Metode analisis mikrobiologimolekuler

Marlia Singgih Wibowo

Peristiwa alam!

Kasus keracunan…

Hepatitis kronis!

Uji /analisis mikrobiologi molekuler

• Tingkat molekul genetik DNA• Analisis kualitatif• Analisis kuantitatif

Struktur DNA

DNA, yang DNA, yang menyusunmenyusunkromosomkromosom, , terdiriterdiri daridari2 helix yang 2 helix yang salingsalingberpilinberpilin, , tersusuntersusun daridarirantairantai nukleotidanukleotida, , setiapsetiap rantairantai tersusuntersusundaridari gulagula deoksiribosadeoksiribosa, , fosfatfosfat, , dandan basabasanitrogen. nitrogen. AdaAda 4 4 jenisjenisbasabasa yang yang berbedaberbeda, , AdeninAdenin, Thymine, , Thymine, Cytosine, Cytosine, dandanGunanineGunanine..

Proses molekular dalam sel

•• ReplikasiReplikasi•• TranskripsiTranskripsi•• TranslasiTranslasi

Prinsip aktivitas molekuler dalam sel

denaturasi

DNA

Proses translasi rantai mRNA, adalah untuk membawa informasi genetik, dari nukleus ke sitoplasma, dimana rantai mRNA menempelpada ribosom untuk pembentukan protein

Basa nitrogen pada mRNA dikelompokkan menjadi 3, dikenalsebagai kodon. Pembacaan mRNA oleh tRNA pada ribosom dikenalsebagai translasi. Suatu rantai asam amino yang spesifik terbentukoleh tRNA mengikuti kode yang telah ditentukan oleh mRNA. Rantai basa dari mRNA telah diterjemahkan menjadi susunan asamamino yang berikatan bersama-sama untuk membentuk protein

3 basa tidak berpasanganyang berikatan denganasam amino spesifik, dikenal sebagai anti kodon berpasangandengan basakomplementer (kodon) pada mRNA

• Analisis molekuler :– Hibridisasi– Amplifikasi

Teknik hibridisasi• Proses denaturasi dsDNA menjadi

ssDNA menggunakan pemanasan• Kombinasi ssDNA tersebut dengan

suatu segmen ssDNA lain yang telah diberi probe (label)

• Hibrid DNA yang telah mengandunglabel dapat dideteksi dengan berbagaicara

Teknik amplifikasi• PCR (polymerase chain reaction) : reaksi

polimerisasi berantai• DNA target didenaturasi menggunakan

panas• Pelekatan primer (suatu oligonukleotida

pendek) yang komplemen dengan salahsatu ujung ssDNA

• Sintesis DNA yang diawali dari primer• Proses pengulangan 20 – 50 x

Proses PCR

3’ 5’3’5’

Denaturasi pada 94 °C

3’5’

3’ 5’

3’ 5’

3’5’

Annealing primer pd 72 °C

3’ 5’

3’5’Polimerisasipada 72 °C

3’5’

3’ 5’ dsDNA baru

dsDNA baru

Proses berulang

Denaturasi

Annealing

Polimerisasi

Proses setelah PCR• Setelah pengulangan 20 – 50 x

diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat di deteksi

• Produk PCR dapat dideteksi denganelektroforesis

• Pita-pita DNA dibandingkan denganmarker DNA

DNA marker Produk PCR

Instrumen dan Bahan untuk analisisPCR

• DNA Thermal cycler• DNA target• Primer• DNA polimerase• Nukleotida• Larutan Mg 2+

• Alat Elektroforesis

Aplikasi PCR• Penelitian dalam bidang biologi• Diagnosis mikroba patogen• Analisis forensik• Kajian bioinformatik

• PCR digunakan untuk studi gene function, gene mapping, dan evolusi.

• Gene-function research menggunakan PCR untuk memperoleh kopi2 individual genes, aktivitasnya dipelajari dan diteliti.

• Gene mapping (pada Human Genome Project) menggunakan PCR utk membuatkopi bagian2 human DNA.

• Hasil PCR dipelajari untuk mengkaji genetic diseases, mis. cystic fibrosis

• Studi evolusi• PCR digunakan untuk prenatal testing pada

kemungkinan adanya genetic diseases. • Sampel DNA diperoleh dari fetus dengan

cara amniocentesis, yaitu sejumlah sample cairan ketuban ibu hamil di uji dengan PCR hanya dalam waktu beberapa jam saja