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UNICAMP UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Rodrigo Luís Taminato . .
Farmacêutico-Bioquímíco .
MESTRADO
Estudo químico do Allium tuberosuin Rottl. ex Spreng
biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida
albicans
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Piracicaba da Universidade
Estadual de Campinas, para obtenção do título
de Mestre em Odontologia - Área de
Farmacofogfa, Anestesiologia e Terapêutica .
PIRACICABA- SP 2006 BIBL!OTEI.:A CENTRAL
DESf NVO t.V!MENTO
CGtZÇÃO
UNICAMP
UNICAMP UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Rodrigo Luís Taminato
Farmacêutico-Bioquímico
MESTRADO
Estudo químico do Allium tuberosum Rottl. ex Spreng
biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida
albicans
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Piracicaba da Universidade
Estadual de Campinas, para obtenção do título
de Mestre em Odontologia - Área de
Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
Orientador:
Profa. Ora. Vera lúda Gai'i:ia Rehder
Co-orientador:
Profa. Ora. Marta Cristina Teixeira Duarte
Banca Examinadora:
Profa. Ora. Vera Lúcia Garcia Rehder
Profa. Di1i. Míiiilí Villíi t-4vva Rodriguês
Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen
Piracicaba - SP Este exemplar foi devidamente corrigido, de acordo com a resolução CCPG 036/83.
CP"Gf".i),~.fo_QJi./ . .QY!.~. ....... ~ •.. :.l/$.td{}&ufL .... 1Y.fl2.... ........ . ... .
Assinatur o Orientador
2006
11
BIBLIOTECA CENTRAL
DESENVOLVIMENTO
C'" ~··õn .._,.,__'s'MIJ
L-_...;U:.:N::..:.l CAM;;:_l'_---l
Tl52e
FICHA CATALOGR.'Í.F!CA ELABORADA PELA
Bll:3LlOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Bibliotecário: Marilenc Girello- CRB-8". I 6159
Taminato, Rodrigo Luís. Estudo quínúco do Allium tuberosum Rottl. ex Spreng
biomonitorado pela avaliação da atividade anti-Candida albicans. I Rodrigo Luís Taminato. --Piracicaba, SP: [s.n.), 2006.
Orientadores: Vera Lúcia Garcia Rehdcr, Marta Cristina Teixeira Duarte
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Ca..'Upinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Cromatografia gasosa. 2. Espectroscopia de massa. I. Rehder, Vera Lúcia Garcia. 11. Duarte, Marta Cristina Teixeira. 111. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
(mg!fop)
Título em Inglês: In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of Alltum tuberosum Rotth.ex Sprengel
Palavras-chave em Inglês (Keywords): 1. Chromatography, gas.
2. Mass spectrometry
Área de Concentração: Farmacologia, Anestesiologia e
Terapêutica
Titulação: Mestre em Odontologia Banca Examinadora: Vera Lúcia Garcia Rehder, Marilí Villa Nova Rodriguês, Pedro Luiz Rosalen Data da Defesa: 06-06-2006 Programa de Pós-Graduação: Odontologia
111
,·)
UNICAMP
•
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Dissertação de MESTRADO, em sessão pública realizada em 06 de Junho de 2006, considerou o candidato RODRIGO LUIS TAMINATO aprovado.
DER
PROFa. ORa. ARIL! VILLA NOVA RODRIGUES
PROF. DR. PEDRO LU Z ROSALEN
DedicãtorTa
À Deus,
Aos meus pais, Luiz e Julia por serem absolutamente tudo de mais importante que eu
tenho na vida. AMO VOCES!IIII
Ao Marcos Nakao (in memorian). "Por ter passado pela minha vida e ser até hoje, um
exemplo e por me dar esperanças de que um dia nos reencontraremos para te abraçar e
dizer mais uma vez o quanto eu te amo, meu irmão."
Aos meus familiares
dedico este trabalho
v
Agradecimentos Especiais
A Profa. Dra. Vera Lucia Garcia Rehder, amtga e orientadora, agradeço pela
orientação, pelos ensinamentos compartilhados, pela paciência, pelo incentivo, pelos
momentos de descontração, pelos momentos de "chamada de atenção", pelo exemplo de
professora e pesquisadora, meu profundo respeito, admiração e carinho_
A Prof. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte pela amizade, profissionalismo, respeito
e por toda dedicação e carinho que tratou meu trabalho como Co-orientadora.
Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo, coordenador do Curso de Pós-Graduação em
Odontologia, Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica, pela amizade,
confiança, profissionalismo e carinho que sempre me tratou.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen, pelo profissionalismo, respeito e amizade.
Ao Prof. Dr. Eduardo Dias de Andrade, pela amizade, exemplo de professor e ser
humano.
A Adriana da Silva Santos, pela dedicação, carinho e ajuda indispensável na
realização deste trabalho, além da amizade.
Aos amigos de mestrado Michele, Karina, Gilson, Alcides e Humberto agradeço,
pelas alegrias, pelos ensinamentos, e acima de tudo pela amizade sincera de um grupo
muito unido_
Ao Alcides Moreira que esteve ao meu lado nesta jornada e que compartilhou comigo
as alegrias e os momentos dificeis, sempre me apoiando e em tudo. De fato, um amigo
MAIÚSCULO e ETERNO que a vida me deu.
Ao Humberto Moreira Spíndola pela amizade sólida e companheirismo em todos os
momentos, um "AMIGAÇO" pra toda vida.
VI
Ao Gilson Nobre Franco, pela amizade, pelos ensinamentos e pelo exemplo de ser
humano.
Aos GRANDES AMIGOS que o destino me apresentou em Piracicaba, Filipe Polese,
Ramiro Mendonça Murata e Leonardo Vedana pela amizade sincera em todos os
momentos e por fazerem parte da minha vida para sempre.
Aos queridos amtgos que fizeram minha vida ter mats sentido: Regiane Yatsuda,
Giovana Tóffoli, Roberta Baglie, Sinvaldo Baglie, Mário Neto e tantos outros
amigos, que sempre incentivaram e torceram por mim, pela amizade e ensinamentos.
A TODA TURMA 48 de graduação em odontologia da FOP- Unicamp, obrigado
pelo carinho e pela amizade sincera e tão carinhosa durante todos esses anos.
Vll
Agradecimentos
À Universidade Estadual de Campinas, por meio do Reitor: Prof Dr. José Tadeu
Jorge.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP - UNICAMP), na pessoa de seu
diretor: Prof. Dr. Thales Rocha Mattos Filho.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas da
Unicamp-CPQBA.
Á secretária Maria Elisa dos Santos, pelo carinho e profissionalismo e atenção.
Aos amigos e competentes profissionais, Adilson Sartoratto, Dra. Marili Villa Nova
Rodrigues, Dr. Rodney Alexandre Rodrigues, Adriana Silva Santos e Sinésio
Boaventura Jr., Ora. Glyn Mara Figueira, ora. Mary Ann Foglio, pelo carinho, convivência,
profissionalismo e acima de tudo, pela amizade.
A Profa. .pr,. Maria Cristina Volpato, chefe do departamento de Ciências
Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
A CAPES, Coordenação de aperfeiçoamento pessoal de nível superior, pela
concessão de bolsa de estudo para realização deste trabalho.
A Fapesp, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio
financeiro.
Aos amigos e funcionários da FOP e do CPQBA, que direta ou
indiretamente, embora não citados, me incentivaram e apoiaram durante o
trabalho.
Vl11
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre recomeçando .. .
