Mestrado Rúbia

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO (MESTRADO) EM CIÊNCIAS MÉDICAS

DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ROTAVÍRUS EM

CRIANÇAS COM GASTRENTERITE AGUDA ATENDIDAS EM UM HOSPITAL

PÚBLICO PEIDÁTRICO DE NITERÓI

Rúbia Laine Andrade Ribeiro

Dissertação de mestrado submetida ao curso de

Pós-Graduação em Ciências Médicas, como um dos

requisitos necessários à aquisição do título de Mestre em

Ciências Médias. Área de concentração: Ciências da

Saúde.

Orientadores: Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia

Dr. José Paulo Gagliardi Leite

Niterói, RJ

2005

I

DEDICATÓRIA

À Deus por sempre estar presente e ser responsável por me guiar nos passos que

devem ser tomados no decorrer da estrada da vida.

Aos meus pais, pela paciência, confiança, incentivo e constante presença em minha

vida sempre me apoiando em todos os momentos.

II

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia pelos

ensinamentos passados, dedicação e paciência no decorrer da execução deste

trabalho.

Ao Dr. José Paulo G. Leite e toda equipe do laboratório de Virologia

Comparada do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, pelo incentivo e agradável

convivência durante realização deste projeto.

À Dra. Maria do Céu L.R. Monteiro e toda equipe do Hospital Getúlio Vargas

Filho – HGVF, pelo fornecimento das amostras utilizadas.

À equipe de alunos, pós-graduandos e professores do Departamento de

Microbiologia e Parasitologia do Instituto Biomédico – UFF pelo constante apoio.

À Coordenação e professores do Curso de Pós – graduação em Patologia

Clínica do Hospital Universitário Antônio Pedro – UFF.

Ao Instituto Oswaldo Cruz e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo auxílio financeiro.

Aos colegas e à Coordenação do Curso de Mestrado em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense por acreditar neste novo curso.

Aos colegas do Hospital de Força Aérea do Galeão pelo total apoio e

incentivo na conclusão deste trabalho.

III

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA I

AGRADECIMENTOS II

LISTA DE FIGURAS V

LISTA DE TABELAS VI

RESUMO VII

ABSTRACT VIII

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 Histórico 2

1.2 Características dos vírus 2

1.3 Proteínas virais, Genoma e Classificação dos RV 5

1.3.1 Proteínas estruturais 5

1.3.2 Proteínas não-estruturais 7

1.3.3 Genoma viral 7

1.4 Replicação dos RV 10

1.5 Transmissão 11

1.6 Patogênese e manifestações clínicas 12

1.7 Imunidade 13

1.8 Diagnóstico Laboratorial 15

1.9 Epidemiologia 16

1.10 Profilaxia 17

2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO 20

3. OBJETIVOS 23

1

4. MATERIAL E MÉTODOS 24

4.1 MATERIAL 24

4.1.1 Amostras clínicas 24

4.1.2 Reagentes e Soluções 29

4.2 MÉTODOS 33

4.2.1 Suspensão fecal a 10% 33

4.2.2 Extração do dsRNA Viral 33

4.2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida 33

4.2.4 RT- PCR para amplificação de VP7(G) e VP4(P) do RV do gp A 34

4.2.5 Nested – PCR para caracterização dos genótipos G e P de RV do

gp A

36

4.2.6 Análise Estatística 37

5. RESULTADOS 38

6. DISCUSSÃO 50

7. CONCLUSÕES 61

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63

9. ANEXO 1 80

10. ANEXO 2

2

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura da partícula do rotavírus (SA-11). Localização e

mobilidade eletroforética das proteínas estruturais e não

estruturais.

4

Figura 2 Esquema representativo dos eletroferotipos dos diferentes

grupos de rotavírus em gel de poliacrilamida.

9

Figura 3 Esquema da replicação dos Rotavírus (RV) na célula. 11

Figura 4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Paciente ou

Responsável

26

Figura 5 Ficha de dados do paciente 27

Figura 6 Distribuição mensal do número de amostras coletadas e

positivas para RV no período de abril a dezembro de 2003 no

HGVF em Niterói.

42

Figura 7 Distribuição mensal dos casos positivos para RV de acordo

com a temperatura média e a umidade relativa do ar no

período de março a dezembro de 2003 em Niterói, RJ.

42

Figura 8 Eletroforese em gel de poliacrilamida de dsRNA extraído de

amostras fecais de crianças atendidas HGVF com diarréia

por RV em Niterói no período de abril a dezembro de 2003.

45

Figura 9 Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos da RT-

PCR para obtenção dos fragmentos consensuais para os

genótipos G (a) e P (b) de RV.

46

Figura 10 Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos da

Nested - PCR para determinar o genótipo G e P e RV.

47

Figura 11 Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos da

Nested - PCR para determinar o genótipo G e P e RV.

47

Figura 12 Distribuição mensal dos genótipos G de RV detectados no

período de abril a dezembro de 2003 em Niterói.

48

3

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Número de atendimentos no HGVF no período de 2000 a

2003, de acordo com os sinais clínicos apresentados pelos

pacientes.

22

Tabela 2 Seqüência de iniciadores utilizados na RT-PCR e Nested-PCR

para detecção dos genótipos G e P de rotavírus.

28

Tabela 3 Reagentes para a reação da transcriptase reversa (RT). 35

Tabela 4 Reagentes para a PCR (amplificação da região VP4 e VP7). 35

Tabela 5 Reagentes para a reação de Nested – PCR (determinação dos

genótipos G e P).

36

Tabela 6 Distribuição das 136 amostras coletadas de crianças 0-2

anos no HGVF de acordo com o município de origem do

paciente e número de casos positivos para RV.

39

Tabela 7 Distribuição do número de amostras positivas para RV de

acordo com a faixa etária dos pacientes atendidos no HGVF

em Niterói de abril a dezembro de 2003.

40

Tabela 8 Distribuição dos casos positivos para RV de acordo com a

faixa etária das crianças atendidas no HGVF e aleitamento.

41

Tabela 9 Sinais clínicos das 136 crianças com diarréia atendidas no

HGVF em Niterói, Rio de Janeiro, Brasil de abril a dezembro

de 2003.

43

Tabela 10 Associação dos sinais clínicos apresentados por 136

crianças de 0-2 anos com diarréia atendidas no HGVF em

Niterói durante 2003.

44

Tabela 11 Distribuição dos genótipos detectados de acordo com a faixa

etária e local de coleta das amostras.

48

4

RESUMO

As diarréias agudas infantis constituem importante problema de saúde pública

particularmente em países em desenvolvimento e os Rotavírus (RV) são presentemente

reconhecidos como a principal causa de diarréia grave em crianças até 5 anos de idade

em todo o mundo. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência da infecção por

RV em crianças com diarréia atendidas em um hospital público pediátrico em Niterói,

RJ, no período de abril a dezembro de 2003. Inicialmente as crianças eram atendidas

na emergência (EM), onde ficavam por até 24 horas recebendo terapia oral e

intravenosa, e de acordo com o quadro clínico eram internadas na enfermaria pediátrica

(CM). As amostras fecais coletadas das crianças foram divididas em 3 grupos: (a) 136

amostras de crianças de 0-2 anos de idade sendo 64 da EM e 72 da CM; (b) 10

amostras de crianças de 0-2 anos admitidas no hospital com pneumonia e que

desenvolveram diarréia após 3 dias de internação; (c) 8 amostras de crianças maiores

de 2 anos (6 da EM e 2 da CM). A partir das amostras fecais foram preparadas

suspensões fecais a 10% em 0,01M Tris-HCl 0,0015M Ca+2 pH 7,2 e o genoma viral

(dsRNA) foi extraído usando isotiocianato de guanidina e sílica. A presença do genoma

característico dos RV foi detectada através da eletroforese em gel de policrilamida

(EGPA). O genoma viral extraído das amostras positivas por EGPA foi analisado pela

reação de polimerização em cadeia precedida de transcrição reversa (RT-Nested-PCR)

para a caracterização dos genótipos G e P dos RV do grupo A. Das 136 amostras de

crianças de 0-2 anos de idade (80 do sexo masculino e 56 do sexo feminino), 51

(37.5%) foram positivas para RV por EGPA. A proporção de casos positivos para RV

em crianças do sexo feminino (41,1%) foi maior do que no sexo masculino (35,0%),

porém esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,5893). Todas as

amostras positivas apresentaram o eletroferotipo característico de RV do grupo A com

perfil eletroforético longo. Não se observou diferença estatisticamente significativa na

positividade para RV entre crianças atendidas na EM e internadas na CM (p=0,5495)

como também em relação a faixa etária de 0-6, 7-12, 13-18 e 19-24 meses (p=0,5669).

Da mesma forma, nenhuma diferença estatisticamente significativa pode ser observada

5

entre a amamentação e a ocorrência da infecção por RV nas diferentes faixas etárias

(p=0,961). Um aumento significativo (p=0,0149) da proporção de casos positivos para

RV pode ser observado nos meses de Junho a Agosto de 2003, correspondendo a

época mais fria e seca do período estudado. Febre, vômito e anorexia foram sinais

clínicos comuns tanto em crianças positivas para RV (51) quanto em crianças negativas

(85). Entretanto, a combinação de febre + anorexia (p=0,039) e vômito + febre +

anorexia (p=0,00726) em crianças positivas para RV apresentou significância estatística

quando comparada com crianças negativas. O genótipo G dos RV do grupo A foi

determinado em 42/51 amostras (82,4%), sendo 32/51 (62,7%) amostras

caracterizadas como G1 e 10/51 (19,6%) como G9. Somente 6 amostras foram

genotipadas para P e todas foram caracterizadas como P[8]. Nas amostras coletadas

de 10 crianças hospitalizadas de 0-2 anos de idade com pneumonia (5 do sexo

masculino e 5 do sexo feminino), que desenvolveram diarréia após 3 dias de internação

na CM, também pode-se detectar por EGPA RV grupo A com perfil eletroforético longo,

sugerindo a ocorrência de infecção nosocomial. Entre estas 10 amostras, 5 foram

caracterizadas como genótipo G1, 1 como G9 e para outras 4 amostras o genótipo G

não pode ser determinado. O dsRNA característico dos RV do grupo A também pode

ser detectado por EGPA em 7/8 amostras fecais de crianças de 3-6 anos com diarréia e

1 amostra foi caracterizada como RV grupo C. Os resultados deste estudo objetivam

complementar as informações sobre os RV neste Estado.

6

ABSTRACT

Acute diarrhea remains an important public health problem specially in developing

countries and Rotavirus (RV) constitute the major cause of severe gastroenteritis in

children < 5 years old worldwide. The purpose of this study was to evaluate the

occurrence of RV in children presenting diarrhea attending at a public pediatric hospital

in Niterói, RJ, between April to December, 2003. Initially children were seen at

emergency (EM), where they could stay for 24 hours receiving oral or intravenous

therapy, or they could be placed at pediatric ward (PW). The fecal samples obtained

from these children were distributed in 3 groups: (a) 136 fecal samples were collected

from 0-2 years old children (64 from EM and 74 from PW); (b) 10 samples were from 0-2

years old children admitted at the Hospital with pneumonia and that developed diarrhea

at least 3 days after admission and (c) 8 samples were also obtained from diarrheic

children older than 2 years (6 from EM and 2 from PW). Approximately 10% (wt/vol)

stool suspensions were prepared in 0.01M Tris-HCl 0.0015M Ca2+ pH 7.2 and viral

genome (dsRNA) was extracted using guanidine isothiocyanate buffer and silica. The

presence of characteristic RV dsRNA was analyzed by polyacrylamide gel

electrophoresis (PAGE). The viral dsRNA, extracted from positive samples by PAGE,

was first reverse transcribed (RT) and amplified by polymerase chain reaction assay

(Nested PCR) in order to determine the G and P genotypes of group A RV. Of 136

samples from 0-2 year old children (80 male and 56 female), 51 (37.5%) were positive

for RV by PAGE. The proportion of positive cases in female children (41.1%) was higher

than in male (35.0%), but this difference was not statistically significant (p=0.5893). All

the positive samples showed the migration pattern of group A RV with long

eletrophoretic profile. No significant statistical difference could be observed in RV-

positivity between children attending at EM or PW (p=0.05495) as also in relation to the

age groups: 0-6, 7-12, 13-18 and 19-24 months (p=0.5669). No significant statistical

difference could also be observed between breast-feeding and RV infection among the

age-groups (p=0.961). A significant raise (p=0.0149) in the proportion of positive cases

could be observed from June to August 2003, that corresponded to the driest and colder

7

months of the studied period. Fever, vomiting and anorexia were common symptoms in

RV-positive (51) and RV-negative (85) children, but the combination of fever + anorexia

(p=0.039) and vomiting + fever + anorexia (p=0.00726) in RV-positive children were

statistical significant when compared with RV-negative children. It was possible to

characterize the G genotype for 42/51 group A RV positive samples (82.4%) and 32/51

(67.7%) were genotype G1 and 10/51 (19.6%) genotype G9. Only 6 samples were

characterized for P genotype and all of them were P[8]. Group A RV genome with long

electropherotype could also be detected in fecal samples of 10 patients (5 male and 5

female) at PW, admitted to hospital with pneumonia and that developed diarrhea at least

3 days after admission. From these 10 samples, 5 were characterized as G1 genotype,

1 as G9 and 4 could not be typed. Group A RV dsRNA could also be detected by PAGE

in 7/8 fecal samples of 3-6 years old diarrheic children (6 male and 2 female). One

sample showed the characteristic group C RV migration pattern. The results of this

study add information about RV in this State.

