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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN GENÉTICA,
FARMACOLÓGICA Y QUÍMICA DE LAS HOJAS DE UNA
ESPECIE DE LA FAMILIA SAPOTACEAE
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO
AUTOR:
Méndez Zumba Joaozinho Enmanuel
TUTORA:
Migdalia Miranda, PhD.
GUAY AQUIL – ECU ADOR
2017 - 2018
I
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser mi guía y darme la oportunidad de cumplir mis metas.
A mi hermana (Andrea), por brindarme su apoyo incondicional durante todos estos
años.
A mis padres (Tanya y Juan), por darme su confianza y la oportunidad de demostrar
mis capacidades.
A mi abuelita (Esperanza), por ser la mujer que me enseñó buenos valores éticos y
morales y por ser quien me apoyó siempre sin esperar nada a cambio.
A mi tutora (Migdalia Miranda PhD) por toda su paciencia, ayuda y colosales aportes
en la realización de este trabajo.
A mis tías (Maribel y Carmen) por brindarme su mano y compañía todo este tiempo.
A mis amigas y compañeras de estudio (Mayra, Sara, Karen y Sandy) por hacer
todo este tiempo de estudio más corto y divertido, así como también por su ayuda
en el ámbito académico y por alentarme en todos los momentos de tensión.
A mi gran amigo (Robert) por darme fuerzas, por todos sus consejos y su ayuda
desinteresada.
A mí cotutora y gran amiga (Dra. Katherine Bustamante) por su gran colaboración
en este trabajo.
A todos un millón de gracias…
II
ÍNDICE
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ................................................................. 1
I.1 Problema científico: ........................................................................... 3
I.2 Hipótesis: ............................................................................................ 3
I.3 Objetivo general: ................................................................................ 4
I.4 Objetivos específicos: ........................................................................ 4
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO ............................................................ 5
II.1 Familia Sapotaceae ........................................................................... 5
II.1.1 Género Manilkara ........................................................................... 5
II.1.1.1 Taxonomía del género Manilkara ............................................... 5
II.1.1.2 Descripción del Género Manilkara ............................................. 6
II.1.1.3 Distribución natural y hábitat ..................................................... 7
II.1.1.4 Usos.............................................................................................. 8
II.1.2 Género Mimusops .......................................................................... 8
II.1.2.1 Taxonomía de la especie Mimusops sp. .................................... 8
II.1.2.2 Descripción del Género Mimosups ............................................ 9
II.1.2.3 Distribución natural y hábitat ................................................... 10
II.1.2.4 Usos............................................................................................ 10
II.1.3 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops ................. 11
II.1.4 Principales compuestos de los géneros Manilkara y Mimusops12
II.1.5 Principales actividades farmacológicas de los géneros
Manilkara y Mimusops .......................................................................... 18
CAPÍTULO III: MARCO METODOLÓGICO ............................................ 20
III.1 Metodología de la investigación .................................................... 20
III.2 Estudio farmacognóstico de la especie ........................................ 20
III.2.1 Recolección y selección del material vegetal ............................ 20
III.2.2 Secado y almacenamiento .......................................................... 21
III.2.3 Caracterización botánica de la especie ..................................... 21
III.2.3.1 Evaluación macromorfológica de la hoja................................ 21
III.2.3.2 Evaluación micromorfológica de la hoja................................. 22
III
III.2.3.3 Caracterización genética de la hoja ........................................ 23
III.2.4 Determinación de los parámetros fisicoquímicos..................... 26
III.2.4.1 Humedad residual ..................................................................... 26
III.2.4.2 Cenizas totales ......................................................................... 27
III.2.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ................................. 27
III.2.4.4 Sustancias solubles ................................................................. 28
III.2.5 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico ............................. 29
III.3 Estudios químicos de las hojas..................................................... 29
III.3.1 Extracción y fraccionamiento preliminar. método 1 ................. 29
III.3.1.1 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de los
extractos ................................................................................................ 30
III.3.2 Extracción y fraccionamiento. método 2 ................................... 31
III.3.2.1 Eliminación del látex por agotamiento .................................... 31
III.3.2.2 Método de extracción y concentración ................................... 31
III.3.2.3 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos32
III.3.2.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica ........................ 32
III.3.2.5 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de las
fracciones .............................................................................................. 33
III.4 Toxicología aguda dérmica (TAD) y oral (TAO) del extracto
acuoso de las hojas .............................................................................. 34
III.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD) ............................................. 34
III.4.1.1 Condiciones de tenencia de los animales .............................. 34
III.4.1.2 Desarrollo del ensayo............................................................... 35
III.4.1.3 Modo de aplicación .................................................................. 35
III.4.2 Toxicología aguda oral (TAO) ..................................................... 36
III.4.2.1 Condiciones de tenencia de los animales .............................. 36
III.4.2.2 Desarrollo del ensayo............................................................... 37
III.4.2.3 Modo de aplicación .................................................................. 37
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................... 39
IV.1 Estudio farmacognóstico y fitoquímico ....................................... 39
IV.1.1 Caracterización botánica de la especie ..................................... 39
IV.1.1.1 Caracterización Taxonómica ................................................... 39
IV
IV.1.1.2 Caracterización genética de la hoja ........................................ 39
IV.1.1.3 Evaluación macromorfológica de la hoja ............................... 45
IV.1.1.4 Evaluación micromorfológica de la hoja ................................ 48
IV.1.2 Determinación de los parámetros Fisico-Químicos ................. 52
IV.1.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico54
IV.2 Estudios químicos preliminares ................................................... 55
IV.2.1 Extracción y fraccionamiento del material vegetal ................... 55
IV.2.2 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos . 55
IV.3 Estudios químicos ......................................................................... 56
IV.3.1 Eliminación de látex por agotamiento ....................................... 56
IV.3.2 Método de extracción y concentración ..................................... 57
IV.3.3 Análisis por cromatografía en capa delgada (CDD) de los
extractos ................................................................................................ 57
IV.3.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica .......................... 58
IV.4 Toxicología dérmica (TAD) y aguda oral (TAO) del extracto
acuoso de las hojas .............................................................................. 66
IV.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD) ............................................. 66
IV.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)..................................................... 67
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES ............................................................ 70
CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES ................................................... 72
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................... 73
V
INDICE DE TABLAS
Tabla I Clasificación Taxonómica .......................................................... 6
Tabla II Clasificación Taxonómica ......................................................... 9
Tabla III Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara ................ 12
Tabla IV Principales compuestos encontrados en los géneros
Manilkara y Mimusops .......................................................................... 13
Tabla V Principales actividades farmacológicas de los géneros
Manilkara y Mimusops .......................................................................... 19
Tabla VI Primers .................................................................................... 24
Tabla VII. Disolventes y proporciones utilizadas en el
fraccionamiento en columna cromatográfica de las hojas ................ 33
Tabla VIII Resultado del BLAST/NCBI .................................................. 41
Tabla IX Dimensiones de las hojas ...................................................... 46
Tabla X Parámetros Fisicoquímicos de las hojas ............................... 53
Tabla XI Tamizaje fitoquímico de las hojas ......................................... 54
Tabla XII. Fracciones obtenidas para los diferentes sistemas de
solventes................................................................................................ 59
Tabla XIII. Fracciones agrupadas por similitud de polaridad ............. 59
Tabla XIV. Compuestos identificados en las fracciones 36-106 ........ 62
VI
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. PCR punto final con el marcador molecular rbcl a una
temperatura de hibridación de 60ºC. La foto muestra la amplificación
con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador
molecular 100bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de
banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar
en la tabla VI .......................................................................................... 40
Figura 2. PCR punto final con el marcador molecular matk a una
temperatura de hibridación de 56ºC. La foto muestra la amplificación
con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador
molecular 100bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de
banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar
en la tabla VI. ......................................................................................... 40
Figura 3. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-
joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la
muestra desconocida con el marcador rbcl y las secuencias del
resultado del Blast-n. ............................................................................ 43
Figura 4. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-
joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la
muestra desconocida con el marcador matk y las secuencias del
resultado del Blast-n. ............................................................................ 44
Figura 5. Caracteres macromorfológicos de la hoja ........................... 45
Figura 6. Histograma del largo de las hojas ........................................ 46
Figura 7. Histograma del ancho de las hojas ...................................... 47
Figura 8. Corte transversal a nivel del nervio central de la hoja ........ 48
Figura 9. Diafanizado de la hoja ........................................................... 50
Figura 10. Detalles micromorfológicos de la droga en polvo............. 50
Figura 11. Sección transversal de la hoja (Chanda et al., 2010). ........ 51
Figura 12. Cromatografía en capa delgada del estudio químico
preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido
sulfúrico. (H) Hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met)
Metanol................................................................................................... 56
Figura 13. Cromatografía en capa delgada del estudio químico
preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido
sulfúrico. (1H) Extracto 1 de hojas; (2H) Extracto 2 de hojas; (Cl)
Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol. ........................ 58
VII
Figura 14. CCD de las fracciones agrupadas por similitud de
polaridad ................................................................................................ 60
Figura 15. Cromatograma gaseoso analítico del grupo de fracciones
36-106 ..................................................................................................... 61
Figura 16. Variación en el peso corporal (gramos) de los animales en
el ensayo de Toxicidad Aguda Dérmica de Extracto acuoso de hojas.
Letras diferentes indican significación estadística p< 0.05 ............... 66
Figura 17. Variación en el peso corporal (g) de los animales en el
ensayo de Toxicidad Aguda Oral del extracto acuoso de hojas a la
dosis de 2000 mg/kg. ............................................................................ 68
VIII
Title: Identification and genetic, pharmacological and chemical characterization of
the leaves of a species of the Sapotaceae family.
Author: Joaozinho Méndez Zumba
Advisor: Migdalia Miranda Martínez PhD.
ABSTRACT
Sapotaceae, is a family of flowering plants with more than a thousand species of
trees and shrubs and pantropical distribution. There is more than one scientific name
to characterize the species taxonomically, by close similarity in genotypic and
phenotypic characteristics. The leaves of a specie of this family were identified and
characterized in a genetic and chemical way. The morpho-anatomical characteristics
of the leaves are reported; also, it was possible to determine its genetic
characteristics, without being able to classify it taxonomically, by similarity between 4
species. Some of the physicochemical parameters of these leaves are also reported.
Fatty, phenolic, flavonoid and terpenoid compounds were found as its main
components. The most suitable solvent for the extraction and fractionation method
was ethyl acetate; and analyzed it by gas chromatography, it was very complex. The
aqueous extract of the leaves does not induce Acute Dermal or Oral Toxicity, for this
reason it is considered practically harmless.
Keywords: genotypes, leaves, phenotypes, Sapotaceae, synonymy.
IX
Título: Identificación y Caracterización Genética, Farmacológica y Química de las
Hojas de una Especie de la Familia Sapotaceae
Autor: Joaozinho Méndez Zumba
Tutor: Migdalia Miranda Martínez PhD.
RESUMEN
Sapotaceae, es una familia de plantas fanerógamas con más de mil especies de árboles y arbustos y distribución pantropical. Existe más de un nombre científico para caracterizar las especies taxonómicamente, por estrecha similitud en características genotípicas y fenotípicas. Se identificó y caracterizó de manera genética y química las hojas de una especie de esta familia. Se informa las características morfoanatómicas de las hojas; también se logró determinar sus características genéticas, sin poder clasificarla taxonómicamente, por similitud entre 4 especies. También se informan algunos de los parámetros fisicoquímicos de estas hojas. Se encontraron compuestos grasos, fenólicos, flavonoides y terpenoides como sus componentes principales. El disolvente más idóneo para el método de extracción y fraccionamiento fue el acetato de etilo; y al ser analizado por cromatografía gaseosa, resultó muy complejo. El extracto acuoso de las hojas no induce Toxicidad Aguda Dérmica ni Oral, por esto se considera prácticamente inocuo.