A certeza de que precisamos continuar .. .
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar .. .
Portanto devemos fazer da interrupção um caminho novo .. .
Da queda um passo de dança .. .
Do medo, uma escada .. .
Do sonho, uma ponte .. .
Da procura, um encontro .. .
Fernando Sabino
lX
Sumário
Resumo
Abstract
1. Introdução geral
2. Proposição
3. Capítulo
3.1. Capitulo I
4. Conclusões gerais
4.1. Referência bibliográfica da introdução geral
S. Anexos
5 .1. Anexo 1 - Resolução do formato alternativo para defesa
5.2. Anexo 2- E-mail de confirmação de aceite do artigo
5.3. Anexo 3- Cromatogramas dos OF, OB, EB e frações Fl a F8 do OB
2
3
7
8
9
23
24
34
35
36
5.4 Anexo 4 -Placa de Cromatografia em Camada Delgada do OB e frações do OB 41
5.5. Anexo 5- Espectros de massa dos principais constituintes do OB 42
5.6. Anexo 6- Principais estruturas químicas identificadas por CG-EM dos OF, 08, 46
EB e frações dos OB.
5.7 Anexo 7- Fórmula para cálculo do índice de Kovatz 48
X
RESUMO
De uso freqüente na medicina popular, o gênero Allium inclui mais de 600 espéctes
encontradas em diversas regiões do mundo como Europa, América do Norte, África e Ásia.
A maioria das espécies é comestível e possui aroma e odor característicos, sendo também
utilizadas como hipocolesterolêmico, antigripal e antimicrobiano. Alguns estudos de
determinação das propriedades de Allium spp. como antifúngico e de identificação de seus
compostos voláteis foram conduzidos. A maior parte de seus constituintes são compostos
sulfurados, embora a compostção química seja variável entre os diferentes estudos_ Dentre
as espéctes de Allium spp., o A. h1herosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae) pertence a mesma
família do alho, cebola e alho-poró, é conhecido também como "Chinese chive", sendo um
importante ingrediente na culinána astática, também utihzado como erva medicinal para
muitas disfunções e doenças. Na China é popularmente chamado de "Jiucai" e no Japão de
"Nirá" Os óleos essenciais das folhas e bulbos de A. tuberosum obtidos por hidrodestilação
em sistema do tipo Clevenger. As fases aquosas ou hidrolatos foram extraídas com
diclorometano, obtendo-se o OB (óleo essencial dos bulbos)- 810 mg (0,12%) e o OF (óleo
essencial das folhas) -750 mg (0,15%). O extrato diclorometânico obtido dos bulbos- EB,
obtido em sistema Ultra-Turrax, apresentou rendimento 3,28% (497 mg).O OB foi
fracionado em coluna seca, utilizando como eluente diclorometano. Foram obtidas 8
frações (FI a F8), analisadas por CCD. As frações 3, 4 e 5 foram agrupadas resultando nas
frações: FI - !38,6mg (33%), F2- 15,3mg (3,7%), F3- 13,6mg (3,3 %), F4- 51,9
(12,6%), F5- 34,1mg (8,3%), F6- 31,2mg (7,6%). Analisados por CG-MS observa-se que
a maioria dos compostos identificados nos óleos essenciais das folhas e bulbos e das
frações obtidas do OB são compostos organosulfetos (COS). As principais classes de
sulfetos identificadas nas diferentes amostras de A. tuberosum, destacam-se os
monosulfetos, disulfetos, trisulfetos, tetrassulfetos e sulfinatos. Na avaliação do MIC
obtiveram-se atividade do OB de 2001-.Jglml e das frações mais ativas Fl (50J..Jglml) e F2
(50jJglmL). Concluii-se que os principais compostos responsáveis pela atividade anti
Candida albicans do Allium luberosum são alil,metil-disulfeto, dimetil-trisulfeto, dialil
disulfeto e alil,metil-trisulfeto, presentes no óleo essencial dos bulbos e nas frações Fl e F2.
I
Abstract
Frequently used in folk medicine, the genusA/lium include more than 600 species founded
in several world regions like Europe, North America, Africa andAs ia. The most of species
is edible and have a aroma and smell characteristics, being algo used as
hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial. Among theAI/ium species, A. tuberosum
RottL ex Spreng (Liliaceae) belongs to the same family of the garlic, anion and poro
allium. In the China, is popularly called "Jiucai" and in Japan, "Nirá" and is also know as
"Chinese chive", a important ingredient in the Asiatic culinaty. Studies aims determine the
properties of Allium spp. as antifungical and aim identify their volatile compounds are
described m literature. The essential oils from leaves (OF) and bulbs (OB) ofA. tuberosum
were obtained by hydrodistillation in a Clevenger system, yielding O, 1 5% and 0,12%,
respectively. The dichloromethanic extract from bulbs (EB), obtained in a Ultra-Turrax
system, presented yield of 3,28%. The minimal inhibitory concentration (MlC) from oils
agamst Candida albicans was: OF (>IOOOfLg/mL), OB (200flg/mL) and EB (250fLg/mL).
The OB was fractionated in dry column by use of dichloromethane as eluent, when were
obtaíned síx fracttons: FI (33%), F2 (3,7%), F3 (3,3 %), F4 (12,6%), FS (8,3%), F6
(7,6%), evaluated to anti-C. albicans activity. The volatile compounds present in the
essential oils, extract and fractions of OB were identified by CG-MS. The majority
compounds present in the OF, OB and in the F 1 and F2 from OB were organosulphides
from disulphides classes, trisulphides, tetrasulphides and sulphinides, to standing out the
allyl, methyl-dísulphíde, dímethyl-trísulphide, d!allyl-dísulphide and alíl,methyl
trisulphide. Significant quantities of limonene and sulphinades and low concentration of
other sulphides were founded in EB. The :MIC evaluation of fractions obtained from OB
revealed a significant increase of activity for Fl and F2, with MIC value of S011g/mL,
when compared to OB (200~tg/mL). These results indicate that the main compounds from
A. tuberosum responsible by anti-Candida activity are allyl, rnethyl-disulphide, dimethyl
trisulphide, diallyl-disulphide and diallyl disulphide, present in higher concentration in OB
and in the fractions Fl e F2.
2
1. Introdução
A atividade biológica de extratos de plantas e óleos essenciais tem sido objeto
de intensa investigação científica. Plantas superiores e aromáticas são amplamente
utilizadas no combate a diversos tipos de infecções pela medicina popular, uma vez que
apresentam amplo espectro de atividade antimicrobiana, com inibição comprovada contra
bactérias, leveduras e fungos filamentosos (Ankri & Mirelman, 1999; Darbyshire & Henry.,
1981; Koch & Lawson, 1996). Como descreveram Adam et al. (1998), grande parte dessas
propriedades é devida aos óleos essenciais que as plantas contém como produtos de seu
metabolismo secundário. Óleos essenciais de várias espécies mostraram-se efíctentes no
controle do cresctmento de fungos relacionados a mfecções superficiais da pele (Adam et
a!., 1998) e sobre uma ampla variedade de microrganismos, incluindo bactérias Gram
negativas e Gram-positívas (Galli et a/., 1998).
De acordo com Lentz et a!. (1998) e Rates (2001 ), o vasto conjunto de
metabólitos secundários sintetizados pelas plantas forma um reservatóno de compostos
orgânicos que são uma rica fonte de fãrmacos. No caso dos óleos essenciais, estes são
constituídos de moléculas de baixa massa molecular, principalmente mono e
sesquiterpenos, o que explica a característica organoléptica olfativa marcante deste grupo
de metabólitos.
