UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “CAROL DAVILA” BUCUREŞTI

Facultatea de Medicină Departamentul 12

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

MEMBRANA AMNIOTICĂ UMANĂ ÎN

TRATAMENTUL PATOLOGIEI SUPRAFEȚEI

OCULARE LA ADULT.

NOI PERSPECTIVE.

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

Prof. Univ. Dr. Liliana Voinea

DOCTORAND

Dr. Alina Gheorghe

București

2016

MEMBRANA AMNIOTICĂ UMANĂ ÎN TRATAMENTUL

PATOLOGIEI SUPRAFEȚEI OCULARE LA ADULT. NOI

PERSPECTIVE.

Leland Kaiser, o autoritate consacrată a viitorologiei în SUA, scria în anul 1992:‘‘O nouă ramură a medicinii se va dezvolta în viitor, în încercarea de a schimba evoluția bolilor cronice și de a regenera țesuturile și organele. Viitorul poate fi reinventat și prevenit.“ Aceasta era prima considerație despre medicina regenerativă, devenită o realitate contemporană.1Cercetările actuale din domeniu includ tehnologii bazate pe biologia celulelor stem embrionare, inginerie tisulară, microsisteme bio-artificiale, transplant de membrană amniotică umană,- oferind speranțe reale de conservare a funcției vizuale în boli grave ale suprafeței oculare.2

Membrana amniotică este un material biologic al placentei umane, constituind peretele intern al membranelor fetale.4 Ea are o parte fetală- corionul și o componentă maternă- decidua.Anatomic este alcătuită din epiteliu monostratificat, membrană bazală, bogată în colagen și stromă. Celulele epiteliale amniotice au calități care fac din ele o sursă foarte bună de celule stem. Astfel, studiile au demonstrat că aceste celule au caracteristici “stem-like”, deoarece exprimă markeri celulari de suprafață asociați celulelor stem embionare (precum SSEA 3 și SSEA 4), TRA -1-60 și TRA 1-81. Foarte interesant este de asemenea faptul că aceste celule exprimă factori de transcripție specifici celulelor stem pluripotente, cum ar fi Oct-4 (“octamer binding transcription factor”), ceea ce sugerează capacitatea pluripotentă de diferențiere.9,10,11,12

Folosită pentru prima dată în chirurgia reconstructivă de DeRott3, în 1940, abia Kim și Tseng, după anii 1990,stabilesc rolul său important în patologia oftalmologică, folosind membrana amniotică pentru vindecarea unui ulcer corneean. Transplantul de membrană amniotică poate fi utilizat fie cu rol de grefon, pentru înlocuirea țesuturilor distruse de la nivelul suprafeței oculare, fie ca patch tisular pentru prevenirea extinderii inflamației 7,8. Mecanismele de acțiune sunt: antiinflamator, antiangiogenic, facilitator al epitelizării. De asemenea, prin similaritatea biologică dintre conjunctivă și membrana bazală amniotică, aceasta din urmă poate constitui o matrice pentru dezvoltarea celulelor epiteliale, susținându-le diferențierea și nutriția și prelungindu-le durata de viață. Membrană amniotică funcționează ca un substrat pentru expansiunea celulelor stem, cu implicații în tratamentul deficitului de celule stem limbice de diferite etiologii și în facilitarea epitelizării ulcerelor corneene severe cu distrucție epitelială și stromală. 7,8

Restaurarea homeostaziei suprafeței oculare după afecțiuni severe este o provocare datorită complexității sale, care necesită atât chirurgie reconstructivă, cât și modularea mecanismelor celulare ale inflamației, cicatrizării și regenerării tisulare in vitro.

Indicațiile terapeutice actuale ale membranei amniotice în oftalmologie sunt: arsurile corneo-conjunctivale termice sau chimice, ulcerul cornean, eroziuni corneene recurente, keratopatia

1

neurotrofică cu defecte epiteliale persistente, pterigion, keratopatia de expunere, sindromul Stevens-Johnson, pemfigoid cicatricial, keratita microbiană severă, keratopatia post-iradiere, keratopatia din sindromul de ochi uscat sever și alte patologii ce converg către insuficiența de celule stem limbice4,5.

Suprafața oculară este o componentă esențială a vederii. Suprafața oculară este o entitate funcțională complexă, un tot unitar ce decurge firesc din unitatea funcțională a componentelor sale. Aceste elemente sunt: conjunctiva, corneea, limbul, sistemul limfoid asociat conjunctivei, pleoapele, glandele lacrimale, filmul lacrimal, sistemul de drenaj lacrimal, nervii senzitivi și corneeni, interconectate prin continuitatea epiteliilor, a inervației, a sistemului vascular, imunologic și endocrin.

Pe scurt, suprafața oculară reprezintă un ansamblu anatomic format din trei structuri contigue : conjunctiva, limbul și corneea.

Limbul reprezintă bariera anatomică dintre corneea transparentă și avasculară și sclera acoperită de conjunctiva bogat vascularizată. Este zona de tranziție dintre epiteliul cornean și epiteliul conjunctivei bulbare. Practic, există trei moduri în care limbul poate fi descris: anatomic, histologic și chirurgical.42

Epiteliul limbic este un epiteliu de tranziție între două zone diferite biologic: zona conjunctivală, vascularizată și bogată în elemente limfoide și zona corneeană, avasculară și bogat inervată.43 La acest nivel, epiteliul și stroma conjunctivală sunt organizate în formațiuni papilare asemănătoare papilelor dermice, orientate radiar și denumite palisade Vogt (0,5 mm/ 2-4 mm). Vase sanguine fine, nervi și vase limfatice străbat palisadele, în interiorul cărora se află celulele-stem corneene.44,45,46,47