Palabras clave: fenotipos, genotipos, hojas, sinonimia, Sapotaceae
1
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
Sapotaceae, es una familia botánica que contiene 58 géneros de
plantas con 1271 especies. Dentro de ésta se encuentran otras 451 plantas de
rango infraespecífico. (Cárdenas-López et al. 2002; Duque, Cárdenas, and
Rodríguez 2003; UNAM 2008). Comprende árboles, arbustos, raramente
subarbustos, hermafroditas, monoicos, dioicos o polígamos, algunas veces
espinosos; con látex por lo general blanco, raras veces amarillo, casi siempre
presente en el tronco, ramas y fruto; y ocasionalmente con ramificación
simpodial. Las hojas están dispuestas en espiral o alternas y dísticas,
generalmente enteras; la inflorescencia son fasciculadas, axilares, ramifloros o
caulifloros (UNNE, 2010).
Entre los géneros más importantes de esta familia se encuentran
Pouteria, Palaquium, Madhuca, Manilkara, Sideroxylon, Chrysophyllum y
Mimusops. De los cuales se destacan los géneros Manilkara y Mimusops por su
distribución geográfica e importancia farmacológica (UNNE, 2010).
Al género Manilkara corresponden 79 especies, de las cuales 30 se
encuentran en Centro y Sudamérica (Armstrong, 2011). Manilkara spp es un
árbol que alcanza alrededor de 35 m de altura, el tallo es cilíndrico con base
recta y alcanza 90 cm de diámetro a 1.3 m del suelo (Barthélémy and Caraglio,
2007).
Esta especie es empleada por diferentes grupos étnicos de la Amazonia
quienes la reconocen y hacen referencia a las características organolépticas de
la madera, fauna asociada, forma del fruto y/o usos (Rivera et al., 2013).
2
Las hojas son simples, alternas, glabras, cartáceas, elípticas a
oblanceoladas, base cuneada y ápice obtuso a redondeado. Se agrupan hacia el
final de las ramas, las cuales a su vez son horizontales, con ramas plagiotropas
por aposición (Barthélémy and Caraglio, 2007). La corteza interna del árbol es
rojiza y al corte exuda abundante látex blanco, espeso y pegajoso. (Camacho,
2005)
En las hojas de la especie se describe la presencia de flavonoides en
extractos etanólicos y además otros constituyentes fenólicos y ácidos grasos
insaturados (Fayek et al., 2012; Guzmán & Guerrero, 2005).
Por otro lado, se indica que en su resina se encuentran triterpenos
pentacíclicos, que como se sabe tienen propiedades antiinflamatorias muy
importantes tanto para la industria farmacéutica como cosmética (Rhourri-Frih et
al., 2013).
Al género Mimusops le corresponde 45 especies descritas y se
encuentran distribuidas en Asia, África, Australasia u Oceanía (James, 2013).
Mimusops sp, es un árbol que alcanza alrededor de 25 m de altura con la copa
densa y algo irregular, un tronco corto y de corteza muy resquebrajada. Sus
hojas son simples, alternas, generalmente agrupadas y de color verde brillante;
las flores tienen su cáliz con 8 sépalos triangulares con pelos externos de color
castaño (Sánchez, 2001). Esta especie es empleada por diferentes grupos
étnicos quienes la reconocen y hacen referencia a características organolépticas,
usos medicinales e industriales (Semenya et al., 2012; Chivandi et al.,2016).
Se ha descrito que en la corteza del árbol se han encontrado una serie
de triterpenoides como taraxerol, acetato de taraxetilo, cinamato de α-amirina, α-
espinosterol y un ácido triterpenoide (Misra and Mitra 1966).
3
Manilkara y Mimusops son dos géneros que tiene ubicado 124
especies, en las cuales se han desarrollado una serie de investigaciones de tipo
farmacognóstico y fitoquímico, a diferentes partes de las plantas.
En el Ecuador se han realizado muy pocos estudios a estos géneros de
la familia Sapotaceae, por este motivo en este trabajo se hace un aporte
científico, en su caracterización e identificación genética, farmacológica y
composición química.
El desarrollo de estas investigaciones en el país, son muy importantes,
porque la distribución de la flora es muy extensa y variada, es decir, que pueden
existir miles de moléculas de interés farmacológico y drogas que aún no se han
desarrollado; motivo por el cual se debe fomentar el interés hacia este tipo de
estudios.
I.1 Problema científico:
¿El estudio taxonómico, genético y fitoquímico de las hojas permitirá
clasificar la especie de la familia Sapotaceae?
Citando estas referencias se plantea la siguiente hipótesis.
I.2 Hipótesis:
El estudio taxonómico, genético y fitoquímico de las hojas permitirá
clasificar la especie de la familia Sapotaceae en estudio.
Para demostrar dicha hipótesis se proponen como objetivos de trabajo:
4
I.3 Objetivo general:
Caracterizar desde el punto de vista genético y farmacognóstico las
hojas de la especie de la familia Sapotaceae.
I.4 Objetivos específicos:
Establecer la caracterización morfoanatómica y genética para
reafirmar su clasificación taxonómica.
Determinar los principales parámetros de las hojas que permitan
establecer su calidad como droga vegetal.
Emplear un método de extracción y fraccionamiento para el estudio
de la composición química de las hojas.
Evaluar la Toxicidad Aguda Oral (TAO) y la Toxicidad Aguda Dérmica
(TAD) del extracto acuoso de las hojas de la especie.
5
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO
II.1 Familia Sapotaceae
La familia Sapotaceae son árboles o arbustos que presentas hojas
alternas o subopuestas, simples y enteras; con flores en cima, perfectas y
actinomorfas. Su perianto está formado con un cáliz que contiene de 4 a 5
sépalos libres y una corola que presenta de 4 a 5 pétalos soldados y a veces
urceolada. El Androceo está constituido por estambres, de 4 a 5 soldados a la
corola y 0 a 5 estaminoidios petaloides. Por lo general el Gineceo está
compuesto por un ovario súpero; a menudo 4 carpelos, de 2 a 5 lóculos,
uniovular con cantidades de óvulos indefinidas. Las frutas que comprenden las
Sapotaceae son bayas con semillas grandes endospermicas oleaginosa que se
pierde en la madurez (UNNE, 2010).
II.1.1 Género Manilkara
II.1.1.1 Taxonomía del género Manilkara
Manilkara es un género que pertenece a la familia Sapotaceae de
distribución pantropical (Pennington, 1990; UNNE, 2010). A este género
pertenecen 70-90 especies, de las cuales 30 se encuentran en centro y
surámerica (Armstrong, 2011). La clasificación taxonómica viene dada como se
expresa en la Tabla I.
6
Tabla I Clasificación Taxonómica
CLASE Equisetopsida
SUB CLASE Magnolidae
SUPERORDEN Asteranae
ORDEN Ericales
FAMILIA Sapotaceae
GENERO Manilkara
Fuente: (Rivera, 2013).
II.1.1.2 Descripción del Género Manilkara
Son arbustos o árboles que alcanzan alrededor de 3-12 m de altura. La
asta tiene forma cilíndrica con base recta y alcanza los 90 cm de diámetro a 1,3
m del suelo. La corteza muerta es de color gris, con fisuras verticales profundas,
desprendible en placas rectangulares. La corteza interna es rojiza y por lo
general al corte exuda látex espeso y pegajoso (Rivera, 2013).
Sus ramas son glabras y sus hojas alternas, frecuentemente en grupos
cerrados al final de las ramas, con cicatrices conspicuas; vaina de hojas
obovadas a obovada-elípticas, ambas superficies glabras, base ancha cuneada
a obtusa, apex retuso. (Barthélémy & Caraglio, 2007). Las flores son axilares y
fasciculadas (Pennington, 1990). El pedicelo es grueso; sépalos ovado-
triangular, por fuera amarillento grisáceo tomentoso (Maués & de Oliveira
2010). Corola blanca o amarillo brillante, lóbulos oblongos; estambres de 5 mm
aproximadamente; lóbulos lineales tomentosos (Camacho et al.,
2005). Drupa obovoide-oblongo a elipsoide. Semillas de 8-10 mm de largo. Su
florescencia se suele dar en otoño (Weaver, 1990).
7
II.1.1.3 Distribución natural y hábitat
Comprende cerca de 79 especies, destacándose entre ellas: Manilkara
bidentata, Manilkara zapota, Manilkara hexandra, Manilkara huberi y Manilkara
kauki.
La distribución que presenta el género es extensa, están diseminados
en lugares tropicales y semitropicales, en varias islas del Pacífico y el Caribe, en
muchas zonas de Madagascar en África, a bajas altitudes en el sudeste
asiático como Camboya, India, Sri Lanka, Tailandia y Vietnam, también en
Australia y América Latina. En la Panamazonia incluye los países de Brasil,
Colombia, Guayana Francesa, Perú, Surinam y Venezuela, En Colombia está
presente en las regiones del Pacifico, Orinoquia y Amazonia (López et al., 2006).
Está a 30 y 1000 metros sobre el nivel del mar, en climas húmedos y
muy húmedos tropicales. Habita en bosques primarios de tierra firme y zonas
con inundaciones ocasionales en la Amazonia. En Brasil las especies crecen
sobre tierra firme, en la cuenca alta del rio Negro cerca de la frontera colombiana
(Stropp et al., 2011). En la Amazonia peruana se encuentra en planos
inundables y pantanos de las cuencas de los ríos Amapiyacú y Yaguasyacú
(Duivenvoorden & Balslev 2001). En Bolivia se reporta para la región de Pando
creciendo en bosques de igapó y várzea (Rodriguez & Montero 2002). En la
Guyana, (Forget et al., 2001) se reporta que la especie da preferencia a suelos
hidromórficos.
Ecuador tiene reportado 49 especies vegetales de la familia
Sapotaceae, y solo dos especies del género Manilkara: Manilkara bidentata y
Manilkara bidentata subs. surinamensis. (Balslev H et al., 2008)
8
II.1.1.4 Usos
Los pobladores nativos de diferentes zonas, les han dado diversos usos
a la madera, fruto o látex de algunas especies a lo largo de los años (Mayorca,
1973).
El látex de las diferentes especies se usó de diversas maneras (Francis
& Lowe, 2000). La savia del árbol supuestamente pudo ser utilizada como un
reemplazo de la leche de vaca. Su látex posee un sabor muy agradable a crema,
puede ser consumido, pero en exceso puede causar estreñimiento (Weaver,
1990). Este látex también se lo usaba a veces en la cobertura de pelotas, cables,
y también en la industria del chicle o goma de mascar (Francis & Lowe, 2000;
Rivera, 2013). Se menciona también que existe una aplicación en resortes de
aviación jet (Sibille & Rodriguez, 1996).
La corteza cocinada se la aplicaba para el tratamiento de cólicos
hepáticos y malestares intestinales. Esta especie es también muy importante por
su madera, ya que posee una gran dureza y durabilidad, por su resistencia a las
termitas y a los hongos de la fermentación. Se la empleó inicialmente, en los
cimientos de las viviendas, puentes y otros tipos de construcciones. El fruto,
comestible en la mayoría de los casos, presentando un excelente sabor (López
et al., 2006).
II.1.2 Género Mimusops
II.1.2.1 Taxonomía de la especie Mimusops sp.
La clasificación taxonómica viene dada como se expresa en la Tabla II.
9
Tabla II Clasificación Taxonómica
Reino Plantae
Filo Tracheophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Ericales
Familia Sapotaceae
Género Mimusops
Fuente: (Global Biodiversity Information Facility 2017)
II.1.2.2 Descripción del Género Mimosups
Mimosups sp. son árboles siempreverdes, algo tortuoso, de 6-8 m de
altura en cultivo, alcanzando hasta 20 metros de altura en su estado adulto, con
la copa densa algo irregular y un tronco corto, de corteza muy resquebrajada
(Sánchez, 2001) que al cortar exuda abundante látex blanco, espeso y pegajoso
(Rivera et al., 2013).
