MEMOIRE DE MAGISTER - dspace.ensa.dz:8080dspace.ensa.dz:8080/jspui/bitstream/123456789/1864/1/MEMOIRE DE... · 4.6. Toxicité des polyphénols de grenade ... I. Extraction, dosage

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

ECOLE NATIONALE SUPERIEURE AGRONOMIQUE EL-HARRACH ALGER

- -#"!

DEPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE

MEMOIRE

En vue de lobtention du diplme de Magister en Sciences Agronomiques

Option : Sciences Alimentaires

THEME

Prsent par : BENDJABEUR Salah Soutenu le : 04 / 12 / 2012

Jury :

Prsident : M. YOUYOU A. Professeur (E.N.S.A. El Harrach)

Directeur de thse : M. AMMOUCHE A. Professeur (E.N.S.A. El Harrach)

Examinateurs : M. BELLAL M.M. Professeur (E.N.S.A. El Harrach)

M. BENCHABANE O. Maitre-Assistant (E.N.S.A. El Harrach)

Anne universitaire 2011-2012

Evaluation du pouvoir antioxydant et antimicrobien des extraits vgtaux (cas de la grenade Punica granatum L.) en vue de leur utilisation alimentaire

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granatum L. .67;

Summary: The purpose of this study is to evaluate the antimicrobial and the antioxidant pomegranate (Punica granatum L.) peel extract (PPE) of in vitro and the oxidative stability of sunflower oil and soybean oil stabilized by this extract during accelerated storage.

The results showed that the PPE is very rich in total polyphenols (448.4 mg/g GAE), flavonoids (30.37 mg/g QE) and hydrolysable tannins (374,37 mg/g TAE). It is effective against Staphylococcus a., Bacillus s., Pseudomonas a., Klebsiella p. bacteria growth and gave inhibition zones diameters that vary between 10 to 26 mm and MIC values ranging between 62.5 and 500 mg/ ml. The PPE showed a high antioxidant activity: The IC50 (DPPH test) obtained for A. Ascorbic, PPE, BHT, and -tocopherol are respectively: 2.903 0.002, 5.49 0.039, 7.113 0.166, 28.15 0.767 g / mL. The EC50 (reducing power) were: 11.05 0.01, 25.78 0.10, 26.74 0.17, 49.95 0.01 g / mL, respectively. A high inhibition activity of peroxidation at 0.5 mg / ml following the order: BHT EPG -tocopherol. High chelating activity but less than the EDTAs. The results of oxidative stability of oils indicate that the PPE showed a higher antioxidant activity than that of the BHT (200 ppm) in sunflower oil (500 and 1000 ppm) and the same activity in soybean oil (1000 ppm).

Therefore, this study indicates that the pomegranate peel extract can be considered as a good source of natural compounds with antioxidant activity and antimicrobial and used in the food industry as a preservative in multi-functional food products.

Keywords : Pomegranate peel extract (PPE), Polyphenols, Antioxidant activity, antimicrobial activity, oxidative stability of sunflower oil, soybean oil.

.

REMERCIEMENTS

Louange Allah le tout puissant qui ma donnla sant, le courage, la volont et la patience

de raliser ce travail.

Jexprime mes sincres remerciements M. AMMOUCHE Ali, Professeur lENSA, pour

mavoir accord sa confiance en acceptant de diriger ce travail. Quil trouve ici lexpression

de ma reconnaissance et mon profond respect.

Je tiens remercier M. YOUYOU Achne, Professeur lENSA, pour mavoir fait lhonneur

de prsider le jury. Quil trouve ici lexpression de ma grande considration.

Mes vifs remerciements vont galement M. BELLAL Mohand Mouloud, Professeur

lENSApour avoir accept de faire partie du jury dexamination.

Je remercie M. BENCHABANE Othmane, Maitre-assistant classe A pour avoir

acceptdexaminer ce travail.

Ce travail naurait pas pu voir la lumire du jour sans laide prcieuse des personnes suivantes :

Lensemble du personnel du dpartement de technologie alimentaire et nutrition

humaine en particulier M. BEN LAHMER Mohammed et M. BEN ALIA Mohammed.

Lensemble dupersonnel du laboratoire de microbiologie de CRD-SAIDAL en

particulier M. SALAH Mohammed et Mlle. AKKACHE Lynda.

M. HADJAL Samir Directeur adjoint charg de la recherche et du dveloppement et

M. ALLIANE Khellaf ingnieur charg du dveloppement produit lentreprise

CEVITAL SPA.

Tous mes collgues du dpartement de technologie alimentaire et de lEcole Nationale

Suprieure dAgronomie.

Enfin, jexprime ma profonde gratitude toutes les personnes qui ont contribu de prsou de

loin au bon droulement de ce travail et que jai peut-tre omis de citer.

DEDICACES

A mes chers parents que Dieu protge

En tmoignage de ma profonde affection. Quils sachent que ce travail est en partie le fruit

de leur soutien ; je leur suis trs reconnaissant. Leur fiert mon gard aujourdhui est pour

moi la meilleure des rcompenses

A mes chers frres qui mont toujours encourag et soutenu. Quils trouvent ici

lexpression de ma grande gratitude

A tous mes amis

A moi-mme

SOMMAIRE

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abrviations

Introduction gnrale ........................................................................................................................... 1

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Loxydation des lipides ................................................................................................................ 3

1.1. Thorie de l'oxydation lipidique ........................................................................................... 4

1.2. Dfinition et proprits des radicaux libres .......................................................................... 5

1.3. Oxydation des graisses et des huiles ...................................................................................... 6

1.4. Evaluation de ltat doxydation ........................................................................................... 9

1.5. Les consquences de loxydation des lipides ..................................................................... 11

1.6. Inhibition de la peroxydation des lipides ............................................................................. 11

II. Les antioxydants ..................................................................................................................... 12

2.1. Dfinition dun antioxydant ................................................................................................. 12

2.2. Utilit alimentaire ............................................................................................................... 12

2.3. Proprits ............................................................................................................................ 12

2.3.1. Les antioxydants synthtiques ..................................................................................... 13

2.3.2. Les antioxydants naturels ............................................................................................ 13

2.4. Mcanismes d'action des antioxydants : .............................................................................. 14

2.4.1. Antioxydants prventifs ............................................................................................... 14

- La dtoxification des ERO. ................................................................................................... 15

- Les chlateurs de mtaux de transition. ................................................................................ 15

- Dsactivateurs de l'oxygne singulet .................................................................................... 16

2.4.2. Antioxydants chain breaking ou mcanisme briseur de chane ............................. 16

- Les donneurs dhydrogne . .................................................................................................. 17

- Les antioxydants sacrifis .............................................................................................. 17

2.5. Les tudes defficacit des antioxydants ............................................................................. 17

2.5.1. des tests trs modliss. .................................................................................................... 18

2.5.2. des tests doxydabilit acclre types test Rancimat. ................................................. 18

2.5.3. les tests en conditions acclres en enceinte thermostate. ........................................ 18

III. Polyphnols ............................................................................................................................ 19

3.1. Dfinition ............................................................................................................................ 19

3.2. Structure et classification des polyphnols ......................................................................... 19

3.2.1. Formes les plus simples ............................................................................................... 20

a. Les acides phnoliques ................................................................................................ 20

b. Les flavonodes ........................................................................................................... 21

c. Autres exemples .......................................................................................................... 22

3.2.2. Formes condenss ....................................................................................................... 23

a. Les tanins ..................................................................................................................... 23

b. Lignines ....................................................................................................................... 24

3.3. Les grands aspects de la biosynthse des polyphnols ....................................................... 24

3.4. Rle des polyphnols ........................................................................................................... 27

3.5. Proprits antioxydantes des polyphnols .......................................................................... 28

3.5.1. Composs phnoliques comme pigeurs de radicaux libres et chlateurs des mtaux 28

3.5.2. Activit pro-oxydante des composs phnoliques ...................................................... 29

IV. Grenadier ................................................................................................................................ 30

4.1. Classification botanique ..................................................................................................... 31

4.2. Le grenadier en Algrie ...................................................................................................... 32

4.3. Composition biochimique du fruit ...................................................................................... 33

4.4. Les constituants du fruit de grenade ................................................................................... 34

4.4.1. Tanins .......................................................................................................................... 34

4.4.2. Flavonodes ................................................................................................................. 36

4.4.3. Alcalodes ..................................................................................................................... 38

4.4.4. Acides organiques ........................................................................................................ 38

4.4.5. Triterpnes et strodes ................................................................................................. 38

4.4.6. Autres composs .......................................................................................................... 38

4.5. Activits biologiques de grenade ........................................................................................ 40

4.5.1. Activit antioxydante .................................................................................................. 40

4.5.2. Activit antidiabtique : ............................................................................................... 41

4.5.3. Activit antifatigue ....................................................................................................... 42

4.5.4. Activit antimicrobienne ............................................................................................. 43

4.5.5. Activit cicatrisante ..................................................................................................... 43

4.5.6. Action anti-ulcre ......................................................................................................... 44

4.5.7. Action anticancreuse .................................................................................................. 44