Regenerarea epiteliului corneean depinde de aceste celule stem.48 Termenul a fost introdus de Till și McCulloch50 și definește celule cu potențial auto-regenerativ și de diferențiere în toate tipurile celulare51. Teoria celulelor stem limbice a modificat în mod crucial abordarea terapeutică a patologiilor suprafeței oculare la om, distrucțiile suprafeței oculare de diferite etiologii (inflamații, arsuri, traumatisme, excizii extinse) putând fi tratate prin auto- sau allo-grefe de celule stem limbice, toate pe suport de membrană amniotică54. Celule stem limbice previn invadarea epiteliului cornean de către cel conjunctival, asigurând transparența corneei. Epiteliul cornean conține keratina 3 (K3/K12)46 iar celulele epiteliului conjunctival conțin keratina 19 și keratina 7 (K7/K16)54 . Gradul diferențierii celulare poate fi evaluat prin markeri celulari specifici, acești markeri putând fi utilizați în demonstrarea sindromului insuficienței de celule sușă limbice. Detectarea în celulele epiteliului cornean a transcripției de MUC5AC prin reacția în lanț a polimerazei este o metodă de diagnostic molecular al insuficienței de celule stem limbice. În cazul distrucției tuturor celulelor stem limbice, epiteliul conjunctival l-ar înlocui pe cel cornean, corneea devenind opacă. Acest lucru demonstrează faptul că limbul este implicat în mod esențial în reglarea diferențierii epiteliului cornean.43 Disfuncția reglatoare a diferențierii celulare apărută în insuficiența celulelor stem limbice

2

duce fie la metaplazia epiteliului cornean (caz în care epiteliul cornean se poate „conjunctivaliza” sau „epidermiza”), fie la displazia acestuia cu producerea carcinogenezei55.

Conjunctiva și corneea răspund în mod foarte diferit agresiunilor la care sunt expuse (mecanice, microbiene, toxice): conjunctiva este hiperactivă imunologic, în schimb corneea beneficiază de așa-numitul privilegiu imunologic și de inhibiția reacțiilor inflamatorii- în scopul conservării transparenței sale. Reacțiile imunologice de la nivelul suprafeței oculare se realizează printr-o rețea complexă de celule inflamatorii, citokine și chimiokine. Există un dublu sistem inunitar: înnăscut și dobândit, care funcționează complementar și /sau intricat.56,57

Deficitul de celule stem limbice este o afecțiune oftalmologică complexă, care însoțește o serie de condiții patologice congenitale sau dobândite, având drept efect disfuncționalitatea totală sau parțială a acestor celule. Răsunetul clinic al deficitului de celule stem limbice corneene derivă din această disfuncționalitate, cu efecte dintre cele mai severe asupra integrității corneei și a întregii suprafețe oculare.48,51 Etiologia deficitului de celule stem limbice este variată; de la agresiuni chimice, termice, mecanice ale limbului( arsuri, chirurgii multiple, agenți antimitotici, sindrom de ochi uscat,etc), la infecții (ulcer recurent) , inflamații cronice, neoplazii, distrucția matricei corneene( keratita neurotrofică)52,77. Ulcerul corneean cronic și neovascularizația corneeană sunt complicațiile principale ale deficitului de celule stem limbice.

Transplantul de membrană amniotică acționează în insuficiența de celule stem limbice prin mai multe mecanisme: a)prelungește durata de viață și menține clonogenicitatea celulelor epiteliale progenitoare; b)favorizează diferențierea celulelor epiteliale, cu evitarea diferențierii în celule caliciforme; c)favorizează diferențierea celulelor caliciforme în prezența fibroblașilor conjunctivali; d)inhibă celulele inflamatorii cu activitate antiproteazică; e)suprimă sistemul de semnalizare moleculară al TGF-beta și diferențierea fibroblașilor normali în miofibroblaști66.

Partea specială a tezei de doctorat demonstrează printr-un studiu experimetal proprietățile benefice ale membranei amniotice la nivel ocular iar printr-un studiu clinico statistic aplicațiile clinice ale membranei amniotice. Cele mai bune rezultate, vizuale și simptomatice se obțin într-o fază acută a bolilor studiate sau înainte ca insufuciența de celule stem limbice să fie extinsă.

Materialul amniotic are numeroase proprietăți:

antiinflamatorii: membrana amniotică produce inhibitori naturali aimetaloproteinazelor și suprimă citokinele pro-inflamatorii IL1- alfa și IL1-beta30,31,32,33; de asemenea, membrana amniotică induce apoptoza celulelor inflamatorii în cazul arsurilor chimice ale suprafeței oculare34.

antimicrobiene: membran aamniotică produce beta defensine și inhibitori de proteinaze, aderând strâns la suprafața lezată și constituind o barieră împotriva mediului exterior35,36,37,38,39;

3

antifibrotice și antiadezive: membrana amniotică secretă inhibitorul tisular al metaloproteinazei, care inhibă activitatea proteazei, cu reducerea fibrozeitisulare; de asemenea, prin inhibarea TGF beta se obține inactivarea fibroblaștilor, ceea ce previne formarea de aderențe între suprafețele tisularelezate40,41,42,43,44;

inerția imunologică și nivelul redus de antigenicitate: acestea se traduc prin expresia foarte redusă a antigenelor de histocompatibilitate HLA, B, CDR, beta 2 microglobulina și prin proprietățile unice de suprafață și biochimice ale membranelor placentare, care nu exprimă clasa de antigene de histocompatibilitate MHC II27,28,45,46,47;

analgezice: reducerea rapidă a durerii prin acoperirea eficientă a terminațiilor nervoase48

antiangiogenice: celulele epiteliale ale membranei amniotice exprimă molecule antiangiogenice, precum thrompospondina-1 și endostatina; de asemenea, la nivelul celulelor epiteliale amniotice au mai fost izolați inhibitori de metaloproteinaze: timp 1,2,3,4; la nivelul membranei bazale amniotice a fost identificat factorul derivat din epiteliul pigmentar (pigment epithelial derived factor-PEDF), cu puternice proprietăți anti-angiogenice; studii recente au evidențiat faptul că antiangiogenetic al membranei amniotice poate fi influențat de prezența inflamației și de tipul patologiei23,33,49,50

protectoare împotriva pierderii de fludide și proteine: matricea colagenică reprezintă un bun suport pentru migrare și proliferare celulară;

Promotoare ale diferențierii și a deziunii celulare, prin conținutul de colagen de tip IV, V și VII51;

Favorizarea epitelizării, prin mai multe mecanisme:

a) Membrana bazală amniotică reprezintă suportul pentru creșterea celulelor epiteliale și menținerea funcționalității acestora;

b) La nivelul membranei amniotice este facilitată migrarea și diferențierea celulelor epiteliale;

c) Membrana bazală amniotică, bogată în colagen, reprezintă un foarte bun substrat pentru re-epitelizare;

d) la nivelul membranei amniotice sunt exprimați mai mulți factori de creștere: KGF (factor de creștere prezent în faza de epitelizare a vindecării plăgilor, atunci când keratinocitele acoperă plaga; b-FGF (factor de creștere implicat în angiogeneză, vindecarea plăgilor, dezvoltarea embrionului); HGF (factor de creștere care reglează creșterea, motilitatea și morfogeneza celulară); TGF-beta (factor de creștere care controlează proliferarea și defierențierea celulară)51,52,53,54,55.