Hojas simples, alternas, generalmente agrupadas hacia el final de las
ramas, con la lámina elíptica o de obovado-elíptica a oblonga, de hasta 20 x 11
cm, aunque generalmente más pequeñas, con la base obtusa, el margen entero
y algo revoluto y el ápice obtuso o redondeado; son gruesas y de textura
coriácea, glabras, de color verde brillante, con el nervio central destacado y 10-
20 pares de nervios laterales. Pecíolo de 1-1,5 cm de longitud, al principio
pubescente, tornándose luego glabro (Sánchez, 2001).
Inflorescencias axilares, compuestas por flores solitarias o fascículos
de 2-6 flores, rotáceas, blancas, aromáticas, sobre pedicelos pelosos de 5-8 cm
de largo. Cáliz con 8 sépalos triangulares, de 11-12 mm de largo, con pelos
10
castaños externamente, los sépalos exteriores ligeramente mayores que los
interiores; corola con un tubo de unos 2 mm de largo y 8 lóbulos de 9-10 mm de
longitud, cada uno con 2 apéndices profundamente laciniados. Androceo con 8
estambres opuestos a los pétalos, con los filamentos de 3-3,5 mm de largo,
pelosos en la base, y las anteras de 4-4,5 mm de largo, alternando con 8
estaminodios de unos 5 mm de largo, pelosos por la cara externa. Ovario
pubescente, cónico, con 8 lóculos; estilo glabro (Sánchez, 2001).
Fruto en baya subesférica de 3-4 cm de diámetro, sobre un pedúnculo
de más de 6 cm de largo, amarillenta en la madurez, con una pulpa dulce y
carnosa-harinosa, comestible, conteniendo de una a varias semillas elipsoides,
de color castaño amarillento (Sánchez, 2001).
II.1.2.3 Distribución natural y hábitat
Comprende cerca de 45 especies aceptadas, destacándose entre ellas:
Mimusops elengi, Mimusops hexandra, Mimusops manilkara, Mimusops balata,
Mimusops globosa y Mimusops zeyheri
La distribución que presenta Mimusops sp se extiende en bosques
tropicales y subtropicales del viejo mundo como Asia, África y Oceanía. Incluye
países como Sri Lanka, India, Tanzania, Malawi, Kenia, Congo, Madagascar,
Mozambique, Papúa Nueva Guinea, Islas Salomón, Indonesia, Arabia Saudita,
Yemén, Islas Comoras, República de Mauricio entre otros (WCSP, 2017).
En Ecuador aún no se han reportado especies del género Mimusops.
II.1.2.4 Usos
Los pobladores les han dado diversos usos a las diferentes partes de la
planta Mimosups sp, a lo largo de los años; como a su madera, fruto, látex, etc.
En primer lugar, se sabe que se la apreció por su madera, ya que posee una
gran dureza y durabilidad, incluso en contacto con el agua, resistente a las
11
termitas y no requiere cualquier tratamiento preservativo, por lo general se la
usó para construcciones pesadas, puentes, muebles y en la fabricación de
vagones (Misra and Mitra, 1966).
Su corteza, flores, frutos y semillas se utilizaron en la medicina
ayurvédica en la que se dice que es astringente, refrescante, antihelmíntica,
tónica y febrífuga. También para dolencias dentales como sangrado de encías,
piorrea, caries dental y en la pérdida de piezas dentales (India Biodiversity,
2018).
II.1.3 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops
La sinonimia describe la presencia de más de un nombre científico para
un mismo taxón; esto a su vez puede darse por coincidencias dentro de la
ciencia de la taxonomía o por una estrecha similitud de las características
fenotípicas de dos o más especies. Este es el caso de la especie Binectaria
laurifolia, que es un sinónimo de Mimusops kauki L; y este al presentar flores
hexámeras se la transfiere al género Manilkara (Friis, 1980).
Existen otros casos de sinonimia presente en otras especies de ambos
géneros, como se expresa en la Tabla III.
12
Tabla III Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara
Género Mimusops Género Manilkara Mimusops amazonica Huber
Manilkara bidentata subsp.
surinamensis (Miq.) T.D.Penn.
Mimusops balata (Aubl.) C.F.Gaertn
Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev.
subsp. bidentata
Mimusops bidentata A.DC Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev
Mimusops cearensis Huber Manilkara triflora (Allemão) Monach.
Mimusops darienensis Pittier Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev.
subsp. bidentata
Mimusops elata Allemão ex Miq
Manilkara elata (Allemão ex Miq.) Monach.
Mimusops excelsa Ducke Manilkara excelsa (Ducke) Standl
Mimusops floribunda Mart Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Mimusops globosa C.F.Gaertn Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev.
subsp. bidentata
Mimusops rufula Miq Manilkara rufula (Miq.) H.J.Lam
Fuente: (Zappi et al., 2015)
II.1.4 Principales compuestos de los géneros Manilkara y Mimusops
La composición química ha sido investigada para algunas especies de
ambos géneros. Los principales compuestos se expresan en la Tabla IV.
13
Tabla IV Principales compuestos encontrados en los géneros Manilkara y Mimusops
Compuesto Especie Matriz Referencia
Triterpenoides
Taraxerol
Mimusops elengi Hojas,
Corteza, Raiz
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops manilkara Corteza,
Hojas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Corteza,
Raiz, Hojas (Misra et al.,
1974)
Taraxerona Mimusops manilkara Corteza (Misra et al.,
1974)
Lupeol
Mimusops elengi Corteza,
Raiz, Semillas
( Misra and Mitra 1966;
Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops manilkara Látex,
Corteza
(Misra et al., 1974)
Mimusops balata Látex (Misra et al.,
1974)
Mimusops globosa Látex (Misra et al.,
1974)
Manilkara zapota Hojas (Fayek et al.,
2012)
Hederagenina Mimusops elengi Corteza
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Ácido Ursólico
Mimusops elengi Corteza,
Fruto
( Misra and Mitra 1966;
Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops manilkara Hojas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Fruto,
Corteza (Misra et al.,
1974)
Saponinas
Mimusops elengi Semillas
(Misra and Mitra 1966; Misra et al.,
1974)
Mimusops manilkara Semillas,
Látex, (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Semillas (Misra et al.,
1974)
14
Mimusops heckelii Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops djave Semillas (Misra et al.,
1974)
Manilkara bidentata Corteza (Cocker,
1962)
Amirina
Mimusops manilkara Corteza,
Fruto, Hojas
(Misra et al., 1974)
Mimusops hexandra Fruto,
Corteza, Raiz
(Misra et al., 1974)
Mimusops globosa Látex (Misra et al.,
1974)
Mimusops balata Látex (Misra et al.,
1974)
Manilkara bidentata Corteza (Cocker,
1962)
Ácido Oleanólico Manilkara zapota Hojas (Fayek et al.,
2012)
Tetraterpenos
β-Caroteno Mimusops elengi Hojas
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Compuestos Fenólicos y Flavonoides
Ácido cafeico miricetina-3-O-α-L-
ramnósido
Manilkara zapota Hojas
( Chanda & Nagi, 2010; Fayek et al.,
2012; Kaneria & Chanda,
2012; Baky et al., 2016)
L-Ácido Ascórbico Manilkara zapota Fruto (Shui, Wong,
& Leong, 2004)
Galocatequina Manilkara zapota Fruto
(Shui, Wong, & Leong,
2004; Baky et al., 2016)
Catequina Manilkara zapota Fruto
(Shui, Wong, & Leong,
2004; Baky et al., 2016)
Epicatequina Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Ácido Gálico Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Metilclorogenato Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
15
Metil-4-O-galoyl clorogenato
Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Acido 4-ogaloilclorogénico
Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Leucodelphinidina Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Leucocyanidina Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Leucoperalgonidina Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Dihidromiricetina Manilkara zapota Fruto (Baky et al.,
2016)
Quercetina
Mimusops elengi Semillas
(Misra et al., 1974;
Sharma et al., 2009)
Mimusops manilkara Semillas,
Hojas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Semillas (Misra et al.,
1974)
Manilkara bidentata Frutos y Semillas
(Baky et al.,2016)
Manilkara zapota Frutos (Baky et al.,
2016)
Manilkara subsericea Hojas (Almeida et al., 2015)
Miricetina
Mimusops manilkara Hojas (Misra et al.,
1974)
Manilkara subsericea Hojas (Almeida et al., 2015)
Dihidroquercetina Manilkara bidentata Frutos y Semillas
(Baky et al.,2016)
Apigenina-7-O-α-L-ramnósido
Manilkara zapota Hojas
( Chanda & Nagi, 2010; Fayek et al.,
2012; Kaneria & Chanda,
2012; Baky et al., 2016)
Miricetina-3-O α-L-Raminopiranosido
Manilkara zapota Hojas (Fayek et al.,
2012)
Dihidromiricetina Manilkara zapota Frutos (Baky et al.,
2016)
Kaempferol Manilkara subsericea Hojas (Almeida et al., 2015)
Esteroles
α-Espinasterol Mimusops elengi
Corteza, Raiz
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops hexandra Semillas, (Misra et al.,
16
Frutos, Raiz
1974)
Manilkara bidentata Corteza (Cocker,
1962)
β-D-glucósido de β-sitosterol
Mimusops elengi Corteza,
Raiz, Semillas
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Ácidos Grasos Insaturados
Ácido Linoleico
Mimusops elengi Semillas
(Misra and Mitra 1966; Misra et al.,
1974)
Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Mimusops manilkara Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops longifolia Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops mottleyana Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops djave Semillas (Misra et al.,
1974)
Manilkara zapota Semillas,
Hojas
( Fayek et al., 2012; Sathish et al., 2015)
Ácido Erúcico
Mimusops elengi
Semillas
(Misra and Mitra 1966; Misra et al.,
1974) Mimusops caffra
Ácido Oleico
Mimusops elengi Semillas
(Misra and Mitra 1966; Misra et al.,
1974; )
Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Mimusops manilkara Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops longifolia Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops mottleyana Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Semillas (Misra et al.,
17
1974)
Mimusops heckelii Semillas (Misra et al.,
1974)
Mimusops djave Semillas (Misra et al.,
1974)
Manilkara zapota Semillas,
Hojas
( Fayek et al., 2012; Sathish et al., 2015)
Ácido Linolénico
Mimusops elengi Semillas
(Misra and Mitra 1966; Misra et al.,
1974)
Manilkara zapota Semillas,
Hojas
( Fayek et al., 2012; Sathish et al., 2015)
Ácido Ginkgolico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Ácido Gadoleico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Ácido Nervónico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Ácido Araquidónico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Ácidos Grasos Saturados
Ácido Palmítico
Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Manilkara bidentata Corteza (Cocker,
1962)
Manilkara zapota Semillas (Sathish et al., 2015)
Ácido Esteárico
Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Manilkara bidentata Corteza (Cocker,
1962)
Manilkara zapota Semillas (Sathish et al., 2015)
Ácido Mirístico Mimusops caffra Semillas (Misra et al.,
1974; Chivandi et
18
al., 2016)
Ácido Heptadecanoico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Ácido Eicodecanoico Mimusops caffra Semillas
(Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016)
Hidrocarburos Saturados
Hentriacontano
Mimusops elengi Hojas
(Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops manilkara Hojas (Misra et al.,
1974)
Mimusops hexandra Hojas (Misra et al.,
1974)
Ciclitoles
Quercitol
Mimusops elengi Hojas
Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974
Mimusops elengi Corteza,
Fruto, Semillas
( Misra and Mitra 1966;
Misra G. and Mitra R,
1968; Misra et al., 1974)
Mimusops manilkara Semillas, Corteza,
Hojas
(Misra et al., 1974)
Mimusops hexandra Semillas, Corteza,
Raiz, Hojas
(Misra et al., 1974)
Manilkara zapota Semillas,
Hojas (Baky et al.,
2016)
II.1.5 Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y
Mimusops
De igual forma, algunas especies del género han sido evaluadas
farmacológicamente para validar su uso tradicional. En la Tabla V se reflejan
algunas actividades demostradas para algunas especies de estos géneros.
