MTODOS PARA DETERMINAR EL ESTUDIO DE LOS VIRUS
Tradicionalmente, el diagnstico de las infecciones vricas so ha
considerado complejo debido a la imposibilidad de efectuar un
examen directo por microscopa convencional y porque el aislamiento
de los virus debe realizarse en lneas celulares, cuyo mantenimiento
es laborioso y requiere experiencia. Por otra parte, la serologa
aporta resultados tardos, ya que, para poder efectuar el diagnstico
de modo inequvoco, se requiere la comparacin del resultado de dos
sueros: uno obtenido en una fase precoz de la enfermedad y otro en
el perodo de convalecencia.
Este contexto tradicional ha ido modificndose por la aplicacin
de tcnicas de examen microscpico relativamente asequibles y
eficaces, como la inmunofluorescencia, que constituye una tcnica de
examen directo del material clnico a travs de la deteccin de los
anlgenos vricos en las clulas infectadas, as como por la
introduccin progresiva de otras pruebas para la deteccin de
antgenos (inmunoenzimticas y otras); adems, la utilizacin de sondas
y, sobre todo, de tcnicas de amplificacin genmica lia incrementado
las posibilidades de diagnstico y permite suplir, en parle, el
cultivo celular.
Sin duda, uno de los campos donde las tcnicas de amplificacin
genmica han sido ms tiles es el del diagnstico urolgico, tanto para
la deteccin de un como para su cuantificacin, dato cjue resulta til
para determinar el estado actual y el pronstico de las infecciones
causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana, el
citomegalovirus, el virus de Kpstein-Barr y los virus de la
hepatitis.
A pesar de las limitaciones propias de la tecnologa tradicional,
hay ocasiones en que el aislamiento de un virus en cultivo celular
poseo inters porque no existen otras tcnicas asequibles para su
deteccin, porque la rapidez, del resultado lo hace eficiente
(herpes simple), porque pennite estudiar las caractersticas
antignicas del virus (gripe) o para disponer de la cepa en estudios
de sensibilidad (citomegalovirus), tipado y epidemiologa.
La toma de las muestras para estudio virolgico debe efectuarse
segn el cuadro clnico y el procedimiento diagnstico que vaya a
utilizarse. En las faringitis, conjuntivitis lceras cutneas, etc.,
la muestra debe tomarse de la lesin con un escobilln despus de
limpiar y eliminar el exudado si existe, con el objeto de recoger
el mximo nmero de clulas. Este material debe introducirse en un
tubo con medio de transporte como ln solucin salina de Hank o
Earle, y, si no es posible, deben utilizarse escobillones con un
medio de transporte para virus'.
El material del aspirado nasofarngeo o el lavado bronco alveolar
ha de sembrarse de inmediato o guardarse en la nevera sin medio de
transporte o conservante. Los lquidos orgnicos (lquido
cefalorraqudeo, pericrdico, amnitico, etc.) se ponen en un lubo
estril con tapn de rosca sin medio de transporte ni conservante y
se mantienen en la nevera hasta su procesamiento.
MTODO DIRECTO
Microscopa ptica
Las tinciones citolgicas convencionales, como la
hematoxilina-eosina, permiten la observacin de los cuerpos de
inclusin en las clulas de las muestras clnicas. As sucedo en las
muestras de orina, en las que puede detectarse el citomegalovirus
en las clulas del tracto urinario o en las lesiones vesiculares
cutneo mucosas, donde puede visualizarse el virus del herpes simple
o el de la varicela. Sin embargo, esto procedimiento en la prctica
slo se ha introducido para el diagnstico de la infeccin cutnea por
virus herpticos (Tcnica de Tzanck); en la actualidad se prefieren
las tcnicas microscpicas de inmunofluorescencia por su mayor
sensibilidad y su mayor especificidad.
Microscopa de fluorescencia
La utilizacin de anticuerpos marcados con fluorescena dirigidos
contra los antgenos de un virus permite observar mediante el
microscopio de fluorescencia las clulas de los tejidos infectadas
con el virus. Es una tcnica de deteccin de antgono, y a la vez un
examen microscpico directo. Aparte de los virus HHV 1,2 y 3, esta
tcnica permite detectar eficazmente los virus de la gripe, virus
respiratorio sincitial, para influenza y adenovirus en las muestras
respiratorias, y el citomegalovirus en la sangre'. Las clulas
presentan fluorescencia con un patrn caracterstico para los
diferentes virus detectados.
