METODE BIOLOGI MOLEKULER

Tim Penulis: Miftahul Jannah, Nila Kartika Sari, Miftahul Mushlih, Muhammad Rifqi Hariri,

Priyambodo, Rina Hidayati Pratiwi, Dwi Sendi Priyono, Yana Rubiyana, Pratiwi Prananingrum, Dwi Anggorowati Rahayu, Sapto Andriyono, Mo Awwanah.

Desain Cover:

Dwi Sendi Priyono

Tata Letak: Aji Abdullatif R

Proofreader: N. Rismawati

ISBN:

978-623-6457-01-6

Cetakan Pertama: Agustus, 2021

Hak Cipta 2021, Pada Penulis

Hak Cipta Dilindungi Oleh Undang-Undang

Copyright © 2021 by Penerbit Widina Bhakti Persada Bandung

All Right Reserved

Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari Penerbit.

PENERBIT:

WIDINA BHAKTI PERSADA BANDUNG (Grup CV. Widina Media Utama)

Komplek Puri Melia Asri Blok C3 No. 17 Desa Bojong Emas Kec. Solokan Jeruk Kabupaten Bandung, Provinsi Jawa Barat

Anggota IKAPI No. 360/JBA/2020

Website: www.penerbitwidina.com Instagram: @penerbitwidina

iii

Alhamdulillahirobbil’alamin dengan terselesaikannya penulisan dan penyusunan buku Metode Biologi Molekuler ini semoga dapat mendukung khasanah keilmuan dibidangnya. Perkembangan dan pemanfaatan biologi molekuler saat ini sangat pesat. Kajian biologi molekuler berperan penting dalam menjawab pertanyaan di berbagai bidang ilmu seperti pangan (pertanian dan perikanan), kesehatan (farmasi dan kedokteran), forensik, energi, lingkungan dan lain-lain termasuk dalam pengelolaan keanekaragaman hayati di Indonesia. Buku ini membahas beberapa metode dan aplikasinya di beberapa bidang melalui pendekatan pengembangan biologi molekuler. Buku ini terdiri dari 12 bab yang menjelaskan sejarah, pemanfaatan dan berbagai metode Biologi Molekuler terkini. Dua bab pertama mendeskripsikan tentang perkembangan Biologi Molekuler dan pemanfaatannya. Bab selanjutnya menjelaskan tentang berbagai metode terkini dalam bidang Biologi Molekuler, di antaranya: RAPD, RFLP, microsatellite, SNP, multipleks PCR, sekuensing, Reverse Transcription, real time-PCR, DNA barcode, e-DNA, dan CRISPR-Cas9. Setiap Bab dalam buku ini ditulis oleh para peneliti yang menguasai teknik tersebut dengan baik, sehingga dapat memberi gambaran yang komprehensif dan mendalam.

Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki Megabiodiversitas hayati di dunia, dengan demikian penelitian mengenai observasi dan inventarisasi keanekaragaman hayati sangatlah penting dalam konservasi dan pengelolaan sumber daya alam. Marka molekuler merupakan salah satu metode yang efektif dalam penelitian keanekaragaman genetik. Mikrosatelit atau simple sequence repeat (SSR), PCR-RAPD, PCR-RFLP adalah marka molekuler yang banyak diaplikasikan dalam identifikasi keanekaragaman genetik. Selain itu, teknologi DNA Barcoding memberikan alternatif cepat dan tepat dalam identifikasi makhluk hidup lokal dan Endemik Indonesia yang sudah maupun belum terdeskripsikan. Penelitian biodiversitas dalam skala besar dapat dilakukan

KATA PENGANTAR

iv

dengan aplikasi DNA lingkungan (eDNA). eDNA merupakan metode baru dalam penelitian keanekaragaman hayati. Sampel DNA dapat diambil dari lingkungan (air, tanah, dan udara) tanpa memerlukan tanda yang jelas dari sumber biologis. Kajian metabarcoding untuk menduga DNA yang tersebar di lingkungan (air, tanah dan udara) memberikan harapan kajian biodiversitas yang semakin efisien dan biaya yang relatif lebih rendah dibandingkan dengan survei tradisional. Aplikasi DNA lingkungan (eDNA) menggabungkan para ilmuwan ekologis, dan bioinformatik untuk bersama-sama terus mengembangkan metode yang lebih efektif dalam pengelolaan sumberdaya alam.

Penemuan PCR dan sekuensing berperan besar dalam perkembangan riset genetika dan biologi molekuler. Saat ini teknik PCR dan sekuensing telah berkembang pesat. Metode multipleks PCR memungkinkan amplifikasi beberapa sekuens menggunakan beberapa pasang primer dalam satu reaksi. Teknik multipleks PCR dapat menghemat waktu dan reagen. Aplikasi multipleks PCR dapat kita lihat secara nyata dalam diagnosis pasien Covid-19. Selain itu, revolusi metode deteksi urutan sekuen nukleotida melalui sekuensing memungkinkan deteksi mutasi virus Covid-19 yang sangat cepat. Awalnya sekuensing berkembang dari metode sanger dan maxam-gilbert, teknik ini telah berkembang menjadi next generation sequencing. Prinsip dan aplikasi teknologi sekuensing ini dapat dibaca dengan lebih jelas di buku ini.

Penemuan enzim reverse transkriptase oleh Termine dan Baltimore pada tahun 1970 merupakan cikal bakal berkembangnya reverse transcription secara in vitro. Teknik Reverse Transcription memanfaatkan enzim transkriptase untuk transkripsi balik RNA menjadi DNA. Aplikasi teknik reverse transcription dan real time-PCR dikenal luas di tengah mewabahnya virus SARS-CoV-2 saat ini. Namun demikian, aplikasi reverse transcription dan real time-PCR tidak terbatas pada analisis diagnosis Covid-19 saja, prinsip dan aplikasi reverse transcription dan real time-PCR dalam berbagai bidang dapat dibaca dalam buku ini.

Bab terakhir dari buku ini akan membahas secara detail tentang prinsip dan aplikasi CRISPR-Cas9, mulai dari sejarah penemuan dan klasifikasi sistem CRISPR, prinsip kerja CRISPR-Cas9 baik sebagai mekanisme imunitas adaptif pada organisme prokariotik maupun sebagai

v

alat dalam metode genome editing, serta aplikasi CRISPR-Cas9 khususnya pada pengeditan genom tumbuhan. Untuk memahami lebih detail tentang CRISPR-Cas9, pembaca dapat mempelajarinya pada bab terakhir dari buku ini.

Buku ini tidak akan hadir tanpa kontribusi dan komitmen berbagai pihak. Kami berterima kasih pada para reviewers karena telah memberikan kritik dan saran yang sangat berharga. Kami berterimakasih pada tim penerbit yang tidak lelah untuk mengkoordinasi dan menampung aspirasi kami. Terimakasih secara khusus pada guru-guru kami, mahasiswa kami, kolega kami, keluarga, dan orangtua kami yang selalu memberikan dukungan agar kami senantiasa berkontribusi positif bagi perkembangan pendidikan dan sains di Indonesia.

Kami berharap bahwa kita semua dapat menikmati membaca buku ini!

Penulis

vi

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ············································································· iii DAFTAR ISI ························································································ vi BAB 1 PENGENALAN DAN PERKEMBANGAN BIOLOGI MOLEKULER ·······1

A. Pengenalan dan sejarah biologi molekuler ·································· 1 B. Prinsip kerja biologi molekuler ····················································· 3 C. Aplikasi biologi molekuler ·························································· 13 D. Rangkuman materi ····································································· 14

BAB 2 PEMANFAATAN BIOLOGI MOLEKULER ····································· 19 A. Pendahuluan ··············································································· 19 B. Pemanfaatan biologi molekuler dalam bidang kesehatan ······· 21 C. Pemanfaatan biologi molekuler dalam bidang pertanian ········· 24 D. Pemanfaatan biologi molekuler dalam bidang peternakan ······ 30 E. Pemanfaatan biologi molekuler dalam bidang perairan ··········· 33 F. Pemanfaatan biologi molekuler dalam bidang ekologi ············· 36 G. Rangkuman materi ····································································· 38

BAB 3 PRINSIP DAN APLIKASI PCR-RAPD DAN PCR-RFLP ····················· 43 A. Pengantar ·················································································· 43 B. Prinsip metode PCR-RAPD dan PCR-RFLP ··································· 45 C. Kelebihan PCR-RAPD dan PCR-RFLP ·········································· 50 D. Kekurangan PCR-RAPD dan PCR-RFLP ········································ 51 E. Pengembangan penggunaan PCR-RAPD dan PCR-RFLP ············· 52 F. Aplikasi PCR RAPD dan PCR-RFLP ··············································· 54 G. Rangkuman materi ····································································· 57

BAB 4 PRINSIP DAN APLIKASI METODE MICROSATELLITE ··················· 65 A. Pendahuluan ············································································· 65 B. Pengenalan metode microsatellite ············································· 66 C. Prinsip metode microsatellite ····················································· 67 D. Aplikasi metode microsatellite ··················································· 70 E. Rangkuman materi ····································································· 74

BAB 5 PRINSIP DAN APLIKASI METODE SNP ······································· 79 A. Pendahuluan ············································································· 79 B. Definisi single nucleotide polymorphisms (SNP) ························· 80

vii

C. Urgensi studi SNP pada bidang biologi ······································· 81 D. Metode analisis SNP ··································································· 82 E. Studi kasus SNP pada manusia ··················································· 84 F. Studi kasus SNP pada hewan ······················································ 85 G. Studi kasus SNP pada tumbuhan ················································ 86 H. Rangkuman materi ····································································· 87

BAB 6 PRINSIP DAN APLIKASI METODE MULTIPLEKS PCR ··················· 93 A. Pengertian metode multipleks PCR ············································ 93 B. Prinsip metode multipleks PCR ·················································· 95 C. Aplikasi metode multipleks PCR ················································· 99 D. Keunggulan dari metode multipleks PCR ································· 105 E. Rangkuman materi ··································································· 107

BAB 7 PRINSIP DAN APLIKASI METODE DNA SEQUENCING ··············· 111 A. Pendahuluan ············································································· 111 B. Prinsip dan metode-metode sekuensing DNA ························· 113 C. Penerapan sekuensing DNA ····················································· 130 D. Rangkuman materi ··································································· 132

BAB 8 PRINSIP DAN APLIKASI REVERSE TRANSCRIPTION ·················· 137 A. Pengenalan metode reverse transcription ······························ 137 B. Prinsip dasar reverse transcription ··········································· 138 C. Aplikasi reverse transcription ··················································· 147 D. Rangkuman materi ··································································· 152

BAB 9 PRINSIP DAN APLIKASI METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) ························································ 157 A. Pengenalan metode ·································································· 157 B. Prinsip kerja metode ································································ 160 C. Aplikasi metode ········································································ 171 D. Rangkuman materi ··································································· 173

BAB 10 PRINSIP DAN APLIKASI DNA BARCODE ································· 179 A. Pendahuluan ············································································ 179 B. Pengertian teknologi DNA barcoding dalam sistematika

Molekuler ················································································· 180 C. Prinsip kerja DNA barcoding ····················································· 184 D. Metode analisis DNA barcoding ··············································· 186 E. Studi kasus terkini DNA barcoding pada hewan ······················ 188

viii

F. Rangkuman materi ··································································· 194 BAB 11 PRINSIP DAN APLIKASI eDNA ··············································· 201

A. Pengenalan metode ·································································· 201 B. Sejarah singkat aplikasi eDNA dalam kegiatan konservasi ······· 202 C. Memahami ekologi DNA lingkungan ······································· 203 D. Kondisi eDNA ··········································································· 205 E. Dinamika perubahan eDNA secara fisik dalam lingkungan ······ 206 F. Faktor yang berperan terhadap keberadaan eDNA ················· 207 G. Tahap pengujian : metode dan prinsip kerja identifikasi

berbasis molekuler melalui DNA lingkungan ···························· 208 H. Aplikasi DNA lingkungan dalam pendugaan biodiversitas ikan 211 I. Rangkuman materi ··································································· 214

BAB 12 PRINSIP DAN APLIKASI CRISPR-Cas9 ····································· 221 A. Pengenalan CRISPR-Cas9 ·························································· 221 B. Prinsip kerja CRISPR-Cas9 ························································· 227 C. Aplikasi CRISPR-Cas9 pada pengeditan genom tumbuhan ······ 236 D. Rangkuman materi ··································································· 261

GLOSARIUM ··················································································· 275 PROFIL PENULIS ·············································································· 285

PENGENALAN DAN PERKEMBANGAN BIOLOGI MOLEKULER

Miftahul Jannah, S.Si., M.Sc Prodi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam As-Syafiiyah

A. PENGENALAN DAN SEJARAH BIOLOGI MOLEKULER Sejarah biologi molekuler dimulai pada tahun 1930-an dengan

pertemuan berbagai disiplin ilmu biologi dan fisika beserta cabang ilmu lainnya seperti biokimia, genetika, mikrobiologi, virologi dan fisika. Biologi molekuler berperan dalam memahami kehidupan pada tingkat yang paling mendasar.

Biologi molekuler adalah cabang ilmu biologi yang mempelajari dasar molekuler dari aktivitas biologi di dalam dan di antara sel, termasuk sintesis, modifikasi, mekanisme dan interaksi molekuler (Albert et al., 2014; Gannon, 2002). Dogma utama biologi molekuler menjelaskan proses di mana DNA ditranskripsikan menjadi RNA, kemudian diterjemahkan (translasi) menjadi protein (Michael, 2015).

Biologi molekuler mencoba menjelaskan fenomena kehidupan yang dimulai dari sifat makromolekul yang menghasilkannya. Dua kategori makromolekul khususnya yang menjadi fokus ahli biologi molekuler yaitu:

Pengenalan dan Perkembangan Biologi Molekuler | 15

DAFTAR PUSTAKA

Albert B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, and Walter P. (2008). Molecular Biology of the Cell. Garland Science, taylor & Francis Group. New York. p : 233-239.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P (2014). Molecular Biology of the Cell, Sixth Edition. Garland Science. pp. 1–10. ISBN 978-1-317-56375-4.

Avery, Oswald T.; Colin M. MacLeod; Maclyn McCarty (1944). "Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types: Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus Type III". Journal of Experimental Medicine. 79 (2): 137–158. doi:10.1084/jem.79.2.137. PMC 2135445. PMID 19871359

Ausubel, F. M., Roger B., Robert E. K., David D. M., J.G. Seidman, John A. S., & Kevin S. (2003). Current Protocols in Molecular Biology. USA: John Wiley & Sons, Inc.

Brown, T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis: An introduction. Blackwell Publishing, Ltd. West Sussex.

Campbell, N.A., J.B. Reece, and L.G. Mitchell. (1999). Biologi. Edisi Kelima. Penerbit Erlangga. Jakarta. pp : 221-231.

Campbell, M. K. and Farrel, Shawn F. (2009). Biochemistry. USA: Thomson Brooks/Cole. pp. 459-467.

Dale, J. W. & von Schantz, M. (2007). From Genes to Genomes. John Wiley & Sons Ltd. West Sussex.

Gannon F (2002). "Molecular biology--what's in a name?". EMBO Reports. 3 (2): 101. doi:10.1093/embo-reports/kvf039. PMC 1083977. PMID 11839687

Gilbert, H. F. (2000). Basic Concepts in Biochemistry. USA: The McGraw-Hill Companies, Inc. pp 76-79.

Hershey, A.D. and Chase, M. (1952) "Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage" J Gen Physiol.

