MEMORIA DE PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMAfacultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/... · poblaciones, identificación y aislamiento de vírgenes,…) -Extracción DNA y

2008

VALENTIA BIOPHARMA S.L. EDUARDO L. CALPENA CORPAS PRÁCTICA Nº 08P220E001

[MEMORIA DE PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA] DROSOPHILA COMO MODELO PARA PATOLOGÍAS GENÉTICAS. LABORATORIO I+D (PCR, TÉCNICAS GENÉTICAS, VECTORES CLONACIÓN,…)

Eduardo L. Calpena Corpas

PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMA

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MEMORIA DE PRÁCTICAS EN EMPRESA

VALENTIA BIOPHARMA

EDUARDO LUIS CALPENA CORPAS

Nº PRÁCTICA: 08P220E001/08P220E001B



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Índice

INTRODUCCIÓN........................................................................................................................... 4

Información general ................................................................................................................... 4 La empresa: VALENTIA BIOPHARMA ..................................................................................... 4 Mis actividades .......................................................................................................................... 4

DROSOPHILA MELANOGASTER ................................................................................................ 5

Ciclo biológico ........................................................................................................................... 5 1. Huevo ............................................................................................................................ 6 2. Larva .............................................................................................................................. 6 3. Pupa .............................................................................................................................. 6 4. Imago ............................................................................................................................. 6 5. Adulto ............................................................................................................................ 7

Morfología externa .................................................................................................................... 7 Identificación del sexo en la mosca adulta ................................................................................ 7 Manejo de Drosophila ............................................................................................................... 8 Recolección de hembras vírgenes ............................................................................................ 9 Cruces ....................................................................................................................................... 9 Recomendaciones para el cuidado de cultivos ....................................................................... 10 Moscas transgénicas ............................................................................................................... 10

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ..................................................... 11

Técnicas de aislamiento de DNA plasmídico .......................................................................... 11 Extracción de RNA .................................................................................................................. 12 Técnicas de análisis de DNA .................................................................................................. 12 Amplificación del DNA mediante PCR .................................................................................... 13 Mutagénesis dirigida ............................................................................................................... 14 Digestiones de DNA con endonucleasas de restricción ......................................................... 15 Ligación de fragmentos de DNA ............................................................................................. 15

TRANSFORMACION GENÉTICA DE MICROORGANISMOS ................................................... 15

Preparación de células competentes (método del cloruro de rubidio) .................................... 15 Transformación mediante choque térmico .............................................................................. 15 Transformación mediante electroporación .............................................................................. 15

CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 16



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INTRODUCCIÓN

Información general

Empresa: Valentia Biopharma S.L., localizada en el Parc Científic Universitat de València

Tutora: M.Carmen Álvarez Abril

Duración: 464 Horas, distribuidas entre Julio, Agosto y Septiembre

Contenido de las prácticas: Drosophila como modelo para patologías genéticas. Laboratorio I+D (PCR, técnicas genéticas, vectores clonación,…)

La empresa: VALENTIA BIOPHARMA El objetivo de Valentia Biopharma es el desarrollo de nuevas formas de terapia capaces de

aportar soluciones a patologías humanas que actualmente no tienen tratamiento efectivo; para

ello la compañía cuenta con un programa de

Drug Discovery basado en la modelización de

enfermedades humanas en Drosophila y el

rastreo de compuestos a gran escala in vivo.

Con este objetivo la empresa ha desarrollado

una plataforma biotecnológica en el campo de la

Genética del Desarrollo y aborda programas de

investigación orientados inicialmente a

patologías genéticas como la distrofia miotónica. La distrofia miotónica es una enfermedad

genética degenerativa. Los afectados por esta enfermedad, se caracterizan, principalmente,

por miotonía (incapacidad para relajar los músculos) y miopatía (degeneración muscular). Esta

enfermedad está catalogada como enfermedad rara puesto que tiene una prevalencia de 1 por

cada 8.000 nacimientos vivos. Actualmente no se dispone de ningún tratamiento efectivo para

esta patología.

