MEDICINA LABORATORIALMEDICINA LABORATORIAL

MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Maria Ana Pessanha -2009

MicrobiologiaMicrobiologia

• Flora bacteriana – sua importância e composição.

• Colheitas e transporte de diversos produtos biológicos.

• Processamento e interpretação clínica.

Flora bacteriana normalFlora bacteriana normal• Constituída por mais de 200 espécies de

bactérias. Depende de factores genéticos, da idade , sexo, stress, estado de nutrição e dieta.

• A interacção é dinâmica e mutualista: a flora normal recebe do hospedeiro nutrientes num ambiente estável com temperatura constante, protecção e transporte.

Flora bacteriana normalFlora bacteriana normal

• O hospedeiro obtém da flora normal benefícios nutricionais com síntese por ex. de vitaminas K e B12, estimulação da imunidade com produção de anticorpos “naturais” e prevenção da colonização por bactérias patogénicas por produção por ex. de bacteriocinas, que inibem o crescimento de outras espécies.

Flora bacteriana normalFlora bacteriana normal• A flora está adaptada aos diversos locais do

hospedeiro através de ligandos ou adesinas que se ligam a receptores específicos nas células do hospedeiro.

• A localização preferencial depende do tropismo para determinados tecidos, da especificidade dos receptores e da capacidade de construir ou integrar biofilmes.

S. aureusS. aureus num cateter vascular num cateter vascular

Biofilme - FormaçãoBiofilme - Formação

BiofilmeBiofilme• As bactérias que vivem em biofilmes têm

propriedades diferentes das que vivem livres no meio ambiente. A protecção permite que elas cooperem e interajam e se tornem resistentes a detergentes e antibióticos.

• Ao mecanismo de percepção da densidade celular foi chamado “Quorum sensing”.

• O “QS” permite a comunicação entre as bactérias e coordena as suas actividades a um nível multicelular.

BiofilmeBiofilme

De acordo com o CDC os biofilmes são tolerantes aos antimicrobianos e são responsáveis por cerca de 80% de todas as infecções. A tolerância do biofilme é devida à persistência de uma pequena quantidade de bactérias que ficam invulneráveis à acção destes agentes. (Brooun et al, 2000; Spoering and Lewis, 2001)

Quorum SensingQuorum Sensing• A produção de subtâncias anti-quorum

sensing pode ser uma das alternativas, no futuro, para criar alternativas aos antimicrobianos actuais.

• O bloqueio das comunicações célula-a-célula entre as diversas espécies de bactérias pode prevenir a sua patogenecidade.

COLHEITA DE PRODUTOS BIOLÓGICOS

• Urina• Exsudado vaginal e uretral• Infecções respiratórias altas• Infecções respiratórias baixas• Infecções gastro-intestinais• Hemoculturas• Cateteres vasculares• Liquido cefalo-raquidiano.

UrinaConsiderações Gerais• Nunca colher urina de arrastadeira, urinol ou saco de algália.• Não enviar pontas de algália.• Não colocar os dedos no interior do recipiente• Enviar a urina o mais rapidamente possível para o laboratório.

Semear até uma hora após a colheita ou refrigerar até 24 horas. Métodos de colheita• Jacto médio• Punção de catéter urinário• Punção supra-púbica• Saco colector em crianças

Colheita do jacto médio – Mulher

  1) Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos;

2) Com uma das mãos, afastar os grandes lábios e manter essa posição durante toda a colheita;

3) Com compressas embebidas em água e sabão (não utilizar anti-sépticos, pois podem inibir o crescimento dos microrganismos), proceder à lavagem da vulva da frente para trás, com uma compressa de cada vez, repetir a operação três vezes;

4) Usando o mesmo processo, lavar só com água esterilizada e secar;

5) Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20cm3 para recipiente esterilizado de boca larga.

Colheita do jacto médio – Homem

1) Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos;2) Afastar o prepúcio e manter essa posição durante toda a colheita;3) Limpar a glande com compressas embebidas em água e sabão4) Usando o mesmo processo, lavar agora só com água esterilizada e

secar; 5)Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm3

para recipiente esterilizado de boca larga. 