Holme, D. J. & Hazel P. (1998). Analytical biochemistry .England : Pearson Education Limited

16 | Metode Biologi Molekuler

Jacob F, Monod J (1961). "Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins". J Mol Biol. 3 (3): 318–356. doi:10.1016/S0022-2836(61)80072-7. PMID 13718526

Jeremy (2002). Biochemistry. Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert (5th ed.). New York: W.H. Freeman. ISBN 0-7167-3051-0. OCLC 48055706

Križman, M., J. Jakše, D. Baričevič, B. Javornik, M. Prošek. (2006). Robust CTAB activated charcoal protocol for plant DNA extraction. Acta agriculturae Slovenica, 87 – 2.

Karp, Gerald. (2008). Cell and Molecular Biology. New York: John Willey & Sons, Inc. pp. 567-573.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2000). Molecular cell biology (4th ed.). New York: Scientific American Books. ISBN 978-0-7167-3136-8.

Lodish, H. et al. (2003). Molecular Cell Biology, 5th ed. WH Freeman & Co. Martin, Robin. (1996). Gel Electrophoresis: Nucleic Acids. UK: BIOS

Scientific Publishers Limited. pp. 11-27. McPherson, Michael J. and Simon G. Møller. (2006). PCR, 2nd ed. USA:

Taylor & Francis Group. pp. 1-22. Miesfeld, Roger L. (1999). Applied Molecular Genetics. New York: John

Willey & Sons, Inc.pp. 57-68. Moyo, M., Amoo, S.O., Bairu, M.W., Finnie, J.F., & Van Staden, J. (2008).

Optimising DNA isolation for medicinal plants. South African Journal of Botany 74: 771–775.

Reinhart, C.A. (2005). Molecular Genetics - Biology 495: Hybridization Experiment. http://bioweb.wku.edu/courses/biol495G/DNA1/Hybrid ization9.html. Diakses tanggal 2 Juni 2012.

Solomon. (2008). Biology 8th ed. USA: Thomson Brooks/Cole. pp. 261-265. Surzycki, S. (2000). Basic techniques in molecular biology. Springer-Verlag

Publishing. Berlin. Switzer. (1999). Experimental Biochemistry. Oxford: Blackwell Scientific

Pub. pp. 301-385. Varma, A., Padh, H., & Shrivastava, N. (2007). Plant genomic DNA

isolation: An art or a science. Biotechnology Journal 2: 386–392

Pengenalan dan Perkembangan Biologi Molekuler | 17

Watson J.D.; Crick F.H.C. (1953). "A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid" (PDF). Nature. 171 (4356): 737–738. Bibcode:1953Natur.171..737W. doi:10.1038/171737a0. PMID 13054692. Retrieved 13 Feb 2007.

Widyatmoko, A.P.B.C. 2020. Aplikasi Genetika Molekuler Untuk Konservasi Genetik Tumbuhan Hutan Tropis Terancam Punah. Bogor: PT Penerbit IPB Press.

Wilson, Keith and Walker, John. (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology 7th ed. New York: Cambridge University Press. pp. 178-186.

Yuwono, Triwibowo. (2006). Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: CV. Andi Offset. pp. 1-2.

PEMANFAATAN BIOLOGI MOLEKULER

Nila Kartika Sari, S.Si., M.Si IKIP Budi Utomo Malang

A. PENDAHULUAN

Perkembangan awal Biologi molekuler dimulai dengan penemuan model struktur DNA oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953. DNA merupakan materi genetik yang tersusun dari gula pentose (deoksiribosa), gugus fosfat, dan basa nitrogen. Basa Nitrogen penyusun DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa Purin terdiri atas adenin (A) dan Guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan Timin (T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Satu komponen pembangun (Building block) DNA terdiri atas satu gula pentose, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Fatchiyah, dkk. 2011).

Sifat organisme ditentukan oleh gen-gen yang dimilikinya. Gen dikode dalam materi genetik organisme, yang kita kenal sebagai molekul DNA, atau RNA pada beberapa virus. Terdapat dua jenis gen, yaitu gen struktural dan gen regulator. Gen-gen struktural mengkode urutan asam amino dalam protein, seperti enzim, yang menentukan kemampuan biokimia dari organisme pada reaksi katabolisme dan anabolisme, atau berperan sebagai komponen tetap pada struktur sel. Gen-gen regulator

Pemanfaatan Biologi Molekuler | 41

DAFTAR PUSTAKA

Fatchiyah., Arumingtyas, A.L., Widyarti, S., Rahayu, S. (2011). Basic Principles Of Molecular Biology Analysis. Jakarta: Erlangga

Ghaffar, Shabarni. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. Bandung: Unpad Press

Kalqutny, Septian Hary., Pakki, Syahrir., Muis., Amran. (2020). Potensi Pemanfaatan Teknik Molekuler Berbasis DNA dalam Penelitian Penyakit Bulai pada Jagung. Agrosainstek, (4)1, 17-27

Kline, M. C., Redman J. W., Butler, J. M. 2001. Training on STR Typing Using Commercial Kits and ABI 310/3100. National Institute of Standards and Technology.

Listyorini, dkk. (2020). Biologi Molekuler & Bioinformatika. Malang.UMM Press

Rahayu, Ayu. (2017). Aplikasi Biomolekuler di Dunia Perunggasan Khususnya Itik. Journal of Livestock Science and Production, (1)1, 13-17

Santoso, Tri Joko. (2013). Aplikasi Teknik Molekuler Untuk Analisis Genetik Tomato Leaf Curl Virus. Jurnal Litbang, (32)4, 141-149

Sari, Nila Kartika. (2017). Penentuan Similaritas dan Variabilitas Genetik pada Keluarga Etnis Jawa dan Arab dengan DNA Fingerprint di Malang, Jawa Timur, Indonesia. Jurnal Ilmiah Sains, (17)1, 51-58

Suryaningtyas, Indyaswan Tegar. (2017). Aplikasi Bioteknologi Molekuler Dalam Budidaya Perairan. Oseana, (XLII)4, 13 – 24

Xu, J., W. Huang, C. Zhong, D. Luo, S. Li, Z. Zhu and W. Hu. (2011). Defining global gene expression changes of the hypothalamic pituitary-gonadal axis in female sGnRH antisense transgenic common carp (Cyprinus carpio). Plos-one 6(6): 1-12.

Yuda, Pramana. (2016). Aplikasi Teknik Molekuler pada Penelitian dan Konservasi Burung di Indonesia. Dipresentasikan pada Konferensi Peneliti dan Pemerhati Burung Indonesia II, UAJY, Yogyakarta

PRINSIP DAN APLIKASI PCR-RAPD DAN PCR-RFLP

Miftahul Mushlih, M.Sc Universitas Muhammadiyah Sidoarjo dan Indonesian Genetic and Biodiversity Community (IGBC)

A. PENGANTAR Perkembangan metode biologi molekuler untuk mendapatkan sebuah

variasi genetik berdasarkan karakteristik tertentu berkembang begitu cepat. Meskipun banyak metode yang baru, pada beberapa kasus Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) dan Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) merupakan metode yang sampai saat ini digunakan dalam beberapa analisis molekuler dan masih banyak diminati. Metode RAPD dikembangkan pada tahun 1990 oleh Welsh dan McClelland pada tahun 1990 dengan menganalisis genom menggunakan primer acak. RAPD merupakan metode dimana amplifikasi dilakukan secara acak menggunakan primer tunggal, hasil potongan DNA dari proses amplifikasi juga berjalan acak sesuai dengan kecocokan basa nukleotida dengan DNA template/cetakan. Primer yang digunakan biasanya berkisar 9-12 bp saja. DNA template yang ada akan digandakan menghasilkan berjuta juta copy, band hasil analisis diamati mulai dari 100 bp - 3000 bp. Band yang muncul juga menunjukkan ketebalan yang berbeda.

58 | Metode Biologi Molekuler

DAFTAR PUSTAKA

Adiningsih, M. W. et al. (2018) “Authentication of Sumateran Wild Boar (Sus scrofa vittatus) meat contamination by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique of Cytochrome b Gene,” Tropical Animal Science Journal, 41(3), hal. 157–164. doi: 10.5398/tasj.2018.41.3.157.

Ali, B. A. et al. (2004) “A review of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in fish research,” Reviews in Fish Biology and Fisheries, 14(4), hal. 443–453. doi: 10.1007/s11160-005-0815-0.

Arif, I., Bakir, M.A., Khan, H., Farhan, A.H., Homaidan, A.A., Bahkali, A., Sadoon, M.A., & Shobrak, M. (2010). Application of RAPD for molecular characterization of plant species of medicinal value from an arid environment. Genetics and molecular research : GMR, 9 4, 2191-8 .

Asmelash, B., Diriba, S. dan Pal, S. K. (2017) “Molecular markers based characterization and conservation of wild animals,” Research Journal of Recent Sciences Res. J. Recent Sci, 6(7), hal. 53–62. Tersedia pada: http://www.isca.in/rjrs/archive/v6/i7/7.ISCA-RJRS-2017-058.pdf.

Bardakci, F., Skibinski, D. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification. Heredity 73, 117–123 (1994). https://doi.org/10.1038/hdy.1994.110

Berg, H. (2012) “Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting,” Gel Electrophoresis - Principles and Basics. doi: 10.5772/37724.

Borisov, A. Y. et al. (1999) “Identification of DNA amplification fingerprinting ( DAF ) markers close to the symbiosis-ineffective sym31 mutation of pea ( Pisum sativum L .),” (May 2014). doi: 10.1007/s001220051152.

Bοusba, R. et al. (2020) “Genotypic diversity assessment of some durum wheat (Triticum durum) genotypes using rapd analysis,” Biodiversitas, 21(6), hal. 2696–2701. doi: 10.13057/biodiv/d210643.

Prinsip dan Aplikasi PCR-RAPD dan PCR-RFLP | 59

Daryono, B. S., Aristya, G. R. dan Kasiamdari, R. S. (2011) “Development of Random Amplified Polymorphism DNA Markers Linked to Powdery Mildew Resistance Gene in Melon,” Indonesian Journal of Biotechnology, 16(2), hal. 76–82. doi: 10.22146/ijbiotech.7837.

de Sousa, D. R. T. et al. (2015) “PCR-RFLP as a useful tool for diagnosis of invasivemycoses in a healthcare facility in the North of Brazil,” Electronic Journal of Biotechnology, 18(3), hal. 231–235. doi: 10.1016/j.ejbt.2015.03.012.

Fatemeh Keify (2012) “Exploitation of random amplified polymorphic DNA (RAPD) and sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers for genetic diversity of saffron collection,” Journal of Medicinal Plants Research, 6(14), hal. 2761–2768. doi: 10.5897/jmpr11.834.

Ferrito, V. dan Pappalardo, A. M. (2017) “Seafood species identification by DNA barcoding, a molecular tool for food traceability,” Biodiversity Journal, 8(1), hal. 65–72. Tersedia pada: http://www.biodiversityjournal.com/pdf/8(1)_65-72.pdf.

Govarthanan M. (2011) “Genetic variability among Coleus sp. studied by RAPD banding pattern analysis,” International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research, 2(12), hal. 202–208. doi: 10.5897/ijbmbr11.030.

Gurusubramanian, Guruswami & Kumar, N. S. (2016) “Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) markers and its applications Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) markers and its applications,” Mipograss, 11(3), hal. 116–124. Tersedia pada: www.usask.ca/.../pawlin/.

Gurusubramanian, Guruswami & Kumar, N. S. (2016) “Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) markers and its applications Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) markers and its applications,” Mipograss, 11(3), hal. 116–124. Tersedia pada: www.usask.ca/.../pawlin/.

Hadrys, H., Balick, M. Dan Schierwater, b. (1992) “applications of random amplified polymorphic dna (rapd) in molecular ecology,” molecular ecology, 1(1), hal. 55–63. doi: 10.1111/j.1365-294x.1992.tb00155.x.

60 | Metode Biologi Molekuler

Handayani, N. S. N. et al. (2021) “Splice-site and Frameshift Mutations of β-Globin Gene Found in Thalassemia Carrier Screening in Yogyakarta Special Region, Indonesia,” The Indonesian Biomedical Journal, 13(1), hal. 55–60. doi: 10.18585/inabj.v13i1.1406.

Hazlianda, C. P., Muis, K. dan Lubis, I. A. (2017) “Uji Diagnostik Tinea Kruris dengan Polymerase Chain Reaction Restriction Fragmented Length Polymorphism,” Periodical of Dermatology and Venereology, 29(2), hal. 158–163.

Hikmah, R., Retnoningsih, A. dan Habibah, N. (2016) “Keragaman Durian Berdasarkan Fragmen Internal Transcribed Pancers (ITS) DNA Ribosomal melalui analisis PCR RFLP,” 39(1), hal. 11–18.

Hiyagarajan, V. T., Au, S. L. dan Soi, M. T. (2010) “Monitoring Bacterial Biodiversity in Surface Sediment Using Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis ( T-RFLP ): Application to Coastal Environment,” Coastal Environmental and Ecosystem Issues of the East China Sea, hal. 151–163.

https://www.goldbio.com/articles/article/Restriction-Enzyme-Cloning-Troubleshooting

Jahangir Tafrechi, R. S., van de Rijke, F. M., Allallou, A., Larsson, C., Sloos, W. C., van de Sande, M., Wählby, C., Janssen, G. M., & Raap, A. K. (2007). Single-cell A3243G mitochondrial DNA mutation load assays for segregation analysis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society, 55(11), 1159–1166. https://doi.org/10.1369/jhc.7A7282.2007

Mhuka, C. et al. (2017) “Use of RAPD-PCR for breed/genotype identification in Zimbabwean cattle,” Journal of Cellular Biotechnology, 2(2), hal. 131–137. doi: 10.3233/jcb-15033.

Minarovi, T. et al. (2010) “Animal Species Identification by PCR – RFLP of Cytochrome b,” Animal Science and Biotechnologies, 43(1), hal. 296–299.

Minarovi, T. et al. (2010) “Animal Species Identification by PCR – RFLP of Cytochrome b,” Animal Science and Biotechnologies, 43(1), hal. 296–299.

Prinsip dan Aplikasi PCR-RAPD dan PCR-RFLP | 61

Mosa, K. A. et al. (2019) “The promise of molecular and genomic techniques for biodiversity research and DNA barcoding of the Arabian Peninsula Flora,” Frontiers in Plant Science, 9(January), hal. 1–19. doi: 10.3389/fpls.2018.01929.

Mushlih, M. et al. (2020) “Identification of molecular markers for type 2 Diabetes mellitus in Sidoarjo, Indonesia,” Jurnal Teknologi Laboratorium, 9(2), hal. 186–191. doi: 10.1525/9780520974166-002.

Ozdemir, K. et al. (2014) “Identification of biodiversity of some Streptomyces species and determination of a restriction fragment length polymorphism (RFLP) profile of 16S rDNA gene region,” Journal of Animal and Veterinary Advances, 13(16), hal. 978–988. doi: 10.3923/javaa.2014.978.988.

Pal, P. (2015) “RAPD-PCR as a Molecular Discriminative Technique for Human Pathogenic Bacteria – A Review,” International Letters of Natural Sciences, 42, hal. 13–17. doi: 10.18052/www.scipress.com/ilns.42.13.

Pal, P. (2015) “RAPD-PCR as a Molecular Discriminative Technique for Human Pathogenic Bacteria – A Review,” International Letters of Natural Sciences, 42, hal. 13–17. doi: 10.18052/www.scipress.com/ilns.42.13.

Partis L, Wells RJ. Identification of fish species using random amplified polymorphic DNA (RAPD). Mol Cell Probes. 1996 Dec;10(6):435-41. doi: 10.1006/mcpr.1996.0060. PMID: 9025081.

Patrinos, G. P. dan Ansorge, W. J. (1986) Molecular Diagnostics : Past , Present , and Future. Second Edi, Molecular Diagnostics. Second Edi. Elsevier Ltd. doi: 10.1016/B978-0-12-374537-8.00001-8.