Microscopa electrnica
La disposicin de microscopios electrnicos de manejo
relativamente sencillo ha permitido el diagnstico rpido de
infecciones vesiculares como el herpes, la varicela, y, sobre todo,
de las infecciones intestinales por rotavirus, calicivirus y otros
virus enteros patgenos. El tratamiento con anticuerpos especficos
de algunas muestras, en particular las heces, antes de observarlas
al microscopio electrnico, facilita la aglutinacin y agregacin de
las partculas vricas y. por tanto, su visualizacin
(inmunomicroscopa electrnica). Estas tcnicas de microscopa
electrnica no se han introducido en la rutina de los laboratorios
de microbiologa clnica, pero se utilizan en centros
especializados.
Cultivo: Aislamiento en cultivos celulares
Los virus no pueden multiplicarse en medios de cultivo
convencionales como los utilizados en bacteriologa y slo se
multiplican en el interior de las clulas. Por ello, para conseguir
el aislamiento y la propagacin de un virus a partir de una muestra
clnica, sta debe inocularse a cultivos celulares, que son clulas
vivas mantenidas in vitro, y en algn caso al embrin de pollo, al
ratn lactante u otros animales. Los cultivos celulares son el
sistema empleado habitualmente para el aislamiento de los virus en
los laboratorios de microbiologa clnica.
MTODOS INDIRECTOSSon aquellos que reconocen la respuesta inmune
(humoral o celular) por parte del husped: Deteccin de anticuerpos
especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB,
etc.). Produccin de anticuerpos in vitro.En el curso de una
infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente al agente
infectante. La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos
cuatro veces o ms observado en dos muestras pareadas de suero. La
primera muestra se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad y la
segunda, 15 a 21 das despus de la primera, en el perodo de
convalecencia.La seroconversin es til para establecer el diagnstico
retrospectivo, pero no para el diagnstico temprano de una infeccin,
puesto que debemos esperar al perodo de convalecencia para obtener
la segunda muestra del suero.Este tipo de diagnstico es til para
estudios epidemiolgicos. Las diferencias de ttulos deben ser
mayores de cuatro veces para tener valor estadstico y se debera
estudiar ambas muestras simultneamente.Las determinaciones
serolgicas tambin nos pueden informar sobre el estado inmune del
paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas,
sarampin y rubola, donde la presencia de anticuerpos especficos
indica que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y
que es inmune para una nueva infeccin.A veces el diagnstico
serolgico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en
recin nacidos para identificar la causa de una infeccin congnita.
La evaluacin de los resultados en este caso es difcil porque los
ensayos serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG
presente en el suero del nio provino de la madre por va
transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de la
IgG de la madre.Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades
virales congnitas se realiza mediante determinaciones seriadas de
IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica que
los anticuerpos eran maternos y que el nio no est infectado. El
aumento en el ttulo de anticuerpos indica que el nio esta
produciendo anticuerpos y por lo tanto esta infectado. Los mtodos
tradicionales para el diagnstico serolgico de las infecciones
virales incluyen: la neutralizacin, la inhibicin de la
hemaglutinacin (IHA) y la hemaglutinacin indirecta (HAI). La
confirmacin serolgica de una infeccin aguda por cualquiera de estas
tcnicas tradicionales esta dada por un aumento de cuatro veces o
mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al
doble seriadas.En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos
para la deteccin de anticuerpos virales, y en muchos casos han
demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en trminos de
economa, sensibilidad, especificidad y rapidez.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)La IFI, es un mtodo rpido y
confiable para la determinacin de anticuerpos antivirales en el
suero del paciente. Se basa en la unin de anticuerpos antivirales
presentes en el suero del paciente a los antgenos virales
expresados en la superficie y citoplasma de clulas infectadas, que
han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de
especificidad se usan clulas no infectadas.El procedimiento es el
que sigue: Se incuba el suero del paciente con las clulas
infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se
agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con
isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es
una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz
ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado se
unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva,
leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia
de Ac se evidencia por la aparicin de fluorescencia en el
citoplasma y superficie de las clulas infectadas, mientras que las
clulas control no fluorescen.ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO
(EIA)Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los
ltimos aos al diagnstico de anticuerpos virales. Tiene las ventajas
de ser un mtodo verstil, relativamente econmico, sensible y de
lectura objetiva (instrumental).La metodologa es la siguiente: Los
antgenos virales se inmovilizan sobre una fase slida (esferita,
policubetas para micro titulacin u otros elementos de plstico) y se
agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la
reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina anti especie
conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para
esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotmetro y en
algunos casos de forma visual.PRODUCCIN DE ANTICUERPOS IN VITROSe
trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el diagnstico
de la infeccin perinatal. Este procedimiento revela la presencia de
anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los
linfocitos B extrados de sangre total, lo que indicara que el
sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.La
produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en
el diagnstico temprano de nios infectados por VIH.BibliografaPrats
Guillem. (2005) Microbiologa Clnica. Editorial Mdica Panamericana.
Buenos Aires, Argentina, 400 pginas. Web-
grafahttp://www.biologia.edu.ar/viruslocal/diagnostico%20viral.htm