Studiul experimental, efectuat pe iepuri de laborator, în conformitate cu toate prevederile legale, demostrează aceste proprietăți.

4

Animalele de studiu au fost împărțite în loturi egale pe cele trei studii. În cadrul primului studiu se evaluează efectul transplantului de membrană amniotică asupra scarificărilor corneene experimental induse, în cadrul studiului II asupra arsurilor chimice și în cadrul studiului III asupra ulcerelor corneene bacteriene. De asemenea se compară efectul membranei amniotice cu efectul tratamentul medicamentos asupra leziunilor induse sau chiar a absenței lui.

Poza 1. Leziune mecanică indusă

Poza 2. Plasarea blefaro statului după toaletarea atentă a fundurilor de sac și leziunilor suprafeței

oculare

Poza 3. Aspect intraoperator

Poza 4. Sutura membranei amniotice la nivelul

suprafeței oculare

Poza 5. Cultură MRSA pe geloză sânge

Poza 6. Secreții conjunctivale și ulcer corneean

după inocul cu MRSA

5

În cadrul studiului I, eșantioanele histologice examinate arată o tendință defectuoasă de epitelizare și fibrozare a stromei în cazul lotului cu scarificare și tratament medicamentos comparativ cu lotul unde s-a efectuat transplant de membrană amniotică și unde se constată o repopulare celulară prin stromă amniotică, cu celule precursoare.

Poza 7. Aspect histopatologic al leziunii induse

mecanic și tratate medicamentos

Poza 8. Leziune prin scarificare și transplant

membană amniotică- detaliu

Studiul II confirmă efectul proepitelizant al membranei amniotice evidențiindu-se straturi de celule unite între ele ce umplu golurile lăsate de plăgile produse în epiteliu. De asemenea, stratul regenerator este alcătuit din nuclei cu formă și structură variabilă, uneori în mitoză.

Poza 9. Infiltrat inflamator cronic abundent după

arsură chimică

Poza 10. Aspecte histologice ale tratamentului

chirurgical al arsurii bazice

După apariția ulcerului corneean cu hipopion, în cadrul studiului III, se evidențiează efectul antinflamator și antibacterian al membranei amniotice. Astfel prin comparație cupele histologice din

6

lotul de animale tratate chirurgical arată un detritus celular scăzut și un singur rând de nuclei picnotici raportat la lotul tratat medicamentos unde infiltratul inflamator polimorf este abundent.

Poza 11. Cupă histologică reprezentând suprainfecție corneană postscarificare

Poza 12.Evoluție favorabilă secundară tratamentului

chirurgical

Studiul clinico statistic este un studiu prospectiv, analitic, descriptiv, de cohortă și terapeutic efectuat pe 77 de pacienți, cu boli ale suprafeței oculare. Aceștia sunt împărțiți, în funcție de diagnostic în 5 loturi. Tuturor pacienților li s-a efectuat tratament chirurgical cu membrană amniotică, fiind urmăriți și evaluați la 2 săptămâni, o lună, 3 luni și 6 luni postoperator în funcție de acuitatea vizuală și scoringul epiforei, senzației de corp străin, durerii oculare și statusului cosmetic.

Pacienții lotului A au suferit arsuri acide sau bazice, de gradul 2, 3 și 4, conform clasificării Dua195.Prognosticul formelor severe a fost mult ameliorat prin utilizarea precoce a membranei amniotice; aceasta fiind foarte bogată în factori de creștere: TGF beta1, TGF beta2, HGF, EGF. Factorii de creștere interacționează cu numeroase alte citokine, favorizând stimularea epitelizării și inhibiția fibrozei2,196,199,200. Transplantul se realizează prin plasarea membranei amniotice cu fața epitelială în jos, astfel încât EGF de la nivelul membranei bazale a epiteliului membranei amniotice să vină în contact direct cu celulele limbice viabile. Acest veritabil pansament tisular realizat de membrana amniotică are și rol de barieră față de celulele imunologice active, diminuând răspunsul imunologic, inhibând expresia interleukinelor IL-1 beta și IL-8 și producând proteine antiangiogenice7,23,201. Prevenirea insuficienței limbice este foarte importantă, debridarea tip epiteliectomie sectorială precoce a epiteliului conjunctival fiind recomandată în arsurile moderate/severe192.Membrana amniotică își relevă astfel un al doilea rol important în regenerarea suprafeței oculare, servind drept substrat pentru cultivarea ex vivo a celulelor stem limbice, recoltate prin prelevarea unui microfragment limbic (1mm X 3 mm). Celulele sunt cultivate pe membrană amniotică denudată, care se comportă ca o membrană bazală186,208.

Lotul B include pacienți cu defect epitelial persistent apărut spontan sau secundar unei afecțiuni oculare sau sistemice. De obicei, epiteliul cornean se vindecă rapid; există însă numeroși

7

factori care pot interfera cu procesul vindecării plăgilor epiteliului cornean: toxicitate medicamentoasă, boli sistemice asociate ( diabet zaharat), anomalii de poziție palpebrală etc286,287. În aceste cazuri membrana amniotică facilitează vindecarea epitelială și reduce vascularizația. Mecanismul de acțiune al membranei amniotice constă în favorizarea diferențierii celulare a celulelor stem limbice, cu inhibiția celulelor inflamatorii și a activității proteazelor, precum și în supresia diferențierii fibroblaștilor normali în miofibroblaști,având drept efect reducerea țesutului cicatricial și a neovaselor266,297,298,299.