Prasad, M. P. (2014) “Molecular characterization and genetic diversity determination of Hibiscus species using RAPD molecular markers,” 4(3), hal. 50–56.

Prihatini, I. dan Faradilla, F. A. (2019) “Teknik Pcr Its RFLP Untuk Seleksi Isolat Jamur Pada Pengujian Agen Pengendali Hayati Pada Serangan Ganoderma Tanaman Acacia mangium PCR ITS-RFLP technique for selection of fungal isolates in biological control agent test against

62 | Metode Biologi Molekuler

Ganoderma attack in Acacia,” Jurnal Pemuliaan Tanaman Hutan, 13(1), hal. 33–43.

Prystupa, A. et al. (2011) “Application of RFLP-PCR method for molecular diagnostics of hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC),” Journal of Pre-Clinical and Clinical Research, 5(2), hal. 70–73. Tersedia pada: www.jpccr.eu.

Ramella, M. S. et al. (2005) “Optimization of random amplified polymorphic DNA protocol for molecular identification of Lophius gastrophysus,” Ciência e Tecnologia de Alimentos, 25(4), hal. 733–735. doi: 10.1590/s0101-20612005000400017.

Randriani, E. dan Tresniawati, C. (2012) “Pemanfaatan Teknik Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) Untuk Pengelompokan Secara Genetik Plasma Nutfah Jambu Mete (Annacardium occidentale L.),” Journal of Industrial and Beverage Crops, 3(1), hal. 1–6. doi: 10.21082/jtidp.v3n1.2012.p1-6.

Sheorey, R. R. dan Tiwari, A. (2011) “Random amplified polymorphic DNA ( RAPD ) for identification of herbal materials and medicines – A review.”

Tanaka, J. dan Taniguchi, F. (2002) “Emphasized-RAPD (e-RAPD): A simple and efficient technique to make RAPD bands clearer,” Breeding Science, 52(3), hal. 225–229. doi: 10.1270/jsbbs.52.225.

Tattikota, S. G. et al. (2013) “Argonaute2 regulates the pancreatic β-cell secretome.,” Molecular & cellular proteomics : MCP, 12(5), hal. 1214–25. Tersedia pada: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3650333&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.

Thiyagarajan, V., Lau, S.C., Tsoi, M., Zhang, W., & Qian, P. (2010). Monitoring Bacterial Biodiversity in Surface Sediment Using Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis (T-RFLP): Application to Coastal Environment.

Tingey, S. (2003) “Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs),” Nucleic Acid Protocols Handbook, The, 25, hal. 675–677. doi: 10.1385/1-59259-038-1:675.

Prinsip dan Aplikasi PCR-RAPD dan PCR-RFLP | 63

VI, K. (2017) “Using RAPD PCR Method for Studying DNA Polymorphism of Agricultural Importance Arthropods,” Agricultural Research & Technology: Open Access Journal, 9(4), hal. 106–107. doi: 10.19080/artoaj.2017.09.555769.

Yılmaz, R. et al. (2015) “Genetic differentiation of lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and streptococcus thermophilus strains isolated from raw milk samples collected from different regions of Turkey,” Food Biotechnology, 29(4), hal. 336–355. doi: 10.1080/08905436.2015.1092091.

Yongjun, F. et al. (2014) “Application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify Taxus chinensis var. mairei cultivars associated with parthenogenesis,” African Journal of Biotechnology, 13(24), hal. 2385–2393. doi: 10.5897/ajb2014.13646.

Zahid, R. A., Sulaiman, B. K. dan Abd, Ahmed, B. (2011) “Molecular Investigation of Genetic Polymorphisms,” Iraqi Journal of Cancer and Medical Genetics, (2), hal. 47–54.

PRINSIP DAN APLIKASI METODE MICROSATELLITE

Muhammad Rifqi Hariri, M.Si Pusat Penelitian Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya – Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia & Indonesian Genetic and Biodiversity Community

A. PENDAHULUAN Marka molekuler merupakan sebuah pendekatan yang cukup efektif

dan memiliki peran sentral penting dalam analisis keragaman genetik dan asesmen kekerabatan, baik di dalam (intra) maupun antar (inter) spesies tumbuhan (Kumar et al., 2009). Hal tersebut menunjukkan potensi yang dimiliki oleh marka molekuler dalam mendeteksi keragaman genetik dan membantu dalam pengelolaan sumber daya genetik tumbuhan (Harikumar & Sheela, 2019). Mikrosatelit merupakan salah satu jenis marka molekuler dengan sebutan yang bervariasi, seperti Simple Sequence Repeats (SSR), Short Tandem Repeats (STRs), atau Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP) (Litt & Luty, 1989; Tautz, 1989; Edwards et al., 1991; Jacob et al., 1991).

Marka ini diperkenalkan pertama kali oleh Condit & Hubbell (1991) yang mendeteksi adanya pengulangan nukleotida (AC)n dan (AG)n pada tumbuhan. Target marka ini adalah nukleotida yang berulang secara

74 | Metode Biologi Molekuler

Brassicaceae memberikan kerangka kerja yang sangat penting dalam penelitian genomik komparatif. Pemetaan gen komparatif dan keterkaitannya terhadap kromosom pada kerabat-kerabat dekat Arabidopsis menyimpulkan adanya ilustrasi kariotipe leluhur spesies tumbuhan pada famili ini. Selain itu, pemetaan komparatif terhadap genus Brassica menunjukkan adanya blok genom yang telah dipertahankan sejak terjadinya divergensi garis keturunan Arabidopsis dan Brassica (Schranz et al., 2007).

E. RANGKUMAN MATERI Marka mikrosatelit tidak hanya digunakan dalam studi keragaman

genetik, genetika populasi, dan studi evolusi, tetapi juga digunakan dalam penelitian fundamental seperti analisis genom, pemetaan gen, maupun marker assisted selection. Pemetaan asosiasi berbasis marka SSR sangat menjanjikan untuk mengejawantahkan keragaman genetik, mengkarakterisasi variasi fenotipik, dan mengaitkan penanda terhadap sifat-sifat yang ada pada plasma nutfah tumbuhan. Marka mikrosatelit yang terkait dengan fenotipe yang jelas dapat digunakan dalam program pemuliaan tumbuhan untuk mempercepat proses pemuliaan. Penanda mikrosatelit dapat memfasilitasi pemetaan komparatif dan membantu mengidentifikasi 'blok keterkaitan', sinkronisasi gen utama, penataan ulang kromosom, dan sinkronisasi mikro antar spesies.

DAFTAR PUSTAKA

Breseghello, F., & Sorrells, M. E. (2006a). Association mapping of kernel size and milling quality in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Genetics, 172(2), 1165-1177.

Breseghello, F., & Sorrells, M. E. (2006b). Association analysis as a strategy for improvement of quantitative traits in plants. Crop Science, 46(3), 1323-1330.

Condit, R., & Hubbell, S. P. (1991). Abundance and DNA sequence of two-base repeat regions in tropical tree genomes. Genome, 34(1), 66-71.

Prinsip dan Aplikasi Metode Microsatellite | 75

Doğrar, N., & Akkaya, M. S. (2001). Optimization of PCR amplification of wheat simple sequence repeat DNA markers. Turkish Journal of Biology, 25(2), 153-158.

Edwards, A., Civitello, A., Hammond, H. A., & Caskey, C. T. (1991). DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American journal of human genetics, 49(4), 746.

Fraser, L. G., Tsang, G. K., Datson, P. M., De Silva, H. N., Harvey, C. F., Gill, G. P., ... & McNeilage, M. A. (2009). A gene-rich linkage map in the dioecious species Actinidia chinensis (kiwifruit) reveals putative X/Y sex-determining chromosomes. BMC genomics, 10(1), 1-15.

Grover, A., & Sharma, P. C. (2016). Development and use of molecular markers: past and present. Critical reviews in biotechnology, 36(2), 290-302.

Harikumar, P., & Sheela, M. N. (2019). Simple Sequence Repeat (SSR) Marker Based Genetic Diversity Analysis in White Yam (Dioscorea rotundata Poir.), Indian journal of pure and applied biosciences, 7(5), 259-264.

Heywood, V. H., & Iriondo, J. M. (2003). Plant conservation: old problems, new perspectives. Biological conservation, 113(3), 321-335.

Hiroe, M. (1958). Umbelliferae of Japan. Univ. Calif. Publ. Bot., 30, 1-444. Jacob, H. J., Lindpaintner, K., Lincoln, S. E., Kusumi, K., Bunker, R. K., Mao,

Y. P., ... & Lander, E. S. (1991). Genetic mapping of a gene causing hypertension in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Cell, 67(1), 213-224.

Jakse, J., Stajner, N., Kozjak, P., Cerenak, A., & Javornik, B. (2008). Trinucleotide microsatellite repeat is tightly linked to male sex in hop (Humulus lupulus L.). Molecular Breeding, 21(2), 139-148.

Jin, L., Lu, Y., Xiao, P., Sun, M., Corke, H., & Bao, J. (2010). Genetic diversity and population structure of a diverse set of rice germplasm for association mapping. Theoretical and Applied Genetics, 121(3), 475-487.

Jones, A. G., Small, C. M., Paczolt, K. A., & Ratterman, N. L. (2010). A practical guide to methods of parentage analysis. Molecular ecology resources, 10(1), 6-30.

76 | Metode Biologi Molekuler

Joshi, S. P., Ranjekar, P. K., & Gupta, V. S. (1999). Molecular markers in plant genome analysis. Current Science, 230-240.

Kalia, R. K., Rai, M. K., Kalia, S., Singh, R., & Dhawan, A. K. (2011). Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica, 177(3), 309-334.

Kelkar, Y. D., Strubczewski, N., Hile, S. E., Chiaromonte, F., Eckert, K. A., & Makova, K. D. (2010). What is a microsatellite: a computational and experimental definition based upon repeat mutational behavior at A/T and GT/AC repeats. Genome biology and evolution, 2, 620-635.

Kumar, P., Gupta, V. K., Misra, A. K., Modi, D. R., & Pandey, B. K. (2009). Potential of molecular markers in plant biotechnology. Plant omics, 2(4), 141-162.

Lee, J., Joh, H. J., Kim, N. H., Lee, S. C., Jang, W., Choi, B. S., ... & Yang, T. J. (2017). High-throughput development of polymorphic simple sequence repeat markers using two whole genome sequence data in Peucedanum japonicum. Plant Breeding and Biotechnology, 5(2), 134-142.

Lieckfeldt, E., Meyer, W., & Börner, T. (1993). Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting. Journal of Basic Microbiology, 33(6), 413-425.

Litt, M., & Luty, J. A. (1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American journal of human genetics, 44(3), 397.

Ma, H., Yin, Y., Guo, Z., Chen, L., Zhang, L., Zhong, M., & Shao, G. (2011). Establishment of DNA fingerprinting of Liaojing series of Japonica rice. Middle East Journal of Scientific Research, 8(2), 384-392.

Meng, W. A. N. G., Fei, X. U. E., Peng, Y. A. N. G., Duan, X. Y., Zhou, Y. L., Shen, C. Y., ... & Wang, B. T. (2014). Development of SSR markers for a phytopathogenic fungus, Blumeria graminis f. sp. tritici, using a FIASCO protocol. Journal of Integrative Agriculture, 13(1), 100-104.

Meyer, W., Lieckfeldt, E., Kuhls, K., Freedman, E. Z., Börner, T., & Mitchell, T. G. (1993). DNA-and PCR-fingerprinting in fungi. In DNA fingerprinting: State of the Science (pp. 311-320). Birkhäuser, Basel.

Prinsip dan Aplikasi Metode Microsatellite | 77

Mittal, N., & Dubey, A. (2009). Microsatellite markers-A new practice of DNA based markers in molecular genetics. Pharmacognosy Reviews, 3(6), 235.

Morgante, M., & Olivieri, A. M. (1993). PCR‐amplified microsatellites as markers in plant genetics. The plant journal, 3(1), 175-182.

Neeraja, C. N., Maghirang-Rodriguez, R., Pamplona, A., Heuer, S., Collard, B. C., Septiningsih, E. M., ... & Mackill, D. J. (2007). A marker-assisted backcross approach for developing submergence-tolerant rice cultivars. Theoretical and Applied Genetics, 115(6), 767-776.

Parasnis, A. S., Ramakrishna, W., Chowdari, K. V., Gupta, V. S., & Ranjekar, P. K. (1999). Microsatellite (GATA) n reveals sex-specific differences in papaya. Theoretical and applied genetics, 99(6), 1047-1052.

Powell, W., Machray, G. C., & Provan, J. (1996). Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in plant science, 1(7), 215-222.

Rahman, M., Malik, T. A., Aslam, N., Asif, M., Ahmad, R., Khan, I. A., & Zafar, Y. (2002). Optimization of PCR conditions to amplify microsatellite loci in cotton Gossypium hirsutum L. genomic DNA. Intern J Agriculture Biol, 4(2), 282-284.

Rahman, M., Iqbal, M.A., & Shaheen, N. (2014). Microsatellites: Methods & Protocols. In Miransari, M (ed.) Stress and Plant Biotechnology. New Delhi: Studium Press, pp 316.

Rode, J., In‐Chol, K., Saal, B., Flachowsky, H., Kriese, U., & Weber, W. E. (2005). Sex‐linked SSR markers in hemp. Plant Breeding, 124(2), 167-170.

Romero, G., Adeva, C., & Battad, Z. (2009). Genetic fingerprinting: advancing the frontiers of crop biology research. Philipp. Sci. Lett, 2, 8-13.

Rosenblum, E. B., Belfiore, N. M., & Moritz, C. (2007). Anonymous nuclear markers for the eastern fence lizard, Sceloporus undulatus. Molecular Ecology Notes, 7(1), 113-116.

Schranz, M. E., Song, B. H., Windsor, A. J., & Mitchell-Olds, T. (2007). Comparative genomics in the Brassicaceae: a family-wide perspective. Current opinion in plant biology, 10(2), 168-175.

78 | Metode Biologi Molekuler

Senan, S., Kizhakayil, D., SASIKUMAR, B., & SHEEJA, T. E. (2014). Methods for development of microsatellite markers: an overview. Notulae Scientia Biologicae, 6(1), 1-13.

Spigler, R. B., Lewers, K. S., Main, D. S., & Ashman, T. L. (2008). Genetic mapping of sex determination in a wild strawberry, Fragaria virginiana, reveals earliest form of sex chromosome. Heredity, 101(6), 507-517.

Silva, P. I., Martins, A. M., Gouvea, E. G., Pessoa-Filho, M., & Ferreira, M. E. (2013). Development and validation of microsatellite markers for Brachiaria ruziziensis obtained by partial genome assembly of Illumina single-end reads. Bmc Genomics, 14(1), 1-9.

Simko, I., Costanzo, S., Haynes, K. G., Christ, B. J., & Jones, R. W. (2004). Linkage disequilibrium mapping of a Verticillium dahliae resistance quantitative trait locus in tetraploid potato (Solanum tuberosum) through a candidate gene approach. Theoretical and Applied Genetics, 108(2), 217-224.

Suotang, P., Jieyun, Z., Qichuan, Y., & Kangle, Z. (2003). SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Zhongguo shuidao kexue, 17(1), 1-5.

Tautz, D. (1989). Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic acids research, 17(16), 6463-6471.

Venter, J. C., Adams, M. D., Myers, E. W., Li, P. W., Mural, R. J., Sutton, G. G., ... & Kalush, F. (2001). The sequence of the human genome. science, 291(5507), 1304-1351.

Wang, M. L., Barkley, N. A., & Jenkins, T. M. (2009). Microsatellite markers in plants and insects. Part I: Applications of biotechnology.

