Produccin de metabolitos secundarios

en biorreactores

Alejandro Mentaberry

Departamento de Fisiologa, Biologa Celular y Molecular

FCEN-UBA

Conceptos y Tcnicas de BiotecnologaCurso 2010

Sumario

Potencial econmico de los metabolitos secundarios

Referencias

Estrategias para incrementar la produccinde metabolitos secundarios.

- Seleccin de especies vegetales apropiadas- Seleccin de lneas celulares mejoradas- Optimizacin de las condiciones de cultivo- Agregado de precursores- Suspensiones, rganos y clulas inmovilizadas- Uso de elicitores microbianos y de estreses abiticos- Permeabilizacin y remocin in situ

Diseo de procesos. Ejemplos

Ingeniera metablica y biotransformacin

Potencial econmico de los metabolitos secundarios

El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante

Concepto general

La produccin de metabolitos secundarios est estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.

- Generalmente no est asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y rganos

(races, tallos, hojas y glndulas).- La biosntesis y acumulacin suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidosy de rganos.

Los metabolitos secundarios se producen ante situacionesde estrs o enfermedad.

- Factores biticos- Factores abiticos

Cultivode tejidos y metabolismo secundario

- Insecticidas- Saborizantes- Colorantes

Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de inters comercial

Potencial

- 75% de las nuevas estructuras qumicas descubiertas provienen de las plantas.

- Slo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.

- 25% de los medicamentos de las industrias farmacuticas son de origen vegetal.

- 75% de la poblacin mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

- Desarrollo creciente de fitoteraputicos y nutracuticos

- Medicinas- Herbicidas- Proteasas

- Fragancias- Antimicrobianos- Enzimas

Ejemplos de terpenoides producidos en plantas Se conocen

unos 25.000 terpenoides presentes en plantas

Taxol (droga anticancergena)

Forbol (irritante y cocarcinognico)

Costunlido (repelente de inserctos;

antinutriente de mamferos)

Azadiractina A (antinutrientede insectos) -Ecdisona

(disruptor de la muda de insectos)

Hecogenina(aglicona de una saponina;

detergente)

Digitoxigenina(aglicona de digitoxina; tratamiento

de congestiones cardacas)

Taxol(droga anticancergena)

Forbol(irritante y cocarcinognico)

Azadiractina A (antinutrientede insectos)

Costunlido(repelente de inserctos;

antinutrientede mamferos)

Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales

Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocana

CafenaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocana

CafenaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Ejemplos de fenlicos derivados de fenilpropanoides

Unos 8.000 fenlicos se forman en las plantas por las rutas del cido shikimico o del malonato/acetato

gingeroles

Rizoma de ginger

Pimiento rojo y negro

piperina

norhidrocapsaicina

capsaicinaGranos de caf

Corteza de canela

cinnamaldehido

cido clorognico

Algunas de las medicinas ms importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002

Nombre Tipo Origen Uso teraputico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, escopolamina

Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinrgicos

Camptotecina Alcaloide indlico Camptotheca acuminata

Antineoplsico

Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico Nicotina Alcaloide pirrolidnico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Antimalrico Quinidina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Cardiotnico Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico Vinblastina, vincristina

Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico

Yohimbina Alcaloide indlico Apocynaceae, Rubiaceae

Afrodisaco

Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotnico Sennsidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de

ipecacuana Cephaelis ipecacuanha

Emtico

Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico

Antitumoral

Produccinde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode clulas y rganos vegetales: por qu?

- Independizarse de factores externos, tales como:cambios de temperatura, sequas, plagas,variabilidad de la produccin, factores polticosy sociales, etc.

- Evitar la extincin de especies vegetales.

- Disponer de condiciones controladas en el procesode produccin y extraccin.

- Hacer viable la produccin de compuestos complejos con uno o ms C quirales en forma mseconmica respecto de la sntesis qumica

- Posibilitar la obtencin de nuevos compuestosno presentes en la planta madre.

- Establecer procesos de biotransformacin slorealizables por enzimas provenientes de plantas.

Procesos industriales

Tipo de compuesto

Farmacuticos

PigmentosFragancias

SaborizantesDepigmentadores

Producto

ShikoninaBerberina

SanguinarinaGingsensidos

TaxolCartaminaGeraniolCitronerolVanillinaArbutina

Compaa

Mitsui Petrochemical Ind.Mitsui Petrochemical Ind.

Vigont Researol Lab.Nitto Denko Co.