Punção de catéter urinário - Doente algaliado

• Clampar a algália durante 10-15 minutos;• Desinfectar com álcool a 70º a porção distal da

algália;• Com agulha e seringa estéreis aspirar a urina;• Transferir a urina para recipiente esterilizado.

Punção supra-púbica

• Doente com bexiga cheia;• Desinfectar a pele da região supra-púbica com a

solução anti-séptica segundo a política de anti-sépticos do hospital;

• Com agulha e seringa estéreis, puncionar a pele e bexiga ao nível do 1/3 inferior da linha que une o umbigo à sínfise púbica;

• Aspirar a urina e colocá-la em recipiente esterililizado.

Na criança sem controlo dos esfíncteres

• Lavar muito bem com água e sabão toda a área genital;

• Limpar com água esterilizada;Secar com compressa esterilizada;

• Aplicar um saco autocolante estéril;• Se, ao fim de 30 minutos não tiver urinado, retirar o

saco e repetir todo o procedimento anterior;• Transferir a urina para recipiente esterilizado.

Microrganismos mais frequentemente isolados na urina:– E.coli, Proteus mirabilis, Klebsiella

pneumoniae– Enterococcus faecalis, Staphylococcus

saprophyticus, Staphylococuus aureus– Candida albicans– Pseudomonas aeruginosa

Exsudado vaginal / uretral

• Exsudado vaginal:Colheita efectuada para pesquisa de Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Candidas e Trichomonas vaginalis.

• Exsudado uretral: Neisseria gonorrhoeae• Raspado células epiteliais: Chlamydia

trachomatis e Mycoplasmas genitais

Colher com espéculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiológico estéril;

Com uma zaragatoa de alginato de cálcio ou dacron colher a amostra da zona de maior exsudado ou do fundo de saco vaginal posterior. Repetir a operação com uma 2ª zaragatoa. - Uma das zaragatoas destina-se à execução do esfregaço a realizar no acto da colheita. A outra zaragatoa deve colocar-se em meio de transporte com carvão, que se deve manter à temperatura ambiente.

Exsudado vaginal

Exsudado uretralA amostra deve colher-se antes da 1ª micção da manhã.

Se não fôr possível, esperar pelo menos uma hora após a última micção;

Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada; Introduzir uma zaragatoa fina e flexível até 2 cm dentro da uretra. Recolher o exsudado com um movimento de rotação para o exame directo a realizar no acto da colheita. Repetir a operação com uma 2ª zaragatoa para o exame cultural, que se deve introduzir em meio de transporte com carvão e manter à temperatura ambiente.

 

Exsudado vaginalPesquisa de Chlamydia

• Os métodos culturais são mais sensíveis e específicos, mas devido à sua complexidade e custo não são efectuados na rotina da maior parte dos laboratórios.

• Os métodos não culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antigénios, ác. nucleicos, por técnicas de imunofluorescência directa, EIA ou sondas de ác. nucleicos.

• As amostras adequadas não são as secreções, mas sim os raspados, já que a Chlamydia trachomatis se encontra nas células do epitélio cilíndrico. Não são adequadas amostras vaginais.

Exsudado vaginal Pesquisa de Chlamydia

Esfregaço endocervical• Remover o excesso de muco com zaragatoa

de alginato de cálcio ou dacron; • Inserir uma nova zaragatoa no canal

endocervical e rodar; • Evitar contacto com a mucosa vaginal;• Transportar e conservar a amostra de acordo

com a informação comercial utilizada

Exsudado uretralPesquisa de Chlamydia

Esfregaço uretral:• Limpar qualquer exsudado;• Inserir uma zaragatoa fina 2 a 4 cm na

uretra e rodar;• Restantes procedimentos iguais ao

exsudado endocervical.O doente não deve urinar pelo menos 1 hora

antes da colheita

Exsudado vaginal /uretralPesquisa de Mycoplasma /Ureoplasma

• Remover o excesso de muco• Inserir a zaragatoa e colher a amostra por

raspagem vaginal ou uretral• Colocar a zaragatoa no frasco com meio de

transporte• Enviar de imediato para o laboratório.