Xiao, X. Y., Wang, Y. P., Zhang, J. Y., Li, S. G., & Rong, T. Z. (2006). SSR marker-based genetic diversity fingerprinting of hybrid rice in Sichuan, China. Chinese J Rice Sci, 20(1), 1-7.

Yue, X. Y., Liu, G. Q., Zong, Y., Teng, Y. W., & Cai, D. Y. (2014). Development of genic SSR markers from transcriptome sequencing of pear buds. Journal of Zhejiang University Science B, 15(4), 303-312.

PRINSIP DAN APLIKASI METODE SNP

Priyambodo, S.Pd., M.Sc Universitas Lampung

A. PENDAHULUAN Dunia merupakan hal yang begitu dinamis, termasuk ilmu

pengetahuan dan teknologi, termasuk bidang biologi molekuler. Seiring bergantinya bilangan tahun, perkembangan dalam bidang biologi molekuler dan aplikasinya turut terus berubah dan berkembang. Salah satu perkembangan studi biologi molekuler adalah kajian terkait Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Fenomena SNP menjadi bahan kajian yang penting dalam kaitan biologi molekuler dengan studi genetika populasi, ekologi, dan evolusi. Peran SNP dalam membentuk keragaman individu dalam populasi menjadi pijakan penting dalam lahirnya variasi populasi yang merupakan modal dasar pembahasan seleksi alam dan konsep evolusi.

Pada bab ini akan dibahas terkait definisi SNP dan urgensi SNP dalam perkembangan dunia biologi molekuler, serta metode analisis SNP. Lebih lanjut, dipaparkan contoh-contoh dalam studi kasus SNP yang terjadi pada manusia, hewan dan tumbuhan.

Prinsip dan Aplikasi Metode SNP | 89

DAFTAR PUSTAKA

Bryant, D., Bouckaert, R., Felsenstein, J., Rosenberg, N. A., & RoyChoudhury, A. (2012). Inferring species trees directly from biallelic genetic markers: bypassing gene trees in a full coalescent analysis. Molecular biology and evolution, 29(8), 1917–1932. https://doi.org/10.1093/molbev/mss086.

Christos, B., Dulger, A.O., Uncu, A.T., Spaniolas, S., Spanos, T., Kalaitzis, P. (2012) A SNP-based PCR-RFLP capillary electrophoresis analysis for the identification of the varietal origin of olive oils. Food Chemistry 134(4):2411-8

Collins, FS. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). https://www.genome.gov/genetics-glossary/Single-Nucleotide-Polymorphisms

Franssila, S., Davis, C.E., LeVasseur, M.K., Cao, Z., Yobas, l. (2020). Chapter 22 - Microfluidics and bioMEMS in silicon. Handbook of Silicon Based MEMS Materials and Technologies (Third Edition). Elsevier. pp 547-563.

Gaudet, M., Fara, AG., Sabatti, M. et al. Single-reaction for SNP Genotyping on Agarose Gel by Allele-specific PCR in Black Poplar (Populus nigra L.). Plant Mol Biol Rep 25, 1–9 (2007). https://doi.org/10.1007/s11105-007-0003-6

Guo, CY., Xu, XF., Wu, JY., & Liu, SF. 2008. PCR-SSCP-DNA Sequencing Method in Detecting PTEN Gene Mutation and its Significance in Human Gastric Cancer. World Journal of Gastroenterology, 14(24): 3804 – 3811.

Han W, Yip SP, Wang J, Yap MKH. (2004). Using denaturing HPLC for SNP discovery and genotyping, and establishing the linkage disequilibrium pattern for the all-trans-retinol dehydrogenase (RDH8) gene. J Hum Genet. 49(1):16-23.

Hahner, S., Kostrzewa, M., Wenzel, T., Fröhlich, T. (2003). Strategies for SNP genotyping by mass spectrometry. International Congress Series. 1239, 11-16. https://doi.org/10.1016/S0531-5131(02)00286-8.

90 | Metode Biologi Molekuler

Inazuka, M., Wenz, HM., & Sakabe, M. 1997. A Steamlined Mutation Detection System: Multicolor Post-PCR Fluorescence Labeling and Single-Stand Conformational Polymorphism Analysis by Capilary Electrophoresis. Genome Research CSH Press. Genome Research 7: 10094 – 1103.

Kurniawati, S., Hartati, N.S., Hartati, Sudamonowati, E. (2020). Motif Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Gen Phytoene Synthase (PSY) Penyandi Karotenoid Ubi Kayu Berumbi Kuning. Jurnal Ilmu Dasar. 21(1):19-26.

Lonetti A, Fontana MC, Martinelli G, and Iacobucci I. (2016). Single Nucleotide Polymorphisms as Genomic Markers for High-Throughput Pharmacogenomic Studies, In Microarray Technology (pp. 143- 159). Humana Press, New York, NY.

Nakajima, E., Matsumoto, T., Yamada, R., Kawakami, K., Takeda, K., Ohnishi, A., & Komatsu, M. 1996. Technical Note: Use of A PCR-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) for Detection of a Point Mutation in the Swine Ryanodine Receptor (RYR1) Gene. Journal of Animal Science. 74: 2904-2906.

Prihandini, P.W., Hariyono, D.N.H., Tribudi, Y.A. (2021). Gen Myostatin sebaga Marka Genetik untuk Sifat Pertumbuhan dan Karkas Sapi Potong. Wartazoa. 31(1): 37-42.

Priyambodo. (2014). Deteksi Molekuler Pembawa Sifat β-thalassemia di Daerah Istimewa Yogyakarta. Thesis. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.

Rahmah, S.F., Widodo, Putri, J.F., Lukitasari, M, Rahman, M.S. (2013). Analisis Single Nucleotide Polymorphism (SNP) -217 Gen Human Angiotensinogen (hAGT) pada Penderita Hipertensi di Rumah Sakit Syaiful Anwar secara PCR-Sekuensing. Biotropika. 1 (2): 71-74.

Rajatileka, S., Luyt, K., Williams, M., Harding, D., Odd, D., Molnár, E., & Váradi, A. (2014). Detection of three closely located single nucleotide polymorphisms in the EAAT2 promoter: comparison of single-strand conformational polymorphism (SSCP), pyrosequencing and Sanger sequencing. BMC genetics, 15, 80. https://doi.org/10.1186/1471-2156-15-80

Prinsip dan Aplikasi Metode SNP | 91

Raut, AA., Kumar, A., Kala, SN., Chhokar, V., Rana, N., Beniwal, V., Jaglan, S., Samuchiwal, S.K., Singh, J.K., & Mishra, A.. 2012. Identification of Novel Single Nucleotide Polymorphisms in the DGAT1 Gene of Buffaloes by PCR-SSCP. Genetics and Molecular Biology, 35(3): 610- 613.

Sadewa, AH. (2015). Peran Single Nucleotide Polymorphisms (Snps) Pada Metabolisme Mikronutrien Dan Enzim Antioksidan Sebagai Predisposisi Terhadap Kanker,Prosiding Anual Scientific Meetng, 1-11.

Salwati, E., Handayani, S., Jekti, R.P. (2014). Identifikasi Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Gen pvmdr1 pada Penderita Malaria Vivaks di Minahasa Tenggara (Sulawesi Utara). Jurnal Biotek Medisiana Indonesia. 3 (2): 49-57.

Singh, R.P., Singh, P.K., Gupta, R., & Singh, L. (2018). Biotechnological Tools to Enhance Sustainable Production. Biotechnology for Sustainable Agriculture. Woodhead Publishing. 19-66. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812160-3.00002-7.

Twyman, RD. (2005). Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Genotyping Techniques-An Overvies, Encyclopedia of Diagnostic Genomic.

Zhang, J., Zhang, J., Tao, R., Yang, Z., Zhang, S.., Li, C. (2019). Mass spectrometry-based SNP genotyping as a potential tool for ancestry inference and human identification in Chinese Han and Uygur populations. Science & Justice. 59 (3). 228-233. https://doi.org/10.1016/j.scijus.2019.01.006.

PRINSIP DAN APLIKASI METODE MULTIPLEKS PCR

Dr. Rina Hidayati Pratiwi, M.Si Universitas Indraprasta PGRI, Jakarta

A. PENGERTIAN METODE MULTIPLEKS PCR

Gambar 6.1 Jenis dan Variasi Teknik PCR

Prinsip dan Aplikasi Metode Multipleks PCR | 107

10. Dapat menghemat volume DNA yang digunakan, waktu pengerjaan yang lebih efektif serta mengurangi biaya untuk amplifikasi DNA (Sambrook & Russel, 2001).

11. Deteksi bakteri Escherichia coli O157:H7 menggunakan multipleks PCR lebih cepat dibandingkan dengan menggunakan metode kultur secara konvensional (mikrobiologi) pada media sorbitol Mac Conkey agar (SMAC), selain itu penggunaan PCR juga menghilangkan kemungkinan kesalahan deteksi ada atau tidaknya bakteri Escherichia coli O157:H7 dalam suatu sampel karena menggunakan berbagai macam primer yang spesifik terhadap gen tertentu.

12. Multipleks PCR memungkinkan amplifikasi beberapa target berbeda dalam satu tube PSC secara bersamaan sehingga menghemat waktu, reagent dan sampel & dapat membandingkan beberapa amplikon secara simultan.

E. RANGKUMAN MATERI PCR multipleks merupakan teknik Biologi Molekuler, adaptasi dari

teknik PCR yang memungkinkan amplifikasi secara simultan dari berbagai sekuen gen. Dalam pengujian multipleks, lebih dari satu urutan target dapat diperkuat dengan menggunakan beberapa pasangan primer dalam campuran reaksi. Dengan metode PCR multipleks dapat mengamplifikasi dua atau lebih sekuen target (multi target) secara simultan dengan satu kali reaksi PCR sehingga dapat menghemat alat, biaya, waktu pengerjaan, dan reagent yang digunakan. PCR multipleks banyak digunakan untuk berbagai kepentingan yang paling umum diantaranya dapat digunakan untuk identifikasi patogen, deteksi GMOs (Genetically Modified Organisms), analisis polimorfisme, analisis mutasi, analisis delesi gen, deteksi RNA, penelitian mengenai forensik dan lain sebagainya. Pada dasarnya, prosedur dan komponen dalam reaksi multiplex PCR sama dengan PCR reguler.

DAFTAR PUSTAKA

Borah P. 2011. Primer Designing for PCR. Science Vision 11(3): 134-136. Chamberlain, J. S., Gibbs, R. A., Ranier, J. E., Nguyen, P. N., dan Caskey, C.

T. 1988. Deletion Screening of the Duchenne Muscular Dystrophy

108 | Metode Biologi Molekuler

Locus Via Multiplex DNA Amplification. Nucleid Acid Research. 16(23): 11141-11156.

De las Rivas B, Marcobal A, Muñoz R. 2005. Improved multiplex-PCR method for the simultaneous detection of food bacteria producing biogenic amines. Federation of European Microbiology Societies. 244:367- 372.

De las Rivas B, Marcobal A, Carrascosa AV, Muñoz R. 2006. PCR detection of foodborne bacteria producing the biogenic amines histamine, tyramine, putrescine, and cadaverine. Journal of Food Protection. 69(10): 2509-2514.

Edwards MC, Gibbs RA. 1994. Multiplex PCR: Advantages, Development, and Applications. Cold Spring Harbor Laboratory 3: 65-75.

Elnifro, E.M., Ashshi, A.M., Cooper, R. J., Klapper, P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clinical Microbiology Reviews, 13(4), p. 559–570.

Gopinath K, Singh S. 2009. Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection and Differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complexes and Other Mycobacterial Species Directly from Clinical Specimens. Journal of Applied Microbiology 107: 425-435.

Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas 9(1): 17-29.

Hayden, M. J., Nguyen, T. M., Waterman, A., dan Chalmers, K. J. 2008. Multiplex-ready PCR: A New Methode for Multiplexed SSR and SNP Genotyping. BMC Genomics. 9: 80.

Hwang CC, Lee YC, Huang YR, Lin CM, Shiau CY, Hwang DF, Tsai YH. 2010. Biogenic amines content, histamineforming bacteria and adulteration of bonito in tuna candy products. Food control. 21: 845-850.

Irine, Nuraini H, Sumantri C. 2013. Species authentication of dog, cat and tiger using cytochrome β gene. J Anim Sci Tech. 36:171- 78.

Kemalaputri DW, Jannah SN, Budiharjo A. 2017. Deteksi MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) pada Pasien Rumah Sakit dengan Metode Maldi-TOF MS dan Multiplex PCR. Jurnal Biologi (6): 4.

Prinsip dan Aplikasi Metode Multipleks PCR | 109

Kitano, et al. (2020). The impact analysis of a multiplex PCR respiratory panel for hospitalized pediatric respiratory infections in Japan. J. Infect Chemoteraphy, 26, pp 82-85.

Lanzilao I, Burgalassi F, Fancelli S, Settimelli M, Fani R. 2005. Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial cyt b gene from species of dairy interest. J AOAC Int. 88:128- 135.

Maksum IP, Suhaili, Amalia R , Kamara DS, Rachman SD, Rachman RW. 2018. PCR Multipleks untuk Identifikasi Mycobacterium tuberculosis Resisten terhadap Isoniazid dan Rifampisin pada Galur Lokal Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Jawa Barat. Jurnal Kimia VALENSI: Jurnal Penelitian dan Pengembangan Ilmu Kimia, 4(2), 107-118.

Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M. 2002. Multiplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach. Journal of Clinical Laboratory Analysis 16: 47-51.

Martin I, Garcia T, Fajardo V, Rojas M, Hernandez PE, Gonzalez I, Martin R. 2007. Technical Note: detection of cat, dog, and rat or mouse tissues in food and animal feed using speciesspecific polymerase chain reaction. J Anim Sci. 85:2734-2739.

Matsunaga T, Chikuni K, Tanabe R, Muroya S, Shibata K, Yamada J, Shinmura Y. 1999. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51:143-148.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Ke-2. Penerbit IPB Press. Bogor.

Nuraini H, Primasari A, Andreas E, Sumantri C. 2012. The use of cytochrome b gene as a specific marker of the rat meat (Rattus norvegicus) on meat and meat products. J Anim Sci Tech. 35:15-20.

Nuraini H, Furqon A, Sari SA, Dewi MK, Zainatha FM, Novianti WT, Sumantri C. 2013. Deteksi kandungan gelatin babi pada produk permen jelly meggunakan penanda gen sitokrom b. J Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil Peternakan. 1:2303-2227.

110 | Metode Biologi Molekuler

Rajalakshmi, S. 2017. Different types of PCR technique and its applications. International Journal of Pharmaceuticals, Chemical and Biological Science, 7 (3), 285-292.

Rodriguez PH, Ramirez AG. 2012. Polymerase Chain Reaction. Croatia: Dalam: Tech Europe. Hlm. 159.

Sambrook, J. & D.W. Russell. 2001. Molecular cloning a laboratory manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis dan Managemen Penyakit Infeksi. Biomedis. 1(2)

Suryadi TP, Ratnayani K, Yowani SC. 2014. Desain Primer untuk Amplifikasi Gen katG Multidrug Resistance Tuberculosis (MDRTB) dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Kimia 8(1): 77-82.

Toma C, Lu Y, Higa N, Nakasone N, Chinen I, Baschkier A, Rivas M, Iwanaga M. 2003. Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 41(6): 2669–2671.

Verma P, Yadav AN, Kazy SK, Saxena AK, Suman A. 2014. Evaluating the diversity and phylogeny of plant growth promoting bacteria associated with wheat (Triticum aestivum) growing in central zone of India. International Journal off Current Microbiology Applied Science. 3(5): 432- 447.

Wu, Xiaojing., et al. (2020). Co-infection with SARS-CoV-2 and Influenza A Virus in Patient with Pneumonia, China. Emerging Infectious Diseases. Vol. 26, (6).