É notável a intensa procura científica por princípios ativos de origem vegetal
nos últimos anos. Várias empresas privadas e orgamzações governamentais têm instituído
projetos de pesquisa nesta área (Calixto, 2000). É importante salientar que, na década de
70, nenhuma das 250 maiores companhias do ramo farmacêutico do mundo mantinham
qualquer programa de pesquisa na área de produtos naturais e atualmente, pelo menos
metade delas introduziram este tipo de pesquisa como uma de suas prioridades (Calixto,
2000).
Existem aproximadamente 250.000 espéctes de plantas superiores em todo
mundo e grande parte da população faz uso rotineiro das plantas medicinais nativas no
cuidado primário à saúde (Cragg et a/_, 1999). No entanto, somente 17% foram estudadas
quanto ao seu potencial medicinal (Newman eta/., 2003).
3
Até meados do século XX, os medicamentos de ongem vegetal constituíam a
base da terapia medicamentosa. Porém o desenvolvimento da síntese orgânica introduziu
raptdamente novos farmacos na terapêutica, relegando às plantas um papel menor neste
contexto. Na última década, houve um aumento do uso de plantas medicinais como fonte de
fármacos e de protótipos, sendo que cerca de 50% dos medicamentos utilizados eram
provementes de moléculas de origem sintética, 25% semi-sintética e os 25% restantes a
partir de fontes de produtos naturais (marinhos, microbiológicos, e principalmente plantas)
(Pezzuto, 1997). Um estudo sobre produtos naturais como fonte de novas drogas entre os
anos de 1981 e 2002, indicou que 67% das 877 pequenas moléculas, são de origem
sintética, porém 16,4% correspondem a moléculas sintéticas com grupos farmacofóricos
derivados diretamente de produtos naturais (Cragg & Newman, 2005).
O aperfeiçoamento dos processos de purificação e isolamento de compostos
ativos de plantas medicinais e de métodos de análise tem possibilitado a elucidação de
estruturas moleculares complexas (Calixto, 2000; Rates, 2001 ). Além dtsso, o
desenvolvimento de métodos de manejo, cultivo e melhoramento genético representa uma
nova tendência no estudo de plantas medicinais, pois assegura maior padronização e
qualidade (Calixto, 2000)
Dados da Organização Mundial de Saúde mostram que os estudos com plantas
medicinais movimentam US$ 1,8 bilhão por ano na China. No ano de 2000 foram gastos no
Japão US$ 2,4 bilhões; Malásia US$ 500 milhões; EUA US$ 2,7 bilhões; Austrália US$
800 milhões; Canadá 2,4 bilhões e Inglaterra US$ 2,3 bilhões (WHO, 2002)
Dentre os diversos causadores de infecções, os fungos merecem enfática
atenção, devido ao aumento progressivo dessas doenças nas últimas décadas (Meunier,
1995; Herbrecht, 1996; Odds, 2000). As infecções fúngicas tornaram-se um sério problema
de saúde pública, especialmente em pactentes portadores de câncer, AIDS, transplantados,
dentre outros (De Lucca & Walsh, 1999). Nestes, os casos costumam ser severos,
rapidamente progressivos, dificeis de diagnosticar e tratar (Joly et al., 1992). Verduyn
Lunel et a/., (I 999) e Pierce (2005) relataram que Pseudomonas aeruginosa e Candida
a!bicans são considerados como os mais importantes agentes de infecção hospitalar.
Em resposta a esse aumento no registro de infecções fúngicas, houve também
4
um aumento considerável no número de agentes antifúngicos nos últimos anos (Pfaller,
2005).
Embora novos antifúngicos venham sendo descobertos ano a ano (Ueki et ai., 1993), as
infecções fúngicas do tipo sistêmicas são as mais preocupantes e poucos medicamentos
sistêmicos são conhecidos para o tratamento de pacientes com infecções invasivas.
Uma das razões para o lento progresso nesta área é a analogia entre as células
fungicas e as de organismos superiores, e o mecanismo de ação das drogas conhecidas
atualmente, uma vez que a maioria dos microrganismos tem mostrado resistência aos
antifú.ngicos convencionais. Assim, agentes que atuem na biossíntese de proteínas, DNA e
RNA terão maiOres chances de serem eleitos como novos medicamentos
(Georgopapadakou & Walsh, 1996) e sua busca deve ser estimulada e constante. Neste
caso, as plantas medicinais aparecem como uma boa alternativa às tradicionais triagens
smtéticas e fermentativas.
Atualmente, várias plantas medicinais têm sido estudadas quanto à atividade
antirnicrobiana (Ahmad & Beg, 1999; Panizzi et ai., 1993; Baba-Moussa et ai., 1999;
Martinez et al., 1996; Mahasneh, 2002; Duarte et al., 2005). No Brasil, devido à vasta
biodiversidade e nqueza etnofannacológica, múmeras plantas com atividade
antimicrobiana são hoje conhecidas.
De uso freqüente na medicina popular, o gênero Allium inclui mais de 600
espécies encontradas em diversas regiões do mundo como Europa, América do Norte,
África e Ásia. A maioria das espécies é comestível e possuem aroma e odor característicos
(Lancaster & Boland, 1999; Block, 1991; Pino et ai., 2001). sendo também utilizadas
como hipocolesterolêmico, antigripal e antimicrobiano (Leporatti & Corradi, 2001; Lemar
et. ai., 2002). Alguns estudos de determinação das propriedades de Allium spp. como
antifúngico e de identificação de seus compostos voláteis têm sido conduztdos (Watanabe
1966; Ankri & Mirelman 1999; Lemar et al., 2002). A maiona de seus constituintes são
compostos sulfurados, embora a composição química seja variável entre diferentes estudos
(Pinoeta/,2001)
Dentre as espécies de Ailium spp., o A. tuberosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae)
pertence a mesma família do alho, cebola e alho-poró, e é conhecido também como
5
"Chínese chive", é um importante ingrediente na culinária asiática, sendo também utilizado
como erva medicmal para muitas disfunções e doenças .. Na China é popularmente
chamado de "Jiucai" e no Japão de "nirá". É natural das regiões central e parte do norte da
Ásia e é comumente cultivado na China, no Japão, Korea, Índia, Nepal, Tailândia e nas
Filipmas (Sang etal, 2001).
O suco prensado do "nirá" tem mostrado inibição contra uma ampla faixa de
microrganismos (Mau et ai., 2001 ). Entretanto, pesquisas sobre o uso desta planta como
antimicrobiano são limitadas, havendo poucas referências com esta abordagem.
Estudos visando determinar as propriedades antifúngicas do Allium tuberosum,
em especial para Candida albicans, nos motivou a avaliar a atividade dos óleos essenciais
das folhas e bulbos e do extrato diclorometânico de seus bulbos e identificar seus principais
constituintes químicos.
6
2. Proposição
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-Candida a/bicam; dos óleos
essenciais obtidos a partir das folhas (OF), bulbos (OB), extrato diclorometânico dos
bulbos (EB) e frações obtidas do OB do A. tuberosum Rottl. ex Spreng, monitorando o
estudo químico a fim de identificar os princípios ativos responsáveis pela atividade
biológica.
Foram objetivos específicos deste estudo:
1 -Avaliar a atividade anti-Candida albicans dos óleos essenciais das folhas (OF), bulbos
(OB) e extrato de diclorometano dos bulbos (EB) de Al/ium tuhern.wm.