8

1. INTRODUÇÃO

Dados da Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) mostram que, as

infecções respiratórias agudas junto com as diarréias são as principais causas de

mortalidade em crianças menores de 5 anos de idade em países em desenvolvimento

(Anonymus, 1998).

Vários agentes microbianos estão implicados na etiologia das diarréias,

destacando-se as bactérias, os parasitas (protozoários e helmintos) e um expressivo

número de episódios relacionados à etiologia viral (Kapikian et al., 2001). Dentre os

agentes virais destacam-se os rotavírus (RV), adenovírus entéricos, astrovírus e

calicivírus (Blacklow & Greenberg, 1991).

Desde os achados pioneiros de Bishop et al. (1973), os RV representam a causa

mais comum de diarréia grave em crianças até 5 anos de idade, em todo o mundo. As

infecções por RV tem maior impacto nas taxas de mortalidade infantil dos países em

desenvolvimento da Ásia, África e América Latina, estando associadas a

aproximadamente 440.000 mortes ao ano (Parrashar et al., 2003).

9

1.1Histórico

Os RV humanos foram inicialmente descritos na Austrália quando Bishop et al.

(1973) observaram, ao microscópio eletrônico, a presença de partículas virais em

biópsias de intestino delgado de crianças que apresentavam diarréia grave de origem

não bacteriana.

No mesmo ano, Flewet et al. (1973) observaram, por microscopia eletrônica

(ME), partículas de vírus semelhantes às descritas por Bishop et al. (1973) em extrato

de fezes de crianças com grastrenterite aguda.

Como a morfologia das partículas era semelhante a de uma roda de carroça

antiga, estes vírus foram denominados de rotavírus (do latim rota, que significa roda)

(Flewett et al.,1973).

Poucos anos após a descoberta destes vírus, Linhares et al. (1977) observaram,

através da ME, partículas semelhantes aos RV em fezes diarréicas de crianças em

Belém do Pará, Brasil, sendo este o primeiro relato de detecção de RV na América

Latina.

Desde então, inúmeros aspectos da infecção por esses vírus têm sido objeto de

estudo, integrando desde os primeiros achados à ME até a caracterização molecular

das cepas circulantes e os ensaios de campo com vacinas experimentais (Gouveia et

al., 1990; Alfieri et al., 1996; Leite et al., 1996; Mascarenhas et al., 2002).

1.2Características dos vírus

Os RV pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavírus. As partículas de RV

quando visualizadas ao ME são esféricas, destituídas de envelope, com

2

aproximadamente 70 nm de diâmetro e o capsídeo apresenta simetria icosaédrica

(Figura 1) (Estes, 1996).

O capsídeo dos RV é constituído de 3 camadas protéicas distintas (triplo

capsídeo viral). A camada mais interna do vírion, que envolve o genoma, é denominada

core. Esta camada é formada pelas proteínas VP1 (125 kDa), VP2 (94 kDa) e VP3 (88

kDa). A camada intermediária, capsídeo interno, é composta pela proteína VP6

(41kDa). A camada mais externa, o capsídeo externo, é constituída pela proteína VP7

(37kDa) e pela proteína VP4 (88 kDa) que forma as espículas virais (Estes, 1996).

O genoma viral é constituído de 11 segmentos de ácido ribonucléico de dupla fita

(dsRNA), sendo que cada segmento codifica uma proteína, com exceção do segmento

11 que codifica 2 proteínas (NSP5 e NSP6). Seis segmentos de RNA codificam as

proteínas estruturais (Viral Protein): VP1-4, VP6 e VP7. Os demais segmentos

codificam as proteínas não-estruturais (Not Structural Protein): NSP1-6 (Kapikian et al.,

2001).

A partícula completa (com o triplo capsídeo viral) apresenta uma densidade de

1,36g/cm3 em gradiente de cloreto de césio (CsCl) e coeficiente de sedimentação em

sacarose de 520-530S, ao passo que a partícula sem o capsídeo externo apresenta

uma densidade de 1,38g/ cm3 em gradiente de CsCl e sedimenta em 380 a 400S. As

partículas nuas, sem os três capsídeos, tem densidade de 1,44 g/cm3 em gradiente de

CsCl e coeficiente de sedimentação de 280S (Bican et al., 1982; Gallegos & Patton,

1989).

A infecciosidade do vírus depende da presença do capsídeo externo e o

tratamento com agentes quelantes como ácido etilenoaminotetracético (EDTA) remove

o capsídeo externo resultado na perda da infecciosidade. A partícula viral é estável em

pH entre 3,0 e 9,0 e os vírus isolados de humanos e bezerros mantêm a infecciosidade

por vários meses a 4oC ou mesmo a -20oC, quando estabilizada com cloreto de cálcio

1,5mM. A infecciosidade pode ser inativada por desinfetantes como fenol, formalina,

3

cloro, betapropiolactona e o etanol (95%) que exerce seu efeito através da remoção do

capsídeo externo (Sattar et al., 1983, Vaughn et al., 1986).

Figura 1 - Estrutura da partícula do rotavírus (SA-11). Localização e mobilidade

eletroforética das proteínas estruturais e não estruturais. Foto captada pela

microscopia eletrônica (adaptada de Conner & Ramig, 1997)

4

1.3 Proteínas virais, Genoma e Classificação dos RV

1.3.1 Proteínas estruturais

As proteínas VP1, VP2 e VP3 que constituem o core são codificadas pelos genes

1, 2 e 3, respectivamente. As proteínas VP1 e VP3 ligam-se diretamente ao RNA e

apresentam, respectivamente, as atividades de RNA polimerase - RNA dependente e

guanililtransferase. A proteína VP2 está envolvida na organização do genoma viral

(Kapikian et al., 2001).

A proteína VP6 do capsídeo interno, codificada pelo sexto segmento genômico, é

a proteína viral mais abundante (compreende 51% da partícula viral), e é usada como

antígeno nos testes diagnósticos. Esta proteína especifica um antígeno que permite a

classificação dos RV em sete grupos, designados de A a G (Hoshino & Kapikian, 1994).

Os RV do Grupo A (gp A) infectam humanos, bovinos, suínos, eqüinos, caninos, felinos

e lagomorfos e são considerados os mais importantes epidemiologicamente (Kapikian

et al., 2001). Os RV do grupo B foram detectados em humanos, bovinos, suínos,

ovinos e murinos (Hung et al,1984; Krishnan et al.,1999). Os do grupo C foram

encontrados em humanos e suínos; os dos grupo E somente em suínos e os dos

grupos D, F e G foram isolados de aves (Penaranda et al., 1989; Oishi et al., 1993;

Jiang et al., 1995; Souza et al., 1998; Teixeira et al., 1998; Gabbay et al., 1999).

Os RV do grupo A podem ainda, de acordo com VP6, ser classificados em quatro

subgrupos: I, II, I + II e não I + não II (Hoshino & Kapikian, 1994).

O capsídeo externo é constituído de 2 proteínas: a VP7 que é predominante,

codificada pelos segmentos genômicos 7, 8 ou 9, dependendo da cepa e é responsável

pelos sorotipos/genótipos G, pois é uma proteína glicosilada; e a VP4, codificada pelo

segmento genômico 4 e que na maioria das cepas animais atua como uma

hemaglutinina. A VP4 é determinante dos sorotipos/genótipos P, por ser sensível à

proteólise (Estes, 1996).

5

A VP4 forma as espículas virais e, provavelmente, é a proteína de ligação à

célula, tendo papel na internalização do vírus. A clivagem de VP4 , em VP5*(60 kDa) e

VP8*(28 kDa), por proteases como a tripsina é necessária para aumentar a

infecciosidade viral. Estudos recentes demonstram que VP5* possui a capacidade de

permeabilizar membranas mediando a ligação dos RV às células hospedeiras,

facilitando a sua entrada (Denisova et al., 1999; Zarate et al., 2000). Ambas as

proteínas do capsídeo externo induzem, independentemente, a produção de anticorpos

neutralizantes (Hoshino et al., 1985; Offit & Blavat., 1986; Hoshino & Kapikian, 1994).

As proteínas do capsídeo externo são responsáveis por conferir uma

classificação binária aos RV: sorotipos/genótipos G e P. Em relação a VP7 são

conhecidos atualmente 15 sorotipos/genótipos G (G1 a G14), dos quais 11 foram

isolados a partir de humanos, sendo que os genótipos G1, G2, G3 e G4 e, mais

recentemente, G9 são considerados os de maior importância epidemiológica (Castelo et

al., 2004; Rahman et al., 2005; Santos & Hoshino, 2005).

Enquanto que para VP7 foi observada uma concordância entre a diferenciação

antigênica (sorotipagem) e análise do genoma (genotipagem), para VP4, a

diferenciação antigênica por sorologia mostrou-se difícil devido a ocorrência de reações

cruzadas induzidas pelo peptídeo VP5*. Por isso, atualmente a diferenciação entre os

tipos Gs e Ps tem sido realizada por genotipagem (Hoshino et al., 1985; Offit et al.,

1986). Até o momento foram encontrados 25 genótipos diferentes de VP4 (P), sendo

quatro em humanos: P[4], P[6], P[8] e P[9] (Castelo et al., 2004; Gentsch et al., 2005;

Rahman et al., 2005; Santos & Hoshino, 2005).

Teoricamente os 15 G (G1 a G14) e os 25 P (P1 a P25) genótipos de RV do

grupo A identificados poderiam levar a muitas combinações possíveis. Entretanto,

estudos sobre a distribuição destes genótipos, tanto em infecções humanas como de

animais, tem demonstrado o predomínio e a freqüência de algumas associações de

genótipos P e G. Quatro combinações são comumente identificadas em crianças com

6

diarréia em todo o mundo: P[8]G1, P[4]G2, P[8]G3 e P[8]G4. Atualmente, devido a

emergência do G9 após o final da década de 1990, este genótipo tem sido incluído

neste grupo (Estes & Cohen, 1989; Gentsch et al., 1996; Castello et al., 2004; Gentsh et

al., 2005; Santos & Hoshino, 2005).

1.3.2 Proteínas não-estruturais

Neste grupo estão presentes as cinco proteínas que são codificadas pelos

segmentos genômicos: 5, 7, 8, 10,11 e denominadas respectivamente de: NSP1, NSP2,

NSP3, NSP4 e NSP5 (Kapikian et al., 2001).

Foi descrito, recentemente, que a NSP4 pode atuar como uma enterotoxina viral,

exercendo papel semelhante a enterotoxina lábel da Escherichia coli, responsável por

produzir uma diarréia de natureza secretória (Ball et al., 1996).

1.3.3 Genoma viral

Os 11 segmentos de dsRNA estão inseridos no core e as partículas virais

contem sua própria RNA-polimerase RNA-dependente a fim de transcrever cada

segmento de RNA em RNAs mensageiros (mRNA) ativos. Os segmentos variam em

tamanho de 667 a 3.302 pares de bases (pb) e o genoma total contém,

aproximadamente, 18.522 pb (Kapikian et al., 2001).

O perfil característico dos segmentos genômicos dos RV, denominado de padrão

genômico ou eletroferotipo, pode ser observado após a metodologia de eletroforese em

gel de poliacrilamida (EGPA) (Figura 2). Com base neste perfil de migração, os RV

tem sido classificados em 7 eletroferogrupos distintos, denominados de A a G (Rodger

et al., 1981; Estes et al., 1984; Desselberger, 1989).

7

Figura 2 - Esquema representativo dos eletroferotipos dos diferentes grupos de

rotavírus em gel de poliacrilamida (adaptada de Araújo, 2001).

Pela ordem de migração no gel, os segmentos são distribuídos em quatro

classes de massa molecular: classe I (genes 1, 2, 3 e 4), classe II (genes 5 e 6 ), classe

III (genes 7, 8 e 9) e classe IV (genes 10 e 11). Esta disposição, característica dos RV

do gp A, também é representada como 4-2-3-2, indicando o número de segmentos

genômicos encontrados em cada classe de dsRNA. As amostras de RV com padrões

de dsR NA distinto daquele descrito para o gp A (4-2-3-2) podem incluir tanto os RV do

gp A com rearranjo genômico quanto os RV não grupo A que também são chamados

de RV atípicos (B-G) (Saif & Theil, 1985; Bridger, 1987; McCrae, 1987; Saif, 1990).

8

Uma característica importante dos RV pertencentes ao eletroferogrupo A é a

migração dos segmentos 7-8-9 em forma de um triplet, já que todos os RV atípicos

identificados até o momento apresentam como importante marcador molecular a não

formação do triplet nos segmentos 7-8-9 (Classe III) do dsRNA. (Pedley et al., 1983,

1986; Saif & Theil, 1985; McCrae, 1987; Saif, 1990).

Os RV do grupo A de acordo com o padrão de migração dos segmentos 10 e 11

do seu dsRNA, ainda podem ser classificados em três perfis distintos: “perfil

eletroforético longo”, por diferenças de mobilidade do segmento 11 e, “perfil

eletroforético curto” e “super curto”, por diferenças de mobilidade que ocorrem no

segmento 10 (Chasey & Banks, 1984; Taniguchi & Urasawa, 1995).

A análise dos perfis eletroforéticos tem sido utilizada para caracterizar amostras

de RV isoladas de surtos e determinar o eletroferogrupo predominante em uma região

num determinado período de tempo.