Pesquisa de Streptococcus - hemolitico do grupo B

• Na gravida entre a 35ª - 37ª semana de gestação.

• É uma pesquisa de colonização para prevenção da sépsis neonatal precoce e importante para instituição pa profilaxia antibiótica na altura do parto.

Pesquisa de Streptococcus - hemolitico do grupo B

• Colheita:– Com zaragatoa colher uma amostra no terço

inferior da vagina, com outra zaragatoa colher amostra no recto.

– Colocar as zaragatoas em meio de transporte sem carvão que se deve manter à temperatura ambiente.

– Enviar de imediato para o laboratório.

Infecções respiratórias altas

• Exsudado faringeo: Streptococcus - hemoliticos dos grupos A, C e G. Se solicitado pode ser efectuada a pesquisa de Arcanobacterium hemolyticum, Angina de Vincent, Corynebacterium diphteriae, Bordetella pertussis e N. gonorrhoea e N. meningitidis para despiste de portadores.

• Exsudado nasal: portadores de S. aureus meticilina resistente.

Infecções respiratórias altasExsudado faringeo

• Não obter amostra se existir inflamação da epiglote, pois pode causar espasmos com consequente obstrução respiratória;

• Baixar a língua com espátula;• Colher com zaragatoa apropriada ao microrganismo a

pesquisar, entre os pilares e por detrás da úvula – faringe posterior, amígdalas e qualquer área inflamada ou ulcerada. (Evitar tocar nas bochechas, língua, úvula ou lábios);

• Enviar no meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

Infecções respiratórias altasExsudado nasal

Inserir uma zaragatoa estéril em cada narina até encontrar resistência (mais ou menos a nível dos cornetos);Rodar a zaragatoa contra a mucosa nasal;Colocar no meio de transporte.

Infecções respiratórias baixasExpectoração

• Pesquisa de: Streptococcus pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. aureus.

• Pesquisa de Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasna pneumoniae por detecção do antigénio ou de anticorpos.

Infecções respiratórias baixasExpectoração

• Preferir a 1ª amostra da manhã em jejum. Lavar a boca e gargarejar só com água antes de iniciar a colheita;

• Instruir o doente para colher expectoração por tosse profunda e não saliva ou secreções nasais;

• Colher o produto em recipiente esterilizado, de boca larga e que feche herméticamente.

 

Infecções respiratórias baixasExpectoração

Se o doente não conseguir expectorar esta pode ser induzida por:

- Cinesioterapia respiratória. - Nebulização efectuada apenas com NaCl

0,85% (inalar 20 a 30 ml de uma solução de 3- 10% de NaCl 0,85% em H2O.

Aparelho gastro-intestinal

Fezes – Exame Bacteriológico:

Despiste por rotina de Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter jejunii/coli. Em certos casos e após contacto com o Laboratório: Yersinia enterocolítica,Vibrio, E.coli enterotoxigénica e Aeromonas hidrophyla. O despiste de C. difficile é efectuado sempre que solicitado sendo as fezes colhidas sem meio de transporte.

Fezes• Colheita: colher para um recipiente limpo e

seco e transferir uma porção do tamanho de uma noz com muco, pús ou sangue para um recipiente com meio de transporte apropriado (meio de Cary-Blair ou meio com glicerol)

• Não são válidas amostras contaminadas com urina.

FezesExame parasitológico:  • Despiste, por rotina, dos parasitas mais habituais

entre nós. Para pesquisa de parasitas mais raros consultar o laboratório de microbiologia.

• A pesquisa de Cryptosporidium spp só se justifica em doentes imunocomprometidos e crianças em casos de diarreia comprovada.

É aconselhada a colheita de 3 amostras com 1 ou 2 dias de intervalo.

Colheita para recipiente limpo e seco.No caso de fezes muito líquidas, colocar cerca de 5-10

ml de fezes em recipiente limpo e seco.No caso de fezes semi-moldadas, colocar uma porção do

tamanho de uma noz em recipiente limpo e seco.