19
Tabla V Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y
Mimusops
Actividad Farmacológica
Especie Matriz Referencia
Actividad antioxidante
Manilkara zapota
Hojas
(Kaneria et al., 2009; Chanda & Nagani, 2010; Fayek et al.,
2012)
Mimusops elengi Corteza (Rao et al., 2011)
Mimusops elengi Hojas (Kar et al., 2012)
Mimusops elengi Pericarpio (Kiran Kumar et
al., 2014)
Actividad antimicrobiana
Manilkara zapota Hojas Kaneria &
Chanda, (2012)
Manilkara zapota Semillas Kothari &
Seshadri, (2010)
Manilkara hexandra Hojas Sumitra & Jigna,
(2010)
Mimusops elengi Pericarpio (Kiran Kumar et
al., 2014)
Actividad hipoglucemiante
Manilkara zapota Semillas (Saradha et al.,
2014)
Manilkara zapota Hojas Fayek et al.,
(2012)
Actividad hipotensora Mimusops elengi Hojas (Dar et al., 1999)
Actividad Hipocolesterolemica
Manilkara zapota Hojas (Fayek et al.,
2012)
Actividad Antiinflamatoria
Manilkara zapota Hojas (Konuku et al.,
2017)
Actividad analgésica Manilkara zapota Hojas (Jain et al., 2011)
Actividad antipirética Mannilkara zapota Hojas (Ganguly et al.,
2013)
20
CAPÍTULO III: MARCO METODOLÓGICO
III.1 Metodología de la investigación
La presente investigación es de tipo exploratoria y se llevó a cabo en el
laboratorio de productos naturales de la facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad de Guayaquil.
III.2 Estudio farmacognóstico de la especie
III.2.1 Recolección y selección del material vegetal
La especie vegetal utilizada fue recolectada por Migdalia Miranda, PhD
y sus colaboradores el 9 de noviembre del 2016; en una zona de vegetación
natural protegida denominada Jardín Botánico de Guayaquil ubicado en la zona
Norte de la ciudadela "las Orquídeas" Av. Francisco De Orellana, en las cumbres
del Cerro Colorado, de la ciudad de Guayaquil provincia del Guayas - Ecuador
con las coordenadas 02°12′13.6800″S 079°53′50.6400″O. Correspondiendo a
plantas adultas de aproximadamente 30 m de altura, con presencia de flores y
frutos. La misma fue herborizada, caracterizada por el Biolg. Xavier Cornejo
Sotomayor. Ms.C y registrada en el Herbario GUAY de la Facultad de Ciencias
Naturales en la Universidad de Guayaquil con la clave 13111.
21
III.2.2 Secado y almacenamiento
El secado se realizó mediante el uso de una estufa universal de
convección natural o circulación de aire forzada de la marca MEMMERT de
modelo 160 de +30º C a +300º C; utilizando 3 Kg de muestra de hojas
aproximadamente, a una temperatura de 50º C ± 5. Se tomó en cuenta el
número de días (3 días), que demoraba la muestra en secar por completo y
posterior retirado de la estufa.
Una vez secado el material vegetal, se trituraron en una licuadora de
marca americana Forever Super Blender, modelo DI9995; sin que la muestra
esté totalmente pulverizada y fueron almacenados en frascos de vidrio
transparente con tapa. Se realizaron determinación de características
organolépticas (olor y color).
III.2.3 Caracterización botánica de la especie
III.2.3.1 Evaluación macromorfológica de la hoja
Se realizó una valoración de las características macromorfológicas de la
especie, considerándose la disposición de las hojas sobre el tallo. Se
describieron 50 hojas, a las cuales se les determinó la forma del limbo, borde,
ápice, base, peciolo, venación y color. Las observaciones se realizaron a simple
vista y con ayuda de un microscopio estéreo NTB-2B, de fabricación china,
empleando cámara modelo HDCE-50B. También se efectuaron mediciones de
largo y ancho de las hojas con ayuda de una regla graduada; se calcularon los
valores promedios y la desviación estándar (Miranda y Cuéllar, 2000).
22
III.2.3.2 Evaluación micromorfológica de la hoja
Para el análisis histológico se realizaron cortes transversales de las
hojas en estado fresco, por el método manual, los que fueron hidratados y
aclarados con hipoclorito de sodio al 1 %. Los mismos se colorearon con
safranina al 1 % en agua, se fijaron con gelatina glicerinada, según los
procedimientos descritos por Gattuso y Gattuso (1999).
Para observar los detalles anatómicos a nivel de la epidermis de la hoja
se efectuó la técnica del diafanizado (corte longitudinal), donde se aclaró la
muestra con solución de hipoclorito de sodio, se lavó con agua destilada y se
coloreó con safranina al 1 % en agua (Gattuso y Gattuso, 1999).
Se determinaron las características microscópicas de la droga en polvo.
Las muestras fueron aclaradas con hipoclorito de sodio y después de lavadas se
colorearon con safranina al 1% para finalmente ser fijadas en gelatina
glicerinada. Se realizaron algunas reacciones histoquímicas tales como: la
determinación de almidón (reactivo de lugol), lignina (safranina al 1 % en agua) y
aceite esencial (solución de Sudan III al 5 % en etanol al 70 %) (Gattuso y
Gattuso, 1999; Miranda y Cuéllar, 2000).
Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal
se empleó un microscopio NOVEL (lente 10X) con cámara acoplada modelo
HDCE-50B.
23
III.2.3.3 Caracterización genética de la hoja
La caracterización genética fue realizada en el laboratorio de Biología
Molecular en el Centro de Investigaciones Biotecnológicas de la Escuela
Superior Politécnica del Ecuador CIBE-ESPOL en 2017.
III.2.3.3.1 Preparación de muestra
La muestra de hoja fue sumergida en nitrógeno líquido para una rápida
congelación, luego se la trituró con la ayuda del molino “Retsch MM400” para
obtener un polvo fino y se la almacenó en un congelador a -80° C hasta ser
usada en los análisis moleculares.
III.2.3.3.2 Extracción de ADN.
El aislamiento de ADN se realizó con el protocolo a base de CTAB
(Doyle and Doyle 1990), modificado por técnicos del laboratorio de Biología
Molecular del CIBE-ESPOL (2,8 % CTAB, 1,3 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM
Tris – HCl pH 8, 1 % PVP40000, 2 % 2-mercaptoethanol), se utilizó entre 100 –
150 mg de muestra triturada como partida. El ADN fue resuspendido en 50 µl de
TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) y cuantificado con 2 µl de muestra de ADN
a una densidad óptica de 260 nm y 280 nm utilizando el espectrofotómetro
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). La concentración se la determinó en ng/µl y
se determinó su calidad tomando en cuenta la relación A260/A280. Luego el
ADN fue diluido a 20 ng/µl y almacenado a -20º C hasta ser usado en las
reacciones de PCR.
III.2.3.3.3 Primers.
Los primers usados en este trabajo se los muestras en la Tabla VI.
Todos los primers fueron obtenidos de la marca Macrogen (Corea del sur) de
24
forma liofilizada y fueron resuspendidos con agua estéril y llevados a una
concentración stock de 100 µM.
Tabla VI Primers
III.2.3.3.4 Condiciones de la PCR punto final
Para realizar la PCR cualitativa o punto final se usó el equipo
Mastercycler ep Gradient S No. 5345 (Eppendorf). Se realizó un master mix por
cada gen y cada reacción de PCR consistía de un volumen final de 50 µl que
contenía 25 µl de 2x-GoTaq® Green Master Mix (Cat. # M7123, Promega), 0,5
µM de cada primer, 3 µl del ADN molde y fue completado con Agua estéril hasta
alcanzar los 50 µl, para cada reacción se usaron tubos de 0,2 ml (PCR-02-C-
500, Axigen). El programa de amplificación fue el siguiente: 95° C por 3 min
como desnaturalización inicial; 38 ciclos de [95° C por 30 segundos de la
desnaturalización, 60° C (rbcLA_F/ rbcLA_R) y 56° C (matK_3F_KIM
f/matK_1R_KIM R) por 30 segundos de hibridación de los primers, 72° C por 90
segundos de la elongación]; y 72° C por 5 minutos de elongación final. Se tomó
5 µl del producto final de la PCR para correr en electroforesis horizontal y
detectar amplificación de las bandas esperadas, los 45 µl restantes fueron
Código pares de Primer
Secuencia Peso Molecular (pares de base)
Referencia
A rbcLA_F/ rbcLA_R
5' ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
3' 550 (Costion et al. 2011)
5' GTAAAATCAAGTC
CACCRCG 3'
B
matK_3F_KIM
f/matK_1R_KIM R
5' CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 3'
850 (Costion et al. 2011)
5' ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTT
C 3'
25
purificados con el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Cat. # A9282,
Promega), y luego se las almacenó a -20° C hasta ser enviadas a secuenciar.
III.2.3.3.5 Electroforesis en gel de agarosa.
Para confirmar la existencia de ADN del aislamiento y para
determinar la amplificación de la banda esperada de cada producto de la
PCR punto final se realizó una corrida de electroforesis al 1 % y 1,8 %
(w/v) respectivamente en gel de agarosa. Para la preparación del gel se
usó el buffer tae (1x) y sybr® safe dna gel stain (1x) (cat. s33102,
invitrogen). Se corrió en cámaras de electroforesis (biorad) a 95 v por 35
min, usando tae 1x, para determinar el peso de la banda esperada se usó
el marcador 100bp DNA ladder (cat.# 62101, promega) y 1kb DNA ladder
(cat. g5711, promega). El resultado de la corrida se visualizó usando en el
equipo geldoc xr+ (biorad) usando el software quantity one.
III.2.3.3.6 Secuenciación
Se preparó entre 1,7 y 2 µg del producto PCR purificado en un volumen
de 35 µl y se envió a secuenciar a Macrogen en dirección forward a una
concentración stock de primers de 10 µM (las condiciones de envío fueron
exigidas por Macrogen).
III.2.3.3.7 Análisis bioinformático de secuencias
Para realizar el análisis de las secuencias se utilizaron los siguientes
programas bioinformáticos:
26
“FinchTV” fue usado para realizar una limpieza de ruidos y determinar la
calidad de la secuencia
Se utilizó la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology
Information, 2018) para realizar un BLAST (BLAST: Basic Local Alignment
Search Tool, 2018) de nucleótido y encontrar similitudes entre secuencias
biológicas, luego se escogió del resultado con la opción más cercana en
referencia a identidad y el menor valor esperado. Finalmente se descargó la
secuencia de diez de los resultados para realizar un análisis filogenético
utilizando el programa MEGA6 (MEGA: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis, 2018)
III.2.4 Determinación de los parámetros fisicoquímicos
Para la realización de los parámetros fisicoquímicos se siguieron los
procedimientos planteados por WHO, 2011 y los ensayos se hicieron por
triplicado.
III.2.4.1 Humedad residual
Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó
una estufa a 105o C marca alemana Mettler Toledo y para pesar, se usó una
balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4
Expresión de los resultados.
Hg: M2 − M1
M2 − M x 100
Dónde:
Hg: Perdida en peso por desecación
27
M2: masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)
M1: masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)
M: masa de la cápsula vacía
100: factor matemático para calculo
III.2.4.2 Cenizas totales
Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E
por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern
Modelo: ABS-220-4. Se partió de 2 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta
obtener cenizas blancas.
Expresión de los resultados.
C: M2 − M
M1 − M x 100
Dónde:
C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemático para cálculo
III.2.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
A las cenizas totales obtenidas según la técnica, se le añadieron de 2-3
mL de ácido clorhídrico al 10 %. El crisol se tapó con un vidrio reloj y se calentó
sobre un baño de agua hirviente durante diez minutos. Se lavó el vidrio reloj con
5 mL de agua caliente y se unió al contenido del crisol. La solución se filtró a
través de un papel de filtro libre de cenizas; se lavó el residuo con agua caliente
28
y se lo transfirió con el papel incluido al crisol. Se incineró en la mufla modelo
MLW Eliktro Modelo: 245.3E a una temperatura de 700-750º C durante dos
horas. Posteriormente se colocó en una desecadora, hasta que alcanzó la
temperatura ambiente para poder pesar.
Expresión de los resultados.