2- Avaliar a composição química dos óleos essenciais e do extrato diclorometânico a fim
de identificar seus principais constituintes químicos.
3 - Fracionar o óleo essencial mais ativo, avaliar a atividade anti-Candida albicans das
frações e identificar seus principais constituíntes químico
7
3. Capítulo
Essa dissertação está baseada na Informação CCPG/001/98/Unicamp que
regulamenta o formato alternativo para a dissertação de Mestrado e permite a inserção de
artigos· científicos de autoria ou co-autoria do candidato. (Anexo 1).
Desta forma, esta tese é composta de 1 artigo, o qual foi submetido para
publicação na revista Joumal of Ethnophannacology conforme descrito abaixo:
3.1.- Artigo 1 -In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of
leaves and bulbs of Allium tuberosum Rotth. ex Sprengel.
8
3.1. In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of
Allium tuberosum Rotth.ex Sprengel
Rodrigo Luís Taminatoa
Marta Cristina Teixeira Duarte h
Glyn Mara Figueira h
Adilson Sartorattob
Camila Delarmina,b
V era Lúcia Garcia Rehderb,*
aFaculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade estadual de Campinas- FOP
Unicamp. Area de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica- Piracicaba- SP- Brasil.
bCentro Pluridisciplinar de Pesquisas químicas, biológicas e agrícolas da Universidade
Estadual de Campinas - CPQBA - Unicamp - Divisão de Química Orgânica e
Farmacêutica
* Corresponding author:
V era Lúcia Garcia Rehder
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas - CPQBA -
UNJCAMP
CP617l, Paulinia-SP-Brazil.
Phone/Fax: 55 19 38847500
E-mail: [email protected]
9
Abstract
Frequently used in folk medicine, the genusAllium include more than 600 species founded
m severa! world regions like Europe, North America, Mrica andAs ia. The most of species
is edible and have an aroma and smell characteristics, being algo used as
hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial. Among theAllium species, A. tuberosum
Rottl. ex Spreng (Liliaceae) belongs to the same family of the garlic, anion and poro
allium. In the China, is popularly called "Jiucai" and in Japan, "Nirá" and is also know as
"Chinese chive", a important ingredient in the Asiatic culinary. Studies aims determme the
properties of Allium spp. as antifungical and aim identify their volatile compounds are
described in literature. The essential oils from leaves (OF) and bulbs (OB) of A. tuberosum
were obt.ained by hydrodistillation in a Clevenger system, yielding O, 15% and O, 12%,
respectively. The dichloromethan1c extract from bulbs (EB), obt.ained in a Ultra-Turrax
system, presented yield of 3,28%. The mínima! inhibitory concentration (:MIC) from oils
agamst Candida a/bicans was: OF (> 1000Dg/mL), OB (200Dg/mL) and EB (250Dg/mL).
The OB was fractionated in dry column by use of dichloromethane as eluent, when were
obtamed six fractions: F1 (33%), F2 (3,7%), F3 (3,3 %), F4 (12,6%), F5 (8,3%), F6
(7,6%), evaluated to anti-C. albicans activity. The volatile compounds present in the
essential oils, extract and fractions of OB were tdentified by CG-MS. The majority
compounds present m the OF, OB and in the FI and F2 from OB were organosulphides
from disulphides classes, trisulphides, tetrasulphides and sulphinides, to st.anding out the
allyl, methyl-disulphide, dimethyl-trisulphide, diallyl-disulphide and alil,methyl
tnsulphide. Significant quantities of limonene and sulphinades and low concentration of
other sulphides were founded in EB. The JviiC evaluation offractions obtained from OB
revealed a stgnificant increase of activity for Fl and F2, with JviiC value of 501J.g/mL,
when compareci to OB (2001J.g/mL). These results indicate that the main compounds from
A. tuberosum responsible by anti-Candida activity are allyl, methyl-disulphide, dimethyl
trisulphide, diallyl-disulphide and diallyl disulphide, present in higher concentration in OB
and in the fractions Fl e F2.
Keywords: Allium tuberosum; Candida albicans, leaves, bulbs, composition, sulphides,
antimicrobial activity
10 fsmÜmcA CENTRAL I DESHlVOLVlf;1ENTO
I COLEÇÃO !JNIC.AMP
1- Introduction
Higher and aromatic plants are widely used in folk medicine to atm contrai
severa! kind ofmfections, since they show antimicrobial activity, with confirmed mhibition
against bacteria, yeasts and filamentous fungi (Ankri and Mirelman, 1999; Darbyshire and
Henry, 1981; Koch and Lawson, 1996). The most ofthese properties is dueto essential oils
that they contain as a product oftheir secondary metabolism (Adam et ai., 1998). Essential
oils from severa! species were efficient to contrai fungi related to skin infections (Adam et
ai., 1998) and against many others microorganisms, including Gram-negative and Gram
positive bacteria (Galli et ai., 1985).
Nowadays, the scientific search for plant active principies is notable. Severa!
private industries and govemment organizations have created research projects in this area
(Calixto, 2005). Is important to point out that in 70's year, the most of the 250 main
pharmaceutical companies from the world had nane research program on natural products
and at present, half ofthem introduced this research subject as priority (Calixto, 2005).
The improvement of the isolation and purification process of the active
compounds from medicinal plants and the methods of analysis have became possible the
elucidation of complexes molecular structures (Calixto, 2005; Rates, 2001). Besides, the
development of handling methods, cultivation and genetic improvement represent a new
tendency in the medicinal plants studies, and ensure patronization and quality (Calixto,
2000).
Among the severa} infections agents, the fungi deserve emphatic attention, due
the progressive mcrease of these diseases in the last decades (Herbrecht, 1996; Odds,
2000). The fungical infections beco me a serious problem of public health, espectally in
patients with cancer, AIDS, transplanted, among others (De Lucca & Walsh, 1999). In
answer to this increase, there was a considerable increase in the number of antifungical
agents in the last years (Pfaller, 2005). Although new antifungal drugs have been
discovered year to year (Ueki et ai., 1993), the systemic infections are the most worrying
and few medicines are known for the treatment of patients undergoing invasive infections.
At present, severa! medicinal plants have been studied regard to antimicrobial
activity (Ahmad and Beg, 2001; Panizzi et a/., 1993~ Baba-Moussa et ai., 1999; Martinéz
et a/., 1996; Mahanesh, 2002; Duarte et ai., 2005). The genusAllium is frequently used in
li
folk medicine, and includes more than 600 species founded in severa! world regions as
Europe, North America, Africa and Asia. The most of species are edible and presented
aroma and smell characteristics (Lancaster and Boland, 1999; Block, 1991; Pino et ai.,
2001 ), andare also used as hypocholesterolemic, anticold and antimicrobial (Leporatti and
Corradi, 2001; Lemar et a/., 2002). Some studies on detennination of Allium spp
antimicrobial properties and about the identification of their volatile compounds were
carried out (Watanabe 1966; Ankri and Mirelman, 1999; Lemar et ai., 2002). The most
part of their constituents are sulphur compounds, although the chemical composition be
variable among different studies (Pino et ai., 2001 ).
Allium tuberosum Rottl. ex Spreng (Liliaceae), one of Allium species, belongs
to the same family of the garlic, anion and poro~allium and is also know as "Chinese
chive", a important ingredient in the Asiatic culinary, being also used as medicinal herb
against severa! disfunctions and diseases. In the China, is popularly called "Jiucat" and in
Japan, "Nirá" (Sang et a/., 2001 ).