O polimorfismo eletroforético exibido pelos segmentos de dsRNA pela EGPA tem

sido um dos aspectos mais observados nos estudos de diversidade genética entre os

RV. A diversidade dos eletroferotipos pode ser devido à mutação pontual,

reestruturação (reassortments) e rearranjos (Taniguchi & Urasawa, 1995).

A mutação pontual consiste em alterações na seqüência de nucleotídeos que

ocorrem durante a replicação do genoma. Os acúmulos de mutações pontuais têm sido

observados em isolados obtidos durante uma única epidemia (Palombo et al., 1993).

A reestruturação (reassortments) consiste em mudanças no genoma que

ocorrem devido a trocas de segmentos de dsRNA entre diferentes estirpes virais (Estes

& Cohen,1989). Através deste mecanismo, novas estirpes virais podem surgir

rapidamente e co-infecção entre estirpes geneticamente próximas promove o mesmo

mecanismo de forma mais eficiente. As estirpes originadas por este processo são

chamadas de reassortants (Taniguchi & Urasawa, 1995).

9

Os rearranjos são alterações em porções significantes da seqüência num mesmo

segmento genômico, muitas vezes na forma de deleções ou duplicações. Estas

alterações levam a modificações na massa molecular dos segmentos de dsRNA,

resultando num perfil eletroforético distinto daquele original (Gonzales et al., 1989).

1.4 Replicação dos RV

A replicação dos RV ocorre no citoplasma das células localizadas no terço apical

das vilosidades do intestino delgado. Após a adsorção, o vírus é internalizado. Existem

dois mecanismos propostos para a penetração dos RV na célula hospedeira: a)

endocitose mediada por receptor, para partículas que não sofrem clivagem de VP4, os

vírus são rapidamente transportados para os lisossomos, onde são fagocitados,

resultando numa infecção abortiva; b) diretamente através da membrana plasmática,

para partículas onde VP4 é clivada. O aumento da infectividade, por clivagem

proteolítica de VP4, devido a exposição do peptídeo de fusão localizado em VP5*,

resulta na infecção produtiva (Conner & Ramig, 1997).

Após a entrada do vírus na célula e a liberação de seu dsRNA no citoplasma,

iniciam-se as etapas de transcrição, tradução, replicação e maturação viral. A partir da

fita molde de RNA (-), os mRNA são transcritos e as proteínas estruturais e não

estruturais, traduzidas. No processo de maturação as partículas de RV passam por

duas etapas: a primeira, quando ocorre a formação de partículas imaturas, e a

segunda, onde estas partículas adquirem um envoltório lipídico transitório através de

sua passagem pela membrana do retículo endoplasmático rugoso. As partículas

infecciosas são liberadas por lise celular (Figura 3) (Estes, 1996; Conner & Ramig,

1997).

10

Figura 3 - Esquema da replicação dos RV na célula (Adaptado de Murray et al.,

2002).

1.5 Transmissão

Durante o inverno, os RV parecem ser mais facilmente transmitidos devido a

baixa umidade relativa do ar que contribui para a disseminação dos viríons (Sattar et

al., 1984). Os RV são transmitidos principalmente pela via fecal-oral. Um indivíduo

infectado pode excretar, aproximadamente, 1 trilhão de partículas por mililitro de fezes,

sendo que apenas 10 partículas constituem a dose infectante para uma criança (Ward

et al.,1986). A possibilidade de transmissão respiratória tem sido considerada em

virtude da ocorrência de sinais respiratórios em alguns indivíduos com gastrenterite e a

detecção do vírus na secreção traqueal de crianças hospitalizadas com sintomas

respiratórios (Foster et al., 1980; Zheng et al.,1991). As transmissões indiretas, através

de fômites, também têm sido descritas (Sattar et al., 1994).

11

Inúmeros estudos indicam que a doença causada pelos RV ocorre mais

freqüentemente dos 6 aos 24 meses de idade, embora não sejam raros em regiões

menos desenvolvidas, os episódios diarréicos no primeiro semestre de vida da criança

(Huilan et al., 1991). Em geral, reinfecções assintomáticas ou clinicamente brandas

ocorrem entre adultos e crianças com idades superiores a dois anos (Blacklow &

Greenberg, 1991). Essas duas condições também são comuns na infecção primária

entre neonatos, talvez pela transferência passiva de anticorpos maternos, ou amostras

virais naturalmente atenuadas, ou ainda pela imaturidade anátomo-fisiológica intestinal

(Haffejee, 1991).

As infecções nosocomiais têm sido relatadas em creches e enfermarias

pediátricas, em virtude da elevada transmissibilidade dos RV, facilitada pelas condições

propícias à sua disseminação (Gusmão et al., 1995; Linhares et al., 2002).

1.6 Patogênese e manifestações clínicas

As células-alvo dos RV são os enterócitos maduros localizados no terço apical

das vilosidades do intestino delgado. Estudos histopatológicos da infecção

experimental de RV em modelos animais tem mostrado: atrofia das vilosidades,

hiperplasia das criptas, escassez mitocondrial e infiltração da lâmina própria por células

mononucleares. Isto sugere que a diarréia induzida pelos RV resulta principalmente da

diminuição na absorção de água e eletrólitos como resultado da lesão intestinal e a

substituição epitélio absortivo por células secretórias das criptas (Macromichalis et al.,

1977). O efeito deletério viral é de natureza lítica, com acúmulo de dissacaridases no

lúmen intestinal, ocasionando o quadro de diarréia osmótica (Estes & Cohen, 1989).

Entretanto, a diarréia pode ocorrer na ausência de lesão epitelial demonstrável

por microscopia óptica. Ball et al. (1996) mostraram que durante o processo de

replicação dos RV na célula, a NSP-4 se localiza na membrana do retículo

endoplasmático rugoso, alterando a permeabilidade desta membrana o que provoca um

12

aumento da concentração de íons Ca+2 intracelular. Dessa forma, poderia funcionar

como uma enterotoxina viral; ao abrir os canais de Ca+2 levaria à liberação de íons Cl-

para fora da célula, o que diminuiria a entrada de íons Na+ e H2O, levando a diarréia

(Tian et al., 1994).

O período de incubação de uma infecção por RV é em torno de 24 a 48 horas,

com quadro agudo e com duração de 5 a 7 dias. Entre os sinais clínicos podem ser

observados vômito e febre seguido de diarréia aquosa profusa não sanguinolenta,

cólicas abdominais e desidratação isotônica de natureza leve a moderada podendo

levar a hospitalização. No caso de crianças desnutridas sem acesso a terapia de

reidratação a infecção por RV pode ser fatal (Linhares et al., 1989).

O tratamento da diarréia por RV é principalmente sintomático e inclui a reposição

de fluidos e eletrólitos perdidos por vômito e diarréia. A reidratação oral tem contribuído

para o declínio das taxas de morbidade e mortalidade e quando há uma necessidade

de reposição rápida de eletrólitos aplica-se o tratamento endovenoso, que pode ser

realizado ao longo de algumas horas nos ambulatórios e a hospitalização propriamente

dita é reservada para os casos mais graves (Linhares et al., 1989)

1.7Imunidade

Os mecanismos imunológicos de proteção contra as gastroenterites por RV

ainda não são bem esclarecidos. Aceita-se que a proteção envolva anticorpos locais

(mucosa) e sistêmicos, assim como a resposta imunológica mediada por células

(Bishop et al., 1983; Offit et al., 1986; Ward , 1996).

Apesar da VP6 ser reconhecida como a proteína viral mais imunogênica, alguns

estudos mostram que anticorpos séricos contra VP4 ou VP7 são capazes de neutralizar

os RV e proteger os hospedeiros susceptíveis (Offit et al., 1986; Hoshino et al., 1988;

Ward et al., 1996). Outros estudos mostram que a VP4 parece ser mais efetiva na

13

indução de anticorpos séricos neutralizantes vírus-específicos durante a infecção

natural. Por outro lado, anticorpos contra VP6, nas secreções, são indicativos da

habilidade da imunoglobulina A (IgA) em neutralizar vírus, refletindo a imunidade de

mucosa e resistência à reinfecções (McNabb & Tomasi, 1981; Mestecky & McGhee,

1987).

Vários estudos sugerem que a infecção natural por RV confere proteção contra a

doença severa durante uma reinfecção (Bishop et al., 1983; Bhan et al., 1993). Cada

infecção nova por RV aumenta a proteção natural e reduz a ocorrência da doença

grave por RV (Velázquez et al., 1996). Sustenta-se que a infecção primária por RV

induza, em geral, resposta imunológica de caráter homotípico (Ward, 1996). Processos

infecciosos posteriores ocasionariam uma imunidade com espectro mais amplo,

decorrendo daí uma expressiva proteção cruzada (Gerna et al., 1990; Arias et al.,

1994).

Os anticorpos das classes IgM, IgG e IgA são detectáveis no soro, saliva e

secreções intestinais após infecções primária ou secundária por RV (Offit, 1996). A

imunidade protetora parece estar relacionada com os níveis de IgA sérica e intestinal,

todavia o exato papel dos anticorpos neutralizantes sorotipo-específicos ainda não está

bem elucidado (Bishop et al., 1996; Offit, 1996). A imunidade mediada por células

também parece contribuir para a resolução da infecção (Offit, 1996; Ward, 1996).

Uma outra forma de proteção natural contra a diarréia por RV é a transferência

passiva de anticorpos maternos via placenta ou aleitamento. Apesar de haver muitas

controvérsias quanto ao papel protetor do aleitamento natural, há evidências que níveis

elevados de anticorpos neutralizantes para RV no colostro materno se associam a

infecções menos freqüentes entre neonatos (Zheng et al., 1991). Um outro importante

mecanismo de imunidade passiva é a transferência de IgG materna para o lúmem

intestinal do recém–nascido, possivelmente por transcitose, causando a neutralização

do vírus antes mesmo da infecção dos enterócitos (Ward, 1996).

14

1.8Diagnóstico Laboratorial

Uma vez que os RV são excretados em altas concentrações durante a fase

aguda da enfermidade (109 partículas virais/ml de fezes), o diagnóstico laboratorial

baseia-se principalmente na detecção do vírus nas fezes do paciente com suspeita de

infecção (Kapikian & Chanock, 2001).

Entre as técnicas mais utilizadas estão o ensaio imunoenzimático (EIE), que

compreende a utilização de anticorpos dirigidos ao antígeno comum de grupo (VP6), e

a aglutinação envolvendo microesferas de látex devidamente sensibilizadas com

anticorpos (Pereira et al., 1983a; Sanders et al., 1986).

Além dos métodos citados, reconhecidos por sua utilidade em laboratórios

clínicos, outros são empregados na pesquisa cientifica: observação das partículas virais

pela ME (Bishop et al., 1973; Pereira et al., 1983a) e as metodologias para detecção e

tipagem do genoma viral: EGPA (Rodger et al., 1981; Pereira et al., 1983b; Sanders et

al., 1986), hibridização do genoma viral com sondas moleculares, amplificação do

genoma viral pela reação em cadeia pela polimerase com prévia transcrição reversa

(RT-PCR) (Gouvea et al., 1990, Gentsch et al. 1992). Ainda, a propagação do vírus em

linhagens celulares suscetíveis (MA104) também é possível (Urasawa et al., 1981).

1.9Epidemiologia

A ocorrência de novos casos de gastrenterite por RV encontra-se relacionada a

fatores climáticos. Nos países de clima temperado a rotavirose ocorre, quase

exclusivamente, durante o inverno. Nos países tropicais, a rotavirose é uma doença

endêmica com picos de incidência não tão pronunciados (Cook et al.; 1990; Linhares,

2000).

15

A distribuição sazonal das gastrenterites por RV no Brasil assume duas distintas

configurações: as regiões Centro–Oeste, Sudeste e Sul brasileiros possuem um

marcante perfil sazonal, com maiores números de casos nos meses mais secos (maio –

setembro) (Gomes et al., 1991; Teixeira et al., 1991;Cardoso et al., 1992; Stewien et al.,

1993); porém nos estados da região Norte e Nordeste, tal sazonalidade não é tão

observada (Linhares et al., 1983; Stewien et al., 1991).

Os RV do gp A são responsáveis por mais de 90% das infecções em humanos

atingindo, principalmente, crianças de 6 a 24 meses de idade. Os RV do Grupo B que

infectam humanos são menos comuns, porém foram responsáveis por grandes surtos

anuais na China, Bangladesh e Índia envolvendo principalmente adultos (Hung et al.

1984; Unicomb et al., 1989; Krishnan et al., 1999). Os RV do Grupo C são

responsáveis por surtos esporádicos em adultos e crianças em todo o mundo

(Penaranda et al., 1989; Oishi et al., 1993; Jiang et al., 1995).

A epidemiologia dos genótipos de RV é muito complexa, havendo predominância

de determinados tipos, os quais podem variar de região para região, de ano para ano.

Apesar de tantos genótipos distintos algumas combinações são mais comuns como

P[8]G1, P[8]G3, P[8]G4, P[8]G9 e P[4]G2. Entretanto, RV de genótipos considerados

incomuns como G5, G8 e G10 tem sido isolado de humanos e alguns destes genótipos

são detectados em alta freqüência nos diferentes países (Nakagomi et al., 1990,

Ramachandran et al., 1996; Gentsch et al., 1996, 2005; Castello et al., 2004; Santos &

Hoshino, 2005).