FezesExame parasitológico

Hemoculturas

Número e “timing” das colheitas:• Habitualmente são suficientes 3 hemoculturas em 24 horas,

colhidas separadamente, sendo o intervalo entre as colheitas variável conforme a situação do doente ou a urgência do início de administração de antibióticos. Um só frasco pode levar a que uma bacteriémia intermitente não seja diagnosticada assim como pode dificultar a interpretação do significado clínico de certos microrganismos isolados.

• Sépsis aguda: Três frascos de hemocultura colhidos separadamente e em locais diferentes antes de iniciar a terapêutica antibiótica

Hemoculturas• Endocardite aguda - Obter três frascos de hemocultura por

3 punções venosas com 1-2 horas de intervalo e iniciar a terapêutica.

• Endocardite subaguda - Três frascos de hemocultura no 1º dia (intervalos de mais ou menos 15 minutos). Se 24 horas depois forem negativas, obter mais três..

• Febre de etiologia desconhecida (SFI): Obter três frascos de hemocultura com, pelo menos, 1 hora de intervalo. Se estes são negativos 24-36 horas depois, colher mais duas hemoculturas com 1 hora de intervalo.(A informação obtida com mais de quatro hemoculturas é mínima.)

Hemoculturas• O volume de sangue é crítico, porque a

concentração de microrganismos na maioria das bacteriémias é baixa, especialmente se o doente já está com antibioterapia. Nas crianças a concentração de microrganismos durante as bacteriémias é maior que nos adultos pelo que é necessário menos sangue.

•  O volume de sangue a colher e recomendado é:  Crianças 1 - 5 ml por punção venosa Adultos 10 – 30ml por punção venosa

HemoculturasSeleccionar a veia periférica a puncionar.Desinfectar o local da punção com álcool a 70% de modo concêntrico e do interior para a

periferia. Repetir a operação com tintura de iodo a 2%, ou seguir a política de anti-sépticos do

hospital;Deixar o desinfectante secar; Nota: Não palpar a veia após a desinfecção da pele e antes de inserir a agulha, se isto

acontecer repita todo o processo de desinfecção. Desinfectar a rolha de borracha do frasco com álcool. Aspirar o sangue e inocular os frascos (sem mudar de agulha);Após a colheita, limpar a pele dos restos de iodo com álcool, para prevenir reacções

adversas ao iodo;Arrumar o material de colheita de acordo com as Recomendações Básicas.Se pretender pesquisa de Brucella spp indique-o claramente na requisição pois este exame

exige um tempo de incubação superior ao habitual. • Nunca refrigerar as hemoculturas.

Hemoculturas

• O volume de sangue a introduzir em cada frasco depende do volume de meio existente no frasco. A diluição final deve ser de 1: 5 a l:10. Habitualmente os frascos comercializados mencionam a quantidade de sangue a introduzir ou, então, a quantidade de meio existente no frasco.

Cateteres intravasculares• O envio de catéter para exame bacteriológico só é

aconselhado se existirem sinais de infecção relacionadas com o catéter.

•  A técnica utilizada é a de Maki, assim:• Antes de retirar o catéter colher sangue para hemocultura de

uma veia periférica, pois só assim será possível valorizar o exame cultural do catéter;

• Desinfectar a pele em redor do catéter, utilizando um anti-séptico de acordo com a política de anti-sépticos do hospital;

• Retirar o catéter;• Cortar assepticamente cerca de 3-5 cm da porção terminal do

catéter e colocá-lo em recipiente esterilizado.

Liquido céfalo-raquidianoPunção Lombar: • Desinfectar o local de colheita com uma solução anti-séptica e

álcool, de acordo com a política de anti-sépticos do hospital;• Inserir a agulha com o mandril. Quando o espaço

subaracnoideu fôr atingido remover o mandril, o fluido espinal aparecerá na agulha;

• Recolher o líquor para tubo esterilizado de centrífuga com encerramento hermético. Habitualmente são necessários três tubos, que devem ser numerados;

• De imediato enviar o líquor ao laboratório. Nunca refrigirar o LCR.

Nota: Devem realizar-se simultâneamente hemoculturas.