Yang L, Wang C, Wang L, Xu C, Chen K. 2013. An Efficient Multiplex PCR Assay for Early Detection of Agrobacterium tumefaciens in Transgenic Plant Material. Turk J Agric For 37: 157-162.

Yusuf, Zuhriana. 2010. PCR. Makalah. FIKK, Universitas Negeri Gorontalo, Gorontalo.

Yuwono T. 2006. Teori dan aplikasi polymerase chain reaction. Yogyakarta (ID): Penerbit Andi Yogyakarta.

PRINSIP DAN APLIKASI METODE DNA SEQUENCING

Dr. Dwi Sendi Priyono, S.Si., M.Si Fakultas Biologi – UGM

A. PENDAHULUAN Bayangkan Anda memiliki sebuah perpustakaan dengan koleksi 20.000

buku dan buku-buku ini memiliki sumber pengetahuan yang luar biasa, seperti penyakit yang langka, segala bentuk instruksi yang mengatur bentuk tubuh dan tingkah laku, dan bahkan kemampuan berpikir manusia. Menariknya, semua buku itu ditulis dengan bahasa yang terdiri dari 4 huruf dengan pola-pola misterius. Buku-buku itu adalah gambaran dari gen-gen yang membawa informasi penting, dan perpustakaan yang menyimpan buku-buku itu adalah genom manusia. Sekuensing DNA atau DNA sequencing adalah suatu proses penentuan urutan basa nukleotida pada bagian atau seluruh molekul DNA (deoxyribonucleic acid). Ibarat Anda sedang membaca buku-buku itu yang tersusun dari 4 huruf basa (C, G, A, dan T). Runutan basa tersebut sangat penting untuk memahami bahasa DNA. Dengan memahami bahasa DNA dalam suatu molekul DNA, akan menyediakan banyak informasi tentang bagaimana struktur dan suatu gen itu berfungsi.

134 | Metode Biologi Molekuler

DAFTAR PUSTAKA

Ansorge, W. J. (2009). Next-generation DNA sequencing techniques. New Biotechnology, 25(4), 195–203.

Bentley, D. R., Balasubramanian, S., Swerdlow, H. P., Smith, G. P., Milton, J., Brown, C. G., Hall, K. P., Evers, D. J., Barnes, C. L., & Bignell, H. R. (2008). Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 456(7218), 53–59.

Callaway, E. (2021). Million-year-old mammoth genomes shatter record for oldest ancient DNA. Nature.

Castro, C. J., Marine, R. L., Ramos, E., & Ng, T. F. F. (2020). The effect of variant interference on de novo assembly for viral deep sequencing. BMC Genomics, 21(1), 1–12.

Check Hayden, E. (2012). Nanopore genome sequencer makes its debut. Nature News.

Curtis, C., & Hereward, J. (2017). From the crime scene to the courtroom: the journey of a DNA sample.

Gilbert, W., & Maxam, A. (1973). The nucleotide sequence of the lac operator. Proceedings of the National Academy of Sciences, 70(12), 3581–3584.

Huo, W., Ling, W., Wang, Z., Li, Y., Zhou, M., Ren, M., Li, X., Li, J., Xia, Z., & Liu, X. (2021). Miniaturized DNA Sequencers for Personal Use: Unreachable Dreams or Achievable Goals. Frontiers in Nanotechnology, 3, 4.

Ley, T. J., Mardis, E. R., Ding, L., Fulton, B., McLellan, M. D., Chen, K., Dooling, D., Dunford-Shore, B. H., McGrath, S., & Hickenbotham, M. (2008). DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. Nature, 456(7218), 66–72.

Low, Lloyd, and Martti Tammi. 2017. Bioinformatics A Practical Handbook of Next Generation Sequencing and Its Applications. Edited by Lloyd Low and Martti Tammi. Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 5.

Prinsip dan Aplikasi Metode DNA Sequencing | 135

Mahé, P., El Azami, M., Barlas, P., & Tournoud, M. (2019). A large scale evaluation of TBProfiler and Mykrobe for antibiotic resistance prediction in Mycobacterium tuberculosis. PeerJ, 7, e6857.

Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E., Attiya, S., Bader, J. S., Bemben, L. A., Berka, J., Braverman, M. S., Chen, Y.-J., & Chen, Z. (2005). Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature, 437(7057), 376–380.

Priyono, D. S., Solihin, D. D., Farajallah, A., & Arini, D. I. D. (2018). Anoa, dwarf buffalo from sulawesi, indonesia: Identification based on dna barcode. Biodiversitas, 19(6), 1985–1992. https://doi.org/10.13057/biodiv/d190602

Priyono, D. S., Solihin, D. D., Farajallah, A., & Purwantara, B. (2020). The first complete mitochondrial genome sequence of the endangered mountain anoa (Bubalus quarlesi) and phylogenetic analysis. Journal of Asia-Pacific Biodiversity. https://doi.org/10.1016/j.japb.2020.01.006

Quick, J., Loman, N. J., Duraffour, S., Simpson, J. T., Severi, E., Cowley, L., Bore, J. A., Koundouno, R., Dudas, G., & Mikhail, A. (2016). Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature, 530(7589), 228–232.

Rainey, K. (2015). Sequencing DNA in the Palm of Your Hand. NASA. Royo, J. L., & Galán, J. J. (2009). Pyrosequencing for SNP genotyping. In

Single Nucleotide Polymorphisms (pp. 123–133). Springer. Wang, J., Wang, W., Li, R., Li, Y., Tian, G., Goodman, L., Fan, W., Zhang, J.,

Li, J., & Zhang, J. (2008). The diploid genome sequence of an Asian individual. Nature, 456(7218), 60–65.

PRINSIP DAN APLIKASI REVERSE TRANSCRIPTION

Yana Rubiyana, M.Si Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)

A. PENGENALAN METODE REVERSE TRANSCRIPTION Reverse Transcription (RT) atau transkripsi balik adalah suatu teknik

yang digunakan untuk mensintesis complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) dari ribonucleic acid (RNA) atau dengan perkataan lain RT adalah kebalikan dari proses transkripsi yaitu menggandakan untai tunggal RNA menjadi cDNA (King, 2010). RNA biasanya digunakan sebagai parameter ekspresi gen akan tetapi molekul RNA tidak dapat teramplifikasi secara langsung sehingga perlu dilakukan transkripsi balik menjadi cDNA. Pembentukan cDNA merupakan hasil proses enzimatik secara in-vitro menggunakan RNA-dependent DNA polimerase atau yang dikenal dengan reverse transcriptase (Baltimore, 1970; Temin & Mizutani, 1970). Teknik konversi RNA menjadi cDNA banyak digunakan oleh para peneliti untuk mengamankan agar sampel yang ditelitinya tidak mudah terdegradasi. Hal ini dikarenakan sifat cDNA yang lebih stabil dibandingkan RNA. Sampel cDNA selanjutnya dapat dianalisis menggunakan metode lainnya seperti Polymerase Chain Reaction (PCR). Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mensintesis cDNA yaitu sumber RNA, teknik isolasi RNA, enzim

Prinsip dan Aplikasi Reverse Transcription | 153

DAFTAR PUSTAKA

Aranda, R., Dineen, S. M., Craig, R. L., Guerrieri, R. A., & Robertson, J. M. (2009) Comparison and evaluation of RNA quantification methods using viral, prokaryotic, and eukaryotic RNA over a 10 4 concentration range. Anal Biochem 387:122-127.

Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. (2003). Current protocols in molecular biology. Volume 1. New York: John Wiley & Sons, Inc.

Baltimore, D. (1970). Viral RNA-dependent DNA polymerase: RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature, 226(5252), 1209-1211.

Becker, C., Hammerle-Fickinger, A., Riedmaier, I., & Pfaffl, M. W. (2010). mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis. Methods 50, 237-243.

Boonham, N., Tomlinson, J. & Mumford, R. (2016). Molecular Methods in Plant Disease Diagnostic: Principles and Protocols. Boston: CABI.

Bustin, S. A. (2004). A-Z of Quantitative PCR. IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla: California.

Farrell, R. E. (2017). RNA Methodologies. Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Fifth Edition. USA: Academic Press.

Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., & Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855.

Habib, S. H., Saud, H. M., & Kausar, H. (2014). Efficient oil palm total RNA extraction with a total RNA extraction kit. Genet Mol Res 13, 2359-2367.

Herawati, N., Kusumawati, A., & Santoso, A. (2018). Pichia pastoris: Sel Ragi Untuk Produksi Protein Rekombinan. Berita Biologi 17 (2): 91-102.

Hizi, A., & Herschhorn, A. (2008). Retroviral reverse transcriptases (other than those of HIV-1 and murine leukemia virus): a comparison of their molecular and biochemical properties. Virus research, 134(1-2), 203-220.

154 | Metode Biologi Molekuler

Jung, Y. J., Park, G. S., Moon, J. H., Ku, K., Beak, S. H., Kim, S., ... & Kim, H. G. (2020). Comparative analysis of primer-probe sets for the laboratory confirmation of SARS-CoV-2. BioRxiv.

King, N. (2010). RT-PCR Protocols second edition. London: Humana Press. Kuang, J., Yan, X., Genders, A. J., Granata, C., & Bishop, D. J. (2018). An

overview of technical considerations when using quantitative real-time PCR analysis of gene expression in human exercise research. PloS one, 13(5), e0196438.

Lamb, L. E., Bartolone, S. N., Ward, E., & Chancellor, M. B. (2020). Rapid detection of novel coronavirus (COVID19) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Available at SSRN 3539654.

Marone, M., Mozzetti, S., De Ritis, D., Pierelli, L., & Scambia, G. (2001). Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample. Biological procedures online, 3(1), 19-25.

Nam, D. K., Lee, S., Zhou, G., Cao, X., Wang, C., Clark, T., ... & Wang, S. M. (2002). Oligo (dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly (A) priming during reverse transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(9), 6152-6156.

Nawattanapaiboon, K., Pasomsub, E., Prombun, P., Wongbunmak, A., Jenjitwanich, A., Mahasupachai, P., ... & Srikhirin, T. (2021). Colorimetric reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) as a visual diagnostic platform for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2. Analyst, 146(2), 471-477.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., & Jackson, R. B. (2014). Campbell biology. Boston: Pearson.

Sambrook, J., & Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Stahlberg, A., Hakansson, J., Xian, X., Semb, H., & Kubista, M. (2004). Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clinical chemistry, 50(3), 509-515.

Prinsip dan Aplikasi Reverse Transcription | 155

Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009.

Temin, H. M., & Mizutani, S. (1970). RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226, 1211-1213.

Tesena, P., Korchunjit, W., Taylor, J., & Wongtawan, T. (2017). Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. Journal of Equine Science, 28(4), 135-141.

Thi, V. L. D., Herbst, K., Boerner, K., Meurer, M., Kremer, L. P., Kirrmaier, D., ... & Anders, S. (2020). A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science translational medicine, 12(556).

Wong, D. W. (2006). The ABCs of gene cloning. Springer. Wan, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R. S., & Li, F. (2020). Receptor

recognition by the novel coronavirus from Wuhan: an analysis based on decade-long structural studies of SARS coronavirus. Journal of virology, 94(7).

Ying, S. Y. (2004). Complementary DNA libraries. Molecular biotechnology, 27(3), 245-252.

PRINSIP DAN APLIKASI METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)

Dr. rer. nat. Pratiwi Prananingrum, S.Si., M.Sc Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia

A. PENGENALAN METODE Istilah "Polymerase chain reaction" (PCR) pertama kali digunakan lebih

dari 30 tahun yang lalu dalam sebuah makalah yang menjelaskan amplifikasi enzimatis DNA baru (Saiki et al., 1985). Reaksi PCR menghasilkan salinan template DNA secara eksponensial. Hal ini menyebabkan hubungan kuantitatif antara konsentrasi awal template DNA yang digunakan dan jumlah produk PCR (amplikon) yang terakumulasi pada siklus tertentu. Acuan penghitungan duplikasi template DNA adalah jumlah amplikon yang terukur pada fase eksponensial. Pada fase eksponensial reaksi PCR berlangsung secara optimal, reaksi ini terus berlangsung hingga terjadi hambatan reaksi PCR oleh beberapa faktor seperti berkurangnya kadar template, reagen, serta akumulasi molekul pirofosfat. Hambatan ini mengakibatkan reaksi PCR memasuki fase plateu. Dengan demikian, penghitungan produk PCR pada fase plateu tidak dapat digunakan sebagai acuan secara akurat. Perkembangan penting dalam pemanfaatan PCR adalah pengenalan konsep pemantauan amplifikasi DNA secara real time melalui pemantauan fluoresensi (Holland et al., 1991;

174 | Metode Biologi Molekuler

DAFTAR PUSTAKA

Abravaya, K., Huff, J., Marshall, R., Merchant, B., Mullen, C., Schneider, G., & Robinson, J. (2003). Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications.

Arya, M., Shergill, I. S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., & Patel, H. R. (2005). Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert review of molecular diagnostics, 5(2), 209-219.

Baldwin, B. G. (1992). Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae. Molecular phylogenetics and evolution, 1(1), 3-16.

Berger, A. and Preiser, W. (2002) Viral genome quantification as a tool for improving patient management: the example of HIV, HBV, HCV and CMV. J. Antimicrob. Chemother. 49, 713–721.

Bhullar, S. S., Chandak, N. H., Purohit, H. J., Taori, G. M., Daginawala, H. F., & Kashyap, R. S. (2014). Determination of viral load by quantitative real-time PCR in herpes simplex encephalitis patients. Intervirology, 57(1), 1-7.

Brodmann, P. D., Ilg, E. C., Berthoud, H., & Herrmann, A. (2002). Real-time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food. Journal of AOAC International, 85(3), 646-653.

Bustin, Stephen A. "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays." Journal of molecular endocrinology 25, no. 2 (2000): 169-193.

Carpenter, C. C., Cooper, D. A., Fischl, M. A., et al. (2000) Antiretroviral therapy in adults: updated recommendations of the International AIDS Society–USA Panel. JAMA 283, 381–390.

Chen W., Dai J., Zhang H., Jiao H., Cheng J. Wu Y. (2014): Concentration and detection of tobacco etch virus from irrigation water using real-time PCR. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 38: 471–477.

Prinsip dan Aplikasi Metode Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | 175

Ginzinger, D. G. (2002). Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. Experimental hematology, 30(6), 503-512.

Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R., & Mathieu, C. (2001). An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods, 25(4), 386-401.

Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., & Raptis, L. (2010). Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. Journal of immunological methods, 355(1-2), 76-79.

GUNDRY, C. N., BERNARD, P. S., HERRMANN, M. G., REED, G. H., & WITTWER, C. T. (1999). Rapid F508del and F508C assay using fluorescent hybridization probes. Genetic testing, 3(4), 365-370.

Hart, K. W., Williams, O. M., Thelwell, N., Fiander, A. N., Brown, T., Borysiewicz, L. K., & Gelder, C. M. (2001). Novel method for detection, typing, and quantification of human papillomaviruses in clinical samples. Journal of clinical microbiology, 39(9), 3204-3212.

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., & Watson, R. (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Bio/technology, 11(9), 1026-1030.

Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., & Gelfand, D. H. (1991). Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(16), 7276-7280.

Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., & Gelfand, D. H. (1991). Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(16), 7276-7280.

Holst-Jensen, A., Rønning, S. B., Løvseth, A., & Berdal, K. G. (2003). PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). Analytical and Bioanalytical Chemistry, 375(8), 985-993.

176 | Metode Biologi Molekuler

Kelley, V. A., & Caliendo, A. M. (2001). Successful testing protocols in virology. Clinical chemistry, 47(8), 1559-1562.