Mis actividades -Tareas generales de mantenimiento del laboratorio (preparación de medios de cultivo y de tampones específicos, utilización del autoclave,…) -Manejo de Drosophila (cultivo y mantenimiento, cruzamientos, sexar poblaciones, identificación y aislamiento de vírgenes,…) -Extracción DNA y RNA de Drosophila -PCR, PCR de colonias -Mutagénesis dirigida por PCR mediante extensión de fragmentos que se solapan -Localización de inserciones mediante PCR inversa y mapeo genético

-Clonaciones (digestiones, ligaciones,…) -Purificación de ácidos nucleicos -Análisis de secuencias -Diseño de oligonucleótidos -Minis y maxis preparaciones -Transformación de células competentes (electroporación, choque térmico,…) -Generación de células competentes de Escherichia coli -Técnicas electroforéticas,…



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DROSOPHILA MELANOGASTER Drosophila melanogaster es una mosca de tamaño pequeño (3 mm en estado adulto) y que

también es conocida como la “mosca de la fruta o del vinagre”. Se ha utilizado como organismo

experimental en estudios genéticos desde principios del siglo pasado (utilizada a partir de

1905). Ha sido el organismo más utilizado por los genéticos, debido a que presenta grandes

ventajas:

-facilidad de cultivo

-tiempo generacional corto (9 a 11 días a 25ºC)

-progenie prolífica

-pequeño tamaño

-número reducido de cromosomas (2n=8)

-cromosomas politénicos en glándulas salivales

-numerosos mutantes

Drosophila melanogaster tiene tres pares de autosomas (cromosomas 2, 3 y 4) y un par de cromosomas sexuales (cromosomas X e Y). La determinación del sexo en este organismo es XX para las hembras y XY para los machos. Los cromosomas 2 y 3 son metacéntricos y el 4 es puntiforme. Los cromosomas sexuales son telocéntricos.

Ciclo biológico D. melanogaster tiene un ciclo biológico que incluye varios estados: huevo, larva (L1, L2 y L3), pupa, imago y adulto. La duración del ciclo de vida varía con la temperatura. A 25ºC, el ciclo de vida completo dura de 9 a 11 días, mientras que a 20ºC la duración es de 15 días. La exposición continua a temperaturas superiores a 30ºC puede conducir a la esterilización y muerte de las moscas. Así mismo, las bajas temperaturas, inferiores a 20ºC hacen decrecer la viabilidad de las moscas y prolongan su ciclo vital. La temperatura óptima para el cultivo es de 25ºC. Los stocks de moscas pueden almacenarse en cámaras a 19ºC.



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1. Huevo La fecundación tiene lugar dentro del útero. A partir de la formación del cigoto, comienza el desarrollo embrionario. El embrión se desarrolla dentro de las membranas del huevo, permaneciendo durante los estados iniciales del desarrollo en el cuerpo de la madre y siendo depositado después. Una hembra puede empezar a depositar huevos después del segundo día de emerger y la puesta puede continuar hasta unos 10 días después. El huevo es de forma ovoide, cubierto por una fuerte membrana quitinosa, el corion, con la cara dorsal más aplastada que la ventral que es redondeada. La superficie del corion presenta unas marcas o relieves hexagonales. El huevo viene a tener un tamaño de 0.5 mm. De su parte anterior se proyectan dos apéndices en cuyo extremo se encuentran una especie de palas, a modo de remos, cuya función es la de hacer de flotadores para prevenir el hundimiento del huevo en la superficie semilíquida en que son depositados. En la parte anterior, entre los dos apéndices, hay un poro diminuto, el micropilo, que es precisamente por donde penetra el espermatozoide para fecundar a la célula huevo.

2. Larva Terminado el desarrollo embrionario emerge del huevo la larva, que es un pequeño gusanillo de gran movilidad, blanco, segmentado, con unas piezas negras en su región anterior, mandíbulas. En las regiones anterior y posterior tiene un par de espiráculos de función traqueal. La larva sufre dos mudas hasta alcanzar el tamaño adulto, a cada periodo entre muda y muda se le denomina estadío larvario. El cambio se produce cuando se rasga la piel del estadío anterior y sale de ella una larva un poco mayor. El primer estadío larvario (L1) es el periodo comprendido entre el nacimiento y la primera muda, el segundo estadío larvario (L2) comprende el periodo entre las mudas primera y segunda y el tercer estadío larvario (L3) va desde la segunda muda hasta la inmovilización de la larva para dar lugar a la pupa. En el tercer estadío larvario la larva llega a alcanzar un longitud de 4.5 mm. Las larvas constituyen el material idóneo para el estudio de los cromosomas politénicos presentes en las células de las glándulas salivales, de ahí la necesidad de conocer sus características y desarrollo. Todo el periodo larvario es de gran movilidad; la larva no cesa de moverse y alimentarse formando unos canalillos característicos por todo el medio de cultivo. La distinción entre los estadíos larvarios se puede hacer fijándose tanto en el tamaño de la larva como en el número de piezas mandibulares. El estado larval se extiende aproximadamente 4 días a 25ºC.