Pacienții lotului C sunt diagnosticați cu pterigion; în studiu sunt incluși pacienți cu o formă de pterigion cu proliferare fibrovasculară rapidă, simptomatologie bogată și rată mare a recidivelor274. Trauma operatorie și inflamația stimulează fibroblaștii subconjunctivali și proliferarea vasculară277. Datorită biocompatibilității foarte bune cu suprafața oculară precum și datorită favorizării vindecării plăgii epiteliale conjunctivale, supresiei fibroblaștilor și reducerii producerii de matrice extracelulară, membrana amniotică este des utilizată278,279.

Tot datorită biocompatibilității bune cu suprafața oculară și proprietăților nutritive membrana amniotică se folosește, pentru reconstrucție și diminuarea inflamației postoperatorii și după excizia tumorilor corneo conjunctivale ( Lot D) .

În cazul ulcerelor corneene recurente sau neurotrofice ( Lotul E) se realizează un transplant multistratificat de membrană amniotică, cu rezultate favorabile, efectul fiind de restaurare sau îmbunătățire a grosimii stromale.

Analiza statistică a datelor ne arată că evoluția bolii și a tratamentului nu este semnificativ statistică în funcție de ochiul afectat, mediul de proveniență, tehnica chirurgicală folosită dar depinde de vârsta și sexul pacientului. Cei mai importanți parametrii urmăriți sunt acuitatea vizuală înainte și după tratament dar și îmbunătățirea sesizabilă a acuității vizuale ( definită ca o îmbunătățire a vederii de cel puțin 3 rânduri, conform tabelului Snellen) ; scoringul final și eficiența membranei amniotice. Acuitatea vizuală este cel mai important parametru studiat.Se constată o corelație semnificativ statistică între AV inițială și AV după tratament (p≤0.001). Media AV după tratament a fost variată pe loturi, găsindu-se astfel o relație semnificativ statistică între AV și distribuția pe loturi. Cele mai bune AV s-au înregistrat la pacienții loturilor B și C , și cea mai scăzută AV la pacienții lotului E.( Figura 1 și Figura 2)

8

Figura 1. AV a tuturor loturilor înainte de tratament

Figura 2. AV după tratament, pe loturi

Îmbunătățirea sesizabilă a AV s-a demostrat pentru loturile A și C, lotul E păstrând și aici

cele mai slabe rezultate.( Figura 3)

9

Figura 3. Îmbunătățirea sesizabilă a AV pe loturi

Statistic, evoluția tuturor simptomelor a fost favorabilă la 2săptămâni, 1, 3, 6 luni. Ce este interesant este că efectul benefic al membranei se instalează progresiv, mai ales pe parcursul primei luni, urmând ca apoi acesta să se mențină. O altă ipoteză ce derivă și din analiza statistică a datelor și explică faptul că ultima măsurătoare la 6 luni nu era necesară este că majoritatea pacienților devin pacienți vindecați mai devreme de acest interval de timp. (Figura 4)

Figura 4. Reprezentația procentuală a scoringului final în funcție de loturi

10

Scoring-ul final reprezintă o sinteză a efectelor transplantului de membrană amniotică. Evaluând atât acuitatea vizuală cât și scoring-ul chestionarului, pacienții sunt declarați vindecați, ameliorați sau cu o evoluție staționară.Se observă că majoritatea pacienților sunt vindecați ( 62,34%), 32.47 % sunt ameliorați iar 5.19 % rămân , după tratament, staționari.

Eficacitatea tratamentului este puternic corelată statistic ( p≤0.001) cu diagnosticul și faza tratamentului.( Figura 5)

Figura 5. Distribuția pacienților în funcție de scoring-ul final și eficiența ridicată a membranei amniotice

Analiza statistică a datelor ne-a demonstrat că membrana amniotică influențează pozitiv acuitatea vizuală și simptomatologia pacientului, dependente, evident, de diagnostic, de gravitatea leziunilor, de faza tratamentului dar și de așteptările pacientului.

De altfel, analiza predictibilității prin relația între sensibilitate și specificitate demonstrează că AV și scoringul sunt factori pozitivi de predictibilitate pentru eficiența membranei amniotice. A fost obținut la 1 luna un factor bun de predictibilitate(aria a avut valoarea de 0.854), iar la 3 luni a crescut pana la 0.880. (Figurile 6 – 7)

Se remarcă aproape o certitudine a predictibilități eficienței membranei amniotice în funcție de scoring-ul la 3 luni.

11

Figura 6. Predictibilitatea eficienței membranei amniotice în funcție de scoring-ul la 1 lună

Figura 7. Predictibilitatea eficienței membranei amniotice în funcție de scoring-ul la 3 luni

12

Ultimul studiu efectuat este studiul lotului martor. Alcătuit din 15 pacienți acesta urmărește și compară evoluția pacienților cu patologii ale suprafeței oculare tratați doar medicamentos, cu a celor ce au beneficiat de transplant de membrană amniotică. Se constată că pacienții tratați fără membrană amniotică au un timp de vindecare mai lung, au un risc și o rată mai mare de apariție a complicațiilor, de cicatrizare defectuoasă sau de recidivă.

Pe lângă concluzii, la final doresc să exemplific prin clișee fotografice câteva din cazurile particulare tratate prin transplant cu membrană amniotică.

Poza 13. Aspect biomicroscopic Ulcer Mooren

Poza 14. Colorație cu fluoresceină

Pacientă, în vârsta de 73 ani, diagnosticată cu ulcer Mooren (Poza 13 și Poza 14) și tratată pentru al doilea puseu inflamator, în cadrul bolii , cu membrană amniotică. (Poza 15)

Poza 15. Aspect biomicroscpic la 3 săptămâni de la intervenție

13

Pacient, în vârstă de 53 ani, se prezintă pentru scăderea AV, epiforă, senzație de corp străin, durere oculară și alterarea statusului cosmetic după arsură corneo-limbo-conjunctivală, cu substanță bazică în urma cu 7 luni. (Poza 16 și Poza 17)

Poza 16.Neovascularizație corneeană și infiltrat

inflamator

Poza 17. Aspect biomicroscopic 3 luni de la

intervenție

Așadar, membrana amniotică este un țesut unic prin biochimia sa. Din punct de vedere al lipsei imunogenicității este transplantul ideal; din punct de vedere al bogăției factorilor de creștere și a citokinelor, este un țesut care facilitează vindecarea; din punct de vedere al recoltării și tehnicii de transplant este accesibil. Toate aceste calități, pledează pentru utilizarea membranei amniotice în patologia severă a suprafeței oculare.