Kline, M. C., Duewer, D. L., Redman, J. W., & Butler, J. M. (2003). NIST Mixed Stain Study 3: DNA quantitation accuracy and its influence on short tandem repeat multiplex signal intensity. Analytical chemistry, 75(10), 2463-2469.

Nauck, M., März, W., & Wieland, H. (2000). Evaluation of the Roche diagnostics LightCycler-Factor V Leiden Mutation Detection Kit and the LightCycler-Prothrombin Mutation Detection Kit. Clinical biochemistry, 33(3), 213-216.

Overbergh, L., Giulietti, A., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R., & Mathieu, C. (2003). The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression. Journal of biomolecular techniques: JBT, 14(1), 33.

Papayiannis, L. C. (2014). Diagnostic real-time RT-PCR for the simultaneous detection of Citrus exocortis viroid and Hop stunt viroid. Journal of virological Methods, 196, 93-99.

Permingeat, H. R., Reggiardo, M. I., & Vallejos, R. H. (2002). Detection and quantification of transgenes in grains by multiplex and real-time PCR. Journal of agricultural and food chemistry, 50(16), 4431-4436.

Ramos‐Payán, R., Aguilar‐Medina, M., Estrada‐Parra, S., González‐y‐Merchand, J. A., Favila‐Castillo, L., Monroy‐Ostria, A., & Estrada‐Garcia, I. C. E. (2003). Quantification of cytokine gene expression using an economical real‐time polymerase chain reaction method based on SYBR® green I. Scandinavian journal of immunology, 57(5), 439-445.

Rodríguez-Lázaro, D., & Hernández, M. (2013). Real-time PCR in food science: introduction. Curr. Issues Mol. Biol, 15, 25-38.

Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., & Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732), 1350-1354.

Prinsip dan Aplikasi Metode Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | 177

Slomka, M. J., Pavlidis, T., Coward, V. J., Voermans, J., Koch, G., Hanna, A., ... & Brown, I. H. (2009). Validated RealTime reverse transcriptase PCR methods for the diagnosis and pathotyping of Eurasian H7 avian influenza viruses. Influenza and other respiratory viruses, 3(4), 151-164.

Smit, M. L., Giesendorf, B. A., Vet, J. A., Trijbels, F. J., & Blom, H. J. (2001). Semiautomated DNA mutation analysis using a robotic workstation and molecular beacons. Clinical chemistry, 47(4), 739-744.

Souček, P., Pavlů, J., Medveďová, Z., Reinöhl, V., & Brzobohatý, B. (2017). Stability of housekeeping gene expression in Arabidopsis thaliana seedlings under differing macronutrient and hormonal conditions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 26(4), 415-424.

Suzuki, T., Higgins, P. J., & Crawford, D. R. (2000). Control selection for RNA quantitation. Biotechniques, 29(2), 332-337.

Tahamtan, A., & Ardebili, A. (2020). Real-time RT-PCR in COVID-19 detection: issues affecting the results. Expert review of molecular diagnostics, 20(5), 453-454.

Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J., & Brown, T. (2000). Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic acids research, 28(19), 3752-3761.

Vaitilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F., & Brignon, P. (1999). Real-time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(12), 5261-5266.

von Ahsen, N., Oellerich, M., & Schutz, E. (2000). Use of two reporter dyes without interference in a single-tube rapid-cycle PCR: α1-antitrypsin genotyping by multiplex real-time fluorescence PCR with the LightCycler. Clinical Chemistry, 46(2), 156-161.

Wabuyele, M. B., Farquar, H., Stryjewski, W., Hammer, R. P., Soper, S. A., Cheng, Y. W., & Barany, F. (2003). Approaching real-time molecular diagnostics: single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) detection for the analysis of low abundant point mutations in K-ras oncogenes. Journal of the American Chemical Society, 125(23), 6937-6945.

178 | Metode Biologi Molekuler

Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S. P., Brown, T., & Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature biotechnology, 17(8), 804-807.

Zhao Z., Yu Y., Zhang Z., Liang P., Ma Y., Li S., Wang H. (2013): A duplex, SYBR Green I-based RT-qPCR assay for the simultaneous detection of Apple chlorotic leaf spot virus and Cherry green ring mottle virus in peach. Virology Journal, 10: 255.

PRINSIP DAN APLIKASI DNA BARCODE Dwi Anggorowati Rahayu, S.Si., M.Si Universitas Negeri Surabaya

A. PENDAHULUAN Saat ini dunia telah dihadapkan pada masalah ancaman krisis

keanekaragaman hayati (biodiversitas) dan sebagian besar ancaman itu berada di Negara tropis Indonesia. Minimnya informasi biodiversitas di Indonesia, memunculkan kekhawatiran beberapa spesies hayati punah sebelum dikenali. Lamanya proses identifikasi membuat spesies Flora dan Fauna tertentu mati sebelum terekam data base-nya. Pendekatan molekuler (marka molekuler spesifik-spesies) melalui teknologi DNA Barcoding akan memberikan alternatif cepat dan tepat mengidentifikasi spesies Tumbuhan dan Hewan lokal dan Endemik Indonesia yang sudah maupun belum terdeskripsikan. Penentuan nama spesies secara tepat akan membuka peluang jangka panjang penerapan konservasi in-situ maupun ex-situ berkelanjutan dan sesuai dengan target Sustainable Development Goals (SDGs). Bahasan pada BAB 10 ini akan memberikan pola pikir, inspirasi, dan acuan bagi mahasiswa dan peneliti Indonesia untuk menggunakan teknologi terkini identifikasi spesies secara tepat, cepat dan akurat untuk menyelamatkan plasma nutfah Indonesia yang belum terdeskripsikan.

196 | Metode Biologi Molekuler

DAFTAR PUSTAKA

Ambarwati, R., Rahayu, D. A., Rachmadiarti, F., & Khaleyla, F. (2021). DNA barcoding of lamp shells (Brachiopoda: Lingula anatina) from Probolinggo, East Java, Indonesia. Biodiversitas, 22(4), 1764–1774. https://doi.org/10.13057/biodiv/d220421

Anzani, L., Madduppa, H. H., Nurjaya, I. W., & Dias, P. J. (2019). Short communication: Molecular identification of white sea squirt Didemnum sp. (tunicata, ascidiacea) colonies growing over corals in raja ampat Islands, Indonesia. Biodiversitas, 20(3), 636–642. https://doi.org/10.13057/biodiv/d200304

Barcaccia, G., Lucchin, M., & Cassandro, M. (2016). DNA barcoding as a molecular tool to track down mislabeling and food piracy. Diversity, 8(1). https://doi.org/10.3390/d8010002

Buhay, J. E. (2009). “Coi-like” sequences are becoming problematic in molecular systematic and dna barcodeng studies. Journal of Crustacean Biology, 29(1), 96–110. https://doi.org/10.1651/08-3020.1

Dudu, A., Georgescu, S. E., Popa, O., Dinischiotu, A., & Costache, M. (2011). Mitochondrial 16S and 12S rRNA sequence analysis in four salmonid species from romania. Acta Zoologica Academiae Scientiarum Hungaricae, 57(3), 233–246.

Endo, K., Noguchi, Y., Ueshima, R., & Jacobs, H. T. (2005). Novel repetitive structures, deviant protein-encoding sequences and unidentified ORFs in the mitochondrial genome of the brachiopod Lingula anatina. Journal of Molecular Evolution, 61(1), 36–53. https://doi.org/10.1007/s00239-004-0214-5

Esa, Y. B., Siraj, S. S., Daud, S. K., Rahim, K. A. A., Japning, J. R. R., & Tan, S. G. (2008). Mitochondrial DNA diversity of Tor tambroides Valenciennes (Cyprinidae) from five natural populations in Malaysia. Zoological Studies, 47(3), 360–367.

Prinsip dan Aplikasi DNA Barcode | 197

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5), 294–299. https://doi.org/10.1071/ZO9660275

Hajibabaei, M., Singer, G. A. C., Hebert, P. D. N., & Hickey, D. A. (2007). DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends in Genetics, 23(4), 167–172. https://doi.org/10.1016/j.tig.2007.02.001

Hebert, P. D. N., Cywinska, A., Ball, S. L., & DeWaard, J. R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270(1512), 313–321. https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218

Hebert, P. D. N., & Gregory, T. R. (2005). The promise of DNA barcoding for taxonomy. Systematic Biology, 54(5), 852–859. https://doi.org/10.1080/10635150500354886

Hebert, P. D. N., Stoeckle, M. Y., Zemlak, T. S., & Francis, C. M. (2004). Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biology, 2(10). https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0020312

Hubert, N., & Hanner, R. (2016). DNA Barcoding, species delineation and taxonomy: a historical perspective. DNA Barcodes, 3(1), 44–58. https://doi.org/10.1515/dna-2015-0006

Islam, M. M., Kurose, N., Khan, M. R., Nishizawa, T., Kuramoto, M., Alam, M. S., Hasan, M., Kurniawan, N., Nishioka, M., & Sumida, M. (2008). Genetic Divergence and Reproductive Isolation in the Genus Fejervarya (Amphibia: Anura) from Bangladesh Inferred from Morphological Observations, Crossing Experiments, and Molecular Analyses. Zoological Science, 25(11), 1084–1105. https://doi.org/10.2108/zsj.25.1084

Jannah, M., Hariri, M. R., Kasiamdari, R. S., & Handayani, N. S. N. (2021). The use of DNA barcoding and phylogenetic analysis to improve identification of usnea spp. based on ITS rDNA. Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology, 6(1). https://doi.org/10.22146/JTBB.58635

198 | Metode Biologi Molekuler

Kang, Y., Deng, Z., Zang, R., & Long, W. (2017). DNA barcoding analysis and phylogenetic relationships of tree species in tropical cloud forests. Scientific Reports, 7(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/s41598-017-13057-0

Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., & Janzen, D. H. (2005). Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(23), 8369–8374. https://doi.org/10.1073/pnas.0503123102.

Kumar S, Stecher G, Tamura K. 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. Mol Biol Evol. doi: 10.1093/molbev/msw054.

Letchuman, S. (2018). Short Introduction of DNA Barcoding. International Journal of Research, 5(4), 673–686.

Listyorini, D., Winaris, N., Prananingrum, P., Kartikasari, N., Rahayu, D. A., Khasna, E. N., & Kahrisma, V. D. (2011). Biologi Molekuler. http.//www.erlangga.co.id

Madduppa, H., Taurusman, A. A., Subhan, B., Anggraini, N. P., Fadillah, R., & Tarman, K. (2017). Short communication: Dna barcoding reveals vulnerable and not evaluated species of sea cucumbers (Holothuroidea and Stichopodidae) from Kepulauan Seribu reefs, Indonesia. Biodiversitas, 18(3), 893–898. https://doi.org/10.13057/biodiv/d180305

Nugroho, ED, Rahayu, DA., AMin, M., Lestari, U. (2015). Journal of Biological Researches. Journal of Biological Researches, 21(1), 41–45.

Popa, L. O., Popa, O. P., Gargarea, P., & Murariu, D. (2007). Sequence analysis of the 5’ COI gene region from Dama dama (Linnaeus, 1758) (Mammalia : Cervidae). Travaux Du Museum National d’Histoire Naturelle Grigore Antipa, 50, 537–542.

Rahayu, DA & Nugroho, E. (2014). Pendekatan Fenetik Taksonomi Dalam Identifikasi Kekerabatan Dan Pengelompokkan Ikan Genus Tor Di Indonesia. Bioedukasi, 7(1), 60–64. https://doi.org/https://doi.org/10.20961/bioedukasi-uns.v7i1.2844

Prinsip dan Aplikasi DNA Barcode | 199

Rahayu, D. A., & Jannah, M. (2019). DNA Barcode Hewan dan Tumbuhan Indonesia. 65, 1–20. https://osf.io/ty7e5/

Rahayu, D. A., Nugroho, E. D., Haryono, Kurniawan, N., & Azrianingzih, R. (2012). DNA Barcode dan Haplotype Network Ikan Lokal dari Telaga Banyu Biru Kabupaten Pasuruan. Prosiding Seminar Nasional Ikan Ke-8, 1993, 67–75.

Rahayu, D. A., Nugroho, E. D., & Listyorini, D. (2019). DNA Barcoding Ikan Introduksi Khas Telaga Sari, Kabupaten Pasuruan. Biotropika: Journal of Tropical Biology, 7(2), 51–62. https://doi.org/10.21776/ub.biotropika.2019.007.02.2

Ratnasingham, S., & Hebert, P. D. N. (2007). BOLD: The Barcode of Life Data System: Barcoding. Molecular Ecology Notes, 7(3), 355–364. https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2007.01678.x

SUNARYO, W. (2015). Aplikasi DNA Barcoding untuk analisis keragaman genetik lai-durian (Durio zibethinus x kutejensis) asal Kalimantan Timur. 1(September), 1273–1277. https://doi.org/10.13057/psnmbi/m010602

Trisyani, N., & Rahayu, D. A. (2020). DNA barcoding of razor clam solen spp. (solinidae, bivalva) in Indonesian beaches. Biodiversitas, 21(2). https://doi.org/10.13057/biodiv/d210207

Waugh, J., Huynen, L., Millar, C., & Lambert, D. (2008). DNA barcoding of animal species - Response to DeSalle [1]. BioEssays, 30(1), 92–93. https://doi.org/10.1002/bies.20698

White, T. J., Bruns, T., Lee, S., & Taylor, J. (1990). Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal Rna Genes for Phylogenetics. PCR Protocols, January, 315–322. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-372180-8.50042-1

Wong, E. H. K., & Hanner, R. H. (2008). DNA barcoding detects market substitution in North American seafood. Food Research International, 41(8), 828–837. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2008.07.005

Wong, E. H. K., Shivji, M. S., & Hanner, R. H. (2009). Identifying sharks with DNA barcodes: Assessing the utility of a nucleotide diagnostic approach. Molecular Ecology Resources, 9(SUPPL. 1), 243–256. https://doi.org/10.1111/j.1755-0998.2009.02653.x

PRINSIP DAN APLIKASI eDNA

Dr. Eng. Sapto Andriyono, S.Pi., M.T Universitas Airlangga A. PENGENALAN METODE

DNA lingkungan (eDNA) dapat didefinisikan sebagai bagian kajian molekuler yang menggunakan objek materi genetik yang koleksi dan diekstraksi dari sampel lingkungan seperti tanah, air, dan bahkan udara. Studi eDNA yang berkembang sangat pesat dan telah membuktikan dapat diaplikasikan dalam beberapa bidang yang sebelumnya belum pernah dilakukan sebagai contoh aplikasinya untuk mendeteksi spesies dan melakukan analisis genetik yang sangat berguna dalam upaya konservasi, pengelolaan, dan penelitian. Hal ini dilakukan karena metode pendekatan molekuler ini (eDNA) dalam mengumpulkan sampel dan material genetic objek penelitian sangat praktis. Sejumlah hasil-hasil penelitian tentang aplikasi eDNA telah menunjukkan keberhasilan dan jumlah kegiatan penelitiannya meningkat pesat dalam beberapa tahun terakhir. Pada tulisan ini, kami akan mendiskusikan prinsip kerja, aplikasi dan manfaat eDNA pada studi ekologi khususnya lingkungan perairan (akuatik).

Prinsip dan Aplikasi eDNA | 215

DAFTAR PUSTAKA

Alam MJ, Kim N-K, Andriyono S, Choi H-k, Lee J-H, Kim H-W. 2020. Assessment of fish biodiversity in four Korean rivers using environmental DNA metabarcoding. PeerJ 8: e9508.

Andriyono S, ALAM MJ, KIM H-W. 2019. Environmental DNA (eDNA) metabarcoding: Diversity study around the Pondok Dadap fish landing station, Malang, Indonesia. Biodiversitas Journal of Biological Diversity 20.