Phyton USAKibun Kyoto University

Kanedo Co.Kanedo Co.Kanedo Co.

Mitsui Petrochemical Ind.

20 M

0,6 M

4.800

340.000

1.000

n/a

3.250

4.500

-

-

Precio (U$S/kg)

18PigmentosMorinda citrifoliaAntraquinonas

12,4Antibacteriano, colorante

Lithospermunerythrorhizon

Shikonina

10,6AntibacterianoThalictrum minusBerberina

8,9PigmentoPerilla frutescensAntocianinas

3,8EsteroideDioscorea deltoideaDiosgenina

0,025AnalgsicoPapaver somniferumMorfina

2,5AntibiticoPapaver somniferumSanguinarina

0AntileucmicoCatharanthus roseusVincristina

0,06AnticancergenoTaxus brevifoliaPaclitaxel (Taxol)

21-36AntiinflamatorioCloeus blumeiAcido rosmarnico

Rendimiento (%)AplicacinEspecieProducto

Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.

Productos comerciales potenciales y rendimientos de algunos cultivos de clulas vegetales

Condiciones econmicas:- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)

- Alto rendimiento y productividad del cultivocomparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta enteracomo fuente alternativa

Parmetros principales:- Productividad: g de producto/L/da

- Concentracin mxima de producto: g de producto/L

- Rendimiento: g producto/g sustrato

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

Estrategias para incrementarla produccin de metabolitos secundarios

Esquema del patrn de crecimientode una suspensin celular vegetal

Rendimiento de biomasa en sustrato

Cuantificaciny cinticade un proceso Td: tiempo de duplicacin de la biomasa : velocidad especfica de crecimiento del organismo

Y: rendimientoX: biomasaS: sustrato

Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento

Patrones de formacin de producto

Seleccin de especies vegetales apropiadas

Seleccin de lneas celulares mejoradas

Optimizacin de las condiciones de cultivo

Agregado de precursores

Tipo de cultivo: suspensiones, rganoso clulas inmovilizadas

Uso de elicitores microbianosy estrs abitico

Permeabilizacin y remocin in situ

Metodologas utilizadas para optimizarla produccin de metabolitos secundarios

Screening y seleccin de lneas sobreproductoras

- Se facilita cuando el metabolito de inters es unpigmento, ya que puede hacerse una seleccin visual.

- Es importante contar con un mtodo rpido y sencillopara seleccionar lneas ms productoras (por ejemplo,ELISA).

Optimizacin del medio de cultivo (variables msensayadas)

- Fuente de carbono- Limitacin en nitrgeno- Limitacin en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relacin C/N

Agregado de precursores

- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metablica

Metodologas utilizadas para optimizarla produccin de metabolitos secundarios

Diferencias entre suspensiones de clulas vegetalesy de clulas microbianas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Consecuencias paracultivos a gran escala

Sedimentacin rpida;sensibilidad a fuerzas de corte;

formacin de gradientes;dificultad para tomar muestras

Largos tiempos de proceso;baja productividad

Necesidad de grandescantidades de inculo;

escalado ms largo

Bajas velocidadesde agitacin

Baja demanda de oxgeno:fermentadores con bajatransferencia de oxgeno

Permeabilizacin;remocin in situ

Clulasvegetales

Agregados de 10-200 m y

de hasta 2 mmde dimetro

Lenta; td ~ 2-5 das

5-20%

Sensible /Tolerante

Baja

Intracelular /a veces extracelular

Clulasmicrobianas

ClulasIndividuales

2-10 m

Rpida;td ~ 1-2 h

Pequea

Insensible

Alta

Extracelular

Caracterizacin

Tamaoy morfologa

Velocidadde crecimiento

Densidad de inoculacin

Sensibilidad a fuerzas de corte

Aireacin

Acumulacindel producto

Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inculo

- Tamao y agregacin de las clulas

- Oxigenacin

- Agitacin

Cultivos en suspensin

2,30,3080 L (EA)Helianthus annuus5,90,127 L (EA)Picrasma quassioides

0,720,9615, 30, 130 L (AG)Nicotiana tabacum0,631,1015, 500 L (AG)Nicotiana tabacum1,40,4810 L (EA)Morinda citrifolia2,20,3230 L (EA)Catharanthus roseus

5,20,137 L (EA)Quassia amara

1,70,42600 L (AG)Nicotiana tabacum

Tiempo de duplicacin (d)

Tasa de crecimientoespecfica (d-1)BioreactoresLnea celular

AG: bioreactor con agitacinEA: bioreactor de elevacin por aire (airlift)

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Ejemplos de tasas de crecimiento de suspensiones de clulas vegetales en biorreactores

La densidad el inculo y del diseo del biorreactor inciden en el desarrollo de las suspensiones celulares

Tamao y distribucin de agregadosde Helianthus annuus en variosbiorreactores y en Erlenmeyer

Efecto de la densidad de inculo en el crecimiento de cultivos de Picrasma quassiodides.

Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Porcentaje de callos de Vitis viniferaque contienen pigmentos de acuerdo

con el tamao de los agregados

Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001.

Distribucin del tamaos obtenido en biorreactores con medio en presencia de carboximetilcelulosa (crculos cerrados)

y en medio control (crculos abiertos)

Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.

Tamao de agregado y acumulacin de metabolitos secundarios

Patrn de flujo de dos diseos de propulsor Agitador de paletas inclinadas

(flujo axial)Agitador de paletas planas o de Rushton

(flujo radial)

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

deflector deflector

Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998.

Diseos de distintos propulsores

Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo

Biorreactores de agitacin neumtica

El biorreactor ms grande del mundo es de tipo air-lift

ICI, Ltd. factory, Billingham, UK

Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de protena bacteriana (Methylophilus methylotrophus) por mes.

Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.

Diseos alternativos para biorreactores con agitacin mecnica

Cultivo de rganos: races transformadas

Propiedad

Forma de crecimientoPatrn de crecimiento

Tiempo de duplicacinBiomasa final (peso seco/L)Background genticoFormacin inicial de productoMedio de crecimiento

Localizacin del producto Tipo de proceso

Suspensiones

Clulas simples-agregadosDesorganizado; cada clulapuede dividirse y expandirse

15 h-das30-60 g

HeterogneoUsualmente bajo

Complejo; hormonasy vitaminas

Intracelular- extracelularBatch; continuo, deben

ser inmovilizadas

Races transformadas

Red de ramificacionesDivisin celular localizada;

crecimiento linear conramificaciones laterales

36 h-das 30-60 g

EuploideSimilares a la planta madre

Simple, sales y azcar

Intracelular- extracelularBatch o continuo, no haynecesidad de inmovilizar

Fenotipo de raz transformada con

Agrobacterium rhizogenes

Gnero

NicotianaCatharanthus

CinchonaDuboisiaDatura

BetaLippia

ArtemisiaCoreopsis, Bidens

Tagetes

DigitalisCassiaPanax

ChaenactisPodophyllum

LinumLithospermum

Solanum

Metabolito

AlcaloidesAlcaloides piridnicosIndoles

Tropano

OtrosBetalainaSesquiterpenos

PoliacetilenosTiofenos

Glicsidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos

NaftoquinonasEsteroides

Algunos metabolitos secundarios producidospor races transformadas

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Biorreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)

Biorreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las races

Biorreactores para el cultivo de races

Bomba de aire

Rot

met

ro

B

o

m

b

a

p

e

r

i

s

t

l

t

i

c

a

Generador de niebla

Cmarade cultivoControlador Controlador

On OffIntensidad

Filtro de aire

Condensadorde niebla

Adicin de nutrientes

Bomba

Salida de aire

AireAire

Inculo

Reservorio

Malla de inmovilizacin

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Applications,

1997.

Compuesto

PiretrinasCardenlidosArtemisinina

Aceites esencialesAceites esenciales

Planta

Chrysanthemum spp. Digitalis spp.

Artemisia annuaMentha spp.

Pelargoium spp.

Cultivode tallos Ventajas

- Cultivos gentica y bioqumicamente estables- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos

presentes en tallos y hojas (glndulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales

- Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple).

Desventajas- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas- Vitrificacin

Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentacin por

goteo; C: Igual que A, pero con alimentacin por niebla.

Produccin de artemisinina en los distintos bioreactoresTomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.

Cultivo de tallos de Artemisia annuapara la produccin de artemisinina

La inmovilizacin se define comoel confinamiento de un biocatilizador, enzimtico o celular, dentro o sobre una matriz slida para favorecer la liberacin del producto y la reutilizacin del propio biocatilizador.

