinari richiede una pianificazione, con il Laboratorio, della loro raccolta ed invio

� Il Laboratorio deve monitorare le condizioni “di sicurezza” del trasporto (ISO 15189)

� Trasporto interno: gli stativi recanti i campioni vengono collocati in apposite valigette e trasportati a mano o con carrelli, unitamente alle relative schede di richiesta esami.� Trasporto esterno : Le provette ed i contenitori primari vengono collocati nelle apposite valigette secondo le modalità previste e qui descritte in seguito:

• porre le provette nell’apposito porta-provette in plastica mantenendo la posizione verticale o conficcarle nelle incisioni predisposte nella spugna

FASE PRE-ANALITICA5. Trasporto “sicuro” del campione

posizione verticale o conficcarle nelle incisioni predisposte nella spugna assorbente;

• accertarsi che i contenitori per urine e feci siano ben chiusi e puliti all’esterno;• porre le provette di sangue/plasma/siero che richiedono refrigerazione in

appositi contenitori refrigerati;• trasportare i documenti di accompagnamento dei campioni in busta

accuratamente separata dai campioni;• assicurarsi che durante il trasporto la valigetta sia sistemata in modo fermo e

sicuro nel bagagliaio del veicolo, che durante il viaggio siano mantenute le condizioni di conservazione del materiale ed evitare le soste al sole;

• l’autista deve assicurarsi di rispettare i tempi di consegna concordati.

TRASPORTO (NORME ISO 15189)

Il Laboratorio deve controllare che i campioni vengano trasportati e consegnati in laboratorio:● Nell’intervallo di tempo appropriato alla natura dell’esame richiesto.● Nel range di temperatura specificato nel manuale di prelievo e con gli idonei additivi per garantire l’integrità del campione.l’integrità del campione.● Con modalità che garantiscano la sicurezza del trasport atore , delle persone presenti nelle strutture e nel laboratorio ricevente. Le procedure devono aderire a norme nazionali o locali.

• Tutti i campioni ricevuti devono essere registrati in una lista cartacea, nei fogli di lavoro o registrati mediante sistema informatico. Vanno segnate data e ora di ricevimento e l’identità del ricevente.

• Il Laboratorio deve stabilire e documentare i criteri per l’accettazione e/o rifiuto dei campioni.

• Se vengono accettati campioni “compromessi” il refert o finale

FASE PRE-ANALITICA6. Accettazione del campione: conformità

dovrà riportare la natura del problema e le eventua li precauzioni da adottare nell’interpretazione del risultato anali tico.

(Norme ISO 15189)

Criteri per definire un campione “non idoneo” (non conforme) per la diagnosi microbiologica

� Contenitore� non conforme alle vigenti norme di sicurezza (siringhe con ago)� non adatto (es. feci per coprocoltura in contenitore per la ricerca di parassiti)� non sterile� non ben chiuso e/o danneggiato con fuoriuscita del materiale

� Campione� non identificabile, modulo di richiesta mancante od incompleto� assente o prelevato in quantità insufficiente (ricerca micobatteri)� assente o prelevato in quantità insufficiente (ricerca micobatteri)� invio in giornata di 2 campioni con stesso materiale (sangue escluso)

� Materiale non idoneo per la ricerca o per il quale la richiesta non è attualmente supportate da evidenze scientifiche:� raccolta urine “delle 24 h” per urinocoltura� ricerca di gonococco/chlamydia in tampone vaginale� prelievo in paziente antibiotizzato� saliva vs escreato

� Impropria conservazione e/o trasporto :� terreno di trasporto assente, ove raccomandato (materiali da apparato uro-genitale, vie

respiratorie, ferite chirurgiche, pus, etc.)� tempo protratto: feci (>1 h), urine (>1 h se RT, >2-8 h se refrigerate)� temperatura non adeguata: flaconi per emocoltura non conservati a temperatura ambiente

Riflessioni … sulla fase pre-analitica

� Il contributo fornito da chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami di laboratorio consiste sia nella conoscenza del fenomeno che nel rispetto di quella serie di norme che permettono di ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle analisi.

� Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e piùrapido.rapido.

� Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del microorganismo responsabile dell’infezione, ovvero una erronea attribuzione di eziologia microbica.

� In tal modo si eviterebbe, inoltre, la "diffusione" di germi patogeni - in particolar modo quelli antibiotico-resistenti (MRSA, Pseudomonas spp) -che indirettamente aumentano l'incidenza delle infezioni nosocomiali.

In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fa se pre-analiticasono responsabili della qualità del percorso diagno stico del paziente … almeno fino all’arrivo del campione in Lab oratorio !

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MEDICINA DI LABORATORIO: MICROBIOLOGIA CLINICA DI... · Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla: • Acquisizione di conoscenze sulle complessive