4.6. Toxicit des polyphnols de grenade .................................................................................. 44

4.7. Extrait de peau de grenade comme additif fonctionnel ...................................................... 45

PARTIE II : MATERIELS ET METHODES

I. Extraction, dosage et valuation de lactivit antioxydante des polyphnols ............................. 48

1.1. Matriel vgtal .................................................................................................................. 48

1.2. Extraction des polyphnols de la poudre de peau de grenade ............................................ 48

1.2.1. Calcul du rendement de lextraction ........................................................................... 48

1.3. Dosage des composs phnoliques ..................................................................................... 48

1.3.1. Polyphnols totaux ....................................................................................................... 48

1.3.2. Flavonodes ................................................................................................................. 49

1.3.3. Tanins hydrolysables ................................................................................................... 50

1.4. Dtermination de lactivit antioxydante ........................................................................... 50

1.4.1. Pouvoir rducteur ........................................................................................................ 50

1.4.2. Pouvoir de pigeage du radical DPPH ......................................................................... 51

1.4.3. Activit antioxydante totale dans le systme acide linolique .................................... 52

1.4.4. Activit de chlation des mtaux : ............................................................................... 53

II. Test de la stabilit oxydative des huiles ltuve ou test de Schaal ....................................... 54

2.1. Choix des huiles .................................................................................................................. 54

2.2. Prparations des concentrations .......................................................................................... 54

2.3. Test ltuve ou test de Schaal .......................................................................................... 54

2.4. Les analyses des huiles ....................................................................................................... 54

2.4.1. Dtermination des dines conjugus (DC) ................................................................... 54

2.4.2. Dtermination de lindice de peroxyde (IP) ................................................................ 55

2.4.3. Indice de para-Anisidine (IPA) .................................................................................... 56

2.4.4. Dosage des acides gras par chromatographie phase gaz (CPG) ................................... 57

III.Activit antimicrobienne .............................................................................................................. 59

3.1. Etude de leffet inhibiteur (analyse qualitative) ................................................................. 59

3.1.1. Souches microbiennes testes ..................................................................................... 59

3.2. Etude quantitative de leffet antimicrobien ......................................................................... 62

3.2.1. Dtermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) en milieu solide ....... 62

3.2.2. Dtermination de la concentration minimale bactricide (CMB) ............................... 63

IV. Analyses statistiques des donnes ............................................................................................... 63

PARTIE III : RESULTATS ET DISCUSSION

I. Rendement et teneur en composs phnoliques de lextrait sec ................................................ 64

1.1. Rendement en extrait sec .................................................................................................... 64

1.2. Teneur en composs phnoliques de lextrait sec (polyphnols totaux, flavonodes et tanins

hydrolysables) ................................................................................................................................. 65

1.3. Activit antioxydante .......................................................................................................... 68

1.3.1. Pouvoir de pigeage du radical DPPH ........................................................................ 69

1.3.2. Le pouvoir rducteur ................................................................................................... 74

1.3.3. Peroxydation de lacide linolique .............................................................................. 77

1.3.4. Chlation de fer ........................................................................................................... 81

II. Etude de la stabilit oxydative des huiles vgtales ................................................................ 85

2.1. Indice de peroxyde ............................................................................................................... 85

2.2. Indice de p-Anisidine .......................................................................................................... 89

2.3. Les dines conjugus .......................................................................................................... 93

2.4. Profil en acides gras des huiles tudies ............................................................................. 98

2.5. Diffrence entre l'activit antioxydante des antioxydants liposolubles synthtiques et

naturels .......................................................................................................................................... 101

III. Activit antimicrobienne ........................................................................................................... 102

3.1. Dfinition dun antimicrobien .......................................................................................... 102

3.2. Analyse qualitative (dtermination des zones dinhibition des souches microbiennes) ... 102

3.3. Dtermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) ....................................... 105

3.4. Dtermination de la concentration minimale bactricide (CMB) .................................... 108

Conclusion gnrale ......................................................................................................................... 110

Rfrences bibliographiques ........................................................................................................... 113

Annexes ............................................................................................................................................ 132

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Mcanismes doxydation des lipides ............................................................................... 5

Tableau 2 : Mthodes dvaluation de ltat doxydation des huiles ................................................ 10

Tableau 3 : Classes des composs phnoliques dans les plantes. ..................................................... 20

Tableau 4 : Varits de grenadier autorises commercialiser en Algrie ...................................... 33

Tableau 5 : Constituants du fruit et de larbre de Punica granatum .................................................. 39

Tableau 6 : Liste et caractristiques des souches microbiennes testes ............................................ 59

Tableau 7 : Rendement et teneur en composs phnoliques ............................................................. 64

Tableau 8 : Rendement en extrait sec de peau de grenade rapport par certains auteurs ................. 65

Tableau 9 : Pourcentage dinhibition du radical DPPH par les diffrents composs antioxydants .. 70

Tableau 10 : La concentration inhibitrice IC50 (g/mL) du radical DPPH ....................................... 72

Tableau 11 : Pouvoir rducteur des diffrents antioxydants tests ................................................... 74

Tableau 12 : La concentration effective EC50 (g/mL) des diffrents antioxydants ........................ 76

Tableau 13 : Absorbance des produits de la peroxydation de lacide linolique .............................. 78

Tableau 14 : Activit dinhibition de lautooxydation de lacide linolique .................................... 79

Tableau 15 : Pourcentages de chlation de fer Fe2+ en prsence de la ferrozine .............................. 82

Tableau 16 : Indices de peroxydes (mqO2/kg) de l'huile de tournesol au cours de stockage acclr

63Cpendant 20 jours ...................................................................................................................... 85

Tableau 17 : Indices de peroxydes (mqO2/kg) de l'huile de soja au cours de stockageacclr

63C pendant 20 jours ........................................................................................................................ 87

Tableau 18 : Indices de p-Anisidine de l'huile de tournesol au cours de stockageacclr 63C

pendant 20 jours ................................................................................................................................. 90

Tableau 19 : Indice de p-Anisidine de l'huile de soja au cours de stockage acclr 63C pendant

20 jours ............................................................................................................................................... 92

Tableau 20 : Coefficients dextinction (E232) nmde lhuile de tournesolau cours de stockage

acclr 63C pendant 20 jours ....................................................................................................... 94

Tableau 21 : Coefficients dextinction (E232) nm de lhuile de soja au cours de stockage acclr

63C pendant 20 jours ........................................................................................................................ 95

Tableau 22 : Composition en acides gras (%) de lhuile de tournesol avant et aprs oxydation ...... 98

Tableau 23 : Composition en acides gras (%) de lhuile soja avant et aprs oxydation ................... 99

Tableau 24 : Vitesse relative doxydation avec oxygne molculaire des acides gras de la famille

C:18 .................................................................................................................................................. 100

Tableau 25 : Rapport acide linolique/acide palmitique (C18.2/C16:0) des deux huiles tudies . 100

Tableau 26 : Diamtres des zones d'inhibition des diffrentes souches microbiennes testes ....... 103

Tableau 27 : Concentration minimale inhibitrice (CMI) des souches bactriennes ....................... 105

Tableau 28 : Concentration minimale bactricide (CMB) des souches bactriennes ..................... 108

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Ractions possibles du processus dauto-oxydation ........................................................... 6

Figure 2 : Ractions possibles de production des hydroperoxydes ..................................................... 7

Figure 3 : Formation des hydroperoxydes par photo-oxydation d'un lipide avec un sensibilisateur .. 8

Figure 4 : Schma des ractions doxydation des lipides ................................................................... 9

Figure 5 : Formules dveloppes du BHA et du BHT ...................................................................... 13

Figure 6 :Acides phnoliques typiques dans les aliments ................................................................. 21

Figure 7 : Structure gnrique dune molcule de flavonode .......................................................... 22

Figure 8 : Les principales classes des flavonodes ............................................................................ 22

Figure 9 : Les grandes lignes de la biosynthse des principaux groupes des composs phnoliques

............................................................................................................................................................ 26

Figure 10 : Relations biosynthtiques entre les phnylpropanodes et les flavonodes .................... 27

Figure 11 : Voie de biosynthse des ellagitanins dans la grenade .................................................... 35

Figure 12 : Structure de lacide ellagique, gallique et les punicalagines A & B .............................. 36

Figure 13 : Reprsentation schmatique de la voie biosynthtique des flavonodes menant la

production des anthocyanines et des proanthocyanidines .................................................................. 37

Figure 14 : Effets bnfiques de peau de grenade et ses extraits ...................................................... 42

Figure 15 :Ractions possibles entre le ractif de p-anisidine et le malonaldhyde ......................... 56

Figure 16 : Illustration de la mthode d'aromatogramme ................................................................. 61

Figure 17 : Courbe dtalonnage de lacide gallique pour le dosage des polyphnols totaux .......... 65

Figure 18 : Courbe dtalonnage de la querctine pour le dosage des flavonodes totaux ............... 66

Figure 19 : Courbe dtalonnage de lacide tannique pour le dosage des tanins hydrolysables ....... 66

Figure 20 : Composition de lextrait de peau de grenade en composes phnoliques........................ 67