Concluzii finale

Suprafața oculară este una din țintele tehnologiilor de regenerare biologice și bio-artificiale. Progresele din ultimul timp au schimbat viziunea terapeutică și au oferit noi modalități de abordare a patologiei severe de la acest nivel.

Membrana amniotică, prin compoziția și complexitatea sa precum și prin proprietățile sale unice explică interesul deosebit al cercetătorilor mai ales prin implicațiile sale în medicina regenerativă.

Studiul pe animale de laborator pune în evidență proprietățile benefice ale membranei amniotice; antiinflamatorii, antimicrobiene, antifibrotice și antiadezive, analgezice și antiangiogenice. De asemenea membrana amniotică este promotor al diferențierii și adeziunii celulare, cu un nivel redus de antigenitate prin celule epiteliale de la nivelul epiteliului amniotic ce au calități stem- like.

14

Studiile făcute pe cele trei experimente sunt în conformitate cu legile în vigoare și cu acordul Comisiei de Etică a U.M.F Carol Davila.Examele histopatologice ale loturilor cu scarificare, cu arsură chimică și cu infectare bacteriană pun în evidență superioritatea tratamentului cu membrană amniotică față de cel medicamentos.

Astfel, eșantioanele histologice examinate arată o tendință defectuoasă de epitelizare și fibrozare a stromei în cazul loturilor ce au primit doar tratament medicamentos comparativ cu cele cu tratament cu membrană amniotică unde se constată o repopulare celulară prin stromă amniotică, cu celule precursoare, efectul proepitelizant al membranei amniotice evidențiindu-se histologic prin straturi de celule unite între ele ce umplu golurile lăsate de plăgile produse în epiteliu. De asemenea stratul regenerator este alcătuit din nuclei cu formă și structură variabilă, uneori în mitoză. După apariția ulcerului corneean cu hipopion cupele histologice arată detritus celular scăzut și un singur rând de nuclei picnotici raportat la lotul tratat medicamentos unde infiltratul inflamator polimorf este abundent, confirmând efectul antiinflamator și antibacterian al membranei amniotice.

Suprafața oculară este o componentă esențială a vederii fiind un tot unitar alcătuit din conjunctivă, cornee, limb, sistem limfoid asociat conjunctivei, pleoape, glande lacrimale, film lacrimal, sistemul de drenaj lacrimal, nervii senzitivi corneeni.

Alterarea homeostaziei suprafeței oculare duce la apariția patologiilor prin mecanime extrinseci și/ sau intrinseci. Deși de cauze diferite, traumatice (arsuri), secundare unor disfuncții imunologice ( pemfigoidul cicatricial) sau unor boli sistemice ( Sindromul Stevens- Johnson/ Lyell) sau leziuni eminamente oftalmologice ( keratite, ulcere corneene,pterigioane, tumori corneo- conjunctivale, distrofii ) patologiile suprafeței oculare converg către insuficiența de celule stem limbice.

Fiziologia normală și patologică a suprafeței oculare aduce în prim plan capacitatea de regenerare și diferențiere celulară a epiteliului corneean cu ajutorul celulelor stem și mecanismele de menținere a transparenței corneei.Teoria celulelor stem limbice a modificat în mod crucial abordarea terapeutică a patologiilor suprafeței oculare, ele putând fi acum tratate prin auto- sau allo-grefe de celule stem limbice.

Transplantul de membrană amniotică reprezintă o opțiune terapeutică din ce în ce mai studiată. Datorită proprietăților sale ea este uilizată ca tratament atât de fază acută cât și de fază cronică. Transplantul de membrană amniotică poate fi utilizat fie cu rol de grefon, pentru înlocuirea țesuturilor distruse de la nivelul suprafeței oculare, fie ca patch tisular pentru prevenirea extinderii inflamației.

Membrana amniotică este un țesut unic prin biochimia sa. Din punct de vedere al lipsei imunogenicității este transplantul ideal; in punct de vedere al bogăției factorilor de creștere și a citokinelor, este un țesut care facilitează vindecarea; din punct de vedere al recoltării și

15

tehnicii de transplant este accesibil. Toate aceste calități, pledează pentru utilizarea membranei amniotice în patologia severă a suprafeței oculare.

Folosită în ingineria tisulară, membrana amniotică este un exoschelet cu un tipar particular al componentelor matricei extracelulare pentru că poate modula vindecarea unei răni prin promovarea reconstrucției tisulare, mai degrabă, decât promovarea vindecării prin formarea de cicatrici tisulare.

Studiul clinico-statistic demonstrează rolul benefic al transplantului de membrană amniotică pentru pacienții cu arsuri corneene, defect epitelial persistent, ulcere neurotrofice sau recurente, pterigion sau tumori corneo- conjuctivale și rolul său în expansiunea celulelor stem. De asemenea se constată superioritatea tratamentului cu membrană amniotică față de tratamentul medicamentos simplu.Durata tratamentului și perioada de vindecare sunt mai scurte pentru pacienții tratați cu membrană amniotică iar acuitatea vizuală și simptomatologia sunt net îmbunătățite.

Evoluția bolii și a tratamentului nu este semnificativ statistică în funcție de ochiul afectat, mediul de proveniență, tehnica chirurgicală folosită dar depinde de vârsta și sexul pacientului.

Timpul scurs de la afecțiune la tratament, pragul de timp depășit dar mai ales diagnosticul pacienților definesc faza tratamentului. Majoritatea pacienților urmează un tratament de fază cronică pentru că patologia lor este cronică, recurentă sau recidivantă. Corelația între faza tratamentului, loturile studiate,diagnosticul, este semnificativ statistică.