Andriyono, S., Alam, M.J., Kim, H.-W. 2021. Marine Fish Detection by Environmental DNA (eDNA) Metabarcoding Approach in the Pelabuhan Ratu Bay, Indonesia. International Journal on Advanced Science, Engineering and Information Technology, 2021, 11(2), :729-737

Barnes MA, Turner CR. 2016. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conservation Genetics 17: 1-17.

Deiner K, Altermatt F. 2014. Transport distance of invertebrate environmental DNA in a natural river. PloS one 9: e88786.

Demestre M, Muntadas A, de Juan S, Mitilineou C, Sartor P, Mas J, Kavadas S, Martín J. 2015. The need for fine-scale assessment of trawl fishing effort to inform on an ecosystem approach to fisheries: Exploring three data sources in Mediterranean trawling grounds. Marine Policy 62: 134-143.

Egan SP, Barnes MA, Hwang CT, Mahon AR, Feder JL, Ruggiero ST, Tanner CE, Lodge DM. 2013. Rapid invasive species detection by combining environmental DNA with light transmission spectroscopy. Conservation Letters 6: 402-409.

Ficetola GF, Miaud C, Pompanon F, Taberlet P. 2008. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters 4: 423-425.

216 | Metode Biologi Molekuler

Foote AD, Thomsen PF, Sveegaard S, Wahlberg M, Kielgast J, Kyhn LA, Salling AB, Galatius A, Orlando L, Gilbert MTP. 2012. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PloS one 7: e41781.

Goldberg CS, Sepulveda A, Ray A, Baumgardt J, Waits LP. 2013. Environmental DNA as a new method for early detection of New Zealand mudsnails (Potamopyrgus antipodarum). Freshwater Science 32: 792-800.

Hopkins G, Freckleton RP. 2002. Declines in the numbers of amateur and professional taxonomists: implications for conservation. Animal Conservation 5: 245-249.

Jerde C, Mahon A, Chadderton W, Lodge D. 2011. Sight unseen detection of environmental DNA for surveillance of aquatic organisms at low densities. Conservation Letters, in press, doi 10: 1111.

Jørgensen T, Haile J, Möller P, Andreev A, Boessenkool S, Rasmussen M, Kienast F, Coissac E, Taberlet P, Brochmann C. 2012. A comparative study of ancient sedimentary DNA, pollen and macrofossils from permafrost sediments of northern Siberia reveals long‐term vegetational stability. Molecular Ecology 21: 1989-2003.

Lang M, Baldwin C. 1996. The Diving for Science… 1996," Methods and Techniques of Underwater Research".

Levy-Booth DJ, Campbell RG, Gulden RH, Hart MM, Powell JR, Klironomos JN, Pauls KP, Swanton CJ, Trevors JT, Dunfield KE. 2007. Cycling of extracellular DNA in the soil environment. Soil Biology and Biochemistry 39: 2977-2991.

Lindahl T. 1993. Instability and decay of the primary structure of DNA. nature 362: 709-715.

Lodge DM, Williams S, MacIsaac HJ, Hayes KR, Leung B, Reichard S, Mack RN, Moyle PB, Smith M, Andow DA. 2006. Biological invasions: recommendations for US policy and management. Ecological applications 16: 2035-2054.

Mahon AR, Jerde CL, Galaska M, Bergner JL, Chadderton WL, Lodge DM, Hunter ME, Nico LG. 2013. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PloS one 8: e58316.

Prinsip dan Aplikasi eDNA | 217

McManus JW, Reyes Jr RB, Nanola Jr CL. 1997. Effects of some destructive fishing methods on coral cover and potential rates of recovery. Environmental management 21: 69-78.

Miya M, Sato Y, Fukunaga T, Sado T, Poulsen J, Sato K, Minamoto T, Yamamoto S, Yamanaka H, Araki H. 2015. MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Royal Society open science 2: 150088.

Niamaimandi N, Valinassab T, Daryanabard R. 2018. Biodiversity of Demersal Species from Trawl Surveys in the Iranian Waters of the Persian Gulf. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 18: 1345-1353.

Nielsen KM, Johnsen PJ, Bensasson D, Daffonchio D. 2007. Release and persistence of extracellular DNA in the environment. Environmental biosafety research 6: 37-53.

Olson ZH, Briggler JT, Williams RN. 2012. An eDNA approach to detect eastern hellbenders (Cryptobranchus a. alleganiensis) using samples of water. Wildlife Research 39: 629-636.

Pedersen MW, Ginolhac A, Orlando L, Olsen J, Andersen K, Holm J, Funder S, Willerslev E, Kjær KH. 2013. A comparative study of ancient environmental DNA to pollen and macrofossils from lake sediments reveals taxonomic overlap and additional plant taxa. Quaternary Science Reviews 75: 161-168.

Petovic S, Markovic O. 2013. Degradation of benthic communities using demersal trawling. Poljoprivreda i Sumarstvo 59: 157.

Rees HC, Bishop K, Middleditch DJ, Patmore JR, Maddison BC, Gough KC. 2014. The application of eDNA for monitoring of the Great Crested Newt in the UK. Ecology and Evolution 4: 4023-4032.

Renshaw MA, Olds BP, Jerde CL, McVeigh MM, Lodge DM. 2015. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a phenol–chloroform–isoamyl alcohol DNA extraction. Molecular ecology resources 15: 168-176.

218 | Metode Biologi Molekuler

Sato Y, Miya M, Fukunaga T, Sado T, Iwasaki W. 2018. MitoFish and MiFish pipeline: a mitochondrial genome database of fish with an analysis pipeline for environmental DNA metabarcoding. Molecular biology and evolution 35: 1553-1555.

Stager JC, Sporn LA, Johnson M, Regalado S. 2015. Of paleo-genes and perch: what if an “alien” is actually a native? PLoS One 10: e0119071.

Takahara T, Minamoto T, Doi H. 2013. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PloS one 8: e56584.

Teletchea F. 2009. Molecular identification methods of fish species: reassessment and possible applications. Reviews in Fish Biology and Fisheries 19: 265.

Thomsen PF, Kielgast J, Iversen LL, Møller PR, Rasmussen M, Willerslev E. 2012a. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS one 7: e41732.

Thomsen PF, Kielgast J, Iversen LL, Wiuf C, Rasmussen M, Gilbert MTP, Orlando L, Willerslev E. 2012b. Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA. Molecular ecology 21: 2565-2573.

Turner CR, Uy KL, Everhart RC. 2015. Fish environmental DNA is more concentrated in aquatic sediments than surface water. Biological Conservation 183: 93-102.

Turner CR, Miller DJ, Coyne KJ, Corush J. 2014a. Improved methods for capture, extraction, and quantitative assay of environmental DNA from Asian bigheaded carp (Hypophthalmichthys spp.). PloS one 9: e114329.

Turner CR, Barnes MA, Xu CC, Jones SE, Jerde CL, Lodge DM. 2014b. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods in Ecology and Evolution 5: 676-684.

Wafar M, Venkataraman K, Ingole B, Khan SA, LokaBharathi P. 2011. State of knowledge of coastal and marine biodiversity of Indian Ocean countries. PLoS one 6: e14613.

Prinsip dan Aplikasi eDNA | 219

Wilcox TM, Schwartz MK, McKelvey KS, Young MK, Lowe WH. 2014. A blocking primer increases specificity in environmental DNA detection of bull trout (Salvelinus confluentus). Conservation Genetics Resources 6: 283-284.

Wilcox TM, McKelvey KS, Young MK, Jane SF, Lowe WH, Whiteley AR, Schwartz MK. 2013. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PloS one 8: e59520.

Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Brand TB, Gilbert MTP, Shapiro B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A. 2003. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science 300: 791-795.

Willerslev E, Cappellini E, Boomsma W, Nielsen R, Hebsgaard MB, Brand TB, Hofreiter M, Bunce M, Poinar HN, Dahl-Jensen D. 2007. Ancient biomolecules from deep ice cores reveal a forested southern Greenland. Science 317: 111-114.

Yamamoto S, Minami K, Fukaya K, Takahashi K, Sawada H, Murakami H, Tsuji S, Hashizume H, Kubonaga S, Horiuchi T. 2016. Environmental DNA as a ‘snapshot’of fish distribution: A case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PloS one 11: e0149786.

PRINSIP DAN APLIKASI CRISPR-Cas9

Dr. rer. nat. Mo Awwanah, S.Si., M.Sc Universitas Pertahanan Republik Indonesia A. PENGENALAN CRISPR-Cas9 1. Metode Pengeditan Genom

Genome editing (GE) merupakan suatu teknik pengeditan sekuens DNA pada genom yang dilakukan secara spesifik dan terarah (Manghwar et. al., 2019). Pengeditan informasi genetik secara spesifik dan terarah akan menghasilkan modifikasi yang akurat dan sangat bermanfaat untuk memahami fungsi dari gen yang menjadi target (Wang et. al., 2016). Mekanisme GE mengacu pada pengenalan sekuens DNA spesifik dari lokus gen yang menjadi target (Doudna dan Charpentier, 2014) untuk memperkenalkan mutasi baik dalam bentuk insersi dan/atau delesi (indels), substitusi basa nukleotida (Manghwar et. al., 2019), penggantian alel (Bortesi dan Fischer, 2015), maupun penambahan atau modifikasi salinan/ copy gen (Braatz et. al., 2017). Pada prinsipnya, GE memerlukan aktivitas suatu perangkat molekuler yang terdiri dari dua komponen utama, yaitu: 1) domain pengikat DNA (DNA-binding domain) yang memediasi pengenalan dan pengikatan sekuens DNA spesifik, dan 2) domain efektor (effector domain) yang memungkinkan terjadinya pemotongan DNA serta pengaturan transkripsi di sekitar situs pengikatan

262 | Metode Biologi Molekuler

konstruksi vektor/ plasmid, transformasi untuk mengirimkan kompleks sgRNA-Cas9 ke dalam sel organisme yang akan direkayasa, validasi atau screening terhadap hasil pengeditan dan selanjutnya analisis output dengan mengamati perubahan karakter yang dihasilkan dari pengeditan gen tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Ali, Z., Abul-faraj, A., Li, L., Ghosh, N., Piatek, M., Mahjoub, A., Aouida, M., Piatek, A., Baltes, N.J., Voytas, D.F., et al. (2015). Efficient virusmediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Mol. Plant, DOI: 10.1016/j.molp.2015.02.011.

Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., dan Jinek, M. (2014). Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature, 513(7519), 569–573. https://doi.org/10.1038/nature13579.

Awwanah, M. (2020). Characterization of Populus x canescens LysM-Receptor like kinases LYK4/LYK5 and LysM-receptor like protein LYM2 and their roles in chitin signaling (Doctoral thesis). Retrieved from https://ediss.uni-goettingen.de.

Bae, S., Park, J., Kim, J.S. (2014). Cas-OFFinder: a fast and versa- tile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 30(10): 1473. DOI: 10.1093/bioinformatics/btu048.

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709–1712 (2007). DOI: 10.1126/science.1138140; pmid: 17379808.

Binns, A.N., Thomashaw, M.F. (1988). Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants. Ann. Rev. Microbiol. 42: 575- 606.

Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A., Ehrlich, S.D. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 151: 2551-2561. DOI: 10.1099/mic.0.28048-0; pmid: 16079334.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 263

Bortesi, L. dan Fischer, R. (2015). The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology advances 33: 41-52. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2014.12.006.

Braatz, J., Harloff, H-J., Mascher, M., Stein, N., Himmelbach, A., Jung, C. (2017). CRISPR-Cas9 targeted mutagenesis leads to simultaneous modification of different homoeologous gene copies in polyploid oilseed rape (Brassica napus). Plant Physiology, Volume 174 (2): 935-942. DOI: 10.1104/pp.17.00426.

Brazelton, V. A. Jr., Scott Zarecor, Y., Wright, D.A., Wang, Y., Liu, J., Chen, K., Yang, B., Lawrence-Dill, C.J. (2015). A quick guide to CRISPR sgRNA design tools. GM Crops & Food, 6:266-276. DOI: 10.1080/21645698.2015.1137690.

Bryant, P.E., and Johnston, P.J. (1993). Restriction-endonuclease-induced DNA double-strand breaks and chromosomal aberrations in mammalian cells. Mutation research/ Genetic toxicology, volume 299: 289-296. DOI: 10.1016/0165-1218(93)90105-M.

Brouns, S.J.J., et. al. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 321: 960-964. DOI: 10.1126/science.1159689; pmid: 18703739.

Char, S. N., Neelakandan, A. K., Nahampun, H., Frame, B., Main, M., Spalding, M. H., Becraft, P. W., Meyers, B. C., Walbot, V., Wang, K., Yang, B. (2017). An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize. Plant biotechnology journal, 15(2): 257-268. DOI:10.1111/pbi.12611.

Chen, H., Choi, J., Bailey, S. (2014). Cut site selection by the two nuclease domains of the Cas9 RNA-guided endonuclease. J. Biol. Chem. 289 (19): 13284-13294.

Christian, M., Cermak, T., Doyle, E.L., Schmidt, C., Zhang, F., Hummel, A., Bogdanove, A.J., Voytas, D.F. (2010). Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186: 757–761. DOI: 10.1534/genetics.110.120717.

Chylinski, K., Le Rhun, A., dan Charpentier, E. (2013). The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems. RNA biology, 10(5): 726-737. DOI: 10.4161/rna.24321.

264 | Metode Biologi Molekuler

Cho, S.W., Kim, S., Kim, Y., Kweon, J., Kim, H.S., et. al. (2014). Analysis of off-target effects of CRISPR/Casderived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24: 132-141.

Clough, S. J., dan Bent, A. F. (1998). Floral dip: A simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 16(6): 735-743. DOI: 10.1046/j.1365-313X.1998.00343.x.

Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., Zhang, F. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science, Vol. 339: 819-823.

Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., dan Peng, S. (2018). Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools. Interdisciplinary sciences, computational life sciences, 10(2): 455-465. DOI: 10.1007/s12539-018-0298-z.

Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C.M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z.A., Eckert, M.R., Vogel, J., Charpentier, E. (2011). CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471: 602-607. DOI: 10.1038/nature09886; pmid: 21455174.

Deveau, H., Barrangou, R., Garneau, J.E., Labonté, J., Fremaux, C., Boyaval, P., Romero, D.A., Horvath, P., Moineau, S. (2008). Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190: 1390-1400. DOI: 10.1128/JB.01412-07; pmid: 18065545.

Doench, J. G., Hartenian, E., Graham, D. B., Tothova, Z., Hegde, M., Smith, I., Sullender, M., Ebert, B. L., Xavier, R. J., and Root, D. E. (2014). Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature biotechnology, 32(12): 1262-1267. DOI: 10.1038/nbt.3026.

Doench, J. G., Fusi, N., Sullender, M., Hegde, M., Vaimberg, E. W., Donovan, K. F., … Root, D. E. (2016). Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology, 34(2): 184-191. DOI:10.1038/nbt.3437.

Doudna, J.A. dan Charpentier, E. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346, 12580096. DOI: 10.1126/science.12580096.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 265

Endo, M., Mikami, M., Toki, S. (2015). Multigene knockout utiliz- ing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell. Physiol. 56(1): 41-47.

Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one, 3(11): e3647. DOI: 10.1371/journal.pone.0003647.

Faulkner, C., Petutschnig, E., Benitez-Alfonso, Y., Beck, M., Robatzek, S., Lipka, V., & Maule, A. J. (2013). LYM2-dependent chitin perception limits molecular flux via plasmodesmata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(22): 9166-9170. DOI: 10.1073/pnas.1203458110.

Filippo, J.S., Sung, P., Klein, H. (2008). Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77: 229-57.