Unin a una matriz:- Covalente - Inica- Por crosslinking- Por adsorcin

Entrampamiento:- Geles o polmeros- Membranas: microencapsulacino reactores de membrana

Inmovilizacin

Ventajas- Posibilita la reutilizacin del biocatalizador y una

rpida separacin del medio de cultivo.- Las clulas vegetales permanecen viables

por largos perodos de tiempo.- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo,

con el consiguiente aumento en la productividad. - Es posible establecer cultivos de alta densidad

permitiendo el uso de biorreactores ms pequeos.- La inmovilizacin favorecera la interaccin entre

las clulas, favoreciendo cierto gradode diferenciacin con el consiguiente incrementoen la produccin.

- Es compatible con otras estrategias de optimizacin. (elicitacin, permeabilizacin y remocin de producto)

- En muchos casos, la misma inmovilizacin inducela secrecin del producto al medio de cultivo.

Inmovilizacin

Desventajas

- Se agrega una etapa ms al proceso,con el consiguiente aumento en los costos operativos. Esto incluye el costo de la matriz y de toda la maquinaria necesariapara la inmovilizacin.

- Al agregar un barrera ms al sistema, aumentan los problemas relacionadoscon la transferencia de nutrientesy de oxgeno.

- El agregado de otra etapa en el proceso aumenta los riesgos de contaminacin.

Inmovilizacin

Efectos de la inmovilizacin en la produccin de metabolitos secundarios

Efectos de la inmovilizacin en la liberacin de metabolitos secundarios

Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.

Inmovilizacin

Compuesto

FerruginolSolasodinaL-DOPACapsaicina

Planta

Salvia miltiorrhizaSolanum surattense

Mucuna pruriensCapsicum frutescens

Clulas Libres

267-

Trazas

Inmovilizadas

4547-59

90100

% Producto en el medio

Especie

Capsicum frutescensCapsicum frutescensCofffea arabicaCatharanthus roseusTagetes patula

Producto

CapsaicinaCapsaicina

MetilxantinasAjmalicinaTiofenos

Incremento

> 100> 100

133,520

Tipo de inmovilizacin

PoliuretanoGelGelGel

Agregados naturales

Biorreactores para clulas inmovilizadas

Lecho empaquetado Lecho fluidizadoAgitacin mecnica

Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.

La inmovilizacin en el contexto de distintas opciones de cultivos de tejidos

Elicitacin

Agentes biticos

- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidnico- Quitosano- Metil jasmonato

Agentes abiticos

- Metales pesados- Radiacin UV- Presin osmtica- Ultrasonido

Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.

Incremento de la produccin de metabolitos secundariospor elicitacin en diferentes cultivos in vitro

Producto despusde elicitacin

75 mol / L

4,27 mg / g peso seco

1 mg / frasco

2% peso seco

15 mg / g peso fresco

28 g / 10 mL

9 mg / g peso seco

160 g / g peso fresco

0,55 g / 100 gpeso seco

Elicitor

Phytium aphanidermatum(extracto crudo)Phytophtora megasperma(extracto crudo)Trichoderma virideae(extracto crudo)Saccaromyces cereviseae(extracto crudo)Verticilium dahliae(extracto crudo)Endgeno(extracto crudo)Penicilinum spp.(extracto crudo)Glutation abitico

Fusarium conglutanis(extracto crudo)

Especie

Catharanthus roseus(suspensiones)Datura stramonium(suspensiones)Capsicum annum(suspensiones)Thalictrum rugosum(suspensiones)Sanguinaria canadensis(suspensiones)Lithospermum erythrorizon(suspensiones)Catharanthus roseus(races transformadas)Lotus corniculatus(races transformadas)Tagetes patula(races transformadas)

Producto

Alcaloidesindlicos

Alcaloidesdel tropano

Capsidiol

Berberna

Dopamina

Shikonina

Alcaloidesindlicos

Isoflavonoides

Tiofenos

Concentracindel elicitor

10 ml / 50 mLde cultivo

55 mg / L de cultivo

20 g / mL

0,2 mg / g peso fresco

1 ml / 15 mLde cultivo

1 mg / mL

0,01 g / L peso seco

10 mM

0,2 mg / mLde medio

Productoen control

50 mol / L

0,85 mg / g peso seco

0

0,5% peso seco

3 mg / g peso fresco

0

3 mg / g peso seco

0

0,2 g /100 gpeso seco

Dosaje de elicitor necesario para biorreactor en columna de burbujeo

y para biorreactores de lecho de goteo o de niebla en funcin de la constante de

equilibrio entre el elicitor y receptor

Gastos de elicitor por biorreactor para biorreactor en columna de burbujeo y para

biorreactor de lecho de goteo o niebla.