A distribuição dos sorotipos/genótipos no Brasil apresenta algumas

características peculiares, como a circulação de G8, G10, P[8]G5 e P[6]G2. G5 é um

genótipo associado à infecção em suínos e sendo responsável por no mínimo 10% dos

casos de diarréia aguda em humanos em algumas regiões do país (Gouvea et al.,

1994; Alfieri et al. 1996; Leite et al., 1996; Timenetsky et al., 1994,1997; Mascarenhas

et al., 1998; Santos et al.,1998, 2001, 2005; Araújo et al., 2001, 2002; Silva et al., 2002).

16

Especula-se que os animais sejam fontes de infecção para humanos, já que

existem evidências de que o rearranjo entre amostras de RV humano e animal ocorra

naturalmente. Os genótipos G6, G8 e G10 comumente associados à infecção em

bovinos tem sido detectados em casos de diarréia humana (Gouvea et al. 1994;

Gusmão et al., 1994). O genótipo G9, de origem bovina inicialmente descrito nos

Estados Unidos (Clark et al., 1987), tem sido foco de inúmeros estudos e juntamente

com os genótipos G1, G2, G3 e G4 é considerado como de alta prevalência em vários

países do mundo, inclusive no Brasil (Santos et al., 1998; Araújo et al., 2001, 2002;

Silva et al., 2002; Souza et al., 2003; Martella, et al. 2003; Castelo et al., 2004;

Sanchez-Fauquier et al., 2004).

1.10 Profilaxia

Um aspecto peculiar das infecções por RV é que os índices de morbidade não

diferem, significativamente, se comparados os países desenvolvidos àqueles em

desenvolvimento (United States, Institute of Medicine, 1986). Estudos sorológicos

mostram que aos 3 anos de idade, independente da condição sócio-econômica, 90%

das crianças possuem anticorpos para o vírus indicando que o acesso a água potável,

higiene e medidas de saneamento básico tem pouco efeito no controle da diarréia por

este agente (De Zoysa & Feachem, 1985; Linhares,2000; Kapikian et al., 2001).

Verificou-se, de acordo com estudos epidemiológicos realizados mundialmente, a

necessidade de um controle preventivo da infecção por RV através de vacinas.

(Kapikian et al., 2001; Linhares, 2000).

Estudos longitudinais tem demonstrado que as infecções por RV naturalmente

adquiridas conferem proteção posterior contra formas graves de diarréia aguda pelo

patógeno. Observa-se que a exposição assintomática de recém-nascidos é associada a

chances reduzidas de desenvolvimento de formas graves de gastroenterite na infância

(Bishop et al. 1983). Portanto, a principal finalidade de uma vacina contra os RV seria

17

prevenir a gastroenterite na sua forma grave nos primeiros dois anos de vida (Bresee,

et al., 2005; Glass et al., 2005).

As primeiras “candidatas” à vacina contra RV eram representadas por amostras

virais atenuadas de origem animal (vacinas jenerianas). Tal estratégia foi

implementada, pois a maioria dos RV oriunda do homem e de animais compartilha o

antígeno comum de grupo VP6 e as cepas animais de RV seriam naturalmente

atenuadas para seres humanos.

Durante a década de 80, duas amostras de origem bovina G6 (RIT 4237 e WC3)

e uma de origem símia G3 (MMU 18006 ou RRV) foram testadas a fim de verificar se o

desenvolvimento de imunidade heteropítica protegeria crianças da infecção natural por

RV (Vesikari, 1997). Como os níveis de proteção induzidos pelas vacinas eram

variáveis nos diferentes estudos e as evidëncias sugeriam que a imunidade homotípica

proporcionaria uma melhor proteção contra a diarréia por este agente, novas

estratégias de desenvolvimento de vacinas foram implementadas (Bresee, et al., 2005).

A fim de proteger os indivíduos contra os principais genótipos de rotavírus

circulantes: G1-G4, foi desenvolvida, uma vacina tetravalente anti-RV (TV-RRV) de

origem símio-humana geneticamente reestruturada (G1, G2 e G4 origem humana e G3

origem símia) (Kapikian et al., 2001). Estudos realizados em diversos países, incluindo

o Brasil, demonstraram resultados de eficácia satisfatórios (60-90%) contra os casos

de diarréia aguda, e com isso a vacina foi licenciada pela “Food and Drug

Administration” para uso nos Estados Unidos da América (EUA) em agosto de 1998

(Linhares, 2000). Porém, após a aplicação de 1,5 milhões de doses em crianças nos

EUA o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) recomendou que a aplicação

da vacina RRV-TV fosse suspensa. Esta ação foi baseada após o relato de 15 casos de

crianças com intussuscepção (uma invaginação de um segmento intestinal em outro

causando uma obstrução intestinal) duas semanas após a 1a dose o que foi

considerado como um sério evento adverso associado à vacina (Bines, 2005).

18

Após estudos realizados na América Latina (México, Brasil e Venezuela), uma

vacina atenuada de rotavírus humano, Rotarix®, cepa RIX4414 (GlaxoSmithKline,

Belgium) com especificidade genotípica G1P[8] foi licenciada para uso no México em

2004 e recentemente foi aprovada para uso no Brasil fazendo parte do Programa do

Plano Nacional de Imunização. Esta vacina será administrada por via oral em 2 doses

e os estudos demonstraram eficácia contra diarréia causada por G1 e G9 (De Vos,

2004; Salinas et al., 2005).

Uma nova vacina reestruturada bovina-humana pentavalente incluindo os

genótipos G1, G2, G3, G4 e P8, RotaTeq® (Merck), está para ser comercializada.

Estudos preliminares mostram que a vacina apresenta uma eficácia de 68 a 74% para

gastroenterites por RV independente da gravidade e de aproximadamente 100% para

episódios graves de diarréia (Heaton et al., 2005).

19

2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO

As gastrenterites agudas são conhecidas em todo o mundo como uma

importante causa de morbidade e mortalidade infantis. Estudos recentes mostram que a

cada ano os RV causam aproximadamente 111 milhões de episódios de diarréia

requerendo apenas cuidado domiciliar, 25 milhões de visitas ao médico, 2 milhões de

hospitalizações e, em média, 440.000 mortes de crianças menores de 5 anos de idade,

sendo que 82% dos óbitos ocorrem nos países em desenvolvimento. Até os 5 anos

cada criança terá pelo menos um episódio de diarréia por RV, uma em cinco crianças

necessitarão de cuidados médicos, uma em 65 serão hospitalizadas e,

aproximadamente, uma em 293 irão a óbito (Parashar et al., 2003).

A detecção dos RV em amostras fecais e a caracterização molecular dos

genotipos G e P são importantes de maneira a identificar as cepas circulantes. A

maioria dos estudos indica que os genótipos G1, G2, G3 e G4, em associação com o

genótipo P8, apresentam circulação mundial, e eles são alvos para o desenvolvimento

de vacinas (Gentsch et al., 1996, 2004).

Entretanto, isolados humanos com genótipos G e P considerados incomuns,

como G5, G8, G10 e P[6], têm sido detectados em vários estudos epidemiológicos

conduzidos em diversos países, inclusive no Brasil (Alfieri et al., 1996; Leite et al., 1996;

Timenetsky et al., 1997; Santos et al., 1998; Mascarenhas et al., 1998; Araújo et al.,

2002).

20

Poucos são os dados sobre a detecção e caracterização genômica das amostras

de RV que circulam no município de Niterói. Em um estudo anterior realizado no

período de 1997-1999, Santos et al. (2001) relataram a detecção de amostras de RV

pertencentes ao genótipo G9 ou P[9], a partir de amostras fecais de crianças com

diarréia até 5 anos de idade.

No Hospital Municipal Getúlio Vargas Filho, que atende a população carente (até

18 anos de idade) do município de Niterói e outros municípios vizinhos (Itaboraí, Magé,

Maricá, Rio Bonito, São Gonçalo e Saquarema), a gastrenterite foi a segunda causa

mais freqüente de consulta e internação nos anos de 2000-2001, sendo que no ano de

2002 o número de atendimentos devido a gastrenterite ultrapassou até mesmo o

número de casos de infecções respiratórias (Tabela 1).

Estes dados nos motivaram a coletar amostras neste Hospital, de maneira a

determinar os casos associados à infecção por RV e caracterizar os genótipos

circulantes nesta população.

Sabe-se que o efetivo controle das gastrenterites por este agente se condiciona

ao advento de uma vacina eficaz para uso corrente ao longo do primeiro semestre de

vida (Linhares, 2000). Estudos anteriores demonstraram que a diversidade das

amostras de RV que circulam no Rio de Janeiro é maior que a encontrada em outros

países, corroborando a necessidade do diagnóstico laboratorial para a caracterização

genômica dos vírus em circulação e que as candidatas a “vacinas” para o nosso país

podem requerer a presença de antígenos adicionais (Araújo et al., 2002).

21

Tabela 1: Número de atendimentos no Hospital Getúlio Vargas Filho no período

de 2000 a 2003, de acordo com os sinais clínicos apresentados pelos pacientes.

2000 2001 2002 2003

Patologia No. de pacientes

% No. de paciente

s

% No. de paciente

s

% No. de paciente

s

%

Pneumonia 3695 66,4 4226 45,7 3934 40,6 4807 43,6

Gastrenterite 1416 25,4 3549 38,2 4215 43,5 4313 39,1

Varicela 213 3,8 757 8,1 479 4,9 1187 10,8

Outras* 244 4,4 764 8,21 1067 11 710 6,4

Total 5568 9296 9695 11017

* Outras: Dengue, escarlatina, hepatite, rubéola, meningite, coqueluche, Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida, Staphylococcus Aureus resistentes a Meticilina, difteria,

sarampo, tuberculose e parotidite.

22

3. OBJETIVOS

3.1. Geral:

Determinar a ocorrência da infecção por RV em crianças hospitalizadas em

Niterói.

3.2. Específicos:

Verificar a ocorrência da infecção por rotavírus em crianças de 0 a 2 anos de idade,

atendidas no Hospital Municipal Getúlio Vargas Filho em Niterói, no período de abril

a dezembro de 2003.

Detectar e determinar os eletroferotipos de RV envolvidos no grupo em estudo pela

EGPA;

Caracterizar através das técnicas de RT-PCR e Nested-RT-PCR os genótipos das

amostras positivas;

Comparar os genótipos de RV circulantes em Niterói com os de outras regiões do

Brasil.

23

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Amostras clínicas

Amostras fecais foram obtidas de crianças com diarréia, durante os meses de

abril a dezembro de 2003, atendidas no Hospital Municipal Getúlio Vargas Filho

(HGVF), hospital pediátrico que atende a população de baixa renda, localizado em

Niterói, Rio de Janeiro, Brasil. Inicialmente as crianças eram atendidas na emergência

(EM), onde ficavam por até 24 horas recebendo terapia oral e intravenosa, e de acordo

com o quadro clínico eram internadas na enfermaria pediátrica (clínica médica - CM).

As amostras fecais deste estudo foram distribuídas em 3 grupos: (A) 136

amostras foram coletadas de crianças de 0-2 anos de idade sendo 64 oriundas da EM e

72 da CM; (B) 10 amostras foram coletadas de crianças de 0-2 anos admitidas no

HGVF com pneumonia e que desenvolveram diarréia, pelo menos, após 3 dias de

internação e (C) 8 amostras também foram obtidas de crianças maiores de 2 anos com

diarréia, sendo 6 da EM e 2 da CM, estas crianças foram atendidas no hospital junto

com seus parentes, crianças de 0-2 anos com diarréia, mas que durante o atendimento

não foi possível coletar amostras.

24

A maioria das 136 amostras coletadas eram provenientes de crianças de 0-2

anos de idade das cidades de Niterói (83) e São Gonçalo (37). Outras 12 amostras

foram provenientes de Maricá (6), Itaboraí (2), Angra dos Reis (1), Araruama (1), Arraial

do Cabo (1), Magé (1), Rio de Janeiro (1) e para 3 amostras este dado não estava

disponível. As 10 amostras do grupo B eram de crianças provenientes de Niterói (4),

São Gonçalo (4), Saquarema (1) e para uma criança este dado não era disponível.

Entre as 8 amostras de crianças maiores de 2 anos, 7 eram de Niterói e 1 de São

Gonçalo.

As amostras foram coletadas, por raspagem das fraldas, a partir de material fecal

evacuado espontaneamente pela criança. Cada amostra era coletada somente após o

consentimento assinado pelo responsável do menor (Figura 4). Cada paciente foi

cadastrado em uma ficha própria contendo dados de identificação do paciente (nome,

endereço, sexo, idade) e sinais clínicos (Figura 5).

O material foi colocado dentro de um frasco plástico e enviado sob refrigeração

ao Laboratório de Virologia do Departamento de Microbiologia do Instituto Biomédico da

UFF.

Este projeto foi submetido ao Comitê de Ëtica da Universidade Federal

Fluminense tendo sido aprovado na data de 21/05/2003 (Anexo 1) e pelo Comitê de

Ética do Hospital Getúlio Vargas Filho.

25

Nome do Paciente: __________________________________Idade: _________Responsável Legal: ________________________________________________

Título do Projeto: Detecção e Caracterização Molecular de Rotavírus associados a casos de gastroenterite no município de Niterói.

Responsável (is) pelo Projeto: Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia José Paulo G. Leite.