Figure 21 : Pourcentage dinhibition du radical DPPH en fonction de la concentration .................. 70

Figure 22 : Concentration inhibitrice IC50 du radical DPPH des diffrents composs antioxydants 73

Figure 23 : Evolution de pouvoir rducteur des antioxydants en fonction de la concentration ........ 75

Figure 24 : Concentration effective (EC50) de pouvoir rducteur des diffrents antioxydants ......... 76

Figure 25 : Evolution de la peroxydation de lacide linolique en fonction du temps ..................... 78

Figure 26 : Activit dinhibition de la peroxydation de lacide linolique ....................................... 79

Figure 27 : Pourcentage dinhibition de Fe2+ en prsence de la ferrozine en fonction de la

concentration ...................................................................................................................................... 82

Figure 28 : Evolution de lindice de peroxyde de lhuile de tournesol au cours de loxydation

acclre 63C ................................................................................................................................. 86

Figure 29 : Evolution de lindice de peroxyde de lhuile de soja au cours de loxydation acclre

63C .................................................................................................................................................... 88

Figure 30 : Evolution de lindice de p-anisidine de lhuile de tournesol au cours de loxydation

acclre 63C ................................................................................................................................. 90

Figure 31 : Evolution de lindice de p-anisidine de lhuile de soja au cours de loxydation

acclre 63C .................................................................................................................................. 92

Figure 32 : Un hydroperoxyde dacide gras polyinsatur avec un dine conjugu ......................... 94

Figure 33 : Evolution de la teneur en dines conjugus de lhuile de tournesol au cours de

loxydation acclre 63C ............................................................................................................... 95

Figure 34 : Evolution de la teneur en dines conjugus des de lhuile de soja au cours de

loxydation acclre 63C ............................................................................................................... 96

LISTE DES ABBREVIATIONS

AG :Acides gras

AGPI : Acides gras polyinsaturs

AGS :Acides gras saturs

ATCC :American Type Culture Collection

BHA :Butyl-Hydroxy-Anisole

BHT :Butyl-Hydroxy-Tolune

CMB : Concentration Minimale Bactricide

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

CPG :Chromatographie en phase gaz

DC : Dines conjugus

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EAG : Equivalent acide gallique

EAT : Equivalent acide tannique

EP : Extrait phnolique

EPG :Extrait de peau de grenade

EEG :Extrait dcorce de grenade

EQ : Equivalent querctine

ERO : Espces ractives loxygne

GC-MS : Gaz Chromatography-Mass Spectometry

HPLC : High performane liquid chromatography

HS : Huile de soja

HT : Huile de tournesol

HS ou HT-TEMOIN : Huile de soja ou de tournesol tmoin (sans antioxydants)

HS ou HT-BHT : Huile de soja ou de tournesol additionne de 200 ppm du BHT

HS ou HT-250 : Huile de soja ou de tournesol additionne de 250 ppm de lextrait



EC50 :Concentration effective 0,5 dabsorbance

IC50 : Concentration inhibitrice de 50% des radicaux

INRAA :Institut National de la Recherche Agronomique dAlgrie

IP : Indice de peroxyde

IPA : Indice de para-Anisidine

Jrs :Jours

Kg :Kilogramme

L :Litre

m : Mtre

mg : Milligramme

MH :Glose Mueller-Hinton

mM : Millimole

min : Minute

ml : Millilitre

mm : Millimtre

nm : Nanomtre

ppm : Partie par million

SAB :Glose Sabouraud

tr/mn : Tour par minute

TAG :Triacylglyceride

TBHQ :Tertiary-butyl-hydro-quinone

UFC : Unit Formant Colonie

UV : Ultra-Violet

g : Microgramme

12 : Oxygne singulet

32 : Oxygne triplet

Introduction gnrale

ENSA 2012 Page 1

INTRODUCTION GENERALE

'oxydation des lipides, qui est la cause principale de la dtrioration de la qualit dans

beaucoup de systmes alimentaires, peut mener une perte significative de la qualit

alimentaire d'un aliment et causer des mauvais gots et la formation des composs

toxiques. Ce processus peut tre lanc par exposition aux enzymes lipoxygnases, catalyseurs de

mtalloprotines, chaleur, radiation ionisante, lumire etions mtalliques (Daker et al., 2008).

Pour cette raison, les antioxydants synthtiques tels que le butyl-hydroxy-anisole (BHA),

butyl-hydroxy-tolune (BHT) et la tertiary-butyl-hydro-quinone (TBHQ) sont largement utiliss

dans l'industrie alimentaire comme inhibiteurs potentiels de l'oxydation des lipides. Des rapports

rcents rvlent que ces composs peuvent tre impliqus dans beaucoup de risques de sant, y

compris le cancer et la carcinogense(Hou, 2003; Prior, 2004).Par consquent, il y a une tendance

vers l'utilisation des antioxydants naturels d'origine vgtale pour remplacer ces antioxydants

synthtiques (Zheng et al., 2010).

L'utilisation des antimicrobiens dans les aliments est galementdevenue de plus en plus

ncessaire pendant que l'conomie globale encourage la production et le transport des aliments dans

le monde entier ;cependant, pourassurer l'approvisionnement en aliments de haute qualit,

l'utilisation des conservateurs est essentielle(Davidson et Branen, 2005).L'application potentielle

des composs antimicrobiens naturels par l'industrie alimentaire est norme, et les tudes sur

l'incorporation des antimicrobiens dans les aliments et pour maximiser leur bio-fonctionnalit ont

t conduites dans le monde entier (Naidu, 2000).

Les industries agro-alimentaires gnrent, partir de leur activit de transformation, des

quantits importantes de dchets et co-produits dorigine organique. La valorisation de ces dchets

reprsente des enjeux importants pour le monde agricole et agro-alimentaire. Les co-produits

dorigine vgtale sont intressants car ils contiennent dimportantes molcules tels que les

polyphnols. De nombreux co-produits ont t tudis comme source dantioxydants et

dantimicrobiens. De ce fait, leur utilisation est encourage, vu l'importance accorde l'activit

biologique des polyphnols prsents dans ces co-produits(Agourram, 2004).

Avec l'intrt croissant pour les antimicrobiens et les antioxydants naturels drivs des fruits,

des lgumes et de la plupart des plantes comestibles, en raison de leur utilisation et leur avantage

dans la conservation des aliments et comme additifs alimentaires naturels, la recherche sur la

grenade a t galement un domaine scientifique intressant pour les chercheurs (Orak et al.,

2011).

L

Introduction gnrale

ENSA 2012 Page 2

La peau de grenade (Punica granatum L.) est une partie non comestible obtenue pendant le

traitement du jus de grenade. La peau de grenade est une source riche en tanins, flavonodes et

autres composs phnoliques (Li et al., 2006). Les proprits antioxydantes et antibactriennes de

la peau de grenade dans les systmes modles in vitro ont t rapportes (Negi et Jayaprakasha

2003; Reddy et al., 2007; Opara et al., 2009; Alzoreky 2009).

L'objectif de la prsente tude est de dterminer les activits antioxydante et antimicrobienne

de la peau de grenade, un sous-produit de jus afin dexploiter son potentiel comme conservateur

naturel et nutraceutique.

Cette tude est axe sur 3 parties principales :

La premire partie de ce travail est consacre lextraction et le dosage des composs

bioactifs tels que les phnols totaux, les flavonodes et les tanins hydrolysables ainsi que

lvaluation de lactivit antioxydante de lextrait de la peau de grenade;

Dans la seconde partie, un essai de valorisation de lextrait phnolique comme antioxydant

naturel a t test sur deux huiles vgtales raffines sans antioxydants savoir : lhuile de

tournesol et lhuile de soja.

Dans la troisime partie, une valuation du pouvoir antimicrobien a t ralise par une

analyse qualitative : par dtermination des zones dinhibition et par analyse quantitative: par

dtermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactricides (CMB).

Chapitre I : Oxydation des lipides Synthse bibliographique

ENSA 2012Page3

I. Loxydation des lipides :

En science des aliments, lorsque lon parle de la raction de l'oxygne molculaire avec des

TAG. On parle de l oxydation . Plus formellement, cependant, il s'agit d'une raction d'addition

dune molcule doxygne qui aboutit la formation de radicaux peroxyle (ROO*). C'est la raison

pour laquelle on utilise plutt le terme de peroxydation des lipides insaturs. Globalement, il s'agit

d'une raction d'addition ou mieux d'insertion d'une molcule d'oxygne dans une liaison C-H. La

peroxydationdes lipides concerne tous les lipides contenant des AG insaturs quelle que soit leur

provenance. Par ailleurs, elle intervient aussi dans de nombreux processus biologiques(Bauer et al.,

2010).

La peroxydation lipidique est le facteur nuisible le plus commun dans les huiles vgtales

parmi les causes principales de la dtrioration d'huile pendant le stockage ou le traitement des

aliments contenant une grande quantit dhuile. L'oxydation des lipides se produit quand l'oxygne

ragit avec des lipides particulirement riches en acides gras insaturs et une srie de ractions en

chane de radicaux de libres mne aux complexes changements chimiques. L'oxydation provoque

une saveur dsagrable et un got rance aussi bien que la perte de la valeur nutritionnelle des

aliments et la formation des composs potentiellement toxiques pour la sant humaine (Pan et al.,

2007; Lambropoulos et Roussis, 2007).