3. Pupa La larva en el tercer estadío cambia sus espiráculos por las antenas pupales y un poco después se va inmovilizando y acortando su longitud, la cutícula se oscurece y fortalece formando el puparium. A esta prepupa se le puede considerar también como el cuarto estadío larvario que termina con una muda. A partir de entonces comienza el periodo de pupa o crisálida en el que se producen grandes cambios histolíticos e histológicos para dar lugar a los tejidos adultos. Las estructuras del adulto que se van adquiriendo van tomando más forma y color conforme avanza el estado de pupa. Los tejidos localizados en el preadulto se llaman discos imaginales y, debido a la facilidad de su aislamiento se han utilizado mucho en Genética del Desarrollo o Epigenética. El metabolismo pupal se centra en la sustitución de los tejidos larvarios por los del adulto.

4. Imago Las transformaciones histológicas dan lugar a un individuo adulto, pero sexualmente inmaduro, llamado imago. Si el medio en el que se desarrolla el animal está a 25ºC, entre el cuarto y quinto día de la vida pupal se rasga el puparium y surge el imago. La Drosophila recién emergida es muy clara y tiene las alas sin desplegar. Una hora más tarde despliega las alas y a las 12 horas ya tiene su pigmentación normal de adulto.



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5. Adulto El adulto es el estadío reproductivo del ciclo. Los adultos serán sexualmente maduros después de seis horas de emerger del pupario. En los machos, la formación tiene lugar en los testículos. Las cuatro células derivadas de la meiosis de una célula madre son gametos viables y se acumulan en el saco eyaculador. En las hembras la célula madre de los gametos femeninos se divide en 16 células, de las cuales sólo una experimenta meiosis, las otras se convierten en células nutritivas. La meiosis se detiene en metafase I. El esperma se almacena en las espermatecas y el receptáculo seminal de la hembra será descargado gradualmente en el oviducto, a medida que los huevos pasan a través del mismo a la vagina. Cuando el espermatozoide penetra en el óvulo inmaduro (fecundación) continúa la meiosis con la formación de los corpúsculos polares y la cariogamia. A continuación el núcleo del huevo comienza a dividirse activamente. La hembra comienza a depositar huevos maduros al 2º día de haber emergido de la pupa; aproximadamente entre 50 y 70 huevos por día, durante los primeros días. La producción de huevos decrece con el tiempo. El promedio de vida de la mosca adulta es de 37 días a 25ºC.

Morfología externa

El cuerpo de la mosca adulta se divide en: cabeza, tórax y abdomen.

a. La cabeza está compuesta por 6 segmentos fusionados. En ella se distinguen:

-Antenas, un par, cada una formada por 3 segmentos

-Probóscide, lengua

-Ojos compuestos, constituidos por numerosas facetas u omatidios (780 en las

hembras, 740 en los machos)

-Ocelo, tres, localizados entre los ojos compuestos, sobre la superficie dorsal de la

cabeza.

-Quetas o cerdas, órganos de los sentidos, de distinto tamaño.

b. El tórax está compuesto por tres segmentos fusionados. Se distinguen:

-Protórax, que lleva el primer par de patas. Cada pata consta de: Coxa, trocánter,

fémur, tibia y 5 segmentos tarsales.

-Mesotórax, que porta las alas y el 2º par de patas. Las alas tienen una estructura

membranosa con 5 venas longitudinales y dos transversales cada una.

-Metatórax, que lleva los halterios o balancines y el 3er par de patas.

c. El abdomen consta de 7 segmentos visibles en la hembra y 5 en el macho.

Identificación del sexo en la mosca adulta

Las diferencias en los adultos son las siguientes:

a. Tamaño. La hembra es ligeramente mayor que el macho.

b. Abdomen. La hembra tiene 7 segmentos visibles y el extremo posterior

alargado, cada segmento abdominal tiene en la superficie dorsal una banda de

color más oscuro. El macho tiene 5 segmentos visibles y el extremo posterior

redondeado; los dos últimos segmentos están fusionados.