Responsável pela Coleta de Material: Rúbia Laine Andrade Ribeiro

Local da Coleta: ____________________________________________________

Eu, _________________________________________,abaixo assino, responsável pelo

paciente, _____________________________________________________________, (nome do paciente)e declaro ter pleno conhecimento do que se segue:

- que estou participando de uma pesquisa destinada a investigar os tipos de rotavírus causadores de diarréia aguda no Município de Niterói.

- que o exame será realizado com as fezes coletadas da fralda do paciente após defecação espontânea.

- que serei beneficiado por saber se a diarréia é causada por rotavírus

- da liberdade de retirar o meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuação do meu tratamento.

- que se manterá o caráter confidencial das informações relacionadas com a minha privacidade, mesmo com a publicação em trabalhos científicos ou apresentações em congresso.

Niterói, ___________ de _____________ de _____________.

Assinatura do ( ) paciente ou ( ) responsável Assinatura do médico

Figura 4: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Paciente ou Responsável

26

Universidade Federal FluminenseInstituto BiomédicoDepto. de Microbiologia e ParasitologiaLaboratório de Virologia

Projeto: Diagnóstico laboratorial de Rotavírus

Local de coleta: _________________________________________________________________

Data: __/___/___

Coleta: ___/___/___

Parasitologia _____________

Bacteriologia _____________

Virologia _____________

INFORMAÇÕES CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS

Nome: _____________________________________________________________________

Endereço: __________________________________________________________________

Sexo: 1-M Idade: _____anos Peso: _____ gramas

2-F _____meses

Diarréia há ________ dias.

Presença de:Sim Não Sim Não

3- Muco: 8- Inapetência:

4- Sangue: 9- Coriza:

5- Febre: 10- Tosse:

6- Vômito: 11- Rash cutâneo:

7-Dor abdominal:

Tipo de alimentação:

12- L.M. exclusivo 13- Mista 14- Outros

15- Possui animal em casa? Sim Não Qual?_______________

16- Uso de antibióticos? Sim Não Qual?_______________

Observações:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

____________________________ (ass. e carimbo)

Figura 5: Ficha de dados do paciente

Ministério da SaúdeFundação Oswaldo CruzInstituto Oswaldo Cruz

Registro:

27

4.1.2. Iniciadores para a reação de transcrição reversa (RT) e amplificação do

cDNA (PCR/Nested-PCR)

A seqüência dos iniciadores utilizados na reação de transcrição reversa (RT) e

amplificação do cDNA (PCR/Nested-PCR) para a caracterização dos genótipos G e P

dos RV de grupo A estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2: Seqüência de iniciadores utilizados na RT-PCR e Nested-PCR para

detecção dos genótipos G e P de rotavírus*.

Iniciadores** Seqüência 5´-3´Posição

(nt)

Produto

(pb)

Protótipo de

origem

9-con1 (+) TAG CTC CTT TTA ATG TAT GG 37-56 - Wa

9-con2(-) GTA TAA AAT ACT TGC CAC CA 922-941 904 Wa

9T1-1 (G1)(-) TCT TGT CAA AGC AAA TAA TG 176-195 158 Wa

9T1-2 (G2)(-) GTT AGA AAT GAT TCT CCA CT 262-281 244 S2

9T-3P(G3)(-) GTC CAG TTG CAG TGT TAG C 484-503 466 107E1B

9T-4 (G4)(-) GGG TCG ATC GAA AAT TCT 423-440 403 STE

9T-9B(G9)(-) TAT AAA GTC ATT GCA C 131-147 110 116E

FT5 (G5)(-) CAT GTA CTC GTT GTT ACG TC 760-779 742 OSU

4-con3 (+) TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A 11-32 876 Wa

4-con2 (-) ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 887-868 - Wa

1T1 P[8] (-) TCT ACT TGG GAT AAC GTG C 339-356 345 Wa

2T1 P[4] (-) CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 474-494 483 RV5

3T1 P[6] (-) TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA 259-278 267 1076

4T1 P[9] (-) TGA GAC ATG CAA TTG GAC 385-402 391 K8

HT8 (G8)(-) CGG TTC CGG ATT AGA CAC 273-256 274 B37

ET10(G10)(-) TTC AGC CGT TGC GAC TTC 714-697 715 B223

* Gouvea et al.,1990; Gentsch et al.,1992.

** Invitrogen

28

4.1.3 Reagentes e Soluções

Tampão Tris-Ca+2 pH 7,2

Tris base 0,01 M ….............................................................................................. 1,21 g

Cloreto de cálcio 0,0015 M.................................................................................... 0,22 g

Água Milli-Q q.s.p.............................................................................................1000,00 mL

Ajustar o pH com HCl concentrado para 7,2 antes de completar o volume final

com água Milli-Q. Filtar em membrana Millipore (0,22u), aliquotar e conservar a 20ºC.

Tampão L2

Ticianato de guanidina ……………………............................................................120,0 g

Tris-HCl 0,1 M, pH 6,4 …………………............................................................... 100,0 mL

Tampão L6

Triton X-100 ……………………………………......….................................................1,3 g

Ticianto de guanidina.…………………………........................................... ...........120,0 g

EDTA 0,2 M pH 8,0………………………………....………………............…............22,0 mL

Tris-HCl 0,1 M, pH 6,4 ………………………..……………………........…..............100,0 mL

Sílica

Dióxido de Sílica.....................................................................................................60,0 g

Água destilada q.s.p. ...........................................................................................500,0 mL

Homogeneizar a sílica e deixar sedimentar por 24h. Aspirar por sucção 430mL e

desprezar. Completar o volume para 500 mL com água destilada, homogeneizar e

deixar sedimentar por 5h. Aspirar por sucção 440 mL do sobrenadante e desprezar.

Ajustar o sedimento a pH 2,0 pela adição de 600uL de HCl 37 %. Aliquotar 10 mL da

solução em frascos de cor âmbar, autoclavar e estocar à temperatura ambiente (TA).

29

Tampão Tris-Glicina pH 8,2 10X

Tris base ...............................................................................................................24,0 g

Glicina………………………………………............................................................115,3 g

Água Milli-Q q.s.p...............................................................................................1000,0 mL

Ajustar o pH 8,2 com HCl P.A., antes de completar o volume final. Diluir a

solução 10X para uso 1X.

Tampão Lower-tris 4X pH 8,8

Tris (hidroxi-metil-tris-aminometano)....................………………………..................6,34 g

H2O destilada q.s.p.............................................................................................200,00 mL

Ajustar o pH 8,8 com HCl P.A ., antes de completar o volume final.

Tampão Upper-tris 4X pH 6,8

Tris (hidroxi-metil-tris-aminometano)……………………………............................12,12 g

H2O destilada q.s.p.............................................................................................200,00 mL

Ajustar o pH 6,8 com HCl P.A . , antes de completar o volume final.

Acrilamida/Bisacrilamida

Bisacrilamida............................................................................................................0,8 g

Acrilamida ..............................................................................................................30,0 g

Água Milli-Q q.s.p.................................................................................................100,0 mL

Persulfato de amônio a 10 %

Persulfato de amônia ..............................................................................................0,2 g

Água Milli-Q q.s.p...................................................................................................10,0 mL

Gel de poliacrilamida – 7,5%

Gel separador.........................................................................................................15,0 mL

Gel concentrador .....................................................................................................5,0 mL

30

Gel separador 7,5%

Água destilada........................................................................................................5,72 mL

Tampão 4X Lower-Tris pH 8,8.................................................................….……...2,50 mL

Acrilamida/bisacrilamida.........................................................................................1,50 mL

Persulfato de amônia..2% (AP)..............................................................................0,30 mL

TEMED....................................................................................................................5,00 µL

Gel concentrador

Água destilada........................................................................................................1,24 mL

Upper-tris................................................................................................................0,50 mL

Acrilamida/bisacrilamida.........................................................................................0,16 mL

Persulfato de amônia..............................................................................................0,12 mL

TEMED....................................................................................................................3,00 µL

Solução fixadora

Etanol P.A..................................................................................................................10 %

Ácido acético PA......................................................................................................0,5 mL

Água Milli-Q q.s.p. ...............................................................................................100,0 mL

Solução de nitrato de prata 0,001M

Nitrato de prata ................................................................................................... 0,095 g


Solução reveladora

NaOH .....................................................................................................................3,00 g

Formaldeído ..........................................................................................................0,75 mL

Borohidreto de sódio............................................................................................20,00 mg

Água Milli-Q q.s.p. .............................................................................................100,00 mL

31

Solução para conservar o gel

Metanol...................................................................................................................65,0 mL

Glicerina ...............................................................................................................500,0 µL

Água Milli-Q q.s.p. ...............................................................................................100,0 mL

Gel de agarose 1,5%

Agarose ...................................................................................................................1,5 g

Tampão TBE 1X pH 8,4 ......................................................................................100,0 mL

Misturar sob agitação e dissolver aqucendo em forno de microondas por 3

minutos.

Tampão TBE 10X pH 8,4

Tris base ..............................................................................................................108,0 g

Ácido bórico ...........................................................................................................55,0 g

EDTA 0,5M pH 8,0……………………………………………………...................…...40,0 mL


Diluir a solução para 1X para uso.

Solução de Brometo de Etídio 0,5ug/mL

Solução de brometo de etídio 10 mg/mL...............................................................15,0 µL

Tampão TBE 1X pH 8,4.......................................................................................300,0 mL

32

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Suspensão fecal a 10%

Foram preparadas suspensões fecais a 10% de cada amostra fecal em tampão

Tris-Ca2+ 0,01M (pH 7,2). Após homogeneização e centrifugação a 2000 rpm por 20

minutos, os sobrenadantes foram recuperados e estocados a -20oC até utilização.

4.2.2 Extração do dsRNA Viral

A extração do dsRNA foi realizada segundo a metodologia descrita por Boom et

al. (1990) com modificações. A 200µL de suspensão fecal a 10%, foi adicionado 800µL

do tampão L6 e 15µL de sílica. Os reagentes foram homogeneizados em vórtex e

mantidos à temperatura ambiente por 20 minutos com agitação constante. A seguir, as

amostras foram centrifugadas a 14.000 x g/ 30 segundos e os sobrenadantes

desprezados em solução de NaOH 10N. Adicionou-se aos sedimentos 500µL de

tampão L2 e após nova agitação em vórtex e centrifugação a 16.000 x g/ 30 segundos,

os sobrenadantes foram desprezados em solução de NaOH 10N. A seguir, os

sedimentos foram sucessivamente lavados uma vez com 500µL de etanol 70% e uma

vez com 500µL de acetona P.A. mantidos a -20C. Os tubos foram incubados a 56C/15

minutos para a secagem completa dos sedimentos, e então adicionou-se a cada tubo

50µL de TE 1 x pH 7,4 (10mM Tris pH 7,4 , 1mM EDTA pH 8,0) para EGPA ou H2O

Milli-Q para RT-PCR . Após nova incubação a 56C/15 minutos, procedeu-se a

centrifugação a 16.000 x g/5 minutos, os eluatos foram coletados e estocados a -20C.

33

4.2.3 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (EGPA)

A eletroforese foi realizada segundo a metodologia descrita por Pereira et al.

(1983a). O gel de polcrilamida era constituído de 5mL de gel concentrador (4%) e

15mL de gel separador (6,5%). O gel vertical era montado em placas de vidro, com

espaçadores de 1mm vedados com agarose 1,5%. Dez µL das amostras de dsRNA

extraídos eram aplicadas no gel, e após a eletroforese em tampão Tris –glicina pH 8,2

(35mA/2horas), procedia-se a impregnação pelo nitrato de prata. O gel era inicialmente

lavado em uma solução fixadora por 30 minutos e a seguir adicionava-se a solução de

nitrato de prata 11mM por 30 minutos. O gel era lavado 2 vezes com água destilada e

adicionava a solução reveladora (substituindo primeiro pela solução de ácido acético

5% e, posteriormente, pela solução de etanol 10%). O gel era conservado em uma

solução contendo 65µL de metanol, 0,5mL de glicerina e H2O q.s.p. 100mL por 30 min.

O perfil eletroforético do dsRNA foi visualizado em negatoscópio, e interpretado de

acordo com Herring et al. (1982).

4.2.4 RT-PCR para amplificação de VP7 (G) e VP4(P) do RV do gp A

Esta técnica foi desenvolvida conforme descrito por Gouvea et al. (1990) e

Gentsch et al. (1992) com modificações introduzidas por Leite et al. (1996), sendo

realizada em duas etapas: a reação de transcrição reversa (RT) e a reação de

amplificação (PCR). Inicialmente, 10µL do dsRNA foi incubado com 2µL de DMSO (di-

metil sulfóxido) a 97ºC por 7 minutos seguido de resfriamento em banho de gelo por 2

minutos. Para obtenção do cDNA adicionava-se a cada tubo 38µL da mistura de

reação da RT (Tabela 3), totalizando um volume final de 50µL. A mistura foi incubada

em termociclador a 42°C por 1 hora e o cDNA era estocado a –20°C.