In vitro, loxydation des lipides dans les aliments pose de srieux problmes pour lindustrie

alimentaire qui utilise de plus en plus des acides gras hautement insaturs tels que ceux de la srie

n-3 ( 3) trs susceptibles lauto-oxydation. Loxydation des lipides alimentaires entrane des

altrations qualitatives (rancissement), nutritionnelles (perte en vitamines) voir mme une toxicit

due aux produits issus de la peroxydation lipidique (peroxydes, aldhydes) (Cillard et Cillard,

2006).

In vivo, la peroxydation lipidique est un phnomne galement trs important. Les membranes

des cellules sont particulirement riches en acides gras polyinsaturs (30 50 %) prsents dans les

phospholipides, les sphingolipides, les cardiolipines. La lipoperoxydation des membranes va altrer

leur fonctionnalit (modification de leur permabilit, de leur fluidit, perte dactivit denzymes,

de rcepteurs). Loxydation des cardiolipines de la mitochondrie est un facteur dterminant dans

le dclenchement de lapoptose des cellules. Les lipoprotines telles que les LDL, riches en

cholestrol et en phopholipides sont galement des cibles privilgies de la peroxydation lipidique.

Les LDL oxydes sont fortement incrimines dans lathrogense.


ENSA 2012Page4

De nombreuses autres pathologies sont associes la peroxydation des lipides. Cest le cas

des maladies neurodgnratives (Alzheimer, Parkinson), du diabte, des cancers, des maladies

inflammatoires, du vieillissement(Cillard et Cillard, 2006).

1.1.Thorie de l'oxydation lipidique :

L'oxydation des lipides est un phnomne complexe induit par l'oxygne en prsence des

initiateurs tels que la chaleur, les radicaux libres, la lumire, les pigments photosensibilisateurs et

les ions mtalliques. Elle se produit par l'intermdiaire de troisprocessusractionnels :

i. auto-oxydation non-enzymatique chane par lintermdiaire des radicaux libres ;

ii. photo-oxydation non-enzymatique et non radicalaire et ;

iii. oxydation enzymatique (Laguerre et al., 2007a).

Les deux premiers types de loxydation consiste en une combinaison de ractions impliquant

loxygne triplet 32, qui pourrait tre considr comme tat fondamental biradical OO, et

loxygne singulet 1O2, qui correspond un tat excit de la molcule.Il y a de nombreuses sources

de 1O2 mais sa prsence est souvent couple limpact photonique UV en prsence des

photosensibilisateurs (Laguerre et al., 2007a).

Selon Frankel (1998), il y a deux types de photosensibilisateurs : type I pour la riboflavine, et

type II pour la chlorophylle et lrythrosine. Brivement, le mcanisme de la photo-oxydation

dpend du type de photosensibilisateur. Dans le type II de ractions, un photosensibilisateur triplet

(3sens, raction (1)) absorbe des photons et devient un singulet, transmettant ensuite son nergie

loxygne molculaire, qui son tour devient excit et forme loxygne singulet autour de 1500

fois plus ractif que loxygne triplet :

hv 3sens 1sens + 3O2

1O2 (1)

Loxygne singulet form par la raction (1) est lectrophile et peut se lier ainsi directement

aux doubles liaisons CC, menant la formation dhydroperoxydes. Cependant, cette photo-

oxydation non radicalaire semble tre une raction mineure par rapport lauto-oxydation (tableau

1) chanes radicales induite par 32. Il a t ainsi suggr que la photo-oxydation gnre

principalement des hydroperoxydes qui se dcomposent en radicaux libres qui pourraient initier des

ractions dauto-oxydation (Cillard et Cillard, 2006).

Lauto-oxydation est la voie la plus importante et un mcanisme principal dans loxydation

des lipides. Elle produit principalement des hydroperoxydes et des composs volatils, gnralement


ENSA 2012Page5

par un processus triphas (initiation, propagation et terminaison). Dautres substances non polaires,

tels que les terpnes, les strols et les carotnodes, sont oxydes suivant des mcanismes similaires

(Pokorny, 2003 ; Laguerre et al., 2007a).

Tableau 1 : Mcanismes doxydation des lipides (Pokorny, 2003)

Type doxydation Lipides oxides Catalyseur Agent

oxydant Prvention

Lauto-oxydation Tous les lipides

insaturs Mtaux lourds, radicaux libres

Oxygne triplet

Antioxydants

Oxydation enzymatique Lipides

polyinsaturs Lipooxygnases

Oxygne triplet

Inactivation des enzymes

Oxydation due loxygne singulet

Tous les lipides insaturs

Molcules photosensibles

Oxygne singulet

Pigeurs doxygne singulet

1.2.Dfinition et proprits des radicaux libres :

Les radicaux libres sont des molcules ou des atomes dont les couches lectroniques

priphriques ont un lectron en surnombre. Ils sont trs ractifs vis--vis des autres radicaux libres

ou de molcules dsatures. Ils donnent naissance un difice stable et alors la raction sarrte, ou

bien il apparat un nouveau radical lorigine dune raction en chane (Frnot et Vierling, 2001).

La raction en chane dbute lorsquun radical libre attaque la molcule stable la plus

proche en lui accaparant son lectron, et la molcule attaque devient alors elle-mme un

radical libre (Pelli et Lyly, 2003).

Leur principal danger vient des dommages quils peuvent provoquer lorsquils ragissent avec

des composants cellulaires importants, tels que lADN ou la membrane cellulaire. Suite une

exposition aux radicaux libres, il peut se produire une prolifration (multiplication anormale) des

cellules, entranant un cancer, un dysfonctionnement cellulaire ou la mort des cellules (Pelli etLyly,

2003).

Les principaux radicaux libres oxygns sont forms partir de :

loxygne molculaire :

O=O O=O [O2] radical superoxyde

leau :

H2O H + HO radical hydroxyle


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Le radical OH est beaucoup plus oxydant que le superoxyde.

lozone de la haute atmosphre :

O3 + H O2 + HO hydroxyle

O2 + [O2] - superoxyde

les substrats des transferts dlectrons dans les cellules. La cellule se dfend en les liminant

par la voie enzymatique de la superoxyde dismutase.

E1 2O2

- + 2 H+ H2 O2 + O2

E1 =superoxyde dismutase des mitochondries, du cytoplasme

E2 H2O2 H2O + 1/2O2

E2 = catalase des peroxysomes (Frnot et Vierling, 2001).

1.3.Oxydation des graisses et des huiles

Dans les graisses et les huiles, le processus de loxydation est semblable celui de

loxydation de nimporte quel autre matriel organique insatur et exige un processus dinitiation,

afin de produire des radicaux libres partir du substrat (Wanasundara et Shahidi, 2005).

- Lauto-oxydation :

Lauto-oxydation est la dtrioration oxydative des acides gras insaturs par lintermdiaire

dun processus auto-catalytique consistant en un mcanisme de chane de radicaux libres. Cette

chane comprend les ractions dinitiation, propagation, et terminaison qui pourraient tre cycliques

une fois dclenches.

Figure 1 : Ractions possibles du processus de lauto-oxydation (R est un groupe alkyle dune molcule lipidiqueinsature, H est un atome hydrogne -mthylnique facilement dtachable cause de linfluence de lactivation de la double liaison ou des liaisons voisines, RO est un radical alcoxyle, ROO est un radical peroxyle, I est un initiateur (Wanasundara et Shahidi, 2005).

I RH R + H [1]

R + 3O2 ROO [2]

ROO +RH ROOH + R [3]

ROOH RO + OH [4]

RO + RH ROH + R [5]


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Le processus d'initiation gnre des radicaux libres partir du substrat.L'atome H -

mthylnique est capt partir de la molcule lipidique insature pour former un radical lipidique

(alkyle). Le radical lipidique est fortement ractif et peut ragir avec l'oxygne atmosphrique (32),

une raction facile rsultant de la nature di-radicale de la molcule d'oxygne, et il produit un

radical peroxyle (ROO) (raction [2]).

Dans les ractions de propagation, le radical peroxyle ragit avec une autre molcule lipidique

insature pour former un hydroperoxyde et un nouveau radical lipidique instable (raction [3]).

Pendant qu'un nouveau radical libre est produit chaque tape, plus d'oxygne est incorpor

au systme. Le radical lipidique nouvellement propag ragira alors avec l'oxygne pour produire

un autre radical peroxyle, ayant pour rsultat un mcanisme cyclique auto-catalys (raction [4]).

Les hydroperoxydes sont instables et peuvent se dgrader en radicaux qui acclrent les

ractions de propagation. Ce sont des tapes embranchantes du processus de l'auto-oxydation

lipidique (ractions [5] et [6]).

Ces ractions en chane procdent, et l'arrt se produit seulement quand deux radicaux libres

se combinent pour former un produit non radicalaire. Lauto-oxydation dcompose les molcules du

substrat aussi bien quelle forme de nouvelles molcules causant des gros changements dans les

proprits chimiques et physiques du substrat oxyd.