Efecto de la configuracin del biorreactor sobre el proceso de elicitacin

Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.

DMSO

Shock trmico

Cambios de pH

Limitacin de fosfato y oxgeno

Elicitacin

Detergentes y aceites de siliconas

Electropermeabilizacin

Liberacindel productoal medio

Lquido-lquido:Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventesorgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o solucionesde polmeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.

Slido-lquido:La segunda fase es un material slido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

Requerimientos:- Autoclavables- No txicos- Fcil separacin del producto de inters

de la segunda fase- No modificacin del medio de cultivo- Permanencia de las clulas en la fase acuosa

Remocin de producto in situ

Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado para operar con remocin in situ del producto

1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races; 3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor

DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;

12: marco de la malla

Diagrama de un biorreactor de agitacin por lquido con loop externo

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Extraccin in situ de alcaloides con aceite de silicona a partir de un cultivo de clulas de Eschscholtzia californica

A: particin de alcaloides con diferentes cantidades de polimetil-silanos. Los alcaloides se acumulan en la fase superior.B: Extraccin in situ de alcaloides en la parte superior de un fermentador de elevacin por aire de 2 L.

Secuencia en laoptimizacin de un proceso para la produccinde metabolitos secundarios

Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro

Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilizacin y seleccin de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,

liberacin al medio

Optimizacin de medio de cultivo para produccinpor diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin,

liberacin y remocin in situ

Optimizacin en biorreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin,

en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto

Ingeniera metablica y biotransformacin

Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulacin gentica

Completar rutas metablicas mediante insercin de genes heterlogos

Amplificar rutas normales

Bloquear rutas alternativas

Bloquear rutas normales

Modificar la regulacin de rutas normales

Modificar los mecanismos de secreciny exportacin

Bloquear rutas de degradacin

Ingeniera metablica del metabolismo secundario

Enzima

Triptofano decarboxilasa(TDC)

Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)

Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)

ORCA3 (factorDe transcripcin)

(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)

Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)

C1 y R (factoresde transcripcin)

Especie

Peganum harmala(suspensiones y races)

Hyosciamus muticus(races transformadas)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Coptis japonica(suspensiones)

Mentha spp.(planta)

Zea mays(callos)

Producto

Serotonina

Escopolamina

Alcaloides indlicos(TIAs)

Alcaloides indlicos(TIAs)

Berberina

Aceites esenciales

Antocianinas

Observaciones

Incremento de 10-20 vecesen producto

Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control

Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Lneas inestables

Incremento de la concentracin de TIAsde 3 veces despus de agregarel precursor secologanina

Incremento del flujo hacia la produccinde berberina de 15%

Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales

Produccin de antocianinas y fenolesque no se producan en los callos sin transformar.

Ingeniera metablica delmetabolismo secundario

Problemas- Clonado de genes

- Estabilidad de lneas transgnicas

- Compartimentalizacin de productos

- Transporte y acumulacin de productos

- Limitaciones y arquitecturade la ruta metablica

- Canales metablicos (limitacin del flujo metabolico por la capacidad de las enzimas participantes)

La biotransformacin es la conversin de un sustrato (natural o sinttico) por medio de un biocatalizador (enzima, clula, tejido, rgano, clulas inmovilizadas) en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimticos.Requerimientos:

- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la clulas y de sus cofactores.- La velocidad de formacin del producto debe ser mayor que su metabolizacin.- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.- El precursor debe poder ingresar en la clula y el producto debe ser preferentemente secretado.

- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.Planta Precursor ProductoCapsicum frutescens(clulas inmovilizadas)

Acido protocatecuicoy cido cafeico

Vainillina y capsaicina

Catharanthus roseus(clulas inmovilizadas)

Vinblastina Vincristina

Daucus carota(clulas inmovilizadas)

Codeinona Codena

Mucuna puriens(clulas inmovilizadas)

Tirosina L-DOPA

Rauwfolia serpentina(clulas inmovilizadas)

Hidroquinona Arbutina

Mentha spp.(clulas inmovilizadas)

Mentona Neomentol

Coffea arabica(clulas inmovilizadas)

Teobromina Cafena

Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.

Biotransformacin

Ejemplos de diseo de procesos

Operacin Productoasociado

Productono-asociado

Batch + +Batch alimentado + +Batch alimentadorepetitivos

+ +

En dos etapas - +Continuo + -Perfusin - +

Relacin entre el sistema de cultivo y el patrn de sntesis del metabolito secundario

Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales

Shikonina

Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.