34

Tabela 3: Reagentes para a reação da transcriptase reversa (RT)

Reagentes Volume por Reação (1x)

dXTP (dATP, dTTP, dCTP e dGTP)* 2,5mM 2 µL

Tampão de enzima (10X)* 2,5 µL

MgCl2 50 mM* 1,25 µL

Pd(N)6** 1,0 µL

SuperScript II – RT (200 U/µL)* 0,5 µL

H2O DNAse/RNAse free 27,25µL

Volume final 50 µL

* Invitrogen

** random primer

A seguir, procedia-se a PCR com iniciadores consensuais para a amplificação de

VP7 e VP4. A 2,5µL do cDNA adicionava-se 22,5µL da mistura da PCR (Tabela 4). A

PCR foi realizada em termociclador automático, e após a desnaturação inicial a 94°C

por 2 minutos foram realizados 35 ciclos a 94ºC/30 segundos, 50ºC/30segundos e

72ºC/1minuto e extensão final a 72ºC por 10minutos.

Os produtos da RT-PCR foram submetidos à eletroforese (100V/1h) em gel de

agarose 1,5% em tampão TBE 1X. Utilizou-se como padrão de corrida o DNA Ladder

(100 pb ou 50 pb) (Invitrogen). O gel foi corado em solução de brometo de etídio a

0,5µg/mL, os produtos amplificados foram visualizados em transiluminador (DyNA Light

Dual Intensity UV Transilluminator - Labnet - National Labnet Company) e as imagens

capturadas pelo processador e fotografadas em sistema de captura de imagem “

BioImaging Systems” que utiliza o software LabWorks 4.0.

35

Tabela 4: Reagentes para a PCR (amplificação da região VP4 e VP7)




MgCl2 50mM* 1,25 µL

Mistura de iniciadores consensuais* * 20µM 1 µL

DNA Taq-polimerase (5U/µL)* 0,125 µL

H2O DNAse/RNAse free 18,125 µL

Volume final 22,5 µL

* Invitrogen

** G tipo: 9con1 + 9con2; P tipo: 4con2 + 4 con3

4.2.5 Nested-PCR para caracterização dos genótipos G e P de RV do gp A

Para a caracterização dos genótipos G pela Nested-PCR foi adicionado 1µL do

produto consensual da RT-PCR a 24µL da mistura de PCR contendo os pares de

iniciadores específicos para identificação dos genótipos G (9con1 + G1, G2, G3, G4,

G5, G8, G9 e G10) e P (4con-3 + P[4], P[6], P[8] e P[9]) (Tabelas 3 e 5). A reação foi

realizada em um volume final de 25µL. A nested-PCR foi realizada em termociclador

automático e consistia de 25 ciclos a 94ºC/30segundos, 47ºC/50segundos e

72ºC/1minuto e extensão final a 72ºC por 10minutos.

Os produtos da Nested-PCR foram processados conforme descrito em 4.2.4.

36

Tabela 5: Reagentes para a reação de Nested – PCR.




MgCl2 50mM* 0,8 µL

Mistura de iniciadores específicos (G tipos e P tipos)* 20mM 0,5 µL (cada)

Iniciador consensual G tipo (9con1) ou P tipo (4 con3)* 0,5 µL

DNA Taq-polimerase (5U/µL)* 0,125 µL

H2O DNAse/RNAse free 15,875 µL

Volume final 24 µL

* Invitrogen

4.2.6 Análise Estatística

A relação entre duas variáveis contínuas, o sexo do paciente e local de coleta da

amostra (EM ou CM) em relação a positividade para RV, foi investigada pelo teste de

Qui-quadrado (2). A fim de avaliar a relação entre positividade para RV e o mês de

coleta da amostra foi aplicado o Teste exato de Fisher. A significância estatística da

proporção dos dados (distribuição temporal e aleitamento) foi examinada pelo Teste de

diferença de proporções Z. A fim de comparar três variáveis (aleitamento, faixa etária e

positividade para RV) foi utilizado o Teste de Mantel-Hoenszel. Para todos os testes

citados o valor p<0,05 foi considerado significante.

37

5. RESULTADOS

Entre as 136 amostras fecais de crianças de 0 a 2 anos de idade com diarréia

aguda (80 do sexo masculino e 56 do sexo feminino), analisadas pela EGPA, 51

(37,5%) foram positivas para RV. Apesar de haver uma predominância de crianças do

sexo masculino, pode-se observar uma positividade maior para RV em amostras de

crianças do sexo feminino (23/56 - 41,1%) do que masculino (28/80 - 35,0%), porém

esta diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,5893).

A maioria das amostras coletada era de crianças da cidade de Niterói e foram

positivas para RV. As demais amostras eram de crianças dos municípios vizinhos de

Niterói conforme a Tabela 6.

38

Tabela 6: Distribuição das 136 amostras coletadas de crianças 0-2 anos no

Hospital Getúlio Vargas Filho de acordo com o município de origem do paciente

e número de casos positivos para RV.

MunicípioNúmero de amostras

testadas

Número de amostras

positivas

Niterói 83 26

São Gonçalo 37 16

Maricá 6 5

Itaboraí 2 0

Angra dos Reis 1 0

Araruama 1 0

Arraial do Cabo 1 0

Magé 1 1

Rio de Janeiro 1 0

ND* 3 3

Total 136 51

*ND = dado não disponível

De um total de 64 amostras coletadas de crianças na emergência (EM), 22

(34,4%) foram positivas para RV e de 72 amostras coletadas de crianças internadas na

clínica médica (CM) 29 (40,3%) foram positivas (Tabela 7). A diferença na positividade

para RV entre crianças atendidas na EM e internadas na CM não foi estatisticamente

significativa (p=0,5495).

39

Sessenta e nove das 136 (50,7%) amostras fecais foram coletadas de crianças

nos primeiros 6 meses de vida (Tabela 7). Entretanto, a diferença na positividade para

RV em relação a faixa etária das crianças atendidas no hospital não foi estatisticamente

significativa (p=0,5669).

Tabela 7- Distribuição do número de amostras positivas para RV de acordo com a faixa etária dos

pacientes atendidos no HGVF em Niterói de abril a dezembro de 2003.

Faixa etária

(meses)

Emergência Clínica Médica Total

N° de amostras

positivas/ N° de

amostras testadas

N° de amostras

positivas/ N° de

amostras testadas

N° de amostras

positivas/ N° de

amostras testadas

No. % No. % No. %

00-06 08/28 28,6 19/41 47,5 27/69 39,1

07-12 05/18 27,8 07/19 35,0 12/37 32,4

13-18 05/08 62,5 03/08 37,5 08/16 50,0

19 -24 04/10 40,0 00/04 0 04/14 40,0

Total 22/64 34,4 29/72 40,3 51/136 37,5

Dentre as 136 crianças que participaram do estudo apenas 28,7% (39/136)

estavam sendo amamentadas, sendo 71,8% (28/39) na faixa etária de 0-6 meses e as

demais 28,2% (11/39) entre 7-18 meses de idade (Tabela 8). Nenhuma diferença

estatisticamente significativa pode ser observada entre a amamentação e a ocorrência

da infecção por RV nas diferentes faixas etárias (p=0,961).

40

Tabela 8: Distribuição dos casos positivos para RV de acordo com a faixa etária das

crianças atendidas no HGVF e aleitamento.

Faixa etária

(meses)

Com aleitamento Sem aleitamentop*

RV (+) RV (-) Total RV (+) RV (-) Total

00-06 13 15 28 14 27 41 0,3046

07-12 2 7 9 10 18 28 0,4519

13-18 0 2 2 8 6 14 0,0777

19-24 0 0 0 4 10 14 1,000

Total 15 24 39 36 61 97

p* < 0,05 significativo

Conforme representado na Figura 6, a detecção de amostras positivas de RV

não ocorreu de forma homogênea durante o período estudado. Enquanto que o número

de amostras coletadas aumentou nos meses de abril a agosto, de outubro a dezembro

não se conseguiu obter amostras de casos de diarréia, apesar da freqüência de idas ao

hospital ter se mantido inalterada.

A correlação entre a detecção de RV e os fatores climáticos (média mensal da

temperatura e umidade relativa do ar) estão representados na Figura 7. Observa-se

que a proporção de casos positivos para RV de junho a setembro foi significativamente

maior que de abril a maio (p=0,0149), correspondendo a época mais fria e seca do

período estudado.

41

Figura 6: Distribuição mensal do número de amostras coletadas e positivas para

RV no período de abril a dezembro de 2003 no HGVF em Niterói.

Figura 7: Distribuição mensal dos casos positivos para RV de acordo com a

temperatura média e a umidade relativa do ar no período de março a dezembro de

2003 em Niterói, RJ (Fonte: Instituto Nacional de Meteorologia – INMET).

42

Os sinais clínicos apresentados pelas 136 crianças na faixa etária de 0 a 24

meses com diarréia atendidas no HGVF, de acordo com os dados da ficha dos

pacientes, estão relacionados na Tabela 9. Pode-se observar que febre, vômito e

anorexia foram sinais clínicos comuns tanto em crianças positivas para RV (51) quanto

em crianças negativas (85). Observou-se muco nas fezes de 10/51 (19,6%) crianças

positivas para RV e em 24/85 (28,2%) crianças negativas. Diarréia sanguinolenta foi

detectada apenas em 2/51 crianças positivas e em 3/85 crianças negativas para RV.

Sintomas respiratórios como coriza, tosse e pneumonia também estava presentes nas

crianças envolvidas no estudo. A comparação dos achados clínicos entre crianças

positivas e negativas para RV não mostrou nenhuma diferença estatística significante.

Tabela 9 : Sinais clínicos das 136 crianças com diarréia atendidas no HGVF em Niterói,

Rio de Janeiro, Brasil de abril a dezembro de 2003.

Sinais Clínicos RV positivo

(n=51)

RV negativo

(n=85)p*

Vômito 35 (68,6%) 54 (63,5%) 0,5450

Febre (> 37.8oC) 37 (72,6%) 46 (54,1%) 0,0164

Anorexia 35 (68,6%) 42 (49,4%) 0,0143

Muco nas fezes 10 (19,6%) 24 (28,2%) 0,2606

Diarréia sanguinolenta 2 (3,9%) 3 (3,52%) 0,9063

Coriza 28 (54,9%) 37 (43,5%) 0,1986

Tosse 34 (66,7%) 61 (71,8%) 0,5305

Pneumonia 2 (3,9%) 12 (14,1%) 0,0582

Rash 6 (11.8) 10 (11.8) 1,0000

*p < 0,05 = significativo

43

A combinação de sinais clínicos mais observada em crianças positivas para RV

foi vômito + febre (60,8%), seguido de vômito + anorexia (54,9%); febre + anorexia

(54,9%) e vômito + febre + anorexia (49,0%). Distribuições similares destes sintomas

também foram observadas em crianças com diarréia negativas para RV (Tabela 10).

Entretanto, a combinação de febre + anorexia (p=0,039) e vômito + febre +

anorexia (p=0,00726) em crianças positivas para RV apresentou significância estatística

quando comparada com crianças negativas (Tabela 10). Utilizando o modelo de

regressão logística pode-se constatar que a chance de uma criança apresentando dois

sintomas (febre + anorexia) ou três sintomas (febre+vômito+anorexia) associados estar

com diarréia por RV é, respectivamente, 2,61 e 2,44 vezes maior que de uma criança

sem esses sintomas associados.

Tabela 10: Associação dos sinais clínicos apresentados por 136 crianças de 0-2 anos

com diarréia atendidas no HGVF em Niterói durante 2003.

Sinais clínicos RV positivo

(n=51)

RV negativo

(n=85)

p*

Vômito + Febre 31 (60.8%) 39 (45.9%) 0,0923

Vômito + Anorexia 28 (54.9%) 34 (40.0%) 0,0912

Febre + Anorexia 28 (54.9%) 27 (31.8%) 0,0039

Vômito + Febre + Anorexia 25 (49.0%) 24 (28.3%) 0,00726

*p < 0,05 = significativo

Todas as 51/136 amostras positivas para RV, de crianças de 0-2 anos de idade,

testadas por EGPA, apresentaram o eletroferotipo característico de RV do grupo A

(distribuição 4-2-3-2) com perfil de migração longo (Figura 8a).

44

Figura 8 : Eletroforese em gel de poliacrilamida de dsRNA extraído de amostras

fecais de crianças atendidas HGVF com diarréia por RV em Niterói no período de

abril a dezembro de 2003. (a) Coluna A: padrão símio SA11 (rotavírus); Coluna B:

amostra positiva para RV grupo A (0-2 anos); Coluna C: amostra positiva para RV

grupo A (nosocomial); Coluna E: amostra positiva para RV grupo A ( > 2 anos); Coluna

D: amostra negativa para RV. (b) Coluna A: amostra positiva para RV grupo A; Coluna

B: amostra positiva para RV grupo C.

Estas 51 amostras positivas foram submetidas a genotipagem através das

técnicas de RT-PCR/Nested-PCR. Apesar de todas as amostras apresentarem reação

com o par de iniciador consensual 9con1/9con2, o genótipo G pode ser determinado em

42/51 amostras (82,4%), sendo 32/51 (62,7%) amostras caracterizadas como G1 e

10/51 (19,6%) como G9 (Figuras 9 e 10).

A B C D E

(a) (b)

A B

4

2

3

2

4

2

3

2

45

Figura 9: Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos da RT-PCR para

obtenção dos fragmentos consensuais para os genótipos G (a) e P (b) de RV.

Linha 1: marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen); Linhas 2,3,4,5,6,7 e 8:

fragmento consensual para genótipos G (906 pb) e P (876 pb); Linha 9: controle

negativo de extração e amplificação.