Un lipide qui contient des doubles liaisons subit l'auto-oxydation induite par de diverses

manires.Il est maintenant clair que la dcomposition des hydroperoxydes prforms, catalyse par

un mtal est la cause la plus susceptible du processus dinitiation.

L'oxydation thermique est galement auto-catalytique et considre comme catalyse par un

mtalparce qu'il est trs difficile d'liminer lestracesdes mtaux (des graisses et huiles ou des

aliments) qui agissent comme catalyseurs et elle peut se produire comme propos dans la raction

[4]. Les mtaux redox de valence variable peuvent galement catalyser la dcomposition des

hydroperoxydes (ractions [6] et [7]).

Figure 2 :Ractions possibles de production des hydroperoxydes (Mn+ est l'ion mtallique valence transitoire) (Wanasundara et Shahidi, 2005).

ROOH + M2+ R + OH + M3+ [6]

ROOH + M3+ ROO + H+ + M2+ [7]


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L'oxydation photosensibilise ou l'oxydation catalyse par la lipoxygnase produisent

galement des hydroperoxydes.

- La photo-oxydation ou auto-oxydation par l'oxygne singulet :

La photo-oxydation directe est provoque par les radicaux libres produits par le rayonnement

ultraviolet qui catalyse la dcomposition des hydroperoxydes et des peroxydes.Cette oxydation

procde comme raction en chane de radicaux libres. Bien qu'il devrait y avoir une irradiation

directe de la lumire UV pour le substrat lipidique, qui est habituellement rare sous pratiques

normales, les mtaux et les complexes mtalliques de l'oxygne peuvent sactiver et gnrer des

radicaux libres ou de l'oxygne singulet.

L'oxydation photosensibilise est une raction directe active par la lumire, l'oxygne

singulet avec les acides gras insaturs, et par la suite,les hydroperoxydes se forment.

L'oxydation photosensibilise se produit cause de la prsence des molcules qui peuvent

absorber la lumire visible ou UV proche pour devenir lectroniquement excites (sensibilisateurs)

(raction 8).

Les pigments initiant l'oxydation photosensibilise dans les aliments incluent les

chlorophylles, les hmoprotines, et la riboflavine. Le type sensibilisateur I sert de radical libre

initiateur photo-chimiquement activ, et le type sensibilisateur II dans l'tat triplet interagit avec

l'oxygne par transfert d'nergie pour former l'oxygne singulet (1O2) qui ragit de mme avec un

lipide insatur (raction 9). Dans des conditions d'oxydation photosensibilise, la raction des

lipides insaturs avec l'oxygne singulet (1O2) mne la formation rapide des hydroperoxydes

(raction 10).

Figure 3 : Formation des hydroperoxydes par photo-oxydation d'un lipide avec un sensibilisateur (hv est lnergie sous forme de lumire UV, les sensibilisateurs qui sont naturellement prsents dans les pigments photosensibles, leurs produits de dgradation, ou des hydrocarbures aromatiques polycycliques capables de transfrer l'nergie partir de la lumire aux molcules chimiques) (Wanasundara et Shahidi, 2005).

Quils soient forms par lun ou lautre des mcanismes dcrits ci-dessus, leshydroperoxydes

ROOH saccumulent dans lhuile. Ce sont des molcules instables, surtout en prsence dions

Sensiblisateur fondamental + hv Sensiblisateur excit [8]

Sensiblisateur excit + 3O2 Sensiblisateur fondamental +

1O2 [9] 1O2 + RH ROO + H [10]


ENSA 2012Page9

mtalliques tels que Fe2+ et Cu+ ou des tempratures dpassant 60 C. Les nouveaux radicaux

quils produisent, notamment les alcoxyles ROet les hydroxyles OH, vont leur tour alimenter

lauto-oxydation des AGI ou trouver pour cibles dautres composs tels que les vitamines, les

pigments, ou encore les protines dans le cas de produits formuls. Les radicaux alcoxyles sont

galement lorigine deractions de scission, de cyclisation et de polymrisation. Ces ractions,

dites de terminaison, vont donner naissance une multitude de composs, parmi lesquels des

composs volatils et trs odorants responsables de lapparition de la note rance. Les produits non

volatils sont plus ou moins oxygns, cycliss et polymriss. Sy ajoutent les polymres dorigine

thermique en cas de chauffage intensif, qui peu peu vont contribuer laugmentation de la

viscosit de lhuile (Cuvelier et Maillard, 2012).

Les ractions de loxydation mentionnes ci-dessous sont rsumes dans la figure 4.

Figure 4 : Schma des ractions doxydation des lipides (daprs Berset et Cuvelier, 1996)

1.4.Evaluation de ltat doxydation :

Ltat doxydation dans lequel se trouve une huile peut tre mesur de diverses manires,

selon que lon dose lapparition des produits primaires doxydation (dines conjugus,

hydroperoxydes) ou des produits secondaires (polymres, composs volatils. . .), la consommation

doxygne ou des acides gras insaturs, ou encore la co-oxydation dautres substrats, tels que des

pigments ou des protines (Cuvelier et Maillard, 2012).


ENSA 2012Page10

Le tableau 2 prsente les diverses mthodes et normes franaises ou internationales

actuellement disponibles. La diversit des techniques avec leurs limites, leurs sensibilits et leurs

spcificits rend difficile la comparaison des rsultats. Lanalyse sensorielle reste bien sr la

mthode de choix puisquelle est la seule rendre compte parfaitement de ltat dacceptabilit

mais elle reste lourde mettre en uvre (Cuvelier et Maillard, 2012).

Tableau 2 : Mthodes dvaluation de ltat doxydation des huiles

Marqueurs doxydation Mthodes

Niveau dinsaturation Indice diode (mesure colorimetrique) (Norme AFNOR NF EN ISO 3961)

Profil en acides gras Dosage par chromatographie en phase gazeuse aprs mthanolyse des triglycrides (Norme AFNOR NF EN ISO 12966-2 et 5508)

Teneur en acides gras libres Indice dacide par colorimtrie (Norme AFNOR NF EN ISO 660)

Teneur en dines conjugus Mesure par spectrophotomtrie UV (Norme AFNOR NF EN ISO 3656)

Taux de peroxides Indice mesure par iodomtrie (Norme AFNOR NF EN ISO 3960) ou potentiomtrie (ISO 27107)

Prsence daldhydes Indice de para-Anisidine par spectrophotomtrie (Norme AFNOR NF EN ISO 6885) Test TBA (acide 2-thiobarbiturique) par spectrophotomtrie

Taux de polymers Mesure directe par chromatographie liquide haute performance dexclusion (AFNOR NF EN ISO 16931) ou par viscosit

Taux de composs polaires Chromatographie liquide dabsorption et gravimtrie (Norme AFNOR NF EN ISO 8420)

Composs volatils Mesure par chromatographie en phase gazeuse de lespace gazeux (AOCS Recommended Practice Cg 1-83, 4-94)

Rancidit Analyse sensorielle avec juges experts (AOCS Recommended Practice Cg 2-83)

Chaque mesure apporte ainsi une information partielle sur un phnomne global, lidal tant

dvaluer ltat doxydation par plusieurs mthodes complmentaires, permettant de suivre en

parallle la formation des produits primaires et secondaires (Cuvelier et Maillard, 2007 ; Frankel,

1998).


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1.5.Les consquences de loxydation des lipides :

La consquence la plus perceptible de loxydation des lipides est lapparition dodeurs et de

flaveurs dsagrables souvent qualifies de rance. Ces odeurs qui conduisent souvent au rejet de

laliment par le consommateur peuvent tre perues trs prcocement. Elles sont lies la formation

de composs volatils aux seuils de dtection olfactifs trs bas. Loxydation des lipides peut

galement induire une modification de la couleur des produits par co-oxydation des pigments quils

soient liposolubles ou hydrosolubles (Villire et Genot, 2006). Cest le cas par exemple des

carotnodes dans la margarine ou le pain (Prior., 2003), ou de lacclration de loxydation de la

myoglobine dans la viande (Genot, 2000). Loxydation peut affecter la texture des aliments, en

raison de la raction des protines avec les produits doxydation (Kanner, 1994 ; Genot et al.,

2003 ; Pokorny, 2003). Elle affecte galement la valeur nutritionnelle des aliments en entranant la

perte dacides gras essentiels mais aussi de vitamines et dacides amins indispensables.

Enfin, la toxicit de produits doxydation des lipides a t observe lors de ladministration de

doses importantes de ces composs des animaux. Or, mme sil est rare de consommer des

aliments contenant des quantits importantes de produits doxydation, notamment en raison de

lodeur que ces produits dveloppent, il existe ce jour peu de donnes quant aux risques lis une

ingestion rgulire daliments faiblement oxyds. Enfin, les risques lis la peroxydation lipidique

au cours du passage et de la transformation des aliments dans le tractus digestif commencent

seulement tre considrs (Villire et Genot, 2006).