The juice of"Nirá" presents inhibition against a wide range ofmicroorganisms
(Mau et a/., 2001). However, researches on the use of this plantas antimicrobial are
limited and there is few references focusing this subject. Studies aims detennine their
properties as antifungical and aim identify their volatile compounds are important to
complement the accounts from literature and to contribute for the development of new
phytotherapics.
The aim ofthis study was to evaluate the anti~Candida albicans activity ofthe
essential oils from leaves and bulbs and from the dichloromethanic extracts from bulbs of
A. tuberosum, and to identi(y their main chemical constituents.
2- Material and Methods
2.1. Plant Material
Aiiium h1berosum Rottl ex Spreng was grown in the CPMA (Collection of
Medicinal and Aromatic Plants) at the Research Center for Chemistry, Biology and
Agriculture (CPQBA- UNlCAMP, Campinas, São Paulo, Brazil). The plant (leaves and
bulbs) was collected in 2005, between July 20 and 22, at voucher number CPMA 490. An
12
exsieeate from plant was deposited in the herbarium ofthe State University from Campmas
(UEC) and identified by Dr. Washington Marcondes Ferreira Neto (curator). The plant
material for the assays was stored at -25°C.
2.2. Essential oils extraction from leaves and bulbs
The essential oils extraction from fresh bulbs from A tuberosum was carned out
by steam distillation in a type Clevenger system. A 750 g sample of bulbs, previoüsly
washed and dried, whteh were ground in a inox industnal blender with 3000 rnL dtstilled
water and distilled by 4 h. After oil separation, the aqueous phase was extracted three times
with diehloromethane (300 rnL) that were grouped. The organie phases were dried with
anhydrous sodium sulphate, filtered and the solvent removed at vacuum in a rotative
evaporator without heating resulting in the essential oils from bulbs (OB). The extraetion of
the essential oil from fresh leaves was carried out on similar manner, by use of 500 g of
\eaves and 3000 mL distilled water, following the distillation for 4 h. After oil separation,
the aqueous phase was extraeted three times with dichloromethane (300 mL) that was
grouped, dried, filtered and the solvent was removed by vaeuum, supplying the essential oi!
from leaves (OL).
2.3. Dicloromethanic extract.fi-om bulbs
Around 15 g of fresh bulbs were extraeted twiee m an ultra turrax system using
100 mL of diehloromethane during 3 min atroam temperature, following vacuum filtration.
The residue from bulbs was washed with diehloromethane and the organie phase was dried
with anhydrous sodium sulphate. The solvent was evaporated in a rotative evaporator
v.rithout heating, providing the dicloromethanic extract from bulbs (EB).
2.4. Fractionation of essential oilsfrom bulbs (OB)
The fraetionation ofOB (41 O mg) was carried out in dry eolumn, by using a
acetate of cellulose filter as support (2 em diameter and 16 em height), packing with silica
gel 60 (0,063- 0,200 mm) Merck 1.07734.1000, and dichloromethane as eluente. After
elution, the column was cut in 8 same parts and the material was extracted from silica by
13
using ethyl acetate. Subsequently, the material was filtered and evaporated in a rotative
evaporator without heating. After solvent evaporation were obtained the fractions F1 - F8.
2.5. Cltromatographic Metlwds
Thin Layer Cltromatography (TLL)
The essential oils OL, OB, the extract EB and the fractions from OB were
analyzed by thin layer chromatography (TLC), in silica gel plates (60 F254, Merck), by
using chloroform as eluent. After elution, the plates were analyzed under UV (A 254 and
366 nm), and revealed with anisaldehyde solution.
Gas Chromatography- Mass Spectroscopy (GC-MS)
The analysis and identification ofthe essential oils constituents from leaves
and bulbs, and the dicloromethanic extract from A. tuberosum was performed using a
Hewlett~Packard 6890 gas chromatograph, equipped with a HP~5971 mass selective
detector and capillary column HP-5 (30m x 0,25 J..Lill x 0,25 J..Lm), automatic injector 7683.
Temperature: injector = 220°C, detector= 250°C, column = 60°C, 3°C.min-1, 240°C. Flow
ofthe carrier gas (He super dry) = 1,0 mL.min-1. Mass spectra were obtained at 70 e V. The
samples ofthe OL, OB, EB and fractions obtained to OB were solubilized in ethyl acetate.
Retention indices (RI) were determmed by injection ofhydrocarbon standards (C9 to C20).
The essential oil components were identified by companson with data from literature
(Adams, 1995), the agar-agar, 15,0.profiles from the Nist Librn.ry Software 599438, and by
co-mjection ofauthentic standards, when available.
2.6. Anti-Candida albicans activity assays
Microorganism: Candida albicans CBMAI 0475 (ATCC 10231) was obtained
from the cbmai (Brazilian Colletion of Environmental and Industrial Micoorganisms,
CPQBNUNICAMP, Brazíl).
Culture medium: Agar Sabouraud Dextrose 4% (Merck), contained (g/L):
peptone, 1 0,0; dextrose, 40,0.
14
Culture storage: C. a/bicam; was maintained in Sabouraud Dextrose Agar
(Merck), replicated monthly and incubated at 36°C during 24 h. The culture was storage
under refrigeration at 4°C. Culture clones were also maintained in criotubes with glycerol at
-70°C.
2. 7. Anti-Candida assay- Minimal Inhibitory Concentration (MTC) Test
Candida albicans was grown overnight at 36°C in Sabouraud Dextrose Agar
(Merck) plates. Inoculum for the assays was prepared by diluting scraped cell mass in
0.85% NaCI solution, adjusted to McFarland scale 0.5 and confirmed by
spectrophotometrical reading at 580 nm. Cell suspensions were finally diluted to 104
UFC.mL·1 for use in the assays.
MlC tests were carried out according to Eloff (1998), using a tis sue culture test
plate (96 wells). The stock solutions of the extracts and oils were diluted and transferred
mto the first well, and serial dilutions were performed so that concentrations in the range of
1000 -15,6 J.1LmL·1 were obtained. Nistatin (Merck) was used as the reference antimycotic
contrai in the range of 60-5 1.1g/mL. The yeast inoculum was added to ali wells and the
plates were incubated at 36°C for 48 h. Antimicrobial activity was detected by adding 20
1.1L of 0.5% TTC (triphenyl tetrazolium chloride, Merck) aqueous solution. J\.1IC was
defined as the lowest concentration of oil and extract that inhibited visible growth, as
indicated by the TCC staining (dead C. albicans cells are not stained by TTC).
3. Results and Discussion
The essential oils o f the leaves and bulbs of A. tuberosum were obtained by
hydro distillation using a Clevenger type system. The aqueous phases were extracted with
dichloromethane, when there was obtained the OB (bulbs essential oil)- 810 mg (0.12 %,
w/w) and the OF (leaves essential oil)- 750 mg (0.15 %, w/w). The dichloromethanic
extract from bulbs EB was obtained in Ultra-Turrax system in 3.28% (w/w).