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c. Región genital. La hembra tiene en la cara ventral del abdomen una placa anal

y la placa vaginal. El macho tiene una placa anal y un arco genital de color

pardo.

d. Peine sexual. Se encuentra sólo en los machos. Es un conjunto de cerdas

sobre cada segmento tarsal proximal del 1er

par de patas.

Manejo de Drosophila

En el laboratorio Drosophila puede cultivarse en botellas estériles con una comida preparada a base de harina de maíz, azúcar, levadura y agar como espesante. Para evitar contaminaciones se añade un fungicida, normalmente nipagín (metil p-oxibenzoato), y un bactericida (ácido propiónico). Una vez solidificada se le añade levadura picada (para proporcionar una fuente de proteínas a las larvas) y opcionalmente un papel en zigzag (para que absorba la humedad). Estos frascos se tapan con un algodón esterilizado y se indica la fecha y el tipo de cepa o cruce cultivado en la botella. Anestesia

Para facilitar su estudio, conviene anestesiar las moscas, para ello hay dos métodos, éter y CO2.

I. Eter

Se toma el frasco donde se encuentran los adultos y se golpea suavemente en un corcho para que caigan hacia el fondo. Se retira el algodón y se vuelca el frasco sobre el eterificador. El eterificador (una botella o tubo de vidrio) se tapa con un algodón impregnado de éter. Cuando las moscas están dormidas se vuelcan sobre un papel y se observan con la lupa. El tiempo que



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tardan las moscas en dormirse es muy variable, y depende bastante de la edad (cuanto más viejas son, antes se duermen).

1.- Hay que tener cuidado, pues una exposición prolongada al éter les puede producir la muerte (se reconoce porque las alas se disponen perpendicularmente al cuerpo). 2.- Hay que cuidar no mantener abierta la botella del cultivo, para evitar que las moscas se escapen o que entren otras y el cultivo se contamine. 3.- No dejar abierto el eterificador ni la botella de éter, ya que además de evaporarse, por su bajo punto de ebullición y cargar el ambiente, hay peligro de explosión, ya que es altamente inflamable. 4.- Antes de eterificar de nuevo, nos hemos de asegurar de que no quedan moscas en el fondo del eterificador. 5.- Si durante una observación o recuento las moscas empiezan a despertarse, se pueden reeterificar, con cuidado de no matarlas. 6.- Para facilitar la observación de los individuos es recomendable alinear todas las moscas sobre la cartulina, pasando la hilera bajo el foco de la lupa. Así se pueden ir separando según nuestro interés. 7.- Cuando se devuelven las moscas dormidas a un frasco con comida, se ha de procurar que éste esté horizontal, para que no se peguen y mueran. La botella no se colocará en posición vertical hasta que estén despiertas. Otro método consiste en meter las moscas en un pequeño cucurucho de papel, que a su vez se mete en el frasco.

II. CO2

El proceso en su inicio es similar, salvo que el algodón con el que se tapa el frasco debe estar seco. A continuación se introduce una aguja perforada por la cual pasará el CO2 y de esta manera, debido a la escasez de oxigeno, las moscas quedan anestesiadas. Se vacía el contenido del frasco eterificador sobre la placa difusora del CO2 sobre la que se realizará la observación. En este caso las moscas no mueren por exceso de anestesia, pero hay que tener cuidado porque se despertarán en el momento que cese el suministro de CO2.

Una vez finalizada la observación, los individuos que no nos interesen se introducen en un frasco (“morgue”) que contiene aceite o una mezcla H2O:EtOH:Eter, para evitar la descomposición de las moscas.

Recolección de hembras vírgenes

Las hembras de D. melanogaster almacenan el esperma de una sola inseminación durante gran parte de su vida reproductiva. Esto supone un inconveniente cuando se trata de realizar estudios genéticos en los cuales es preciso realizar cruces entre genotipos determinados, y por tanto es necesaria la utilización de hembras vírgenes. Hay distintos métodos para seleccionar hembras vírgenes. Uno de ellos es la recolección de hembras imagos (aún sexualmente inmaduras). Son fácilmente identificables: hembras con las alas plegadas y con el cuerpo sin pigmentar. La pigmentación normal no se adquiere hasta horas después de la emergencia.