1.6. Inhibition de la peroxydation des lipides

Lauto-oxydation des lipides insaturs ne peut tre vite qu'en l'absence totale d'oxygne. En

pratique, elle ne peut jamais tre totalement exclue, mais uniquement freine ou retarde en mettant

en uvre les moyens suivants :

exclusion partielle de l'oxygne: possible par un emballage sous vide ou par adjonction de

glucose oxydase dont l'action est de consommer l'oxygne rsiduel.

entreposage basse temprature et dans l'obscurit. La vitesse de l'auto-oxydation s'en

trouve rduite. Pour les fruits et lgumes qui contiennent l'enzyme lipoxygnase, cette

mesure est en rgle gnrale insuffisante: une dgradation peut uniquement tre vite si

l'enzyme a t inactive par un blanchiment pralable,

addition d'antioxydants (Bauer et al., 2010).

Chapitre II : Antioxydants Synthse bibliographique

ENSA 2012Page12

II. Les antioxydants :

2.1.Dfinition dun antioxydant:

Dans un systme biologique, un antioxydant est dfini comme toute substance qui, si prsente

faible concentration compare celle du substrat oxydable, retarde ou prvient de manire

significative l'oxydation de ce substrat (Halliwell, 1995 ; Halliwell et Gutteridge, 1999).

En termes daliments, les antioxydants peuvent tre dfinis comme toutes les substances qui

sont capables de retarder ou empcher le dveloppement de la rancidit ou de toute autre

dtrioration de saveur dans les aliments due l'oxydation. Les antioxydants retardent le

dveloppement des mauvaises odeurs en tendant la priode d'induction. L'addition des

antioxydants aprs la fin de cette priode tend tre inefficace retarder le dveloppement de

rancidit (Glin, 2011).

Le substrat oxydable peut tre toute molcule qui se trouve dans les aliments ou matriaux

biologiques, y compris les hydrates de carbone, lADN, les lipides, et les protines. Laliment est un

systme plusieurs composants constitu de varit de biomolcules, et donc, cette dfinition dcrit

bien un antioxydant (Wanasundara et Shahidi, 2005).

2.2.Utilit alimentaire :

Matriser l'oxydation est indispensable pour grer l'volution des systmes biologiques dans

leur complexit, en particulier dans le cas des aliments dont la dgradation peut avoir des

consquences sur la scurit alimentaire. L'activit antioxydante est value soit par le dosage des

produits forms (en particulier des hydroperoxydes) par des techniques photomtriques plus ou

moins directes, soit par la mesure de l'efficacit du compos piger des radicaux libres.

Pour limiter l'oxydation, l'industrie agroalimentaire peut baisser le taux d'oxygne

(immersion, vide, atmosphre sous azote), ralentir les ractions par rfrigration ou conglation,

dtruire les enzymes d'oxydation (polyphnols oxydases) par blanchiment, et user d'antioxydants

inhibant l'oxydation induite par l'oxygne molculaire.

En limitant les risques de radicaux libres, la prsence d'antioxydants, combine d'autres

techniques, est indispensable la stabilit des produits. (Marc et al., 2004).

2.3.Proprits :

L'antioxydant alimentaire idal, et facilement incorporable et efficace faible dose, est non

toxique, n'entrane ni coloration, ni odeur, ni saveur indsirable. Il est rsistant aux processus

technologiques et stable dans le produit fini (Marc et al., 2004).


ENSA 2012Page13

Il s'agit, en fait, d'agents de prvention ou de terminaison capables d'viter ou de piger les

radicaux libres en bloquant l'initiation, en complexant les catalyseurs, en ragissant avec l'oxygne

ou en dviant de l'aliment les effets de lumire ou les rayonnements (Wannas, 2000).

Bien que la plupart des matires premires utilises contiennent dj des antioxydants

naturels, durant les procds de fabrication des aliments, ils en sont appauvris, ncessitant l'addition

d'antioxydants synthtiques. Les antioxydants peuvent tre efficaces de trs faibles concentrations,

0,01%, mais ils ne peuvent ni rendre le processus d'oxydation rciproque ni prvenir la rancidit

hydraulique (Madhavi et al., 1996).

2.3.1. Les antioxydants synthtiques :

Pour une utilisation pratique, les antioxydants doivent remplir les conditions suivantes: ils ne

doivent pas tre toxiques, ils doivent tre hautement actifs de faibles concentrations (0,01-0,02%)

et tre prsents la surface ou dans la phase grasse de l'aliment. De ce fait, les antioxydants

fortement lipophiles sont particulirement indiqus pour des mulsions de type huile dans eau H/E

(p. ex. BHA, BHT, tocophrol, gallate de dodcyle). En revanche, les antioxydants TBHQ, plus

fortementpolaires, et les gallates de propyle sont particulirement actifs dans les graisses et les

huiles, tant donn qu'ils se trouvent surtout dans linterface lipide-air. Ces antioxydants doivent

pouvoir rsister aux oprations unitaires de la technologie alimentaire.

Cependant lutilisation des antioxydants synthtiques tels que le butylhydroxyanisole (BHA)

et le butylhydroxytolune (BHT) (figure 5) dans les industries agroalimentaire, cosmtique et

pharmaceutique est suspecte long terme deffets tratognes, mutagnes et cancrignes

(Chavron , 1999).

Figure 5 : Formules dveloppes du BHA et du BHT

2.3.2. Les antioxydants naturels :

Le remplacement des antioxydants synthtiques par ceux naturels peut avoir des avantages

dus aux implications de sant et la fonctionnalit telle que la solubilit dans l'huile et l'eau,

d'intrt pour les mulsions, dans les systmes alimentaires. Cependant, certains d'entre eux comme


ENSA 2012Page14

ceux des pices et des herbes (origan, thym, dictame, marjolaine, lavande, romarin) ont des

applications limites malgr leur activit antioxydante leve, parce quils donnent une saveur

caractristique de l'herbe l'aliment, et donc, des tapes de dsodorisation sont requises (Reglero et

al., 1999).

Les caractristiques organoleptiques des extraits doivent convenir l'incorporation dans les

produits alimentaires sans confrer la saveur intense de lherbe qui peut limiter quelques

applications, comme se produit pour l'extrait naturel de romarin qui a d'excellentes proprits

antioxydantes (Moure et al., 2001).

La majorit des antioxydants naturels sont les composs phnoliques, et les groupes les plus

importants des antioxydants naturels sont les tocophrols, les flavonodes et les acides phnoliques

(Glin, 2011).

2.4.Mcanismes d'action des antioxydants :

Les antioxydants peuvent agir contre loxydation de deux manires distinctes : soit en

protgeant les lipides cibles des initiateurs de loxydation, soit en interrompant la phase de

propagation (Leger, 2006).

Selon cette classification, certains antioxydants prsentent plus d'un mcanisme d'activit, par

consquent, appels antioxydants multiples-fonctions. Une autre classification couramment utilise

catgorise les antioxydants en antioxydants primaires : pigeurs de l'oxygne, et antioxydants

secondaires : enzymatiques et chlateurs/squestrants (Wanasundara et Shahidi, 2005).

Dans le premier cas, les antioxydants dits prventifs (ou retardeurs), empchent la formation

ou pigent les ERO responsables de linitiationde loxydation (O-2, 1O2.). Dans le second cas, les

antioxydants dits briseurs de chane interceptent les radicaux propagateurs de loxydation

(lipoperoxyradicaux, ou ROO) ou participent indirectement linterruption de loxydation

radicalaire en chane (Laguerre et al., 2007a).

2.4.1. Antioxydants prventifs

Il y a diffrentes voies prventives d'anti-oxydation en raison de la gamme diverse des

initiateurs disponibles d'oxydation.Ces voies incluent la chlation des mtaux de transition, de la

dsactivation de l'oxygne singulet, de la dsintoxication enzymatique de ERO, de la filtration UV,

de l'inhibition des enzymes pro-oxydant, des cofacteurs antioxydants d'enzymes, etcIci, nous

dcrirons seulement les plus renomms.


ENSA 2012Page15

La dtoxification des ERO constitue une voie de prvention primordiale de loxydation,

principalement relaye par les systmes antioxydants enzymatiques endognes.

Tout dabord, la superoxyde dismutase, une mtalloenzyme ubiquitaire chez les eucaryotes,

catalyse la raction de dismutation de lanion superoxyde en peroxyde dhydrogne et en oxygne

(Laguerre et al., 2007a). SOD

2O-2+ 2H+ H2O2+ O2

La glutathion peroxydase (GSH-Px), une autre enzyme, ayant une activit de dtoxification

qui concerne trois espces ractives : le peroxyde d'hydrogne, hydroperoxydes des lipides et

peroxynitrite, qui est une espce d'azote fortement ractive.GSH-Px est une enzyme slno-

dpendant contenant quatre atomes de slnium situs, sous forme de slno-cystine, au noyau

actif de l'enzyme. En particulier, cette enzyme dtoxifie le peroxyde dhydrogne en acclrant la

raction doxydation du glutathion (thiol peptidique) par le peroxyde dhydrogne, qui est alors

rduit en eau (Laguerre et al., 2007a). GSH-Px

H2O2+ 2GSH 2 H2O + GSSG

Une troisime enzyme, la catalase (CAT), a galement comme substrat le peroxyde

dhydrogne quelle rduit en eau et en oxygne molculaire.Cette enzyme hminique se produit

principalement dans les peroxysomes et les rythrocytes (Laguerre et al.,, 2007a).