The OB was fractionated in dry column using dichlorometane as eluent. There
were obtained eight fractions (FI to F8), analyzed by TLC and the fractions 3, 4 and 5 were
15
grouped to produce the fractions: Fl- 138,6mg (33 %), F2- 15,3mg (3.7 %), F3 -FS
13,6mg (3.3 %), F6- 51,9mg (12.6 %), F7- 34, lmg (8.3 %), F8- 31,2mg (7.6 %)
The evaluation of the chemical composition of the essential oils,
dichloromethanic extract and fractions obtained from OB of A. tuberosum was carried out
by Gas chromatographic coupled in the mass spectrometry (GC-MS). The majority volatíle
constituents were identified by comparison of the mass spectra with those o f the NIST
electronic libnuy, with the standards of fragmentation of sulphides described in the
literature (Pino et ai., 2001; Martin-Lagos et ai., 1995), as well as for comparison ofthe
Retention lndices data and mass spectra with either those compounds published data (Pino
et al., 2001), collected in similar chromatographic conditions. When no information was
available, the identification was made by interpreting the fragmentation ofthe mass spectra.
The main volatile compounds identified in the different evaluated samples, the
retention índices (RI) and the relative percentages ofthe areas ofthe peaks are presented in
the Table 1.
Table 1
The organosulphides compounds (OSC) represent the main class of compounds
presents in essential oils OL, OB and fractions Fl and F2 ofOB oftheA.tuberosum. The
majority compounds are disulphides, trisulphides, tetrasulphides and sulphinates, as listed
in Table 2. Similar results were also observed by Pino et al., (2001 ).
Table 2
Forthe OL, the disulphides are the majority compounds (26.33 %), followed by
the trisulphides (20.30 %). Dialtyl disulphide was detected in 13.14 %, allyl, methyl
trisulphide in 14.16%, allyl, methyl-dtsulphide in 5.70 %, dimethyl-tnsulphide in 5 14%
and diallyl, trisulphite in 3. 72 % (Table 1 ). In the OB, the trisulphides are the majority ones
(60.50 %), followed by the disulphides (26.90 %). We also observed in fractions Fl and F2
higher trisulphides concentration, followed by disulphides. In the OB, the main compounds
identified were dimethyl-trisulphide (35.14 %), allyl, methyl-trisulphide (22.24 %) resulted
16
from the disulphides: allyl, methyl-disulphide (1 5.65 %), diallyl disulhide (4.72 %) and
dimethyl-tetrasulphide (3.08 %), Table1
Theses sulphurated oxygenated compounds, similar to allicin, were not detected
in the essential oils from leaves and bulbs, which can be explained by the decomposition of
the compounds for the heating used in the extractions. Alheio is one of the main
compounds of Allium spp with potential antimicrobial activity (Lemar et a!., 2002). Most of
the sulphurated compounds founded in extracts and essential oils ofAI/ium spp are result of
the allicin decomposition or transformation process according to shown in Figure 1. Severa!
works for evaluation ofthe percentage of allicin in Allium ssp are described in the literature
(Kubec ela/., 1999; Arnault ela/., 2003)
Figure 1
The antimicrobial properties of the Allium spp can be more explored as an
effective alternative in phannaceutical preparations. A wide scale of effects, particularly
antifungical properties have been investigated, including the organosulphides compounds
for specific inhibition effects (Lemar et ai., 2002). The propose of which ali antimicrobial
properties are produced by the allicin has been descnbed in severa1 in vitro studies (Dt
Paolo and Carruthers, 1960; Bouchara et a/., 1990; De Pauw et a!., 1995). The ability for
affecting the lipidic components of the extern surface of C. albicans was described by
Lemar et al. (2002).
There is not a consensus on the levei of acceptable inhibitlon for natural
products when compareci with antibiotic standards, so much what any authors consider only
results similar to that of antibiotics, while others consider with good potential itself those
with leveis of superior inhibitions. Aligiannis et al., (2001) proposed a classification for
vegetable materiais on basis of the results of N.IIC, considering how: strong inhibition -
IvliC up to 500 )lg/mL; modemte inhibition - MIC between 600 and 1500 )lg/mL and like
weak inhibition - MIC above 1500 )lg/mL.
The determination of the MIC (Mínima! Inhibitory Concentration) of the
essential oils from leaves (OL) and bulbs (OB), crude extract ofthe bulbs (EB) and also of
the fractions F1 to F8, obtained of the OB of A. tuberosum was carried out for C. albicans
17
ATCC 10231. The results are presented in Table 3.
Table 3
The values ofMIC obtained for the OL (>IOOOjtg/mL), OB (200 ~g/mL), and
EB (250 1-Lg/mL), show that the OB presented better inhibitory activity against C. albicans.
The OB was fractionated in dry column and the fractions evaluated for anti-C.albicans
activity. The fractions FI and F2, less polar, presented the better :MIC value (50 )..lg/mL),
followed by F6 and F7 fracions (100 )..lg/mL), Table 3 The F8, containing more polar
compounds, presented :MIC similar to obtained for the OB.
The increase of the activity observed for the Fl and F2 can be explained in
function ofthe chemical composition. The main compounds present in these fractions are di
and tri-sulphides, as allyl methyl disulphide, dimethyl trisulphide, diallyl disulphide and
allyl methyl trisulphide. On the other side, there were not observed in these fractions, the
presence ofsulphinates, compounds present in the OB and in the fractions FS and F6, Table
I and 2
4. Conclusions
In conclusion, the essential oil, extract and fractions Fl and F2 ofbulbs from A.
tuberosum showed important activities agamst C. albicans at lowconcentrations, especially
the FI and F2 fractions. This finding imphes that the pharmacologically active compounds
responsible by the activity from A. tuberosum are allyl methyl disulphide, dimethyl
trisulphide, diallyl disulphide and allyl methyl trisulphide, presents in OB and in fractions
FI and F2.
Acknowledgements
Research was supported bay a grant from CAPES and F APESP (SP, Brazil).
18
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22
Conclusões gerais
Este trabalho demonstrou que o óleo essencial extraído com diclorometano por
hidrodestilação em sistema Clevenger (OB), o extrato diclorometânico extraído por ultra
turrax (EB) e as frações F 1 e F2 do OB apresentaram forte inibição ao apresentarem MIC
contra C. a/bicans de 200 ~g/mL (OB), 250 ~g/mL (EB) e 50 ~g/mL (Fl e F2).
Os óleos essenciais apresentaram rendimentos de 0.12% w/w(OB), 0.15% w/w
(OL) e 3.28% w/w (EB), observa-se que o extrato p-ossui rendimento melhor que o dos
óleos brutos.
As amostras analisadas por CG-EM apresentaram compostos sulfurados, sendo
que os majoritários principais foram dissulfetos, trissulfetos e sulfinatos. Várias substâncias
foram encontradas e identificadas nas amostras, o que poderia demonstrar um sinergismo
entre as moléculas químicas, ou seja, interagem entre si em uma mesma amostra, formando
fitocomplexos químicos, conferindo assim a atividade anti-C. a/bicam·. Nenhuma
substância foi isolada e testada separadamente, sendo assim, a atividade antifúngica dos
extratos brutos e frações podem ser consideradas promissoras.
23
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28
Table 1. Compounds identifíed in the essential oils ofthe leaves (OL), bulbs (OB), ofthe
fractions Fl to F8, obtained of the OB and dichloromethanic extract from bulbs of
A.tuberosum, Retention Indices (RI) and relative percentages (%)for GC-MS.
GCarea 0/o
Compound RI OL EB OB Fl F2 F3-5 F6 F7
Furfural - - - 3.60 - - - 37.70 --·· ...