B: M2 − M
M1 − M x 100
Dónde:
B: porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base
hidratada
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa de crisol con muestra vegetal deseca (g)
M2: masa del crisol con la cenizas insolubles (g)
100: factor matemático para cálculo
III.2.4.4 Sustancias solubles
Este ensayo se determinó a partir de 5 g de la droga. Los disolventes
utilizados fueron agua, alcohol al 98 % y hexano.
Expresión de los resultados.
Ss: R. 500 x 100
M(100 − H)
Dónde:
29
Ss: sustancias solubles (%)
H: humedad de la muestra (%)
500 y 100: factores matemáticos para los cálculos
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
III.2.5 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico se realizó a las hojas secas, según
procedimiento descrito por Miranda y Cuellar (2000).
Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad
creciente, a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo
sucesivamente con éter di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los
extractos etéreo, alcohólico y acuoso, los cuales se sometieron a diferentes
ensayos (anexos 1 y 2).
III.3 Estudios químicos de las hojas
III.3.1 Extracción y fraccionamiento preliminar. Método 1
Para el estudio se desarrolló un proceso de extracción por maceración
continua (anexo 3) con disolventes de diferentes polaridades: hexano y metanol.
A partir de 973,1 g de hojas, utilizando una balanza de marca alemana BOECO
modelo BBL 52 con un tamaño de plato de 174 x 143 mm.
En la primera prueba se utilizó hexano en cantidades de 1300 mL de 7 a
14 días; previo a esto se realizó una humectación con el mismo solvente en 460
mL. Este ensayo se lo realizó dos veces, variando el suministro de hexano esta
30
vez con 1120 mL. Luego de este procedimiento se pesaron los residuos sólidos
con un peso de 939,3 g; después se procedió a trabajar de la misma manera
cambiando el disolvente a metanol; este ensayo se lo realizo cuatro veces, en
donde el suministro de metanol para la primera maceración fue 1700 mL, para la
segunda fue 1190 mL, en la tercera fue 930 mL y en la última maceración se
utilizó 1500 mL.
Los extractos obtenidos se reunieron y filtraron con papel filtro y gasa,
luego se concentraron sin llegar a sequedad en un rotaevaporador de marca
alemana HEILDOPH Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión
reducida y a temperatura de 80º C aproximadamente; se conservaron en
refrigeración a una temperatura de 3º C aproximadamente para los análisis
correspondientes.
III.3.1.1 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de los extractos
Los extractos hexánicos y metanólicos fueron analizados por
cromatografía de capa delgada. Se emplearon placas de 20 x 10 cm, de gel de
sílice F254 sobre soporte de aluminio, de la Merck.
El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizaron las
siguientes mezclas de disolventes como fases móviles:
Hexano: Cloroformo: Acetato de Etilo (AcOEt): Metanol (10:5:5:2,5)
Cloroformo: Metanol (50:50)
Cloroformo: AcOEt (20:80)
Para el revelado de las placas fue empleado las condiciones:
Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm
Rociado con Ácido sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a una
temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de manchas o
modificación de la apariencia de las ya existentes.
31
III.3.2 Extracción y fraccionamiento. Método 2
III.3.2.1 Eliminación del látex por agotamiento
En vista a que en los análisis preliminares la presencia de látex en los
extractos predominó en el hexánico; interfería en su estudio, se optó por realizar
la eliminación del látex por agotamiento con diferentes solventes como éter de
petróleo y hexano, aplicando el método de Soxhlet utilizando 110 g de muestra y
un tiempo de 3 horas, como se observa en el anexo 4.
III.3.2.2 Método de extracción y concentración
Posterior a la determinación del chicle, se desarrolló un proceso de
extracción por maceración continua (anexo 5) con disolventes de diferentes
polaridades: Cloroformo, AcOEt y Metanol. A partir del residuo de las
extracciones con Soxhlet.
En la primera extracción se utilizó cloroformo en cantidades de 600 mL
de 7 a 14 días. Este ensayo se lo realizó dos veces, variando el suministro de
cloroformo esta vez con 344 mL. Después se procedió a trabajar de la misma
manera cambiando el disolvente a AcOEt; este ensayo se lo realizo dos veces
también, en donde el suministro para la primera maceración fue 400 mL y para la
segunda fue 265 mL y por último se utilizó metanol en cantidades de 350 mL
para la primera maceración y 275 mL para la segunda.
Los extractos obtenidos se reunieron y filtraron con papel filtro y gasa,
luego se concentraron sin llegar a sequedad en un ratoevaporador de marca
alemana HEILDOPH Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión
reducida y a temperatura de 80º C aproximadamente; se conservaron en
refrigeración a una temperatura de 3º C aproximadamente para los análisis
correspondientes.
32
III.3.2.3 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos
Los extractos fueron analizados por cromatografía de capa delgada. Se
emplearon placas de 20 x 10 cm, de gel de sílice F254 sobre soporte de aluminio,
de la Merck.
El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizaron las
siguientes mezclas de disolventes como fases móviles:
Hexano: Cloroformo: AcOEt: Metanol (10:5:5:2,5)
Cloroformo: Metanol (50:50)
Cloroformo: AcOEt (20:80)
Para el revelado de las placas fue empleado las condiciones:
Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm
Rociado con Ácido Sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a una
temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de manchas o
modificación de la apariencia de las ya existentes.
III.3.2.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica
El extracto de acetato de etilo seco y lavado con hexano, obtenido por
extracción sucesiva de las hojas, se sometió a fraccionamiento en columna
cromatográfica de 80 cm de largo y 4,5 cm de diámetro, empaquetada con gel de
sílice activada de 60-200 (mesh), en proporción 3:1 respecto al peso del residuo
a separar, el cual fue previamente adsorbido en gel de sílice, secado en corriente
de aire y colocado en la parte superior de la columna. La elución se realizó
empleando presión atmosférica, con disolventes de grado analítico Merck en
orden creciente de polaridad. El sistema de disolventes empleados para el
fraccionamiento se expone en la Tabla VII.
33
Tabla VII. Disolventes y proporciones utilizadas en el fraccionamiento en
columna cromatográfica de las hojas
Disolventes Proporción (%)
Hexano 100%
Hexano - Diclorometano 75:25
Hexano - Diclorometano 50:50
Hexano - Diclorometano 40:60
Hexano - Diclorometano 25:75
Diclorometano 100%
Diclorometano – AcOEt 75:25
Diclorometano – AcOEt 50:50
Diclorometano – AcOEt 25:75
AcOEt 100%
AcOEt – Metanol 75:25
AcOEt – Metanol 50:50
III.3.2.5 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de las
fracciones
En los fraccionamientos realizados por cromatografía de columna se
empleó como criterio para el cambio de disolvente la CCD. Para ello se
emplearon cromatoplacas Merck de 20 x 8 cm, de gel de sílice 60 GF254 sobre
soporte de aluminio.
El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente, se utilizó
indistintamente como fases móviles, las mezclas de disolventes siguientes:
Hexano: Cloroformo: AcOEt: Metanol (10:5:5:2,5)
Para el revelado de las placas cromatográficas, se empleó:
Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm
Rociado con Ácido sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a
una temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de
manchas o modificación de la apariencia de las ya existentes.
Las fracciones 36 - 106 de esta columna, obtenida con la mezcla de
disolventes Hexano - Diclorometano 50:50 y Hexano - Diclorometano 40:60, se
reunieron, se analizaron por CCD y se enviaron para su análisis por CG-EM con
las siguientes condiciones:
34
Estas fracciones reunidas se analizaron en un cromatógrafo de gases
Agilent 6890 acoplado a espectrómetro de masas 5973N, las condiciones de
trabajo fueron: columna Ultra 2 de 30 m x 0,320 um x 0,25 µm, temperatura
inicial: 70º C por 2 minutos incrementando 5º C/ min hasta 285º C por 5 min.
Tiempo de corrida: 45 min. Espectrómetro de masas operado a 70 eV en modo
full scan desde 50 hasta 600 unidades de masa. Temperatura de la fuente 250º
C, temperatura del cuadrupolo 150º C. Temperatura del inyector: 280º C,
volumen de inyección 2 µL con gas portador helio a 1 mL/min. Los compuestos
fueron identificados por comparación de los espectros con la base de datos del
equipo, tomando como referencia aquellos que superaban el 95 % de
coincidencia.
III.4 Toxicología aguda dérmica (TAD) y oral (TAO) del extracto
acuoso de las hojas
III.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD)
Se desarrolló la metodología descrita por la OECD TG 402 y establecida
en el CEIEB. Para la preparación de la muestra se tuvo en cuenta la metodología
descrita en el anexo 4. Luego de ello al residuo se lo sometió a reflujo con agua
destilada por dos horas.
III.4.1.1 Condiciones de tenencia de los animales
Se emplearon ratas albinas Wistar procedentes del Centro para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con su correspondiente
certificado de salud y un peso comprendido entre 170 y 180 g.
35
Las condiciones de cuarentena y aclimatación fueron las del bioterio y
se siguieron los procedimientos establecidos: Temperatura: 20 ± 3º C, Humedad
Relativa: 30 - 70 % (La variación no debe ser mayor de ± 5 %), Luz/ oscuridad:
12/ 12 horas. El agua y la comida fueron suministradas “ad libitum”.
III.4.1.2 Desarrollo del ensayo
En el ensayo se confeccionaron 2 grupos tratados (machos y hembras)
o sea recibieron el producto en estudio. Los grupos estaban compuestos de 5
animales cada uno. Al inicio del experimento todas las ratas fueron pesadas,
para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo con el peso de
las mismas.
III.4.1.3 Modo de aplicación
La sustancia que se administró fue el extracto acuoso de las hojas, de
manera tal que se empleó una dosis de 2000 mg/kg, y teniendo en cuenta los
sólidos totales del producto (6 %) fue entonces la cantidad suministrada a cada
animal.
24 horas antes del inicio del ensayo las ratas fueron peladas en un área
del 10 % de la superficie corporal en el dorso de la misma , posteriormente el
sitio de aplicación se cubrió con una almohadilla de gasa atada de forma
segura a la piel y toda la región fue cubierta con una banda de goma elástica
hipoalergénica y enrollada en la región media del cuerpo para de esta manera
evitar que el animal pudiera lamerse la zona de aplicación y por ende se
falsearan los resultados.
36
La sustancia en estudio se dejó en contacto con la piel por 24 horas,
transcurrido este tiempo se removió la cubierta y el agente residual fue eliminado
por lavado con solución de Cloruro de Sodio al 0,9 % con la ayuda de una
almohadilla de gasa estéril.
Después de la administración se realizaron las observaciones, y se
registraron sistemáticamente en el récord individual para cada animal, varias
veces durante el primer día y al menos una vez al día para los 13 restantes. Las
pesadas de las ratas se realizaron en los tiempos siguientes: 1, 7 y 14 días.
Al final del ensayo se procedió a sacrificar los animales empleando para
ello una sobredosis de tiopental sódico, siguiendo los procedimientos de
Refinamiento que se emplean actualmente en la Toxicología Experimental.
Si en las observaciones realizadas de los órganos (pulmones, corazón,
bazo, riñones y estómago) u otro signo clínico, se notan problemas graves,
entonces se toman muestras para su procesamiento histopatológico.
III.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)
Se desarrolló la metodología descrita por la OECDTG 423 y establecida
en el CEIEB. Para la preparación de la muestra se tuvo en cuenta la
metodología descrita en el anexo 4. Luego de ello al residuo se lo sometió a
reflujo con agua destilada por 2 horas.
III.4.2.1 Condiciones de tenencia de los animales
Se emplearon ratas albinas Wistar procedentes del Centro para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con su correspondiente
certificado de salud y un peso comprendido entre 186 y 202 g.
37
Las condiciones de cuarentena y aclimatación fueron las del cuarto y se
siguieron los procedimientos establecidos: Temperatura: 20 ± 3° C, humedad
Relativa: 30 – 70 % (La variación no debe ser mayor de ± 5 %), ciclo de luz/
oscuridad: 12/ 12 h. El agua y la comida fueron suministradas “ad libitum”.