Cruces La selección de las moscas se hace bajo lupa, con un pincel fino y sobre una placa difusora de

CO2. Se cruzan moscas con fenotipos concretos y normalmente con una proporción de 5♀

(vírgenes) x 3♂. Podemos eliminar los padres a los 5-6 días para no confundirlos con la F1



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Recomendaciones para el cuidado de cultivos

1.- Es importante impedir la contaminación de un cultivo por otras cepas. No se debe dejar nunca la botella destapada para que no entren individuos indeterminados. 2.- Antes de empezar un cultivo, conviene mirar que el frasco no contenga ninguna mosca. 3.- Los cultivos descartados son un nido de infecciones de hongos y ácaros en el laboratorio, por ello cuando un cultivo ya no se necesita, se pone en una estufa de desecación para esterilizarlo y matar todos los individuos. Después se limpia y esteriliza la botella. 4.- Si no se necesitan algunas moscas determinadas se echan a la morgue. 5.-A veces el medio se llena de hongos del género Penicillium, que impiden la marcha normal del cultivo, ya que acaban cubriendo toda la superficie de la comida, haciéndola inaccesible a los adultos. Cuando se prepara la comida suelen usarse trazas de fungicida, pero éste puede accidentalmente no tener efecto, y se produce la infección. Se puede aumentar la dosis de fungicida, pero poco, porque se retrasa el desarrollo del cultivo, o incluso se interrumpe. Conviene esterilizar todo el material utilizado, y subcultivar las cepas contaminadas. 6.- Otra plaga peligrosa para los cultivos la constituyen los ácaros. Se alimentan de larvas y adultos, adhiriéndose a patas, órganos genitales y trompa (las partes que la mosca tiene en contacto con el medio). Todos los ácaros tienen un mayor poder reproductor que Drosophila, por lo que pueden infectar en poco tiempo todo el laboratorio. Sus efectos siempre son nocivos, y por eso conviene detectarlos pronto y combatirlos a tiempo. El cultivo afectado se ha de pasar cada dos o tres días a medio fresco con un papel impregnado en benzil-benzoato, compuesto que ataca selectivamente los ácaros sin afectar a las moscas. Para prevenir, lo mejor es la limpieza y la revisión periódica de los cultivos.

Moscas transgénicas El sistema UAS-GAL4 es un sistema de regulación transcripcional de levaduras por el que la proteína activadora GAL4 (un factor de transcripción) se une a la secuencia UAS (upstream activator sequence, que es el nombre que reciben los enhancers de levaduras), activando la transcripción del gen ubicado hacia la dirección 3’ de dicha secuencia. Se ha demostrado que la expresión de Gal4 es capaz de activar la expresión de un gen reporter ubicado en sentido 3’ de la secuencia UAS en Drosophila y su desarrollo fue posible debido a que es posible, y relativamente sencillo, lograr líneas de moscas transgénicas. Al establecerse este sistema, los distintos laboratorios del mundo han ido generando distintas líneas “promotoras” y distintas líneas “UAS”, de modo tal que actualmente existen miles de ellas y son compartidas por los distintos laboratorios. La gran potencialidad de este sistema para lograr expresión espacio-temporal controlada de genes y el gran número de líneas existentes lo han vuelto una herramienta fundamental en los estudios funcionales en Drosophila.

Esquema del funcionamiento del sistema GAL4-UAS. Cruzando moscas en las que la expresión de Gal4 está dirigida por un promotor específico por una línea que posee un gen de interés downstream de la secuencia UAS, se puede lograr en la progenie la expresión de dicho gen bajo el patrón de expresión dirigido por el promotor de Gal4.



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Una característica importante de este sistema de expresión es su dependencia de la temperatura. Debido a que el sistema ha sido “exportado” de levaduras, su temperatura de funcionamiento óptimo es 28ºC, una temperatura en la que se pueden cultivar a Drosophila, pero que es un poco más elevada que la temperatura óptima (25ºC). Un modo de regular el funcionamiento del sistema es variar la temperatura de cría, pudiéndose optimizar la expresión si se sube la temperatura a 28ºC o disminuirla al bajarla, por ejemplo a 18-21ºC.

TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Técnicas de aislamiento de DNA plasmídico Minipreparaciones de Escherichia coli (método de la lisis alcalina)

Recolección de las bacterias

1. Se cogen 1.5-3 mL de un cultivo de E. coli que se ha dejado creciendo durante toda la noche en agitación a 37°C en LB con ampicilina.

2. Se dispensan en un tubo eppendorf y se centrifuga durante 3 min a 12.000 g. 3. Se retira el sobrenadante. 4. Se da un pulso de centrífuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que aún quede.