Suspensiones celulares- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen

la produccin de shikonina.- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery

Produccin de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Berberina

Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 aos.

Suspensiones celulares- Las lneas celulares productoras se seleccionaron a travs de

. protoplastos y screening de por fluorescencia.- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto est

. asociado al crecimiento.

Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery

Produccin del alcaloide berberinapor suspensiones celulares de Coptis japonica

Ginsensidos

Planta entera- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 aos .- Se requieren perodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivosa riesgos de pestes y cambios drsticos de clima.

- La concentracin de saponinas es de 0,5 % peso seco.

Suspensiones celulares- La concentracin de saponinas es de 0,65 % peso seco.- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/da.- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.- A gran escala se emplean tanques agitados mecnicamente a bajas velocidades.

Races transformadas- La concentracin de saponinas es de 0,95 % peso seco.- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.- A gran escala se emplean tambores rotatorios.

Produccin de ginsensidos por Panax ginseng

Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery

Taxol

Planta entera- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.- Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.

. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.

. - El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.- Las plantas empleadas crecen lentamente.

Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery

Produccin de taxol por Taxus spp

Taxol

Suspensiones celulares de T. brevifolia- Se emplean metiljasmonato o extractos fngicos como elicitores.- La composicin ptima de gases es 10% (v/v) oxgeno, 0,5% (v/v) dixido de carbono y 5 ppm de etileno.- El incremento de la presin osmtica, sacarosa (60 g/L), estimula la produccin.- Los precursores como la fenilalanina y el cido benzoico incrementan la productividad.

- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.

- El sistema de operacin se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda en un medio de produccin con elicitacin.

- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcanpoco estrs hidrodinmico (escalado hasta 75.000 L).

Schoepke Plant Image Gallery

Produccin de taxol por Taxus spp

Planta entera- La planta tiene bajas concentracionesde alcaloides.

- La purificacin y extraccin son costosas. Suspensiones celulares

- La limitacin de fosfato y nitrgeno combinado con la elictacin, inducen la produccin de del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertencin y problemas cardiolgicos).

- Las lneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitandoel desarrollo de cultivos a gran escala,

- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.- Las suspensiones no acumulan alcaloides indlicos dimricos: vinblastina y vincristina.- Se necesitara aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad especfica obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/da) para que el proceso sea viable.

Vinblastina

Tomado de: Manhart Plant Image Gallery

Produccin de alcaloides indlicos de Catharantus roseus:vincristina y vinblastina

Estructuras de vainillina y de distintasantocianinas

Vainillina (1)Pelargonidina-3-glucsido R2=OH (1)Cianidina-3-glucsido R2+R3=OH (2)Delfinidina-3-glucsido R1+R2+R3=OH (3)

Wescott et al., 19940,7B5Races areas transfectadasWescott et al., 19940,002-Fruto

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Wescott et al., 19940,7B5Races areas transfectadasWescott et al., 19940,002-Fruto

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Produccin de vainillina en clulas y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro

a Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/Lb Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM total Nc Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina

Do y Cormier, 1991B5bSuspensin celularVitis viniferaOxalis reclinata

Aralia cordataEspecie

Crouch et al., 1993MScSuspensin celular

Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensin celularReferencia% Peso SecoMedioMaterial

Do y Cormier, 1991B5bSuspensin celularVitis viniferaOxalis reclinata

Aralia cordataEspecie

Crouch et al., 1993MScSuspensin celular

Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensin celularReferencia% Peso SecoMedioMaterial

Produccin de antocianinas por clulas cultivadas in vitro

Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.

Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos tpicos...

Conclusiones Aspectos bioingenieriles a resolver:

- Diseo de biorreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales

- Instrumentacin y control de los bioprocesos- Diseo de biorreactores ms econmicos- Mtodos no letales para liberacin

de los metabolitos secundarios- Mtodo adecuado para la remocin in situ

Aspectos biolgicos a resolver:

- Conocimiento de la regulacin de las rutas biosintticas: enzimas y factores de transcripcin

- Conocimiento de la regulacin del transportey acumulacin de los metabolitos secundarios

- Conocimientos de los mecanismosde degradacin del producto

1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. andMoo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.

2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich Hanser Publishers, 1991.

3. Secondary products from plant tissue culture. Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford University Press, 1990.

4. Design, formulation, and optimization of media. In: Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J. (ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.

5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.). Harwood Academic Publishers, 1997.

6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. AcademicPress, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.

Referencias