Distribuția celor 77 de pacienți din studiu s-a făcut în 5 loturi inegale. Pentru a evalua eficacitatea transplantului de membrană amniotică se urmăresc parametrii generali ( acuitatea vizuală, scoringul final) dar și specifici fiecărui lot ( testul Schirmer, gradul arsurii, dimensiunea tumorii, patologii asociate).

Astfel pentru pacienții cu arsuri statistic s-a demonstrat că faza de tratament, adică timpul scurs de la momentul arsurii la momentul inițierii tratamentului, este semnificativ statistică în raport cu gradul și evoluția afecțiunii; defectul epitelial persistent este puternic corelat cu patologii asociate, 50 % din pacienții cu defect epitelial persistent au asociat diabet zaharat. În lot sunt incluși doar 2 pacienți ce au defect epitelial persistent din cauze strict oftalmologice (traumă) sau neprecizate (spontan). Majoritatea pacienților cu tumori au avut limfon non- Hodgkin însă pacienții cu neoplazie cu celule scuamoase au fost toți de sex masculin.

Acuitatea vizuală este cel mai important parametru studiat.Se constată o corelație semnificativ statistică între AV inițială și AV după tratament. Media AV după tratament a fost variată pe loturi, găsindu-se astfel o relație semnificativ statistică între AV și distribuția pe loturi.Cele mai bune AV s-au înregistrat la pacienții cu defect epitelial persistent și

16

pterigioniar cea mai scăzută AV la pacienții diagnosticați cu tumori corneo- conjunctivale. În plus pacienții cu arsuri și pterigion se bucură de o îmbunătățire sesizabilă a AV.

Îmbunătățirea simptomatologiei pacienților s-a urmărit prin chestionarul postoperator ce a gradat scoringul epiforei, senzației de corp străin, durerii oculare și efectul cosmetic. Evoluția tuturor simptomelor a fost favorabilă. Ce este interesant este că efectul benefic al membranei se instalează progresiv, mai ales pe parcursul primei luni, urmând ca apoi acesta să se mențină. O altă ipoteză ce derivă și din analiza statistică a datelor și explică faptul că evaluarea la 6 luni a pacienților nu era necesară este că majoritatea pacienților devin pacienți vindecați mai devreme de acest interval de timp.

Eficiența crescută a membranei amniotice este dovedită și prin scoringul final ce arată că majoritatea pacienților sunt vindecați (62,34%), sau ameliorați(32.47%). Doar 5.19% din pacienți rămân, după tratament, staționari.

Bibliografie selectivă

1. The Future of Aging Not just sci-fi: regenerative medicine works. Words by James Tonin

2. Dua HS, Gomes JA, King AJ,Maharajan VS. The amniotic membrane in ophthalmology. Survey of Ophthalmology.2004Jan;49(1):51-77)

3. Rahman I, Said DG, Maharajan VS, Dua HS. Amniotic membrane in ophthalmology: indications and limitations. Eye. 2009;23(10):1954-61

4. Silini AR, Cargnoni A, Magatti M1, Pianta S1, Parolini O. The Long Path of Human Placenta, and Its Derivatives, in Regenerative Medicine.Front Bioeng Biotechnol. 2015 Oct 19;3:162. doi: 10.3389/fbioe.2015.00162. eCollection 2015.)

5. Brian L.Schwam. Human amniotic membrane transplantation for the treatment of ocular surface diseases. DCMS Medical Articles, September 2002, 1-2

6. Azzuaro Bianco, Pillai CT, Dua HS. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. Br.J.Ophthalmol 1999; 83(4): 399-402)

7. Alexander Battler, Jonathan Leor- Stem cell and gene-based therapy. Frontiers in regenerative medicine. Editura Birkhauser, 2006. 281-298

8. Baum J. Thygeson lecture. Amniotic membrane transplantation: Why is it effective? Cornea 2002; 21:339-41)

9. G. L. Bourne, “The microscopic anatomy of the human amnion and chorion,” American Journal of Obstetrics and Gynecology, vol. 79, no. 6, pp. 1070–1073, 1960).

17

10. C. Mamede, M. J. Carvalho, A. M. Abrantes, M. Laranjo, C. J. Maia, and M. F. Botelho, “Amniotic membrane: from structure and functions to clinical applications,” Cell and Tissue Research. In press.

11. Meraj Tabatabaei,1Nariman Mosaffa,1Shohreh Nikoo,2Mahmood Bozorgmehr,3Roya Ghods,4Somaieh Kazemnejad,5Simin Rezania,6Bahareh Keshavarzi,1Soheila Arefi,5Fahimeh Ramezani-Tehrani,7Ebrahim Mirzadegan,2 and Amir-Hassan Zarnani3,8,. Isolation and Partial Characterization of Human Amniotic Epithelial Cells: The Effect of Trypsin. Avicenna J Med Biotechnol. 2014 Jan-Mar; 6(1): 10–20.,

12. Miki T1, Marongiu F, Dorko K, Ellis EC, Strom SC. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2010 Jan;Chapter 1:Unit 1E.3. doi: 10.1002/9780470151808.sc01e03s12.)

13. Jingbo Liu,1,2Hosam Sheha,1,3Yao Fu,1,4Lingyi Liang,5 and Scheffer CG Tseng1. Update on amniotic membrane transplantation. Expert Rev Ophthalmol. 2010 Oct; 5(5): 645–661. Doi; 10.1586/eop.10.63),

14. Adinolfi M, Akle CA, McColl I, Fensom AH, Tansley L, Connolly P, Hsi BL, Faulk WP, Travers P, Bodmer WF. Expression of HLA antigens, beta 2-microglobulin and enzymes by human amniotic epithelial cells.Nature. 1982 Jan 28;295(5847):325-7.

15. Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, Leibowitz S, McColl I. Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet. 1981 Nov 7;2(8254):1003-5)

16. Shimmura S1, Shimazaki J, Ohashi Y, Tsubota K. Antiinflammatory effects of amniotic membrane transplantation in ocular surface disorders.Cornea. 2001 May;20(4):408-13.