Nos quedamos con el precipitado de las bacterias.

Lisis alcalina

5. Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 μl de una solución isotónica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4°C. Se deja a temperatura ambiente durante 5 min.

6. Se añaden al mismo tubo, 200 μl de la solución de lisis (NaOH, SDS) que está a temperatura ambiente. Se agita suavemente con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba no más de 5 min.

Neutralización

7. Se añaden 150 μl de la solución de neutralización (acetato potásico 3M, pH 4,8). Se agita con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces).

Aislamiento de los plásmidos

8. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugación (15 min a 12.000 g y 4°C), formándose un sedimento blanco de aspecto lechoso.

9. El sobrenadante, que contiene mayoritariamente ADN plasmídico, se transfiere a un nuevo tubo al que previamente se ha añadido 1 mL de etanol absoluto. Se mezcla con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se incuba 15 min.

10. Se precipitan los plásmidos por centrifugación (15 min a 12.000 g), se retira cuidadosamente el sobrenadante.

11. Lavado opcional: se añaden al mismo tubo, 900 μl de etanol al 70%. Se mezcla suavemente con la mano por inversión del tubo (unas 10 veces). Se vuelven a precipitar los plásmidos por centrifugación (10 min a 12.000 g), se retira cuidadosamente el sobrenadante.

12. Se da un spin (pulso de centrifugación) y se retira cuidadosamente el sobrenadante que aún quede.

13. Se resuspende el precipitado de plásmidos en 30-50 μl de agua. Se incuba a temperatura ambiente 5 min.

14. Mantener la muestra a 4°C o congelar para su uso posterior.



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Extracción mediante preparado comercial

Cuando es necesario disponer de ADN plasmídico de gran pureza, se utiliza el sistema QIAprep Spin Miniprep Kit de QIAGEN, siguiendo las indicaciones del fabricante. Lo mismo ocurre con las maxipreps (el kit empleado en este caso es específico para obtener grandes cantidades).

Extracción de RNA El RNA total de mosca se extrae en 1 mL de Tri-Reagent (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diluye 1 μL de RNA en 499 μL de agua y se cuantifica su concentración a partir de las medidas de absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro.

Técnicas de análisis de DNA Electroforesis en gel de agarosa

La separación y visualización de plásmidos, fragmentos de restricción o productos de PCR, se realiza mediante electroforesis sumergida horizontal en gel de agarosa de baja electroendósmosis (tipo 1A, Sigma) a la concentración apropiada (0.8-1.5 %), según el tamaño de los ADNs a resolver. El tampón de la electroforesis empleado es TBE (1x). Las muestras se mezclan con tampón de carga (1/10 de su volumen) y se depositan en los pocillos del gel, aplicando a continuación un voltaje constante, hasta que el frente llegue al borde del gel o hasta donde sea suficiente para conseguir una separación de bandas adecuadas a las necesidades (en función de si solo se quiere hacer una comprobación o si se quiere purificar a partir de una banda). Una vez terminada la electroforesis, el gel hay que teñirlo, y para ello se sumerge en una solución de TBE con Sybr Green o con GelRed durante 20 min (se intenta no usar bromuro de etidio debido a su toxicidad). El ADN se visualiza por exposición a luz UV en un transiluminador. Los geles son también fotografiados en una cámara especialmente acondicionada para este cometido. Para conocer el tamaño aproximado de los ADNs presentes en las muestras sometidas a electroforesis, se utilizan como patrones los marcadores de peso molecular VI, VII,… (en función del tamaño de la banda que se espera) o los del marcador 100 pb DNA ladder. Además de servir para conocer el tamaño aproximado,los marcadores nos sirven también para cuantificar, comparando la intensidad de la banda obtenida con la de los marcadores (conocemos la cantidad adicionada y la concentración de cada banda del marcador). Normalmente se prepara 1 µL de marcador, con 1 µL de tampón de carga y 8 µL de agua, cargando los 10 µL obtenidos. Purificación de fragmentos de ADN de los geles de agarosa Una vez realizada la electroforesis en gel de agarosa y visualizadas las bandas de ADN, se corta con un bisturí el trozo de agarosa correspondiente al fragmento de ADN que se quería recuperar y se sigue instrucciones del kit específico según el fabricante. Purificación de ácidos nucleicos

La purificación del producto de digestiones o de PCR se lleva a cabo mediante kit específico (high pure PCR product purification kit de Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Determinación de la concentración de ADN

La determinación de la concentración de ADN de una solución se lleva a cabo mediante método espectrofotométrico. Se determina la absorbancia de la solución de ADN a 260 y 280



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nm utilizando como blanco agua destilada (disolvente utilizado en la disolución del ácido nucleico). La relación A260/A280 sirve para comprobar la pureza de la preparación, considerándose que valores por debajo de 1.8 son indicadores de contaminación por proteínas y/o fenol. Si la concentración es muy baja, es posible concentrar la muestra mediante un concentrador de vacío.