2H2O2 2 H2O + O2

In vivo, il est classiquement admis quil existe une cooprationtroite entre ces diffrentes

enzymes. Ainsi, lactivit superoxyde dismutaseconduit la formation de peroxydes dhydrogne

dont la dtoxification est alors prise en charge par le systme catalase et/ou glutathion peroxydase

(Laguerre et al., 2007a).

Les chlateurs de mtaux de transition comme le cuivre et le fer peuvent prvenir loxydation

en formant des complexes ou des composs de coordination avec les mtaux. Il sagit de protines

telles que la transferrine, la ferritine, la lactalbumine qui squestrent le fer, ou encore la

cruloplasmine et lalbumine qui squestrent le cuivre. Les polyphosphates, lacide

thylnediaminettractique, lacide citrique, les acides phnoliques et les flavonodes sont

galement connus pour leur capacit chlater les mtaux de transition (Laguerre et al., 2007b).

Il semblerait cependant que limportance de ce type dantioxydation dpende troitement de

la cible protger. Compar lactivit antiradicalaire par capture de ERO, ce mode daction serait


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mineur dans linhibition de la peroxydation lipidique mais prdominant dans linhibition de la

coupure oxydante des brins dADN (Dangles, 2006).

Dsactivateurs de l'oxygne singulet

Selon Buettner (1999), ils peuvent agir par dsactivation chimique en se fixant sur une

molcule tel quun acide gras pour donner un hydroperoxyde (raction 11) ou encore par

dsactivation physique liminant lnergie dexcitation sans changement chimique (raction 12).

1O2 + LHROOH (11) 1O2 + b-carotneO2 + -carotne*(12)

Les carotnodes sont, en ltat actuel de nos connaissances, les molculesles plus efficaces

pour piger loxygne singulet. Les carotnodes peuvent tre des hydrocarbures purs appels

carotnes (lycopne, -carotne...) ou possder un groupement fonctionnel oxygn et dans ce cas,

sappeler xanthophylles (astaxanthine, lutine...) (Krinsky, 1998).

Le lycopne est le plus ractif. Sa vitesse de raction avec 1O2 est particulirement leve (31

109 M1S1) [13]. Le -carotne ragit avec 1O2 avec une vitesse de raction 6 fois plus faible (5

109 M1S1).

Les tocophrols (2,7 107 M1S1), les thiols, lacide ascorbique (1 108 M1S1) sont moins

efficaces vis vis de la dsactivation de 1O2. Nanmoins ces composs ont des concentrations

leves dans les systmes biologiques et contribuent galit avec les carotnodes la

dsactivation de 1O2. Un acide amin comme lhistidine est aussi un bon quencher de 1O2

(Cillard et Cillard, 2006).

2.4.2. Antioxydants chain breaking ou mcanisme briseur de chane

Les antioxydants primaires, galement appels antiradicalaires, sont des molcules capables

de bloquer les radicaux lipidiques R, RO et ROO par transfert dun H :

ROO + AOH ROOH + AO

Lantioxydant devient alors lui-mme porteur dun radical, mais la diffrence des radicaux

lipidiques, il est peu ractif, ce qui stoppe la propagation radicalaire. Ce groupe dantiradicalaires

est constitu presque exclusivement de composs phnoliques en raison de la grande stabilit

apporte par leur cycle aromatique. On trouvera ainsi dans ce groupe les additifs antioxydants,

BHA, BHT, TBHQ, gallates, mais aussi les tocophrols (vitamine E) et les polyphnols vgtaux

(flavonodes, acides phnoliques, diterpnodes) (Berset, 2006).


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Cette catgorie dantioxydants va ragir le plus souvent avec les radicaux peroxyles ou

alcoxyles, interrompant ainsi la raction de propagation de la peroxydation. Il est noter que ces

antioxydants ninhiberont pas par consquent lauto-oxydation des lipides par loxygne singulet.

Ces antioxydants peuvent agir selon deux mcanismes :

les donneurs dhydrogne : Cest le cas leplus frquent. Ils doivent avoir un potentiel de

rduction infrieur au potentiel des AGPI (E = 0,6 V) et doivent pouvoir donner un hydrogne au

radical alcoxyle (E = 1,6V) et au radical peroxyle (E = 1V). Ces antioxydants sont principalement

des composs phnoliques mono- ou polyhydroxyls (tocophrols, tocotrinols, BHT, BHA,

flavonodes...) avec diverses substitutions sur les noyaux.

Aprs la raction doxydation, lantioxydant est transform en un radical qui doit tre

suffisamment stable pour inhiber la formation dun autre radical et arrter ainsi la propagation de la

chane radicalaire. Il doit ensuite voluer vers un produit doxydation stable, ce qui conduit la

consommation de lantioxydant.

Ces antioxydants introduisent une phase de latence ou lag phase pendant laquelle la

peroxydation lipidique est trs faible et qui persiste tant que lantioxydant nest pas consomm par

les radicaux peroxyles. Aprs la disparition complte de lantioxydant, la vitesse de la peroxydation

augmente trs rapidement (Cillard et Cillard, 2006).

Les antioxydants sacrifis :Le qualificatif de chain breaking antioxidant sacrificial

employ par Buettner concerne des molcules, elles-mmes radicalaires, qui ragissent avec les

radicaux peroxyles ou alcoxyles pour donner des produits non radicalaires interrompant ainsi la

propagation de la peroxydation.

Deux radicaux sont connus pour se combiner avec les radicaux peroxyles : le monoxyde

dazote (NO) et lanion superoxyde (O2-) (Cillard et Cillard, 2006).

2.5.Les tudes defficacitdes antioxydants

Pour mesurer lefficacit dun antioxydant, deux possibilits soffrent au formulateur :

Soit mettre en uvre un test de vieillissement en conditions normales de stockage :

parfaitement reprsentatif, ce type de test est long et incompatible avec les contraintes de

dveloppement dun produit.

Soit mettre en uvre un test acclr, pour gagner du temps lors des dveloppementsde

produits. Plusieurs types de tests acclrspeuvent tre envisags :


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2.5.1. des tests trs modliss, mettant en uvre des substrats modles (esters) dans des milieux

modles parfois loigns de la matrice huile , et dans des conditions souvent assez drastiques.

Citons titre dexemples le test DPPH (dipicrylphnylhydrazine), le test de co-oxydation au -

carotne, et plus rcemment mis au point, le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Le

principe de ce dernier est le suivant : mesure de la destruction dune protine vgtale, qui possde

la proprit de fluorescer lorsquelle est soumise un rayonnement lumineux spcifique. Sous

laction des radicaux libres prsents dans le milieu ractionnel, la protine est dtruite et perd sa

fluorescence, tandis quen prsence dun capteur de radicaux libres (antioxydant) la fluorescence

persiste : ce test permet dvaluer la capacit globale dantioxydation (pouvoir antiradicalaire) dun

extrait vgtal, par rfrence un standard qui est le TROLOX (vitamine E sous forme

hydrosoluble, dpourvue de chane carbone). Ces tests modliss permettent de raliser un premier

screening conduisant au classement des antioxydants tests en deux groupes : ceux qui ont une

efficacit, ceux qui en ont aucune (Judde, 2004).

2.5.2. des tests doxydabilit acclre types test Rancimat (ISO 6886), Oxydograph ou

Oxipress. Le test Rancimat est le plus connu : la spcification de TIR (soit le Temps dInduction au

test Rancimat, exprim en heures) est encore utilise dans les cahiers des charges des corps gras.

Elle correspond au temps pendant lequel lhuile vgtale a rsist un stress oxydatif. Le principe

est le suivant : la prise dessai de corps gras est soumise une temprature leve (98 C) et un

bullage intensif dair, ce qui dclenche les ractions doxydation, et notamment la libration

dacides organiques volatils, entrans et pigs dans une cellule contenant de leau distille, dont la

conductivitva varierconscutivement. Lenregistrement repre le moment partir duquel cette

conductivit varie et qui correspond au TIR. Lavantage de ce type de test est la possibilit de suivre

en parallle plusieurs chantillons, avec des dures danalyse rduites. Linconvnient majeur

repose sur les conditions mmes du test, trs drastiques, et peu reprsentatives des conditions

normales de stockage. En consquence, les rsultats obtenus grce un test Rancimat ne peuvent

tre transposs directement (Judde, 2004).

2.5.3. les tests en conditions acclres en enceinte thermostate: les conditions de ces tests

doivent tre ajustes au cas par cas, lobjectif de lessai, la nature de la matrice, la nature du

corps gras, et dbouchent sur le choix des facteurs acclrateurs de loxydation (niveau de

temprature, prsence de la lumire), sur la slection des mthodes dvaluation de loxydation et

sur la dfinition des points de cintique (Judde, 2004).