III.4.2.2 Desarrollo del ensayo
En el ensayo se confecciona primero un grupo tratado con una dosis de
2000 mg/kg (hembras) de tres animales que recibieron el producto en estudio. Si
los resultados obtenidos indican que no hay muertes, se repite el mismo
procedimiento en un grupo de otros 3 animales, del mismo sexo. de encontrarse
muertes, se disminuía la dosis según lo indicado en la guía de la OECD y se
desarrollaba el mismo procedimiento. Al inicio del experimento todas las ratas
fueron pesadas, para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo
con el peso de las mismas.
III.4.2.3 Modo de aplicación
La tarde noche anterior fue retirada la comida de los animales,
transcurridas las horas de ayuna se comenzó la prueba, para ello todas las ratas
fueron pesadas para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo
con el peso de las mismas. Transcurridas de 2 a 3 horas de la administración de
la sustancia se procedió a colocar nuevamente la comida.
Después de la administración se realizaron las observaciones, y se
registraron sistemáticamente en los registros individuales para cada animal,
varias veces durante el primer día y al menos una vez al día para los 13
restantes.
38
Atendiendo a que la vía de administración fue la oral se incluyeron los
signos de toxicidad retardada. Las pesadas de las ratas se realizaron en los
tiempos siguientes: 1, 7 y 14 días.
Al final del ensayo se procedió a sacrificar los animales empleando para
ello una sobredosis de barbitúrico, evitando en lo posible que el animal sufriera y
cumpliendo de esta manera con el principio de las 3 ERRES, establecido por la
Toxicología Alternativa.
En las observaciones que se realizaron de los órganos (pulmones,
corazón, bazo, riñones y estómago u otro que durante los días de observación
se manifestó mediante los signos clínicos) si se encontraba alguna afectación,
entonces se tomaban muestras para su procesamiento histopatológico.
39
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1 Estudio farmacognóstico y fitoquímico
IV.1.1 Caracterización botánica de la especie
IV.1.1.1 Caracterización Taxonómica
La especie objeto de estudio fue caracterizada por el biólogo Xavier Cornejo
Sotomayor. Ms.C como Mimusops sp. a partir del material de herbario que fue
entregado. (Anexo 6)
Clase: Equisetiopsida C. Agardh
Subclase: magnoliidae Nóvak ex. Takdt.
Superorden: Asteranae Takht.
Orden: Ericales Bercht. & J. Presl
Familia: Sapotaceae Juss
Género: Mimusops L.
Nombre científico: Mimusops sp.
IV.1.1.2 Caracterización genética de la hoja
IV.1.1.2.1 Producto PCR
Se realizó un análisis de PCR punto final con las condiciones
mencionadas en la metodología. Se obtuvo una amplificación en los dos pares
de primers utilizados en este estudio (figura 1 y 2). Como control negativo se usó
un ADN de coral y un control sin ADN. Para el control positivo se utilizó ADN de
hojas de banano.
40
Figura 2. PCR punto final con el marcador molecular matk a una temperatura de hibridación de 56º C. La foto muestra la amplificación con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador molecular 100 bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de banda y los códigos de los pares de
primers se los puede apreciar en la tabla VI.
Figura 1. PCR punto final con el marcador molecular rbcl a una temperatura de hibridación de 60º C. La foto muestra la amplificación con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador molecular 100 bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar en la tabla VI
41
Tabla VIII Resultado del BLAST/NCBI
CÓDIGO PRIMER RESULTADO BLAST-N
Hit/ Description Max score Total score Query cover E value Ident Accession
A rbcLA_F
Mimusops elengi voucher ARG324 ribulose-1,5-
bisphosphate carboxylase/oxygenase large
subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast
797 797 100 % 0.0 100% KX807132.1
A rbcLA_F
Manilkara hexandra isolate 233 ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds;
chloroplast
797 797 100 % 0.0 100% JX856723.1
A rbcLA_F
Mimusops laurifolia isolate 4R2 voucher KSU:21544 ribulose-1,5-
bisphosphate carboxylase/oxygenase large
subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast
797 797 100 % 0.0 100% JQ304271.1
B matK_3F_KIM f Mimusops elengi voucher SBB-1082 maturase K (matK) gene,
partial cds; chloroplast 1131 1131 100 % 0.0 100% JN114760.1
B matK_3F_KIM f Mimusops obtusifolia voucher OM2627 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast
1131 1131 100 % 0.0 100% JX518165.1
B matK_3F_KIM f Palaquium sp. JH-2017 isolate
16-2990 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast
1131 1131 100 % 0.0 100% MF418677.1
B matK_3F_KIM f
Payena lucida voucher BT_0070234360 maturase K
(matK) gene, partial cds; chloroplast
1131 1131 100 % 0.0 100% KJ709037.1
42
La Tabla VIII muestra el resultado del Blast N con las secuencias producto
de la amplificación de los marcadores rbcl y matk con la muestra de árbol
desconocido. En esta tabla sólo se muestran las especies que presentaron mayor
similitud, tomando en cuenta el mayor porcentaje de identidad (Ident) y el menor
valor esperado (E value). En el marcador rbcl se observó que 3 especies distintitas
presentaron los mismos resultados y dos de ellos correspondían a un mismo
género: Mimusops elengi, Mimusops laurifolia, Manilkara hexandra. Por otro lado,
con el marcador matk presentó 4 especies distintas con los mismos resultados y dos
de ellos correspondían al mismo género: Mimusops elengi, Mimusops obtusifolia,
Palaquium sp., Payena lucida. El género Mimusops se presenta en ambos
marcadores con un alto porcentaje de identidad.
IV.1.1.2.2 Análisis de secuencia
Las secuencias fueron analizadas realizando un Blast-nucleotide (Tabla
VIII). Luego se escogió 10 secuencias del resultado para realizar un árbol
filogenético incluyendo la secuencia de la muestra desconocida. (Figura 3 y 4)
43
Figura 3. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de
la muestra desconocida con el marcador rbcl y las secuencias del resultado del Blast-n.
44
Figura 4. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-joining. El árbol fue realizado tomando como base la
secuencia de la muestra desconocida con el marcador matk y las secuencias del resultado del Blast-n.
45
IV.1.1.3 Evaluación macromorfológica de la hoja
La evaluación macromorfológica permitió observar hojas oblongas de
textura coriácea-cerosa, peciolo corto, ápice retuso, borde entero y base obtusa
(Miranda y Cuéllar, 2001; González, 2013). La venación es del tipo cerrada, la cual
se corresponde con un sistema reticular (las venas se ramifican y se anastomosan
unas con otras formando una red que facilita la difusión de líquidos), muy frecuente
en las dicotiledóneas, en este caso, del tipo penninervia, el cual es uno de los
sistemas más avanzados que asegura la nutrición a todas las partes de la hoja
(González, 2013). En la figura se muestran los detalles macroscópicos de las hojas.
Figura 5. Caracteres macromorfológicos de la hoja
46
Con respecto a las dimensiones de las hojas, los resultados se muestran en
la Tabla IX. Se pudo observar que el valor promedio para el largo de las hojas era
de 13,56 cm y el ancho de 7,49 cm.
Tabla IX Dimensiones de las hojas
PARÁMETRO VALOR
MEDIO
DESVIACIÓN
ESTÁNDAR VARIANZA
Largo (cm) 13,56 1.46 2,14
Ancho (cm) 7,49 0,65 0,43
Para el largo y ancho de las hojas se realizaron los histogramas de
frecuencia y los resultados representan en las figuras 6 y 7.
Figura 6. Histograma del largo de las hojas
47
Figura 7. Histograma del ancho de las hojas
Como se observa, las mayores frecuencias de valores se encontraron entre
12,8 -14,2 cm para el largo y 7,4 – 8,0 cm para el ancho, existiendo una gran
dispersión para el tamaño de las hojas.
Para Mimusops elengi L., Gami et al., (2012), informaron que las hojas
presentaban forma elíptica, poco acuminadas en el ápice, glabras de base aguda y
peciolos de 1,3 – 2,5 cm de longitud, informa que las dimensiones de las hojas
oscilan entre 6,3 – 10,0 cm de largo por 3,2 – 5,0 cm de ancho.
Mimusops hexandra Roxb (sin. Manilkara hexandra Roxb), presenta hojas
oblongas, redondeadas en el ápice, glabras, verde oscuro en el haz y claro en el
envés, con una dimensión de 2,5 – 11 cm de largo y 1,0 – 6,0 cm de ancho (Chanda
et al., 2010).
48
Algunas especies genéticamente similares a la especie objeto de estudio,
presentan algunas diferencias sobre todo en dimensiones de las hojas respecto a
las estudiadas, que son superiores.
La información referenciada en la literatura respecto a las características de
las hojas es escasa, por lo que no fue posible realizar comparaciones al respecto.
IV.1.1.4 Evaluación micromorfológica de la hoja
figura 8. Corte transversal a nivel del nervio central de la hoja
49
En la anatomía foliar a nivel de un corte transversal del nervio central (G)
se pudo observar que la superficie adaxial es convexa, ligeramente ondulada y la
cara abaxial es cóncava. Una vista ampliada del nervio (H) muestra una cutícula de
textura cerosa que recubre toda la hoja, y que fue bien visible en el estudio
macromorfológico, seguida de la epidermis la cual está conformada por células
tabulares, que dan paso al conjunto de células que forman el parénquima
esponjoso, dado los espacios intercelulares que se definen. También se observan
posibles cristales de oxalato de calcio.
Bordeando la parte central del nervio central, existe un cordón (C),
coloreado de rojo, que debe corresponderse con la endodermis, estructura que
rodea al periciclo. En centro se encuentra el tejido conductor formado por haces
vasculares xilema y floema (H e I).
Una imagen del mesófilo de la hoja (J) evidencia una cutícula algo gruesa
en la superficie abaxial, seguida de la epidermis, un parénquima empalizada con
células alargadas que por momentos se tornan estratificadas; de igual forma se
aprecia todo el centro de la estructura ocupado por el parénquima esponjoso, que
limita con la epidermis superior que concluye con la cutícula, ya referida
anteriormente.
El diafanizado a una porción de la hoja por la cara adaxial mostró una
epidermis con células de forma y tamaño variable (K). Sin embargo, la epidermis
abaxial evidenció gran cantidad de estomas del tipo anomocítico donde las células
epidérmicas que rodean el par de células oclusivas no son morfológicamente
diferentes del resto de las células epidérmicas (L). Una tinción con el reactivo de
Sudan III a nivel de la epidermis, permitió visualizar bolsas de aceites esenciales,
las cuales tomaron coloración rojiza (M).
50
El análisis micromorfológico de la droga en polvo mostró diferentes fibras y
haces vasculares, en este caso pertenecientes al tejido xilemático, encargado del
transporte de la savia bruta hacia los centros fotosintéticos y de la circulación del
mayor porciento de agua. Los vasos xilemáticos presentados se clasifican como
escalariforme o escaleriforme.
Solo para la especie Mimusops hexandra Roxb; se encontró información
acerca de las características micromorfológicas. Chandra y col, (2010) señala
similitud en cuanto a la epidermis con células rectangulares, pero en su caso estas
Figura 9. Diafanizado de la hoja
Figura 10. Detalles micromorfológicos de la droga en polvo
51
estaban cubiertas con una cutícula delgada contraria a la de la especie en estudio
que es gruesa.
Las estomas de ambas son anomocíticos y más abundantes en la
epidermis abaxial. También se observaron cristales de oxalato de calcio, tejido
esponjoso con espacios intercelulares.
La diferencia más marcada en la microscopía de las hojas, es en la forma
del nervio central, que en el caso de M. hexandra es más pronunciado hacia la
superficie abaxial que la especie objeto de estudio (Figura 11).
Figura 11. Sección transversal de la hoja (Chanda et al., 2010).
Si se tiene en cuenta que las características micromorfológicas, son la
huella dactilar de una especie, podemos señalar, que a pesar de sus similares
características genéticas, no parece de tratarse de la misma especie.