2 fumnmcthanol - - - 0.80 - - - 5.84 10.04
F8
1.93
1.93
3-Propanal meU1yl sulphide 915 2.52 - 1.55 - 1.15 1.38 36.73 4.95 4.08
Allyl methyl disulphidc 926 5.70 15.65 12.94 10.86 1.16
Mclhyl prupyl di~ulphidc 929 0.58 - - -l.i.IJithiane 937 - - 0.72 0.52 - - -
? · Furanecarboxaldehyde,5- 970 - - 0.87 - - 12.40 1.55 -mdhyl
Dimethyl iri~ulphide 98, ::>.\6 - 35.14 33.71 40.77 - - - -Dimethyl disulphidc 986 - 8.05 3.58 - - - - 18.62 42.45
sulphinate
Limonenc 1035 1.81 67.02 t - - -S methyl- 1062 - 2.62 ' - 1.28 7.3(, - -
mcthanotiosulphinate
11iallyl disulphíde 1087 13.14 - 4.72 6.30 6.30 - - - -Allyl propenyl disulphide 1102 4.42 - 0.57 0.37 - - -
Mcthyl mctyltio disulphide 1124 3.07 - 0.76 0.38 4.03 - -.A.Jlyl mdhyl !risulphide 1148 14.16 - 22.24 28.25 30.50 - - - -Dimethy tetrasulphide 1235 3.32 - 3.08 5.55 4.00 - - -
Diallyl trisulphide 1307 3.72 - 3.12 5.05 2.34 1.66 - -2·Methoxy-4 vinylphcnol 1311 5.20 - 0.03 - - -
2- Methoxy ·2· 1356 2.24 - - - - - -propenylphenol
Allyl methyl tetrasulphide 1371 1.68 0.45 2.18 0.35 - - -Buthyl methyltrisulphide 1411 0.98 - - - - -
[) Gutjunene 1491 - 3.60 - - - - -
• - no detected, t traces ( < O, 1 O%)
29
Table 2: Relative percentages of total sulphides class presented m essential oils of leaves
(OL), bulbs (OB), fractions FI to F8, obtained from OB, ande dichloromethamc extract of
bulbs (EB) of A. tuberosum.
Total Sulphides (% ) OL EB OB FI F2 F3-5 F6 F7 F8
GC-MS
Sulphides 2,52 - L 55 - 1 '15 1,38 36,73 4,95 4,08 i
Disulphides 26,33 - 26,90 20,60 21,20 - - 1,16 -
Trisulphides 20,30 3,60 60,50 67,00 73,60 1,66 -
letrasulphides 5,00 0,45 5,26 5,90 4,00 - - - -
Sulphinates - 10,67 3,::.8 - - 1,28 7,36 18,62 42,45 I
- no detected
30
Table 3: Values of minimal inhibitory concentration (MIC - 11g/mL) of essential oils from
leaves (OL) and bulbs (OB), extract from bulbs (EB) and fractions FI to F8 of the A
tuberosum against C. albicans ATCC 10231.
Microorganism Nistatin OF EB OB Fl F2 F3-5 F6 f7 fR
'
C afbicans 2 -~ 1000 ?SQ i - i 200 50 50 200 100 100 200
31
FIGURE 1
Allicin
' l deoomposition I transformatlon
~s,8~ ~s,8...,.s~
diallyl-disulphide diallyl-trlsulphide
3-vinyi-[4H]-1 ,2-dlthin
(1 dlaUyt-tetrasulphlde diallyl-pentasulphide
2-vinyi-[4H]-1 ,3.-dithiin
Figure 1 - Organosulphides compounds obtained from decomposition o r transformation of
the allicin.
32
FIGURE2
Muller-Hinton medium: 104UFC/ml lncubation: 36"C /24h Ref: Chloranpheniool Revelation: 20 ,,L TTC 0,5%
[0,015 mg ml
Figure2. Minimallnhibitory Concentration (MIC) lest by microdilution method (EIIof, 1998}.
Posilive contrai
Negative contrai
Figure 2 ~ Minimal Inhibitory Concentration (MIC) test by microdilution method (Ellof, 1998).
33
lll!lLIOTECA CENTRAL
DE!lENVOL VIMENTO t;(JtEÇÃO
UNICAMP
Anexo 1 -Resolução do formato alternativo para defesa
DELIBERAÇÃO CCPG- 001/98
Dispõe a respeito do formato das tese~ de Mestrado e de Doutorado aprovadas pela UN!CAMP
Tendo em vista a possibilidade, segundo parecer PG Na 1985/96. das teses de Mestrado e Doutorado terem um formato altematívo âquele já bem estabelecido, a CCPG resolve:
Artigo 1° - Todas as teses de mestrado e de doutorado da UN!CAMP h1t'ão o seguinte formato padrão:
l) Capa com formato úníco, dando visibilidade ao nfve! (mestrado e doutorado). e à Universidade.
H) Primeira fo!ha interna dando visibilidade ao nível (mestrado ou dolltorado), á Universidade, à Unidade em foi defendida e â banca examina.dora. ressaltando o nome do orientador e co-orientadores. No seu verso deve constar a ficha catalográfíca.
!I!) Segunda folha interna onde conste o resumo em português e o Abstract ern inglês.
IV) Introdução Geral. V) Capitulo. VI) Conclusão geraL VI!} Referência~ Bibliográficas. VIII) Apéndices (se necessários).
Artigo 2° - A critérío do orientador, os Capitulas e os Apêndices poderão conter cópias de artigos de autorta ou de co-autoria do candidato, já publicados ou submetidos para publ!cação em revístas científicas ou anais de congressos sujf)itos a arbitragem, escritos no idioma exigido pelo veículo de divulgação.
Parágrafo único~ Os veículos de divulgação deverão ser expressamente indicados.
Art1go 3° -A PRPG providenciara o projeto gráfico das capas bern como a impressao de um número de exemplares, da versão final da tese a ser !lomologada.
Artigo 4°- Fica revogada a resoluçao CCPG 17/97.
34
Anexo 2- E-mail de confirmação da submissão do artigo no Journal ofEthnopharmacology
Pasta Atual: INBOX.Sent Escrever Endereços Pastas Opções Procurar .A.i.lli.ill
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Mensagens I Apagm: I Editar Anterior I Próxima Encaminhar I Encaminhar como anexado I Responder I Responder a tod( mensagem como nova
Assunto: [Fwd: Submission Confirrnation for your paper] De: [email protected]
Data: Qui, Junho I, 2006 !0:19am Para: [email protected]
Prioridade: Normal Opções: Vçr cabecalho con:mlcto I Ver Ver:>ã9_Rara lmp.r~.:::.;;ão
--------------------------- Mensagem Original ----------------------------Assunto: Submission Confirmation for your pape= De: Data:
"Journal o f Ethnopharmacology" < j eth~oph@l§l.cdr. leidenuni v_ nl > Qui, Junho 1, 2006 10:34 am
Para: rehder@cp~ba.u~icamp.br
Dear Dr.Rehder,
Your submission entitled "In vitro anti-Candida activity and chemical investigation of leaves and bulbs of Allium tuberosum Rotth.eK Sprengel" has been received by journal Journal of Ethnopharmacology
You will be able to check on the Elsevier Editorial as an author.
progress The U?.L
of your paper by logging on to is b.t.!;,p__UÉ_es. elsev!_~r. com/ i_~L.
Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned.
Thank you for submitting your work to t:-,.:..s jo:...::::nal.
Kind regards,
Journal of Ethnopharmacology
35
Anexo 3- Cromatogramas dos OF, OB, EB e frações Fl a F8 do OB
=i ' = i
4CXXX:Oj
=
Figura 1: Cromatograma do óleo essencial das folhas- OF de A. tuberosum
TIC c:B.jb03a.D.data.rn;
Figura 2: Cromatograma do óleo essencial dos bulbos extraídos- OB de A. tuberosum
36
Figura 3: Cromatograma do extrato diclorometânico dos bulbos - EB de A. tuberosum.