Figura 10: Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos da Nested - PCR

para determinar o genótipo G e P de RV. (a) Linha 1: Marcador de peso molecular de

50 pb (Invitrogen); Linhas 2,4,5: amostras genótipo G1; Linha 7: amostra genótipo G9.

(b)

906 pb 876 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

(a)

158pb G1 180 pb G9 345 pb P[8]

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9

(a) (b)

46

(b) Linha1: Marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen); Linhas 2,3,4,5:

amostras genótipo P[8]; Linha 6: controle negativo de extração e amplificação.

A distribuição dos genótipos de acordo com a faixa etária das crianças atendidas

e o local de coleta das amostras no HGVF está demonstrada na Tabela 11. Observa-se

a predominância do genótipo G1 em relação ao G9 em crianças de 0-6 meses.

Tabela 11: Distribuição dos genótipos detectados de acordo com a faixa etária e local de coleta

das amostras.

Faixa etária Emergência Clínica Médica

(meses) G1 G9 G? G1 G9 G?

00-06 05 03 01 16 03 00

07-12 04 01 00 03 02 02

13-18 02 00 03 01 00 02

19 -24 01 01 02 00 00 00

Total 12 05 05 20 05 04

A distribuição mensal dos genótipos G está demonstrada na Figura 11. Não foi

possível observar a predominância de um genótipo em relação a outro.

47

Figura 11 : Distribuição mensal dos genótipos G de RV detectados no período de

abril a dezembro de 2003 em Niterói.

O genoma viral extraído das 51 amostras positivas também foi amplificado com o

par de iniciador consensual 4con2/4con3, entretanto somente 6 amostras foram

genotipadas até o momento, e todas foram caracterizadas como P[8]. Portanto, a

classificação binária completa só pode ser determinada para 6 amostras: P[8]G1.

Nas amostras coletadas de 10 crianças hospitalizadas de 0-2 anos de idade com

pneumonia (5 sexo masculino e 5 sexo feminino), que desenvolveram diarréia após 3

dias de internação na CM, testadas pela EGPA, também pode-se detectar RV grupo A

com perfil eletroforético longo (Figura 8a). Estas amostras foram coletadas nos meses

de Julho (3/10), Agosto (6/10) e em Setembro (1/10) de 2003.

Entre estas 10 amostras, 5 foram caracterizadas como genótipo G1, 1 como G9

e para outras 4 amostras o genótipo G não pode ser determinado.

Amostras fecais de 8 crianças de 3-6 anos com diarréia (6 sexo masculino e 2

sexo feminino) foram também testadas por EGPA e 7 apresentaram o eletroferotipo

característico de RV do gp A com perfil longo. Em uma amostra coletada de uma

criança de 3 anos de idade do sexo masculino no mês de setembro de 2003 pode-se

observar, pela EGPA, o perfil eletroforético de um RV não grupo A (Figura 8b). A

comparação do padrão genômico mostrou a ausência da formação do triplet nos

segmentos 7, 8 e 9 presentes nos RV gp A, e que 3 segmentos genômicos migravam

na região correspondente aos segmentes 5 e 6 dos RV gp A. Apenas um segmento

migrou na região correspondente aos segmentos 7,8 e 9. Estes achados são

compatíveis com a detecção de RV do grupo C .

48

49

6. DISCUSSÃO

Muitos estudos têm demonstrado a importância dos RV como causa de diarréia

em crianças menores de 5 anos de idade, tanto em países desenvolvidos como em

desenvolvimento (Linhares, 2000; Parashar et al., 2003). O presente estudo avaliou a

detecção de RV em amostras fecais coletadas de crianças apresentando quadro de

gastrenterite aguda, em um hospital público pediátrico (HGVF) do município de Niterói,

RJ. O HGVF é um hospital que atende não só a população de Niterói, mas também de

municípios vizinhos, o que reflete a amostragem deste estudo.

Através da EGPA foi possível detectar o genoma dos RV em 51 (37,5%) das 136

amostras fecais testadas. A escolha deste método para o diagnóstico laboratorial

baseou-se no fato que esta técnica permite a separação do genoma viral de outros

ácidos nucléicos nas fezes e a análise do perfil de migração dos segmentos de dsRNA

viral (Pereira et al., 1983a). Enquanto que os métodos imunológicos (ensaio

imunoenzimático, aglutinação em látex) são capazes de detectar somente os RV do gp

A, através da EGPA é possível detectar também os RV considerados atípicos (não

pertencentes ao gp A) ou RV do gp A que sofreram rearranjo genömico, como também

a ocorrência de infecções mistas (Pereira et al., 1983a).

Todas as 51 amostras positivas de crianças até 2 anos de idade foram

caracterizadas pela EGPA como RV do gp A apresentando perfil eletroforético longo.

Estes resultados estão em concordância com os obtidos por Cruz (2001) na cidade do

Rio de Janeiro, que ao analisarem 814 amostras fecais de casos de gastrenterite

50

aguda, com solicitação médica para pesquisa de RV, encontraram 155 amostras

positivas para RV do grupo A pela EGPA e todas apresentaram perfil eletroforético

longo.

Santos et al. (1998) ao analisarem 685 amostras fecais de crianças até 5 anos

de idade provenientes de laboratórios das cidades do Rio de Janeiro e Niterói,

encontraram um total de 100 amostras positivas para RV grupo A pela EGPA, sendo 78

com perfil eletroforético longo.

Vaz et al. (1999) e Araújo et al. (2002) estudando amostras fecais de crianças

com diarréia hospitalizadas na cidade do Rio de Janeiro, observaram, respectivamente,

que 70% e 81% das amostras de RV gp A caracterizadas pela EGPA apresentavam

perfil eletroforético longo. Resultados semelhantes (87% RV grupo A - perfil longo)

foram descritos por Teixeira et al. (1991) no Distrito Federal, ao testarem amostras

coletadas de crianças com diarréia atendidas no setor de emergência de dois hospitais

públicos da região.

Estudos realizados em outros estados brasileiros (Minas Gerais e Goiás) com

amostras fecais de crianças hospitalizadas e não hospitalizadas mostram também que

a maioria das amostras positivas de RV do gp A apresenta este perfil (Silva et al., 2001;

Cardoso et al., 2003).

A prevalência de diarréia aguda por RV varia de acordo com a faixa etária da

população estudada e o local de coleta das amostras. Estudos realizados no Brasil em

crianças até 5 anos de idade mostram uma prevalência de 12 a 48,5 %, dependendo se

as amostras foram obtidas em laboratórios clínicos, serviços de emergência ou de

crianças hospitalizadas (Coiro et al. 1983; Timenetsky et al., 1993; Pereira et al.,1994;

Bittencourt et al. 2000; Linhares, 2000; Silva et al. 2001; Cardoso et al. 2003; Costa,

2004).

51

Na cidade de Porto Alegre, RS, Bittencourt et al (2000), ao analisarem amostras

fecais de 603 crianças com GE até 5 anos, atendidas em um laboratório particular,

observaram uma prevalência de 16,4 % de positividade para RV. Em um estudo

anterior realizado na mesma região, Coiro et al. (1983) observaram uma positividade de

41,8%, mas o estudo não relata o local de coleta das amostras.

Costa et al. (2004) na cidade de Goiânia, GO, com 207 amostras de crianças

com gastrenterite aguda atendidas em pronto-socorros e enfermarias da região

relataram uma positividade para infecção por RV de 32,7%.

A alta positividade (37,5%) observada em Niterói provavelmente foi devido a

população alvo serem crianças com até 2 anos de idade atendidas em hospital público

pediátrico apresentando quadro de gastrenterite, época em que a diarréia grave por RV

requer maior número de hospitalizações (Kapikian et al., 2001).

Mata et al. (1983) relatam que a diarréia causada por RV ocorre mais

comumente em crianças menores de 2 anos de idade atingindo principalmente a faixa

etária de 9 – 12 meses. Um estudo realizado em Porto Alegre, Região Sul do país,

mostrou que as crianças de 7-18 meses foram as mais atingidas (Bittencourt et al.,

2000). Em Minas Gerais, Silva et al. (2001) ao analisarem 53 amostras positivas

observaram que 27,8% eram de crianças na faixa etária de 6-24 meses.

Teixeira et al. (1991) ao analisarem amostras fecais de crianças atendidas no

setor de emergência de dois hospitais no Distrito Federal, região Centro Oeste do

Brasil, detectaram amostras positivas para RV em todas as faixas etárias estudadas (0-

72 meses), apresentando maior índice de infecção entre as crianças de 6-24 meses

(27,7%). Neste mesmo estudo verificou-se que a positividade diminuiu

significativamente nas faixas etárias de 0 a 6 meses (10,8%) e entre crianças maiores

de dois anos (6,49%).

52

Ao estudar 134 amostras de crianças de 0-8 anos internadas em dois hospitais

públicos da cidade do Rio de Janeiro, Costa (2004) observou que 62% das amostras

coletadas eram de lactentes (0-12 meses).

Neste estudo, 50% das amostras coletadas (69/136) foram de crianças com até 6

meses de idade. Entre as 27 amostras positivas nesta faixa etária, 19 foram obtidas de

crianças hospitalizadas. Estes resultados estão em concordância com outros que

mostram que a diarréia por RV é mais observada em crianças hospitalizadas até 6

meses de idade (Barnes et al.,1998; Cardoso et al. 2003; Costa, 2004).

Nesta faixa etária (0-6 meses) as crianças estariam protegidas da ocorrência de

diarréia devido a presença de anticorpos maternos. Apesar do pequeno número de

amostras, tal fato não pode ser corroborado neste trabalho onde se observa que o

aleitamento não conferiu proteção contra a diarréia por RV, ainda que na faixa etária de

0-6 meses 70% das crianças estivessem sendo amamentadas (p=0,3046).

Ainda existem controvérsias sobre a importância do aleitamento na prevenção da

diarréia por RV (Zheng et al., 1991). Em um estudo anterior sobre o perfil etiológico das

diarréias agudas em crianças no município de São Paulo, Souza et al. (2002) não

observaram diferença significativa entre a utilização de leite materno e diarréia por RV.

Enquanto alguns estudos do Brasil mostraram um aumento de casos de RV nas

faixas etárias de 7-24 meses (Teixeira et al., 1991; Bittencourt et al., 2000; Silva et al.,

2001), estudos mais recentes mostram uma alta prevalência em crianças de 0-6 meses

(Cardoso et al., 2003; Costa, 2004). Entretanto estes estudos não apresentam dados

sobre aleitamento.

Variações na freqüência de infecções por RV em função da época do ano têm

sido relatadas tanto no Brasil como em outros países (Suzuki et al., 1981; Azeredo et

al.,1983; Coiro et al., 1983; Martella et al., 2003; Sánchez-Fauquier et al., 2004).

53

Na população estudada, observou-se um aumento do número de casos positivos

para RV entre Junho e Agosto, período de baixa pluviosidade e temperatura média. Os

nossos resultados estão em concordância com estudos anteriores realizados no Estado

do Rio de Janeiro e outros estados da Região Sul, Sudeste e Centro-Oeste que

também relatam a ocorrência de picos da infecção por RV nos meses mais frios e

secos de cada período estudado (Teixeira et al., 1991; Bittencourt et al. , 2000; Silva et

al. 2001; Araújo et al., 2002; Silva et al., 2002; Cardoso et al., 2003; Costa, 2004).

Estudos anteriores em países de clima temperado relatam que baixas

temperaturas influenciam diretamente a sobrevivência do vírus na natureza, assim

como a baixa umidade relativa do ar, coincidindo com nossos achados, reforçando a

influência da temperatura e índice pluviométrico na detecção de casos positivos (Moe &

Shirley, 1982).

Dados da literatura mostram que crianças com diarréia por RV apresentam com

maior freqüência outros sintomas como febre e vômito que crianças com diarréia

causada por outros patógenos. Estes sintomas podem ocorrer sozinhos ou em

combinação, resultando na hospitalização das crianças para tratamento (Mangia et al.,

1993; Araújo et al., 2002; Souza et al., 2002; Nguyen et al., 2004).

Nossos resultados mostram que vômito, febre e anorexia foram observados tanto

em crianças positivas como negativas para RV. Outros estudos realizados com

crianças hospitalizadas no Brasil já relatavam que a presença desses sinais clínicos

podem não ser indicativos da diarréia por RV (Mangia et al., 1993; Vaz et al., 1999;

Costa, 2004). Entretanto, a associação dos sinais clínicos (febre + anorexia e vômito +

febre + anorexia) foi observada em maior proporção em crianças positivas para RV do

que em crianças negativas. Mangia et al. (1983) também relataram que vômito e febre

associados estavam presentes em 50% das crianças hospitalizadas com diarréia por

RV no Rio de Janeiro. Nguyen et al. (2004) ao estudarem crianças hospitalizadas no

Vietnam também observaram que a combinação destes sinais era mais freqüente em

crianças com RV.

54

No presente estudo sinais respiratórios (coriza, tosse, pneumonia) foram

observados em crianças com diarréia por RV. Vários trabalhos realizados com crianças

hospitalizadas mostram que é comum crianças com diarréia por RV apresentarem estes

sintomas. Isto pode ser facilmente explicado já que o aumento de diarréia aguda por

RV é observada na época mais seca do ano, o que coincide com o aumento do número

de casos de infecções respiratórias (Mangia et al., 1993; Araújo et al., 2002; Costa,

2004). Em Niterói, o aumento de diarréia aguda por RV na época mais seca coincidiu

com o aumento do número de infecções do trato respiratório nas crianças atendidas no

HGVF.