52
IV.1.2 Determinación de los parámetros Fisico-Químicos
A las hojas se le determinaron los parámetros fisicoquímicos de calidad.
Estos fueron: humedad residual, cenizas totales, cenizas insolubles en HCl y
sustancias solubles en agua, etanol al 80 % y hexano. Los resultados se muestran
en la Tabla X.
La determinación de humedad residual en el material vegetal es uno de los
índices numéricos que ayudan a complementar la calidad del método de secado
evaluado. Las Normas y Farmacopeas establecen, en dependencia del material
vegetal, un contenido de humedad residual entre 8 y 14 % (LouZhi-cen, 1980; WHO,
1998; Miranda, 2001). El estudio realizado proporcionó un valor de 14.34 %, estando
este valor fuera del rango establecido, pero se puede aceptar por tolerancia
matemática.
Dada las características de las hojas, con una gran superficie y
consistencia coriácea, es de esperar valores altos de humedad residual. Sin
embargo, Chanda et al., (2010) señala valores de pérdida en peso de un 4 %.
Las cenizas son indicativas de la calidad del material con que se trabaja y
constituye una base para juzgar su pureza e identidad, brindando información
relativa a la posible adulteración con materias inorgánicas o cuerpos extraños que
posea (Miranda y Cuéllar, 2001).
Las Farmacopeas plantean un índice de cenizas totales hasta el 5 %
(LouZhi-cen, 1980; WHO 1998). El ensayo realizado dio un valor de 7,35 %, valor
que está por encima de lo establecido. La cantidad de cenizas insolubles en HCl al
10 %, es también un parámetro que ayuda a evaluar la pureza de la droga. Al
53
analizar los resultados se pudo observar que el porcentaje de estas cenizas
insolubles fue de 4,23 %, valor que se encuentra fuera del límite establecido
(alrededor del 2 % para plantas medicinales) (LouZhi-cen, 1980; WHO 1998).
Al ser las cenizas indicativas de la concentración de minerales del suelo
dónde se desarrolla la especie, se considera necesario realizar un estudio más
profundo sobre las cenizas de la especie. Chanda et al., (2010) encontraron para M.
hexandra, valores altos de cenizas totales, pero las insolubles en el rango
establecido.
Los valores obtenidos para las sustancias solubles indican que el mayor
porcentaje de metabolitos presentes en las hojas son de naturaleza medianamente
polar, lo que se demuestra en el porcentaje de sustancias solubles en alcohol, es
superior a las solubles en agua y hexano.
Valores similares para las sustancias solubles en disolventes apolares
fueron obtenidos para M. hexandra; sin embargo, las sustancias extraídas en etanol
y agua fueron bajo en comparación con la especie en estudio (Chanda et al., 2010).
Tabla X Parámetros Fisicoquímicos de las hojas
PARÁMETRO PORCENTAJE (%)
Valor reportado
para M.
hexandra*
Humedad Residual 14,34 4,00
Cenizas Totales 7,35 6,00
Cenizas Insoubles en HCl 4,23 1,00
Sustancias Solubles en Agua 19,26 12,30
Sustancias Solubles en Etanol 90
%
44,03 10,60
Sustancias Solubles en Hexano 4,67 3,74
54
*(Chanda et al., 2010).
IV.1.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico
Uno de los aspectos considerados de interés en el estudio de una droga es
conocer de forma preliminar su composición química general por métodos de
tamizaje fitoquímico. Para el estudio se utilizaron tres extractos con diferentes
solventes como se expresa en la Tabla XI.
Tabla XI Tamizaje fitoquímico de las hojas
Ensayo Metabolito Resultado
Extracto Etéreo
Sudán Aceites y Grasas +
Lieberman-Buchard Triterpenos-Esteroides Morado
Extracto Alcohólico
Resinas Resinas +++
Lieberman-Buchard Triterpenos-Esteroides Verde Oscuro
Espuma Saponinas ++
Cloruro Férrico Fenoles y Taninos Azul Intenso
Borntrager Quinonas ++
Extracto Acuoso
Cloruro Férrico Fenoles-Taninos Azul Intenso
Shinoda Flavonoides +
Fehling Azúcares Reductores +++
Espuma Saponinas ++
Principios Amargos Compuestos Amargos y
Astringentes +
Al efectuar los análisis correspondientes a los extractos etéreos (Tabla XI)
se evidenciaron resultados positivos para núcleos triterpénicos y esteroidales y
compuestos grasos. Los extractos alcohólicos (Tabla XI) respondieron positivo para
resinas, núcleos triterpénicos y esteroides, saponinas, fenoles, taninos y quinonas.
En los extractos acuosos (Tabla XI) resultaron positivos los ensayos para fenoles,
taninos, flavonoides, compuestos reductores, saponinas y sustancias amargas.
55
Aunque en la literatura consultada no se referencian estudios de tamizaje
fitoquímico; para los géneros Manilkara y Mimusops si se ha informado el
aislamiento y caracterización de diversos compuestos en las hojas, que pudieran ser
los responsables de los ensayos positivos del tamizaje, entre ellos: taraxasterol,
saponinas, α-amirina, ácido ursólico (triterpenoides), quercetina, miricetina
(flavonoides) (Misra et al., 1974).
IV.2 Estudios químicos preliminares
IV.2.1 Extracción y fraccionamiento del material vegetal
Como resultado del proceso se obtuvieron dos extractos: hexánico y
metanólico. Los extractos hexánicos presentaron una alta pigmentación verde, que
con el pasar del tiempo se pudo presenciar la aparición de un precipitado muy
viscoso (látex) de color verde oscuro que interfería durante los ensayos. Luego se
obtuvo el extracto metanólico con una coloración igualmente de color verde intenso,
lo que sugiere que la composición química que prevalece en la planta es de alta
polaridad.
IV.2.2 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos
En el extracto hexánico se pudo observar la presencia de látex en
abundancia al pasar del tiempo. En el extracto metanólico también se presenció la
aparición de látex, pero en menor proporción.
No obstante, para el análisis por cromatografía en capa delgada, de los tres
tipos de fases móviles utilizados para los extractos hexánico y metanólico, se obtuvo
56
mejor resultado con hexano: cloroformo: AcOEt: metanol (10:5:5:2,5), la cual mostró
tanto al visible con luz UV como al revelado con metanol: ácido sulfúrico (50:50), un
comportamiento cromatográfico con cierta complejidad, como se observa en la
Figura 12; pero sin lograrse una adecuada separación. No se pudo destacar
ninguna mancha bien separada.
IV.3 Estudios químicos
IV.3.1 Eliminación de látex por agotamiento
Se agotó casi en su totalidad el látex del material vegetal como se observa
diagramado en el anexo 4. Este látex se encontró en mayor concentración en el
extracto hexánico presentando una consistencia dura de color amarillo verdoso.
Figura 12. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz
UV y ácido sulfúrico. (H) Hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt)
Acetato de etilo; (Met) Metanol.
57
IV.3.2 Método de extracción y concentración
Como resultado del proceso se obtuvieron tres extractos: clorofórmico,
AcOEt y metanólico, los que fueron concentrados en el rotaevaporador y luego
almacenados en vasos de precipitación.
Los extractos clorofórmicos presentaron una alta pigmentación verde
negruzca, para los extractos con AcOEt, la apariencia fue verde oscuro y para los
metanólicos también fueron oscuros, muy similares a los extractos clorofórmicos.
IV.3.3 Análisis por cromatografía en capa delgada (CDD) de los extractos
Para el análisis por CCD se usaron los extractos clorofórmicos, AcOEt y
metanólicos. Como fase móvil se usó la que dio mejores resultados en los estudios
preliminares la cual fue hexano:cloroformo:AcOEt:metanol (10:5:5:2,5); mostrando
tanto al visible con luz UV como al revelado con metanol: ácido sulfúrico (50:50), un
comportamiento cromatográfico también con cierta complejidad, como se observa
en la Figura 13.
58
Todos los extractos fueron analizados según su complejidad
cromatográfica, apariencia y consistencia; llegándose a la conclusión de descartar
los extractos hexánicos y clorofórmicos, para luego continuar el ensayo con una
columna cromatográfica con los extractos de AcOEt y metanol.
IV.3.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica
A partir de 0,19 g de extracto de acetato de etilo seco, lavado con hexano;
se procedió a fraccionar el mismo por cromatografía en columna, empleando como
criterio la CCD para el cambio de disolvente. En la Tabla XII se exponen las
fracciones obtenidas para cada uno de los sistemas de solventes empleados.
Figura 13. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido
sulfúrico. (1H) Extracto 1 de hojas; (2H) Extracto 2 de hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol.
59
Tabla XII. Fracciones obtenidas para los diferentes sistemas de solventes
Sistemas de solvente Número de fracciones
Hexano 100% 5 (1 - 5)
Hexano - Diclorometano 75:25 5 (7 – 11)
Hexano - Diclorometano 50:50 88 (13 – 100)
Hexano - Diclorometano 40:60 5 (102 – 106)
Hexano - Diclorometano 25:75 10 (108 – 117)
Diclorometano 100% 10 (119 – 128)
Diclorometano – AcOEt 75:25 11 (130 – 140)
Diclorometano – AcOEt 50:50 10 (142 – 151)
Diclorometano – AcOEt 25:75 11 (153 – 163)
AcOEt 100% 6 (165 – 170)
AcOEt – Metanol 75:25 6 (172 – 177)
AcOEt – Metanol 50:50 6 (179 – 184)
Metanol 100% 6 (186 – 191)
Las fracciones se reunieron de acuerdo con similitud de polaridad,
mostradas en la tabla XIII; y luego se les realizó CCD, para observar su
complejidad.
Tabla XIII. Fracciones agrupadas por similitud de polaridad
#1: 1-5 #2: 7-11 #3: 13-15 #4: 16-17 #5: 18-20 #6: 21-26
#7: 27-29 #8: 30-35 #9: 36-106 #10: 108-117
#11: 119-128
#12: 130-140
#13: 142-151
#14: 153-163
#15: 165-170
#16: 172-177
#17: 179-184
#18: 186-191
60
Figura 14. CCD de las fracciones agrupadas por similitud de polaridad
Después de ver el resultado de la CCD, las fracciones se reunieron por
segunda ocasión, de acuerdo con similitud cromatográfica:
Primer grupo: 21 – 35 (Hexano - Diclorometano 50:50)
Segundo grupo: 36 – 106
o 36 – 100 (Hexano - Diclorometano 50:50)
o 102 – 106 (Hexano - Diclorometano 40:60)
Tercer grupo: 108 – 163
o 108 – 117 (Hexano - Diclorometano 25:75)
o 119 – 128 (Diclorometano 100%)
o 130 – 140 (Diclorometano – AcOEt 75:25)
o 142 – 151 (Diclorometano – AcOEt 50:50)
o 153 – 163 (Diclorometano – AcOEt 25:75)
Al finalizar se seleccionaron las fracciones 36 - 106, que fueron las más
numerosas, por que aparecía una sola mancha cromatográfica, la cual precipitaba
en la mezcla de disolventes Hexano - Diclorometano 50:50 y Hexano -
Diclorometano 40:60. La misma fue enviada para ser caracterizada por
61
cromatografía gaseosa – espectrometría de masas. El cromatograma gaseoso
analítico de esta fracción se presenta en la Figura 15.
Como se aprecia la mancha que por CCD parecía ser un solo compuesto,
al ser analizada por cromatografía gaseosa, presentó un cromatograma complejo
con alrededor de 147 picos cromatográficos, de los cuales pudieron asignárseles
estructuras, por comparación de los espectros con la base de datos del equipo a 88
compuestos, los cuales se presentan en la Tabla XIV.