Amplificación del DNA mediante PCR PCR

Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de DNA de interés. Además esta técnica es empleada tanto para verificar la presencia de un inserto determinado en los transformantes obtenidos, como para llevar a cabo mutagénesis dirigida por PCR. El método se basa en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. Se lleva a cabo en un termociclador: permite controlar el tiempo y la temperatura de cada paso, así como repetir los ciclos. Lo primero que se debe hacer es calentar la tapa del termociclador para minimizar la evaporación al situar las muestras en el termociclador. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "anillamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar se produce la “extensión”, en la que una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa dNTPs agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, anillamiento y extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Los productos resultantes de la amplificación mediante PCR son purificados posteriormente mediante un kit específico.



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PCR inversa

La técnica de la PCR inversa (inverse PCR) permite amplificar fragmentos de DNA desconocidos y que son adyacentes a una secuencia conocida en el genoma. A partir de DNA genómico digerido y ligado entre sí se amplifica por i-PCR fragmentos de DNA adyacentes a la secuencia conocida, utilizando para la reacción cebadores internos encarados hacia fuera y complementarios a las zonas más externas de la secuencia conocida. El producto de amplificación es purificado y mandado a secuenciar. Cada nueva secuencia obtenida se enfrentaba contra las bases de datos mediante Blast La reacción de ligación se lleva a cabo en grandes volúmenes para minimizar las posibles uniones entre distintos fragmentos, favoreciendo así a la circularización de los fragmentos obtenidos en la digestión. En este caso se utilizó para localizar la posición del inserto en el genoma de Drosophila transgénicas. Tras amplificar las secuencias flanqueantes al inserto, se mandaron a secuenciar y con la secuencia obtenida podemos identificar la posición que ocupa enfrentándola contra el genoma de Drosophila mediante BLAST. PCR de colonia

Para identificar los clones que contienen nuestro fragmento, una vez realizada la transformación, podemos usar la PCR de colonia. Este tipo de PCR permite amplificar un fragmento de DNA clonado a partir de una colonia bacteriana sin necesidad de crecer en medio líquido y purificar plásmidos recombinantes. Este tipo de PCR ahorra tiempo de trabajo. De no hacerlo así, tras la transformación se tendrían que picar las colonias positivas y ponerlas a crecer en LB durante toda la noche, y al día siguiente realizar la minipreps o purificación del plásmido recombinante.

Mutagénesis dirigida Para la introducción de una mutación dentro de un gen estructural, se puede emplear el método de mutagénesis dirigida por PCR mediante extensión de fragmentos que se solapan.

Este método se basa en la utilización de cuatro cebadores (primers), dos de los cuales contienen la mutación que se desea introducir y son complementarios al menos en una parte de sus secuencias. Los primers externos, además pueden contener secuencias específicas que servirán de diana para la digestión con enzimas. También se puede incluir en el oligonucleótido externo A (del dibujo) la secuencia Kozak. Esquema del método de mutagénesis dirigida por PCR mediante extensión de fragmentos que se solapan. Se indican los nombres de los oligonucleótidos A, B, M (mutante) y MC (mutante complementario). Cada reacción de PCR se nombra como PCR1, PCR2 y PCR3, para indicar que son reacciones separadas. En primer lugar se realizan dos reacciones de PCR

paralelas, una utilizando los cebadores A y M (este último porta la mutación), y otra utilizando los cebadores MC y B (donde MC porta la mutación y es parcialmente complementario a M).



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De esta forma se generan dos fragmentos de ADN que tienen una secuencia común en un extremo y contienen la mutación deseada. Estos dos fragmentos sirven simultáneamente de molde y de cebador en los ciclos iniciales de una tercera reacción de PCR, de modo que se obtuvo un fragmento suma de los dos productos que contenía la mutación deseada y que se amplifica con los cebadores A y B.