17. Gomes JA1, Romano A, Santos MS, Dua HS. Amniotic membrane use in ophthalmology. Curr Opin Ophthalmol. 2005 Aug;16(4):233-40.

18. Solomon A1, Rosenblatt M, Monroy D, Ji Z, Pflugfelder SC, Tseng SC. Suppression of interleukin 1alpha and interleukin 1beta in human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix.Br J Ophthalmol. 2001 Apr;85(4):444-9;

19. Hao Y, Ma DH-K, Hwang DG, Kim W-S, Zhang F. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea .2000;19(3):348-52

20. Liu T1, Zhai H, Xu Y, Dong Y, Sun Y, Zang X, Zhao J. Amniotic membrane traps and induces apoptosis of inflammatory cells in ocular surface chemical burn.Mol Vis. 2012;18:2137-46. Epub 2012 Jul 26

21. Kjaergaard N1, Hein M, Hyttel L, Helmig RB, Schønheyder HC, Uldbjerg N, Madsen H. Antibacterial properties of human amnion and chorion in vitro.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Feb;94(2):224-9.

22. Kjaergaard N, Helmig RB, Schønheyder HC, Uldbjerg N, Hansen ES, Madsen H. Chorioamniotic membranes constitute a competent barrier to group b streptococcus in vitro. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1999;83:165–169.

18

23. Galask RP, Snyder IS. Antimicrobial factors in amniotic fluid. Am J Obstet Gynecol. 1970;106:59–65.), Talmi YP, Sigler L, Inge E, Finkelstein Y, Zohar Y. Antibacterial properties of human amniotic membranes. Placenta. 1991;12:285–288.

24. King AE, Paltoo A, Kelly RW, Sallenave J-M, Bocking AD, Challis JRG. Expression of Natural Antimicrobials by Human Placenta and Fetal Membranes. Placenta. 2007Feb;28(2-3):161-9

25. Buhimschi IA, Jabr M, Buhimschi CS, Petkova AP, Weiner CP, Saed GM. The novel antimicrobial peptide beta3-defensin is produced by the amnion: A possible role of the fetal membranes in innate immunity of the amniotic cavity. American Journal of Obstetrics and gynecology. 2004Nov;191(5):1678-87

26. Lee SB1, Li DQ, Tan DT, Meller DC, Tseng SC. Suppression of TGF-beta signaling in both normal conjunctival fibroblasts and pterygial body fibroblasts by amniotic membrane.Curr Eye Res. 2000 Apr;20(4):325-34.

27. Li DQ1, Lee SB, Tseng SC. Differential expression and regulation of TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-betaRI, TGF-betaRII and TGF-betaRIII in cultured human corneal, limbal, and conjunctival fibroblasts.Curr Eye Res. 1999 Aug;19(2):154-61.

28. Huang SS1, Huang JS. TGF-beta control of cell proliferation.J Cell Biochem. 2005 Oct 15;96(3):447-62.

29. Adzik NS, Longaker MT. Scarless fetal healing. Therapeutic implications. Annals of surgery. 1992;215(1):3

30. Cuttle L, Nataatmadja M, Fraser JF, Kempf M, Kimble RM, Hayes MT. Collagen in the scarless fetal skin wound: Detection with Picrosirius-polarisation. Wound repair and regeneration. 2005;13(2):198-204);

31. Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42:1539–1546.

32. Aagaard -Tillery KM, Silver R, Dalton J. Immunology of normal pregnancy. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 2006Oct;11(5):279-95

33. Chen EH, Tofe AJ. A literature review of the safety and biocompatibility of amnion tissue. J.impl Adv Clin Dent. 2010;2(3):67-75

34. Mermet I,Pottier N, Sainthillier JM, Malugani C, Cairey-Remmonay S, Lombardi G, et al. Use of amniotic membrane transplantation in the treatment of venous leg ulcers. Wound repair and regeneration. 2007;15(4):459-64) ;

35. Zhu D1, Muljadi R1, Chan ST1, Vosdoganes P2, Lo C3, Mockler JC1, Wallace EM1, Lim R1. Evaluating the Impact of Human Amnion Epithelial Cells on Angiogenesis.Stem Cells Int. 2016;2016:4565612. doi: 10.1155/2016/4565612. Epub 2015 Dec 29.

36. Rowe TF1, King LA, MacDonald PC, Casey ML. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in human amnion mesenchymal and epithelial cells.Am J Obstet Gynecol. 1997 Apr;176(4):915-21.

37. Keene DR, Sakai LY, Lunstrum GP, Morris NP, Burgeson RE. Type VII collagen forms an extended network of anchoring fibrils.J Cell Biol. 1987 Mar;104(3):611-21

38. Guo M, Grinnell F. Basement membrane and human epidermal differentiation in vitro. J Invest Dermatol. 1989;93:372–378

39. Streuli CH, Bailey N, Bissell MJ. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. J Cell Biol. 1991;115:1383–1395

19

40. Koizumi NJ and et al. (2000) Growth Factor mRNA and Protein in Preserved Human Amniotic Membrane. Current Eye Research, 20(3):173-7

41. Premier Laboratories, LLC. Longmont, CO. Immunohistochemical staining to dtermine the presence or absence of collagen IV, V, and VII, Laminin, TGF-beta, EGF, FGF, PDGFalpha, and PDGF-beta in non-processed human amniotic membrane as opposed to processed amniotic membrane samples. Study Numbers: 2011-261, 2011-432. Study completed 2011

42. Al-Aquaba MA, Fares U, Suleman H, et al. Histology of the human eye. Saunders company ; 1971), (Van Buskirk EM. The anatomy of the limbus. Eye (Lond) 1989 ; 3 :101-8

43. F. Majo, T. Hoang-Xuan. Le limbe. Surface Oculaire. Pierre-Jean Pissela, Christophe Baudouin, Thanh Hoang-Xuan, ed. Elsevier Masson, 2015

44. Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell 1989 ; 57 : 201-9

45. Davanger M, Evensen A. Role of the pericorneal papillary structure in renewal of corneal epithelium. Nature 1971 ; 229 : 560-1

46. Schermer A, Galvin S, Sun T: Differentiation-related Expression of a Major 64K Corneal Keratin In Vivo and In Culture Suggests Limbal Location of Corneal Epithelial Stem Cells. J Cell Biol1986, 103: 49

47. Goldberg MF, Bron AJ. "Limbal palisades of Vogt". Transactions of the American Ophthalmological Society 1982 ; 80: 155–71).