Dans tous les cas, les conditions seront choisies les plus douces possible, ce qui implique des

tests assez lents (en semaines en gnral), mais qui rservent lapproche la plus cohrente avec ce

qui se passe en conditions normales de stockage.

Chapitre III : Polyphnols Synthse bibliographique

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III. Polyphnols :

3.1. Dfinition :

Lappellation polyphnols ou composs phnoliques regroupe un vaste ensemble de

plus de 8 000 molcules, divises en une dizaine de classes chimiques, qui prsentent toutes un

point commun : la prsence dans leur structure dau moins un cycle aromatique 6 carbones, lui-

mme porteur dun nombre variable de fonctions hydroxyles (OH) (Hennebelle et al., 2004).

3.2. Structure et classification des polyphnols :

La structure des composs phnoliques va du simple noyau aromatique de faible poids

molculaire jusquaux tanins complexes de trs haut poids molculaire, et ils peuvent tre classs

selon le nombre et larrangement des atomes de carbone qui les composent, en fonction de la nature

de leur squelette carbon et en fonction de la longueur de la chane aliphatique lie au noyau

benznique(Cheynier et al., 1997 ; Bravo, 1998).

En dpit de cette diversit structurale, ces composs sont souvent dsigns sous le nom des

polyphnols (Balasundram et al., 2006).

La plupart des composs phnoliques naturels sont prsents conjugus avec des mono et des

polysaccharides, lis un ou plusieurs groupes phnoliques (Harborne, 1989; Harborne et al.,

1999 ; Chira et al., 2008 ) et peuvent galement se produire comme drivs fonctionnels tels que

les esters et les esters mthyliques. Cependant une telle diversit structurale a comme consquence

l'ventail de composs phnoliques qui se produisent dans la nature, ces composs phnoliques

peuvent fondamentalement tre classs par catgorie dans plusieurs classes comme montr dans

letableau 3 (Harborne, 1989; Harborne et al., 1999).

Les principales classes des polyphnols sont dfinies selon la nature de leur squelette de

carbone :acides phnoliques, flavonodes, stilbnes moins communs, et lignanes. Les acides

phnoliques sont abondants dans les aliments.Les plus frquemment rencontrs sont l'acide

caffique et, un moindre degr, l'acide frulique.

De ces classes, les acides phnoliques, les flavonodes et les tanins sont considrs comme les

principaux composs phnoliques alimentaires (King et Young, 1999).


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Tableau 3 : Classes des composs phnoliques dans les plantes(Harborne, 1989; Harborne et al.,

1999).

Classe Structure

Polyphnols simples, benzoquinones C6

Acides hydroxybenzoques C6C1

Acethophnones, acides phnylactiques C6C2

Acides hydroxycinnamique , phnylpropanoides C6C3

(coumarines, isocoumarines, chromones, chromenes)

Napthoquinones C6C4

Xanthones C6C1C6

Stilbnes, anthraquinones C6C2C6

Flavonodes, isoflavonodes C6C3C6

Lignanes, neolignanes (C6C3)2

Biflavonodes (C6C3C6)2

Lignines (C6C3)n

Tanins condenss (proanthocyanidines ou flavolanes) (C6C3C6)n

3.2.1. Formes les plus simples :

Les formes phnoliques les plus simples prsentent des structures chimiques allant du simple

phnol en C6 (non prsent naturellement chez les vgtaux) aux flavonodes en C15 et des

molcules proches. Sauf exceptions, ces substances sont prsentes sous forme soluble dans la

vacuole (Macheix et al.,2006).

a. Les acides phnoliques :

Les acides phnoliques se composent de deux sous-groupes, c.--d., les acides

hydroxybenzoques et hydroxycinnamiques (figure 6). Les acides hydroxybenzoques incluent les

acides : gallique, p-hydroxybenzoque, protocatchique, vanillique et syringique, qui ont en

commun la structure C6-C1. Les acides hydroxycinnamiques, d'autre part, sont les composs

aromatiques avec une chane latrale de trois-carbone (C6-C3), avec les acides caffique, frulique,

p-coumarique et sinapique tant les plus communs (Bravo, 1998).

Bien que les fruits et les lgumes contiennent beaucoup d'acides phnoliques libres, dans les

grains et les ppins en particulier dans le son ou la coque. Les acides phnoliques sont souvent sous

forme lie. Ces acides phnoliques peuvent seulement tre librs ou hydrolyss par hydrolyse

acide ou alcaline, ou par des enzymes (Tsao, 2010)


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Figure 6 : Acides phnoliques typiques dans les aliments

b. Les flavonodes :

Les flavonodes, les polyphnols les plus abondants dans nos rgimes, les plus nombreux

(plus de 5 000 molcules isoles) et les plus connus, peuvent tre divises en plusieurs classes selon

le degr d'oxydation de l'oxygne htrocyclique (Reinli et Block, 1996; Scalbert et Willamson,

2000) : Les flavonodes stricto sensu, pigments vgtaux jaune-orang (leur nom venant du mot

latin flavus : jaune), les anthocyanes, composs de couleur rouge violet et un groupe de tanins, les

proanthocyanidines, molcules incolores et trs hydrosolubles (Kris-Etherton et al., 2002).

Les flavonodes sont les composs faible poids molculaire, se composant de quinze atomes

de carbone, disposs dans une configuration C6-C3-C6. Essentiellement,leur structure se compose

de deux anneaux aromatiques A et B, unis par un pont 3-carbones, habituellement sous forme

d'anneau htrocyclique C (Figure 7).L'anneau aromatique A est driv de la voie

d'actate/malonate, alors que l'anneau B est driv de la phnylalanine par la voie de shikimate

(Bohm, 1998 ; Merken et Beecher, 2000).


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Figure 7 : Structure gnrique dune molcule de flavonode

Les variations des modles de substitution par rapport l'anneau C ont comme consquence

les principales classes des flavonodes, c.

catchine), isoflavones, flavanonols, et anthocyanidines (figure 8)

quelles les flavones et les

diverses(Harborne et al., 1999).

diffrents composs dans chaque classe des flavonodes

inclure l'oxygnation, l'alkylation, la

Hollman et Katan, 1999).

Figure 8 :

Polyphnols Synthse bibliographique

Structure gnrique dune molcule de flavonode


les principales classes des flavonodes, c.--d., flavonols, flavones, flavanones, flavanols (ou

catchine), isoflavones, flavanonols, et anthocyanidines (figure 8) (Hollman et Katan, 1999)

les flavonols sont les plus largement rencontres et structurellement

1999). Les substitutions par rapport aux anneaux A et B provoquent les

diffrents composs dans chaque classe des flavonodes (Pietta, 2000). Ces substitutions peuvent

l'oxygnation, l'alkylation, la glycosylation, l'acylation et la sulfatation

8 : Les principales classes des flavonodes

Polyphnols Synthse bibliographique

Structure gnrique dune molcule de flavonode


d., flavonols, flavones, flavanones, flavanols (ou

Hollman et Katan, 1999), des

plus largement rencontres et structurellement

Les substitutions par rapport aux anneaux A et B provoquent les

Ces substitutions peuvent

et la sulfatation (Bohm, 1998;


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c. Autres exemples :

A ct des composs voqus ci-dessous, de trs nombreux autres phnols peuvent tre

prsents chez les vgtaux. Ainsi, la tyrosine est un acide amin de nature phnolique constitutif des

protines chez tous les tres vivants. Parmi les phnols simples, on peut citer le catchol et le

pyrogallol, un aldhyde comme la vanilline, constituant majeure de larme de la vanille,

loleuropine responsable de lamertume de lolive (Macheix et al., 2006).

Certains terpnes (thymol, gossypol), des alcalodes (morphine, papavrine) ou encore

des composs azots comme la btanidine (pigment rouge de la betterave) sont galement de nature

phnolique, bien que rattachs dautres groupes de mtabolites secondaires par leur origine

biosynthtique et leurs proprits. Les tocophrols (vitamine E) et les tocotrinols sont galement

caractriss par un noyau portant un hydroxyle phnolique (Macheix et al., 2006).

Les quinones (benzoquinones, naphtoquinones dont la juglone, anthraquinones) peuvent

galement tre rattaches aux composs phnoliques simples dont elles drivent par processus

oxydatifs (Macheix et al., 2006).

3.2.2. Formes condenss :

a. Les tanins :

Les tanins sont des polyphnols vgtaux de poids molculaire lev diviss en deux groupes

chimiquement et biologiquement distinctes: les tanins condenss ou proanthocyanidines

(th, raisins, canneberges, etc), et les tanins hydrolysables : ellagitanins (Ets) (framboises, fraises,

grenades) et gallotanins (GTs) (Aguilar et al., 2008).

Les tanins, les composs de poids molculaire relativement lev qui constituent le troisime

groupe important des composs phnoliques peuvent tre subdiviss en tanins hydrolysables et

tanins condenss. Les premiers sont des esters d'acide gallique (gallo- et ellagi-tanins), alors que les

derniers (galement connu comme proanthocyanidines) sont des polymres des monomres de

polyhydroxyflavan-3-ol (Porter, 1989). Une troi

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