Digestiones de DNA con endonucleasas de restricción La digestión del ADN con enzimas de restricción se realiza con los tampones y las condiciones óptimas de incubación indicadas por los proveedores para cada enzima. Las reacciones contienen por lo general 0.1-5 μg de ADN, 0.1 volúmenes del tampón de restricción correspondiente (10 veces concentrado), y 0.5-10 unidades del enzima, en volúmenes finales de 10-30 μl, completados con agua destilada estéril.

Ligación de fragmentos de DNA Para la ligación de moléculas de ADN se generan fragmentos de ADN mediante digestión con los enzimas de restricción apropiados, que originan extremos compatibles con los sitios de clonación del vector empleado. Se mezclan el vector linearizado y el fragmento de ADN purificado procedente de la digestión con una o varias enzimas de restricción, en proporción 1:2 ó 1:3. Se añaden 0.1 volúmenes de tampón de ligación (suministrado por el fabricante) y una unidad de ADN ligasa del fago T4, en un volumen final de 10-20 μl, y se incuba en las condiciones adecuadas (normalmente 4°C en el caso de extremos cohesivos y a 19ºC en el caso de extremos romos). El tiempo y la temperatura de la reacción de ligación suelen ser factores críticos. También se prepara una reacción sin inserto en las mismas condiciones y se usa como control negativo de la digestión.

TRANSFORMACION GENÉTICA DE MICROORGANISMOS

Preparación de células competentes (método del cloruro de rubidio) Se hace un cultivo de células de E.coli en medio LB y se deja incubando a 37°C hasta obtener una OD adecuada (se va midiendo la absorbancia a 590 nm) y se pone el cultivo en hielo. Las células se recuperan por centrifugación a 4°C y se lavan con buffer 1. Las células se incuban nuevamente en hielo, se centrifugan y se recuperan en buffer 2. Las células se alicuotan (100 μL por eppendorf) para su almacenaje a -80°C o para su utilización inmediata.

Transformación mediante choque térmico Se descongela cada alícuota de células competentes (100 μL) 10-15 minutos en hielo. Se agrega de 1 a 10 μL de ADN. Se mezcla con cuidado. El choque térmico se realiza incubando 20 min en hielo, 100 s a 42ºC y 1-2 min en hielo. Se añaden 400 μL de LB (se añade 4 veces el volumen de células de partida) y se incuba 1 hora a 37ºC. Se centrifuga 1-2 min a 6000g. Se elimina la mayor parte del sobrenadante (aprox. 400 μL ) y se resuspenden las células en los 100 μL restantes, con lo que se plaquea en placa de agar que lleva ampicilina y se dejan incubando a 37ºC toda la noche.

Transformación mediante electroporación Se requiere la preparación de células de E. coli electrocompetentes. La electroporación se realiza según las condiciones descritas en el protocolo del electroporador para E. coli electrocompetentes, utilizando cubetas específicas para el proceso. En la cubeta se mezclan 1-5 μl de ADN (10-20 ng) y 45 μl de células electrocompetentes, previamente descongeladas en hielo. La mezcla se dispone inmediatamente en el electroporador y se aplica un voltaje de 2.5 KV a una resistencia de 129 Ω y una capacitancia de 25 μF. A continuación, las células se



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diluyen rápidamente en 950 μl de medio LB frío y se incuban a 37 ºC durante 1 h en agitación para permitir la expresión fenotípica del ADN incorporado. Tras ese período, se siembran 100 μl de la suspensión bacteriana en placas de LB con ampicilina, incubando a 37 ºC hasta que se observa la aparición de colonias.

CONCLUSIONES Estas prácticas me han servido para poner en práctica las técnicas y conceptos aprendidos durante la licenciatura y para aprender nuevas técnicas hasta ahora desconocidas para mí, así como aprender a trabajar con otros organismos modelos como es Drosophila. He de agradecer la atención recibida en todo momento en Valentia Biopharma, ya que he tenido a mi disposición apoyo y ayuda, así como a alguien que me guiase en mis cometidos o que supervisara los experimentos. El ambiente que hay en el laboratorio es muy bueno, lo que ayuda a la rápida adaptación y a la realización de las prácticas.

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MEMORIA DE PRÁCTICAS EN VALENTIA BIOPHARMAfacultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/... · poblaciones, identificación y aislamiento de vírgenes,…) -Extracción DNA y