Os estudos realizados no Brasil para a caracterização dos genótipos de RV do

gp A circulantes mostram que, semelhante a outros países, os genótipos G1, G2, G3 e

G4 associados com genótipos P[8] e P[4] são os mais comumente detectados em

amostras fecais de crianças com diarréia. Entretanto, a epidemiologia dos genótipos

circulantes no Brasil apresenta algumas características peculiares: (a) há uma grande

diversidade de genótipos G e P circulando simultaneamente; (b) observa-se

freqüentemente a ocorrência de genótipos G e P incomuns, assim como combinações

G-P incomuns; (c) uma grande proporção de infecções mistas que parecem facilitar o

rearranjo genético entre as amostras e subseqüentemente o aparecimento de novas

combinações G-P (Gouvea et al.,1994; Leite et al.,1996; Mascarenhas et al., 1998;

Araújo et al., 2001; Santos et al., 2001; Mascarenhas et al., 2002).

Em um estudo anterior realizado também com crianças hospitalizadas menores

de 5 anos de idade na cidade do Rio de Janeiro no período de 1996 a 1998, Araújo et

al. (2002) detectaram os genótipos comuns de RV do gp A nas seguintes proporções:

G1 (18,0%), G2 (34%), G3 (15%) e G4 (9%). Entre os genótipos incomuns o G5 foi

detectado em 11% e G9 em 8% das amostras.

Ao analisarem amostras de crianças com diarréia menores de 5 anos de idade,

coletadas no período de março de 1997 a dezembro de 1999, das cidades do Rio de

55

Janeiro e Niterói, Santos et al. (2001) detectaram G1 (30%), G2 (14%), G3 (10,2%), G4

(1,9%) e G9 (12,1%), e o genótipo G5 não foi detectado.

Em Juiz de Fora, Minas Gerais, no período de Janeiro de 1998 a Dezembro de

1999, Silva et al. (2002) analisando amostras oriundas de crianças hospitalizadas

detectaram G1 (27%), G3 (60%), G4 (5%), G8(20%) e G9(8%).

Souza et al. (2003), estudando amostras obtidas de crianças até 5 anos de idade

em Goiânia durante 1998-2000, relataram a detecção do genótipo G1 em 76,6% das

amostras, G2 e G9 em 5% das amostras e G3 foi detectado em apenas 0,8%.

Na Itália, Martella et al. (2003), no período de março de 2001 a junho de 2002, ao

analisarem amostras de crianças até 5 anos de idade atendidas com diarréia aguda em

hospital detectaram a presença de G9 em 53% dos casos de diarréia por RV, seguido

de G1 (40%).

Na Espanha, RV foi detectado em 31% das amostras diarreicas testadas de

crianças hospitalizadas até 5 anos de idade, sendo que G1 foi o principal genótipo

detectado (53%), seguido por G4 (24%), G2 (14 %), G9 (6%) e G3 (2%) (Sanchez-

Franquier et al., 2004).

Utilizando as técnicas de RT-PCR e Nested-PCR foi possível determinar os

genótipos G em 82,5% (42/51), das amostras fecais de crianças de 0-2 anos com

diarréia, o que está em concordância com outros estudos que mostram que a faixa de

caracterização do genótipo G varia de 73,3% a 89% das amostras analisadas (Araújo et

al., 2002; Mascarenhas et al., 2002; Souza et al., 2003; Costa et al., 2004).

Neste estudo, o genótipo G1 foi detectado em aproximadamente 70% das

amostras enquanto em torno de 20% foi detectado G9. Costa (2004) estudando

crianças até 8 anos com diarréia internadas em dois hospitais municipais da cidade do

Rio de Janeiro durante o ano de 2004 detectou apenas os genótipos G1 e G9 em 57%

56

e 40%, respectivamente, das amostras fecais obtidas de fevereiro a setembro de 2004.

Da mesma forma que neste estudo, não houve a detecção dos genótipos G2, G3, G4

ou G5.

A detecção do genótipo G9 é de grande importância, pois este genótipo tem sido

o foco de um grande número de estudos que vêm colocando-o, juntamente, com G1,

G2, G3 e G4, como de alta prevalência em diversos países do mundo, podendo ser o

quinto genótipo mais importante epidemiologicamente (Araújo et al., 2001; Banyai et al.,

2004; Castelo et al., 2004; Santos & Hoshino, 2005).

Apesar da tipagem de P ter sido realizada em apenas 11,85% (6/51) das

amostras, todas foram caracterizadas como P[8] em combinação com genótipo G1. Em

âmbito global, P[8]G1 destaca-se como a combinação mais prevalente (Linhares, 2000;

Castelo et al., 2004; Santos & Hoshino, 2005). Entretanto devido ao baixo número de

amostras tipadas é difícil discutir se esta combinação será a mais detectada neste

estudo.

Alguns fatores importantes devem ser considerados em relação às amostras não

tipadas: (a) a ausência de amplificação não é conseqüência da ausência de dsRNA,

visto que a EGPA foi positiva; (b) quando ocorre amplificação e caracteriza-se somente

um dos genótipos (G ou [P]), a presença de inibidores no dsRNA extraído deve ser

descartada. Assim sendo, pode-se ainda sugerir que os genótipos incomuns não

identificados estejam circulando na região.

A RT-PCR seguida de Nested-PCR com iniciadores específicos, representam

técnicas extremamente sensíveis e adaptáveis na identificação de genótipos incomuns

e emergentes. A ocorrência de amostras não tipáveis pode ser ainda atribuído a

variações de seqüências de nucleotídeos da região dos iniciadores, impossibilitando

uma amplificação adequada, podendo tais amostras ser consideradas variantes

genotípicas (Araújo, 2001). Porém neste estudo há evidências que sugerem que a

genotipagem para [P] não foi possível de se realizar devido a problemas com os

iniciadores.

57

Os estudos de epidemiologia molecular das rotaviroses no Brasil assumem

grande importância devido a flutuação observada na circulação dos genótipos comuns

e incomuns de RV do gp A. Por exemplo, Gouvea et al. (1994), demonstraram a

ocorrência do genótipo G5 em crianças com diarréia em São Paulo. A freqüência de

diarréia por RV G5 aumentou progressivamente até 1996. Após 1996 observou-se a

diminuição dos casos atribuídos a G5 e a emergência do genótipo G9 no Brasil (Alfieri

et al. 1996; Santos et al., 1998, 2001; Araújo et al., 2001).

Os RV do gp A são considerados os principais agentes de diarréia grave em

crianças de 0-5 aos em todo o mundo. Sabe-se que somente uma vacina pode reduzir

o número de hospitalizações causadas pela infecção por estes vírus (Linhares, 2000;

Parrashar et al., 2003; Glass et al., 2005).

Atualmente, uma vacina monovalente humana com especificidade G1P[8]

(RotaRix ® , Glaxo Smith Kline) está disponível no Brasil e será incluída no Programa

Nacional de Imunização no próximo ano. Os estudos longitudinais realizados

mundialmente mostram que este genótipo é detectado em mais de 50% dos casos de

primoinfecção por RV (Linhares, 2000; Castelo et al., 2004; Gentsch et al., 2005;

Santos & Hoshino, 2005). Estudos conduzidos na América Latina (México, Brasil e

Venezuela) demonstraram a eficácia da vacina na proteção contra diarréia causada

pelos genótipos G1 e G9 de RV do gp A (Salinas et al., 2005).

O monitoramento dos genótipos dos RV circulantes continuará sendo de grande

importância, pois os resultados de um estudo com RV bovino no Brasil mostraram que

embora uma vacina monovalente P[8]G6 inativada tenha produzido uma boa proteção

de caráter homotípico, ela não protegeu os animais da infecção por RV de diferentes

genótipos. Além disso, o aumento no título de anticorpos contra certos genótipos

endêmicos na população animal contribuíram para o aparecimento de amostras com

rearranjo genômico (Barreiros et al., 2004).

58

Relatos prévios de Pacini et al. (1987) e Welliver & McLaughlin (1984) tem

documentado que RV e adenovírus são as causas mais comuns de diarréia nosocomial

em crianças. No Norte do país, Gusmão et al. (1999) verificaram que entre 237 crianças

admitidas em um hospital público da região, 1/3 das GE desenvolvidas no curso da

internação era causada por RV, mostrando a transmissibilidade desses agentes no

ambiente hospitalar. Alguns estudos mostram casos de infecção nosocomial por RV

concomitante ao aumento do número de casos de diarréia por RV na comunidade,

sendo que as cepas virais circulantes nas enfermarias refletem aquelas encontradas no

meio externo ao hospital (Gusmão et al., 1995, 1999; Linhares et al., 2002; Costa,

2004).

Em nosso estudo 10 crianças hospitalizadas com pneumonia não estavam

apresentando diarréia no momento da internação. Estas crianças após receberem

cuidados médico-hospitalares na mesma enfermaria em que se encontravam crianças

com diarréia, tornaram-se positivas para RV. Estes dados estão em concordância com

outros que também relatam que a transmissão nosocomial de RV em crianças

admitidas em hospital estava associada ao fato da criança ter um companheiro de

quarto positivo para RV (Pacini et al., 1987; Gusmão et al., 1995, 1999; Linhares et al.,

2002; Costa, 2004).

Os companheiros de quarto infectados parecem não ser a única fonte de

transmissão direta da infecção nosocomial e a transmissão por outras vias (fômites,

equipe médico-hospitalar ou talvez transmissão respiratória) podem facilitar a

disseminação. Sabe-se que os RV podem permanecer viáveis em pequenas partículas

em suspensão no ar (Moe & Harper,1983), o que favoreceria a disseminação do vírus

pelas correntes de ar. Ainda, aerossóis podem ser gerados durante a troca de fraldas

de crianças o que facilitaria a transmissão hospitalar (Teixeira et al., 1991).

Os RV do gp A são os mais importantes epidemiologicamente (Linhares, 2000;

Parrashar et al., 2003). A seguir, os RV do gp C, tem sido os mais detectados

59

causando infecções em suínos e humanos e quase sempre relacionados a casos

graves de diarréia (Alfieri, 1996).

Os RV do gp C foram primeiro isolados de suínos com diarréia nos Estados

Unidos e foram identificados como patógenos humanos por Bridger et al. (1986). O

primeiro relato de identificação de RV gp C no Brasil foi realizado por Pereira et al.

(1983b) em espécime fecal de criança com gastrenterite no Rio de Janeiro. Desde

então, RV gp C tem sido reportado em fezes de crianças e adultos em outras regiões

do país, incluindo São Paulo, Santa Catarina, Belém, Brasília e Rio de Janeiro (Gabbay,

et al.,1989, 1999; Pereira et al., 1993; Teixeira et al., 1998).

A maioria dos casos humanos apresentam-se sob foram esporádica porém,

surtos já foram relatados na Inglaterra, Japão e mesmo no Brasil (Alfieri, 1996; Gabbay

et al., 1999).

Neste estudo, uma das seis amostras positivas para RV, obtida de crianças

maiores de dois anos de idade, foi caracterizada como pertencente ao grupo C pela

EGPA. Esta amostra foi obtida de uma criança em setembro de 2003 residente em

Niterói. Na mesma época foram observados RV do gp C em 7 amostras no Rio de

Janeiro e da Bahia, coletadas também em 2003. Desde 1992, não se descrevia a

detecção de RV do gp C no Rio de Janeiro (Leite, J.P.G. comunicação pessoal).

É provável que a ocorrência da infecção por RV do gp C seja subestimada, pois

os métodos utilizados na maioria dos laboratórios clínicos para diagnóstico das

rotaviroses só detectam RV do gp A, e a técnica de EGPA é restrita aos laboratórios de

pesquisa. Portanto, estudos futuros são necessários para se conhecer a epidemiologia

destes vírus nas infecções humanas, já que estes RV são patógenos primários de

suínos (Gabbay et al., 1999).

60

7. CONCLUSÔES

1. RV do grupo A com perfil eletroforético longo foi detectado pela PAGE em 51/136

(37,5%) das crianças de 0-2 anos de idade atendidas no HGVF em Niterói

durante Abril a Dezembro de 2003.

2. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a positividade para RV e

o sexo dos pacientes, local de coleta das amostras (emergência ou enfermaria),

faixa etária e aleitamento.

3. A proporção de casos positivos para RV de junho a setembro foi

significativamente maior que de abril a maio (p=0,0149), correspondendo a

época mais fria e seca do período estudado.

4. A presença de vômito, febre e anorexia podem não ser indicativos da infecção

por RV, entretanto a associação dos sinais clínicos (febre + anorexia e vômito +

febre + anorexia) foi observada em maior proporção em crianças positivas do

que naquelas negativas para RV.

5. Utilizando a RT-PCR e Nested-PCR, o genótipo G pode ser determinado em

42/51 amostras (82,4%), sendo 32/51 (62,7%) amostras caracterizadas como G1

e 10/51 (19,6%) como G9.

61

6. Somente 6 amostras foram genotipadas para P até o momento, e todas foram

caracterizadas como P[8]. Portanto, a classificação binária completa só pode ser

determinada para 6 amostras: P[8]G1.

7. A transmissão nosocomial de RV pode ser verificada em 10 crianças internadas

com pneumonia.

8. RV do grupo C pode ser detectado na amostra fecal de uma criança maior de 2

anos de idade com diarréia.

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9. ANEXO 1

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78

10. Anexo 2

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