I 45.00 ff)_(X} 55_(X}
Figura 4: Cromatograma da Fl da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
37
r t!Í.sÜnn:cA CENTRAL
I !J';S~lJVOLV!MENTO ('. '" ;.;.;····~()I ·' '. ·~·~..., .... UNlCAMP
' ~I
' -o= I
=
Figura 5: Cromatograma da F2 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
-o=.
a'llXX)l ::m::rni
i =I =i
' I 1EaXO! 1oco:Dj
8X.()J! l
' sm 10.00 lcllG)~, ~,~. ~, I~J
35.00 40.00 45.00 8000 5S.CO
I 15.00 2[)_(X) 25.00 30.C:O
Figura 6: Cromatograma da F3-5 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
38
S.CD 10:CD 15.CD 2D.CD 25.CD 30.CD 35_CD 40_CD 45.CD !'n.CD 55_CD
Figura 7: Cromatograma da F6 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
3ECO:Di =' =I =I :::r~ ~~~,. ,c,,.l~'""'· ~~*',..,i,Jl;.Jl.~"+~'+·~~~. ~~·~.-.... L~
5_CD 10.CD 15.CD 2D.CD 25_CD 3Q_(X) 35_CD 4Üo:> 45o:> EO.CD 55.CD
Figura 8: Cromatograma da F7 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
39
= "="
1lC Fi<lcao6.0..dala...-s
,=1 , iUJ~,, •. J.~~~~ l ~ k.,
S.CO 1Q(X) 15.00 2íHD 25.00 3CHXl 35_CO 40.00
11 I I~ 45.00 !1)_00 55_00
Figura 9: Cromatograma da F8 da coluna seca do óleo essencial dos bulbos- OB de A. tuberosum.
40
Anexo 4- Placa de CCD (cromatogra:fia em camada delgada) das frações de OB
41
[SÍBI.IVTECA CENTRAL
I !lF-SENifOLVIMENTO
CCH .. f.:ÇÃO
UNICAMI'
Anexo 5- Espectros de massa dos principais constituintes do OB
I=<XJOOj
IIC~
'
o
·~ 120:)00!
s s H3G_.... 'S/ 'CH3
dimatil~trisulfeto
MM= 126
T
::;; .!1 ~~· ·="~71 ~~·~·~e;:,~~~~-~~1~1 -=-;::t} ,=~. ~.,;,.~.~~.~1~·~~.0~~-m.~;:,~·~~
.,
I '
dialil-disulfeto MM= 146
s.,.__..-, 1268 (9_931 nin): CEAit"K> Ro<:*>:l<>.D.d"-an--..
1oxooj
=I I "' I =:1 ~= Ü~.l~7-=~=~·-,~·~·-~~ ~·~·~~~~~l,_,l~~~+ll~,-.-~T ~;"r~, ~·~·,~r-·~·~"c.-ccl"~'~"'c--1j"'"~ ~ ......- 'su eo 70 so so 1m' 110 12D 1:\.o 1.J.o 1k
42
'~I
=:I
==j 500Cúl
' ~·
::1 oi = I
' =
~5's/5'cH3 alil,metil-trisuifeio
MM= 152
=
I
~ "' ' ,I, I. ~li,, 11~-, ~
' ' = ~ '~
H3c/s'-s/s,s/cH3
dimetil-tetrasu ifeto
"o 1201:<E
' '"" '=
Sc:an22!90 (152SO .-ril): CEAiho R=tigo_D.dorn._ns
79
'= " '~ '= '=
I 1
~ ,li!, ,,):-'i'C:I "Í)'""' -4!J'"I ~,c'iccl "'~cf!',l,~T~,.;, . , .. ,'.'i'--c,~"±~ :~~ 40 50 80 70 80 90 1CO 110 120 130 140 150 160
43
I =I
=I I
~I
~ ...... s_....s~ dialif..trisulfeto
MM= 178
Sc-..an2913 (1aS17 n"in): CEAir>o R:>driQC>.DI.ddarT»
= I
I
=LJl' ,li ' I 64 i·
0 = _ÍI · 48 ~1 , __ j, , 1j 96 103 Jl, ,-, -·~,:c'o'~~C:'"~"''==-CCJ'::c-·cc:::c-'cS~,~-- .
90 1CK> 110 120 130 140 150 160 170 180
~'-''-'"1
' ~~"'"'I
' """'"! 2<0·00~
'-''-''-'''1 '
30 40 50 60 70
o li
H3C-8-SCH3
~ 8-metil,metano-sulfinato
MM= 126
'!
44
I 4000001 '-''-'<>~•<><>
"DODDD
'-'<>uoool
260000,
74<><><>'-'j
1-4U000
120000
20000
o
I li
I 02
'~dl .• 40 oO
o 11
H3C_...S,S_....CH3
dimetil-disulfeto-S-óxido
MM:: 110
.,,.., li· ·'I ' I 'o I'-'-!' ~·.
45
_," '
ao
[, .t .. ,,, " '-~"
Anexo 6- Principais estruturas químicas identificadas por CG-EM dos OF, OB, EB e
frações dos OB
H3C'--./s,8
/CH3
metil,etil-disu~eto
MM= 108
_/---,,/_s,8/c H3
metil,propil-disulfeto
MM= 122
metil,2-propenil-disu~eto propil,etil-disu~eto
MM= 120 MM= 136
butil,meti~disu~eto
MM= 136 dialü-disulfeto MM= 146
o 11
_......S....__ _......CH3 H3C S
H3C'--./S, /"'-. S CH3
dietil-disulfeto
MM= 122
dipropil-disulfeto MM= 150
alil-1-propenil-disu~eto
MM= 146
o 11
H3C-S-SCH3 g
metil,metiltio-disulfeto
MM= 152
dimetil-disulfeto-S-óxido
MM= 110
s-metil,metano-sulfinato
MM= 126
46
1 ,3-ditiano
MM; 120
dimeti\-trisulfeto
MM; 126
dimeti\-tetrasuWeto
MM;158
diali\-tetrasuWeto
MM;210
propana\,3-metil-suWeto
MM; 104
dialil-trisuWeto ali\,meti\-trisuWeto
MM; 178
a\i\,propi\-tetrasuWeto MM; 212
a\i\,metil-tetrasuWeto MM;184
47
MM; 178
Anexo 7- Fórmula para cálculo de índice de Kovatz
Q_ llM>.lo<!eO"ir;ie<l
O'>)l--t<;> • ••rrt.lc .'<JIQ
IK=--·
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
CENTRO PLURJDISCIPUNAR DE PESQUISAS QUÍMICAS1 BIOLÓGICAS E AGRÍCOLAS
DIVISÃO DE QUÍMICA ORGÂNICA E FARMACÊUTICA
ÍNDICE DE KOVATZ
+ 100 C~, Tr cn- Tr cn-1
Tr, Tempo de retenção da amostra
'NT'10 PLURIO!SCIPLIW>.R DE PESQUISAS OUIMJCAS, BIOLOG\CAS E AGR[CQU\5
onde:
Trc, Tempo de retenção do hidrocarboneto com "n" carbonos Tren-, Tempo de retenção-do hidrocarboneto com "n-1" carbonos C, Número de carbonos do hidrocarboneto "n" C"' Número de carbonos do hidrocarboneto "n-1"
48