48. Fuchs E, Segre JA. Stem cells: a new lease on life. Cell 2000; 100: 143–155 49. Till, J.E. and McCullough, E.A. (1961). A direct measurement of the radiation sensitivity of

normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 14, 213–222) 50. Goto Y, Kaneko K. Minimal model for stem cell diferentiation. Phys Rev E Stat Nonlin Soft

Matter Phys 2013 ; 88 : 032718) 51. Alison MR, Poulsom R, Forbes S, Wright NA. An introduction to stem cells. J Pathol 2002;

197: 419–423 52. Tseng SC. Concept and application of limbal stem cells. Eye 1989; 3(Part 2): 141–157.) 53. Tsubota K, Stake Y, Kaido M, et al. Treatment of severe ocular surface disorders with

corneal epithelial stem-cell transplantation. N Engl J Med 1999 ; 340 : 1697-703) 54. Jirsova K, Dudakova L, Kalasova S, et al. The OV-TL 12/30 clone of anti-cytokeratin 7

antibody as a new marker of corneal conjunctivalization in patients with limbal stem cell deficiency. Invest Ophhalmol Vis Sci 2011 , 52 : 5892-8

55. McNairm AJ, Guash G. Epithelial transition zones: merging microenvironments, niches and cellular transformation. Eur J Dermatol 2011 , 21 : 21-8)

56. F. Brignole-Baudouin, H. Liang, L. Trinh, E. Warcoin, C. Roubeix, A. Pauly, C. Baudouin. Regulation immunologique de la surface oculaire. Surface Oculaire. Pierre-Jean Pissela, Christophe Baudouin, Thanh Hoang-Xuan, ed. Elsevier Masson, 2015

57. Mannis MJ, Smolin G. Natural defense mechanisms of ocular surface. In: Pepose JS, Hollande GN, Wilhelmus KR. Ocular infection Immunity. St. Louis: Mosby ; 1996, p. 185-90

58. Medi Eslani,1Alireza Baradaran-Rafii,2Asadolah Movahedan,1 and Ali R. Djalilian1. The Ocular Surface Chemical Burns) JournalofOphthalmologyVolume 2014 (2014), Article ID 196827, 9 pages

20

59. A. Lin, N. Patel, D. Yoo, S. Demartelaere, and C. Bouchard, “Management of ocular conditions in the burn unit: thermal and chemical burns and stevens-johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis,” Journal of Burn Care & Research, vol. 32, no. 5, pp. 547–560, 2011

60. H. S. Dua, A. J. King, and A. Joseph, “A new classification of ocular surface burns,” British Journal of Ophthalmology, vol. 85, no. 11, pp. 1379–1383, 2001

61. Burman S, Tejwani S, Vemuganti G, Gopinathan U, Sangwan V (2004) Ophthalmic applications of preserved human amniotic membrane: a review of current indications. Cell Tissue Bank 5:161

62. Kim JS, Kim JC, Na BK, Jeong JM, Song CY. Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn. Exp. Eye Res. 2000 Mar;70(3):329–37

63. J. Imanishi, K. Kamiyama, I. Iguchi, M. Kita, C. Sotozono, and S. Kinoshita, “Growth factors: importance in wound healing and maintenance of transparency of the cornea,” Progress in Retinal and Eye Research, vol. 19, no. 1, pp. 113–129, 2000

64. Bari M, Choudhury M, Khan A, Nessa A (2002) Role of human fetal membranes (amniotic membrane) in the management of burn wounds. Ann Burn Fire Disasters 15:12,

65. M. Eslani, A. Baradaran-Rafii, and S. Ahmad, “Cultivated limbal and oral mucosal epithelial transplantation,” Seminars in Ophthalmology, vol. 27, no. 3-4, pp. 80–93, 2012.

66. Tseng SCG, Prabhawasat P, Barton K, et al. Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Arch Ophthalmol 1998; 116: 431-41

67. Dua HS, Azuara-Blanco A. Amniotic membrane transplantation. Br J Ophthalmol 1999; 83: 748–752.

68. Buratto L, Phillips R L, Carito G. Pterygium surgery NJ:SLACK: Slack Incorpor rated. 2000 69. Mutulu FM, Sobaci G, Tatar T, Yildirim E. A comparative study of recurrent pterygium

surgery. Ophthalmology. 1999;106:817–821 70. Nakamura T, Inatomi T, Sekiyama E, Ang LP, Yokoi N, Kinoshita S. Novel clinical

application of sterilized,freeze-dried amniotic membrane to treat patients with pterygium. Acta Ophthalmol Scand. 2006;84:401–405

71. Ma DH, See LC, Liau SB, Tsai RJ. Amniotic membrane graft for pterygium. Br J Ophthalmol. 2000;84:973–978

72. Berman M. The pathogenesis of corneal epithelial defects. Acta Ophthalmol Suppl. 1989;192:55–64

73. M. Ayaki, S. Yaguchi, A. Iwasawa, R. Kiode. Cytotoxicity of ophthalmic solutions with and without preservatives to human corneal endothelial cells, epithelial cells and conjunctival epithelial cells. Clin Exp Ophthalmol, 36 (6) (2008), pp. 553–555

74. Prabhasawat Pinnita, Kosrirukvongs Panida, Booranapong Wipawee, Vajaradul Yongyudh. Application of Preserved Human Amniotic Membrane for Corneal Surface Reconstruction. Cell Tissue Bank. 2000;1(3):213–222.

75. Tseng SC, Tsubota K. Important concepts for treating ocular surface and tear disorders. Am J Ophthalmol. 1997 Dec;124(6):825–835.

76. Hao Y, Ma DH, Hwang DG, Kim WS, Zhang F. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea. 2000 May;19(3):348–352

77. Dua HS, Forrester JV. The corneoscleral limbus in human corneal epithelial wound healing. Am J Ophthalmol 1990; 110: 646–656

21