Figura 15. Cromatograma gaseoso analítico del grupo de fracciones 36-106
62
Tabla XIV. Compuestos identificados en las fracciones 36-106
Pico TR Compuesto Área de
Pico %
Abundancia
1 8,16 Prehnitol 0,12 0,18
2 8,25 Isodureno 0,22 0,32
3 10,35 α-Terpineno 0,31 0,46
4 13,05 Tridecano 0,40 0,59
5 15,26 β-Patchouleno 0,07 0,10
6 15,46 1-Tetradeceno 0,10 0,15
7 15,67 Tetradecano 0,37 0,54
8 16,54 α-Guaieno 0,19 0,28
9 16,91 Seychelleno 0,27 0,40
10 17,20 α-Patchouleno 0,26 0,38
11 17,46 α-Isometilionona 0,82 1,21
12 18,06 Ciclododecano 0,09 0,13
13 18,16 Pentadecano 0,22 0,32
14 18,93 Docosano 0,12 0,18
15 20,36 1-Hexadeceno 0,50 0,74
16 20,53 Hexadecano 0,08 0,12
17 21,65 Metil dihidro jasmonato 0,08 0,12
18 22,19 Alcohol Patchouli 0,45 0,66
19 22,64 2-Tetradeceno 0,03 0,04
20 22,72 Tetracosano 0,08 0,12
21 22,79 Heptadecano 0,09 0,13
22 23,69 Heneicosano 0,09 0,13
23 24,17 Pentadecano 0,17 0,25
24 24,29 Benzoato de Bencilo 0,22 0,32
25 24,81 1-Octadeceno 1,41 2,07
26 24,95 Octadecano 0,18 0,26
27 25,06 1-Octadeceno 0,08 0,12
28 25,43 Miristato de isopropilo 0,13 0,19
29 26,85 Ácido 9-Octadecenoico 0,15 0,22
30 27,00 Nonadecano 0,26 0,38
31 27,48 Éster metílico del Ácido 14-metil-
Pentadecanoico 0,57 0,84
32 28,38 Ácido Palmítico 1,50 2,21
33 28,85 1-Eicoseno 1,81 2,66
34 28,96 Eicosano 0,60 0,88
35 30,65 Éster metílico del Ácido10,13-
octadecadienoico 0,19 0,28
36 30,84 Heneicosano 1,28 1,88
37 31,12 1-Eicoseno 0,24 0,35
38 31,29 Éster metílico del Ácido octadecanoico 0,25 0,37
39 31,41 9-Tricoseno 0,10 0,15
63
40 31,69 Ácido oleico 2,30 3,38
41 32,00 Éster etílico del Ácido 9-octadecenoico 0,90 1,32
42 32,11 1,2-dietil-ciclohexadecano 0,36 0,53
43 32,22 14β-Pregnano 0,31 0,46
44 32,54 1-Docoseno 1,57 2,31
45 32,64 Docosano 1,56 2,29
46 33,15 Tricosano 0,23 0,34
47 33,72 Eicosano 0,28 0,41
48 33,87 14β-Pregnano 0,27 0,40
49 34,36 Tricosano 1,85 2,72
50 34,54 14β-Pregnano 0,52 0,76
51 34,94 3-Pentacoseno 0,59 0,87
52 35,09 14β-Pregnano 0,22 0,32
53 35,29 14β-Pregnano 0,33 0,49
54 35,40 Heneicosano 0,56 0,82
55 35,55 14β-Pregnano 0,71 1,04
56 35,92 1-Docoseno 1,07 1,57
57 36,03 Tetracosano 2,53 3,72
58 36,56 14β-Pregnano 0,76 1,12
59 36,70 3-Pentacoseno 0,53 0,78
60 36,93 Docosano 0,50 0,74
61 37,02 14β-Pregnano 0,69 1,01
62 37,43 14β-Pregnano 1,21 1,78
63 37,62 Pentacosano 3,63 5,34
64 38,47 3-Pentacoseno 0,70 1,03
65 38,57 Tricosano 0,93 1,37
66 38,72 Tetracosano 0,87 1,28
67 39,15 Hexacosano 3,93 5,78
68 39,46 Z-12-Pentacoseno 0,40 0,59
69 39,62 Nonacosano 1,24 1,82
70 39,87 Escualano 1,70 2,50
71 39,97 Tetracosano 0,58 0,85
72 40,06 14β-Pregnano 0,81 1,19
73 40,21 Hexacosano 1,45 2,13
74 40,40 1-Hexacoseno 0,67 0,99
75 40,62 Eicosano 4,43 6,52
76 41,50 Octacosano 0,96 1,41
77 41,64 Nonacosano 2,98 4,38
78 42,04 Eicosano 1,94 2,85
79 42,14 Escualeno 1,19 1,75
80 42,47 Nonacosano 1,03 1,51
81 42,71 Triacontano 0,26 0,38
82 42,82 Octacosano 0,23 0,34
83 42,89 1-Hexacoseno 0,37 0,54
64
84 43,04 14β-Pregnano 0,43 0,63
85 43,41 Heptadecano 1,06 1,56
86 43,81 Nonacosano 0,97 1,43
87 44,24 Nonacosano 0,20 0,29
88 44,74 Triacontano 1,08 1,59
TOTAL 67,99 100,00
Del total de compuestos encontrados, 7 de ellos pertenecen a los ácidos
grasos tanto libres como metilados, de los cuales 2 se encuentran reportados en la
literatura, como es el ácido oleico, que está presente en las semillas de Mimusops
elengi (Misra y Mitra 1966; Misra et al., 1974), Mimusops caffra (Misra et al., 1974;
Chivandi et al., 2016), Mimusops manilkara, M. longifolia, M. mottleyana, M.
hexandra, M. heckelii, M. djave (Misra et al., 1974) y Mimusops zapota (Fayek et al.,
2012; Satish et al., 2015). El ácido palmítico reportado en semillas de Mimusops
caffra (Misra et al., 1974; Chivandi et al., 2016) y Mimusops zapota (Satish et al.,
2015), y en corteza de Manilkara bidentata (Cocker et al., 1962).
También 33 compuestos corresponden a hidrocarburos saturados e
insaturados; 6 pertenecen a terpenoides, de éstos 1 es un monoterpeno, el α-
Terpineno; y 5 a sesquiterpenos, el α-Patchouleno, β-Patchouleno, α-Guaieno,
Seychelleno y Patchoulenol.
Se encontraron compuestos fenólicos, iononas, ésteres bencílicos y
propílicos y una hormona natural de defensa como el metil dihidro jasmonato.
Aparece en varias ocasiones el 14β-pregnano; y se puede recalcar que en
la naturaleza, se presentan solamente los derivados de tres estereoisómeros del
pregnano: el 5β-pregnano, el 14β-pregnano y el 5β-pregnano, 14β-pregnano.
65
Cabe mencionar que la fracción resultó muy compleja, y se puede destacar
a tres compuestos, todos alcanos de cadena lineal: el eicosano, pentacosano y el
hexacosano, ya que estos sobrepasaron el 5% de abundancia;
66
IV.4 Toxicología dérmica (TAD) y aguda oral (TAO) del extracto acuoso
de las hojas
IV.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD)
No se reportaron signos clínicos en ninguno de los grupos estudiados.
En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos para el peso corporal
(en valores medio y desviación estándar) para los días 1, 7, y 14 de la experiencia.
Figura 16. Variación en el peso corporal (gramos) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Dérmica de Extracto acuoso de hojas. Letras
diferentes indican significación estadística p< 0.05
67
Como se puede apreciar en la Figura 16, los animales tratados con el
extracto de hojas tuvieron ganancia en peso durante todas las pesadas efectuadas,
encontrándose en algunos casos diferencias estadísticamente significativas como lo
demuestran las letras diferentes.
Las muestras tomadas de los órganos seleccionados no presentaron
afectaciones desde el punto de vista macroscópico, por lo que el patólogo decidió
no efectuar la toma de las mismas para su estudio histopatológico.
No se observaron signos clínicos de toxicidad en ninguno de los animales
sometidos a ensayo. Desde el punto de vista de las necropsias efectuadas a los
animales no se presentaron afectaciones en los órganos seleccionados. El producto
estudiado no afecta la ganancia en peso de los animales en prueba. Cuando se
administra de forma aguda en la piel el extracto de hojas, no se producen efectos
tóxicos en los animales de experimentación.
El extracto no indujo toxicidad aguda dérmica observable en los animales
de experimentación cuando se utiliza el ensayo descrito por la OECD TG 402, a una
dosis de 2000 mg/kg. El producto se considera prácticamente inocuo para los
humanos, cuando se aplica de forma aguda.
IV.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)
Las pesadas de las ratas en los diferentes tiempos se procesaron
estadísticamente para obtener la media y la desviación estándar.
68
Con el empleo de la dosis de 2000 mg/kg no murió ninguna de las ratas
administradas con el producto objeto de estudio.
Se realizaron observaciones diarias durante 14 días de duración de todo el
ensayo. No se reportaron signos clínicos en ninguno de los animales estudiados con
el empleo de la dosis de 2000 mg/kg.
En la Figura 17 se muestran los resultados obtenidos para el peso corporal
(en valores medio y desviación estándar) para los días 1, 7, y 14 de la experiencia
que se corresponde con la dosis de 2000 mg/kg.
Figura 17. Variación en el peso corporal (g) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Oral del extracto acuoso de hojas a la dosis de 2000
mg/kg.
69
Como se puede apreciar en la Figura 17, los animales de los dos grupos
tratados con el extracto acuoso de hojas tuvieron ganancia en peso durante todas
las pesadas efectuadas lo que sugiere ausencia de efectos tóxicos sistémicos.
Las muestras tomadas de los órganos seleccionados no presentaron
afectaciones desde el punto de vista macroscópico, por lo que se decidió no
efectuar la toma de las mismas para su estudio histopatológico en los animales de
2000 mg/kg.
Cuando se utilizó la dosis de 2000 mg/kg no murieron ninguno de los
animales sometidos a ensayo. No se observaron signos clínicos en ninguno de los
animales. Desde el punto de vista de las necropsias efectuadas a los animales no
se presentaron afectaciones en los órganos seleccionados de ninguno de los grupos
sometidos a estudio.
El producto estudiado no afecta la ganancia en peso de los animales en
prueba. Cuando se administra oralmente de forma aguda del extracto acuoso de
hojas no se producen efectos tóxicos sobre los animales en prueba.
70
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permitieron arribar a las siguientes conclusiones:
Se informaron las características morfoanatómicas de las hojas de la
especie estudiada.
Se determinaron las características genéticas de la especie estudiada,
sin llegar a la confirmación de su clasificación taxonómica, por estrecha
similitud entre seis especies de la familia Sapotaceae; las cuales fueron
Mimusops elengi, Mimusops obtusifolia, Palaquium sp, Payena lucida.
Se informaron por primera vez, algunos de los principales parámetros
fisicoquímicos de las hojas de la especie: Humedad Residual, Cenizas
Totales, Cenizas Insolubles en HCl, Sustancias Solubles en Agua,
Etanol 90 % y Hexano.
Para la composición química cualitativa a través del tamizaje fitoquímico,
se encontraron los compuestos grasos, fenólicos, flavonoides y
terpenoides como los componentes principales.
Se diseñó y aplicó un método de extracción y fraccionamiento para el
estudio de la composición química de las hojas, observándose que el
disolvente más adecuado para el método fue el acetato de etilo, cuyo
extracto resultó muy complejo, destacándose tres alcanos de cadena
larga: el eicosano, pentacosano y hexacosano, ya que estos lograron
sobrepasar el 5 % de abundancia en la cromatografía gaseosa.
El extracto acuoso de las hojas en estudio no indujo Toxicidad Aguda
Dérmica (TAD) ni Toxicidad Aguda Oral (TAO), observable en los
71
animales de experimentación. Cuando se utiliza el ensayo descrito por la
OECDTG 423 y OECD TG 402; a una dosis de 2000 mg/kg de peso. El
producto se considera prácticamente inocuo para los humanos, cuando
se aplica en forma aguda.
72
CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES
Se recomienda utilizar marcadores moleculares más elevados en la
caracterización genética.
Se considera necesario realizar un estudio más profundo sobre las
cenizas de la especie.
Ampliar el aislamiento y fraccionamiento químico de los diferentes
extractos
Realizar estudios farmacológicos a diferentes extractos de las hojas
estudiadas.
73
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