Gaj, T., Gersbach, C.A., Barbas, C.F. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotech, 31 (7): 397-405. DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004.

Garneau, J.E., Dupuis, M.E., Villion, M., Romero, D.A., Barrangou, R., et. al. (2010). The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 468: 67-71.

Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. (2012). Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U.S.A, 109: E2579–86.

Gibson, D.G., Young, L., Chuang, R-Y., Venter, J.C., Hutchison III2, C.A., Smith, H.O. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, Vol. 6(5): 343-345. DOI: 10.1038/NMETH.1318.

Godde, J.S., Bickerton, A. (2006). The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes: evidence of horizontal transfer among prokaryotes. J. Mol. Evol. 62: 718. 10.1007/s00239-005-0223-z.

Gong, B. Q., Xue, J., Zhang, N., Xu, L., Yao, X., Yang, Q. J., … Li, J. F. (2017). Rice chitin receptor OsCEBiP is not a transmembrane protein but targets the plasma membrane via a GPI anchor. Molecular Plant, 10(5): 767-770. DOI: 10.1016/j.molp.2016.12.005.

266 | Metode Biologi Molekuler

Grison, M. S., Brocard, L., Fouillen, L., Nicolas, W., Wewer, V., Dörmann, P., … Bayer, E. M. (2015). Specific membrane lipid composition is important for plasmodesmata function in arabidopsis. Plant Cell, 27(4): 1228-1250. DOI: 10.1105/tpc.114.135731.

Guy, C.P., Majerník, A.I., Chong, J.P.J., Bolt, E.L. (2004). A novel nuclease-ATPase (Nar71) from archaea is part of a proposed thermophilic DNA repair system. Nucleic Acids Res. 32: 6176-6186. DOI: 10.1093/nar/gkh960; pmid: 15570068.

Haft, D.H., Selengut, J., Mongodin, E.F., Nelson, K.E. (2005). A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLOS Comput. Biol. 1. DOI: 10.1371/journal. pcbi.0010060; pmid: 16292354.

Hale, C.R., et. al. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell 139, 945–956 (2009). DOI: 10.1016/j.cell.2009.07.040; pmid: 19945378.

Hatoum-Aslan, A., Maniv, I., Marraffini, L.A. (2011). Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 21218-21222. DOI: 10.1073/pnas.1112832108; pmid: 22160698.

Haurwitz, R.E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J.A. (2010). Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science 329: 1355-1358. DOI: 10.1126/ science.1192272; pmid: 20829488.

Hayafune, M., Berisio, R., Marchetti, R., Silipo, A., Kayama, M., Desaki, Y., … Shibuya, N. (2014). Chitin-induced activation of immune signaling by the rice receptor CEBiP relies on a unique sandwich-type dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(3). DOI: 10.1073/pnas.1312099111.

Heler, R., Samai, P., Modell, J.W., Weiner, C., Goldberg, G.W., et. al. (2015). Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation. Nature, 519 (7542): 199-202.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 267

Honig, A., Marton, I., Rosenthal, M., Smith, J.J., Nicholson, M.G., Jantz, D., Zuker, A., dan Vainstein, A. (2015). Transient expression of virally delivered meganuclease in planta generates inherited genomic deletions. Mol. Plant, DOI: 10.1016/j.molp.2015. 04.001.

Hsu, P.D., Scott, D.A., Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V., et. al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol, 31: 827-32. DOI: 10.1038/nbt.2647.

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429-5433. pmid: 3316184.

Jansen, R., van Embden, J.D.A., Gaastra, W., Schouls, L.M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43(6): 1565-75. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x.

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L.A. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31(3): 233-39.

Jiang, F. Dan Doudna, J.A. (2017). CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu. Rev. Biophys., 46: 505-529. DOI: 10.1146/annurev-biophys062215-010822.

Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., Charpentier, E. (2012). A programmable dual- RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337: 816-21.

Jinek, M., Jiang, F., Taylor, D.W., Sternberg, S.H., Kaya, E., Ma, E., Anders, C., Hauer, M., Zhou, K., Lin, S., Kaplan, M., Lavarone, A.T., Charpentier, E., Nogales, E., Doudna, J.A. (2014). Structures of Cas9 endonuclease reveal RNA-mediated conformational activation. Science, 343 (6176): 1247997. DOI: 10.1126/science.1247997.

Kaku, H., Nishizawa, Y., Ishii-Minami, N., Akimoto-Tomiyama, C., Dohmae, N., Takio, K., Minami, E., Shibuya, N. (2006). Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

268 | Metode Biologi Molekuler

United States of America, 103(29): 11086-11091. DOI: 10.1073/pnas.79.20.6304.

Kouzai, Y., Mochizuki, S., Nakajima, K., Desaki, Y., Hayafune, M., Miyazaki, H., … Nishizawa, Y. (2014). Targeted gene disruption of OsCERK1 reveals its indispensable role in chitin perception and involvement in the peptidoglycan response and immunity in rice. Molecular Plant-Microbe Interactions, 27(9): 975-982. DOI: 10.1094/MPMI-03-14-0068-R.

Li, T., Huang, S., Zhao, X., Wright, D.A., Carpenter, S., Spalding, M.H., Weeks, D.P., Yang, B. (2011). Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Research, Volume 39 (14): 6315-6325. DOI: 10.1093/nar/gkr188.

Li, Y., Mendiratta, S., Ehrhardt, K. et. al. (2016). Exploiting the CRISPR/Cas9 PAM constraint for single-nucleotide resolution interventions. PLoS One 11(1): e0144970.

Lieber, M.R. (2010). The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu. Rev. Biochem. 79: 181-211.

Lillestøl, R.K., Redder, P., Garrett, R.A., Brügger, K. (2006). A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea 2 (1): 59-72. DOI: 10.1155/2006/542818.

Liu, X., Homma, A., Sayadi, J., Yang, S., Ohashi, J., & Takumi, T. (2016). Sequence features associated with the cleavage efficiency of CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports, 6, 19675. DOI: 10.1038/srep19675.

Ma, X., Zhang, Q., Zhu, Q., Liu, W., Chen, Y., Qiu, R., … Liu, Y. G. (2015). A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Molecular Plant, 8(8), 1274–1284. DOI: 10.1016/j.molp.2015.04.007.

Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y.-G. (2016). CRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing inPlants: Developments and Applications. Molecular plant, 9: 961-974. DOI: 10.1016/j.molp.2016.04.009.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 269

Ma, X. dan Liu, Y.-G. (2016). CRISPR/Cas9-Based Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Current Protocols in Molecular Biology, 31.6.1-31.6.21. DOI:10.1002/cpmb.10.

Makarova, K.S., Aravind, L., Grishin, N.V., Rogozin, I.B., Koonin, E.V. (2002). A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis. Nucleic Acids Res. 30: 482-496. DOI: 10.1093/nar/ 30.2.482; pmid: 11788711.

Makarova, K.S., Grishin, N.V., Shabalina, S.A., Wolf, Y.I., Koonin, E.V. (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: Computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct 1(7). DOI: 10.1186/1745-6150-1-7; pmid: 16545108.

Makarova, K.S., Aravind, L., Wolf, Y.I., Koonin, E.V. (2011a). Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems. Biol. Direct 6, 38. DOI: 10.1186/1745-6150-6-38; pmid: 21756346.

Makarova et. al. (2011b). Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9: 467-477. DOI: 10.1038/nrmicro2577; pmid: 21552286.

Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Iranzo, J., et. al. (2020). Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nature Reviews Microbiology volume 18: 67-83. DOI: 10.1038/s41579-019-0299-x.

Mali, P., Aach, J., Stranges, P.B., Esvelt, K.M., Moosburner, M., et. al. (2013). CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31: 833-838.

Manghwar, H., Lindsey, K., Zhang, X., Jin, S. (2019). CRISPR/Cas system: recent advances and future prospects for genome editing. Trends in Plant Science, Vol. 24, No. 12. DOI: 10.1016/j.tplants.2019.09.006.

Mehta, A., Haber, J.E. (2014). Sources of DNA double-strand breaks and models for recombinational DNA repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. DOI: 10.1101/cshperspect. a016428.

270 | Metode Biologi Molekuler

Miya, A., Albert, P., Shinya, T., Desaki, Y., Ichimura, K., Shirasu, K., … Shibuya, N. (2007). CERK1, a LysM receptor kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(49): 19613-19618. DOI: 10.1073/pnas.0705147104.

Mojica, F.J., Díez-Villaseñor, C., Soria, E., Juez, G. (2000). Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol. 36: 244-246. DOI: 10.1046/ j.1365-2958.2000.01838.x; pmid: 10760181.

Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60: 174-182. DOI: 10.1007/s00239-004-0046-3; pmid: 15791728.

Morais, P., Adachi, H., Yu, Y-T. 2020. Suppression of nonsense mutations by new emerging technologies. Int. J. Mol. Sci., 21: 4394. DOI:10.3390/ijms21124394.

Muhr, M., Paulat, M., Awwanah, M., Mascha, B., Thomas, T. (2018). CRISPR/Cas9-mediated knockout of Populus BRANCHED1 and BRANCHED2 orthologs reveals a major function in bud outgrowth control. Tree Physiology, 38: 1588-1597. DOI: 10.1093/treephys/tpy088.

Nam, K.H., et. al. (2012). Cas5d protein processes pre-crRNA and assembles into a cascade-like interference complex in subtype I-C/Dvulg CRISPR-Cas system. Structure 20: 1574-1584. DOI: 10.1016/j.str.2012.06.016; pmid: 22841292.

Negritto, M. C. (2010). Repairing double-strand DNA breaks. Nature Education 3(9):26.

Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology, 151: 653-663. DOI: 10.1099/mic.0.27437-0; pmid: 15758212.

Povirk, L.F. (2012). Processing of damaged DNA ends for double-strand break repair in mammalian cells. ISRN Molecular Biology. DOI:10.5402/2012/345805.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 271

Prykhozhij, S.V., Rajan, V., Gaston, D., Berman, J.N. (2015). CRISPR MultiTargeter: A Web Tool to Find Common and Unique CRISPR Single Guide RNA Targets in a Set of Similar Sequences. s. PLoS ONE 10(3): e0119372. DOI: 10.1371/journal.pone.0119372.

Puchta, H. (2017). Applying CRISPR/Cas for genome engineering in plants: the best is yet to come. Curr. Opin. Plant Biol. 36: 1-8. DOI: 10.1016/j.pbi.2016.11.011.

Ran, F.A., Hsu, P.D., Lin, C.Y., Gootenberg, J.S., Konermann, S., et. al. (2013). Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 154: 1380-1389.

Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. (2015). The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochimie, 117: 119-128. DOI: 10.1016/j.biochi.2015.03.025.

Ren, C., Liu, X., Zhang, Z., Wang, Y., Duan, W., Li, S., Liang, Z. (2016). CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay (Vitis vinifera L.). Scientific report, 6: 32289. DOI: 10.1038/srep32289.

Rong, Y.S., Golic, K.G. (2000). Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science 288: 2013-2018. DOI: 10.1126/science.288.5473.2013.

Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. (1994). Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol. Cell. Biol. 14(12): 8096-8106. Pmid: 7969147.

Rouillon, C., et. al. (2013). Structure of the CRISPR interference complex CSM reveals key similarities with cascade. Mol. Cell 52: 124-134. DOI: 10.1016/j.molcel.2013.08.020; pmid: 24119402.

Rudin, N., Sugarman, E., Haber, J. E. (1989). Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122 (3): 519-534. Pmid: 2668114.

Sapranauskas, R. et. al. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 39: 9275-9282. DOI: 10.1093/nar/gkr606; pmid: 21813460.

272 | Metode Biologi Molekuler

Scherer, S., Davis, R. W. (1979). Replacement of chromosome segments with altered DNA sequences constructed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 4951-4955. DOI: 10.1073/pnas.76.10.4951.

Semenova, E., Jore, M.M., Datsenko, K.A., Semenova, A., Westra, E.R., et. al. (2011). Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. PNAS 108 (25): 10098-10103.

Shah, S.A., Erdmann, S., Mojica, F.J.M., Garrett, R.A. (2013). Protospacer recognition motifs: Mixed identities and functional diversity. RNA Biol. 10: 891-899. DOI: 10.4161/rna.23764; pmid: 23403393.

Shimizu, T., Nakano, T., Takamizawa, D., Desaki, Y., Ishii-Minami, N., Nishizawa, Y., … Shibuya, N. (2010). Two LysM receptor molecules, CEBiP and OsCERK1, cooperatively regulate chitin elicitor signaling in rice. Plant Journal, 64(2): 204-214. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2010.04324.x.

Shinya, T., Motoyama, N., Ikeda, A., Wada, M., Kamiya, K., Hayafune, M., … Shibuya, N. (2012). Functional characterization of CEBiP and CERK1 homologs in arabidopsis and rice reveals the presence of different chitin receptor systems in plants. Plant and Cell Physiology, 53(10): 1696-1706. DOI: 10.1093/pcp/pcs113.

Smithies, O, Gregg, R.G., Boggs, S.S., Koralewski, M.A., Kucherlapati, R.S. (1985). Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature 317: 230-234. DOI: 10.1038/317230a0.

Sonoda, E., Hochegger, H., Saberi, A., Taniguchi, Y., Takeda, S. (2006). Differential usage of non-homologous end-joining and homologous recombination in double strand break repair. DNA repair, volume 5 (9–10): 1021-1029. DOI: 10.1016/j.dnarep.2006.05.022.

Sternberg, S.H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E.C., Doudna, J.A. (2014). DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507 (7490): 62-67.

Strauß, A. dan Lahaye, T. (2013). Zinc fingers, TAL effectors, or Cas9-based DNA binding proteins: what’s best for targeting desired genome loci?. Molecular plants, Volume 6 (5): 1384-1387. DOI: 10.1093/mp/sst075.

Prinsip dan Aplikasi CRISPR-Cas9 | 273

Tang, T-H., Bachellerie, J.P., Rozhdestvensky, T., Bortolin, M-L., Huber, H., Drungowski, M., Elge, T., Brosius, J., Hüttenhofer, A. (2002). Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 7536-7541. DOI: 10.1073/pnas.112047299; pmid: 12032318.

Tang, X., Lowder, L.G., Zhang, T., Malzahn, A.A., Zheng, X., Voytas, D.F., Zhong, Z., Chen, Y., Ren, Q., Li, Q., Kirkland, E.R., Zhang, Y., Qi, Y. (2017). A CRISPR–Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat. Plants 3, 17018.

Terns, M.P. dan Terns, R.M. (2011). CRISPR-Based Adaptive Immune Systems. Curr Opin Microbiol. 2011 June ; 14(3): 321–327. doi:10.1016/j.mib.2011.03.005.

Thyme, S.B., Akhmetova, L., Montague, T.G., Valen, E., Schier, A.F. (2016). Internal guide RNA interactions interfere with Cas9-mediated cleavage. Nat. Commun. 7, 11750.

Tyson, G.W. dan Banfield, J.F. (2008). Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses. Environ. Microbiol. 10: 200-7. DOI: 10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x.

Waibel, F. dan Filipowicz, W. (1990). U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribed by RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNA polymerase II-transcribed UsnRNA genes. Nucleic Acids Res. 18:3451-3458.

Wang, T., Wei, J.J., Sabatini, D.M. dan Lander, E.S. (2014). Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science 343: 80-84.

Wang, H., La Russa, M., Qi L.S. (2016). CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annu. Rev. Biochem, 85: 227–64. DOI: 10.1146/annurev-biochem-060815-014607.

Wiedenheft, B., van Duijn, E., Bultema, J.B., Bultema, J., Waghmare, S.P., et. al. (2011). RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions. PNAS 108 (25): 10092-10097.

274 | Metode Biologi Molekuler

Wood, A.J., Lo, T-W., Zeitler, B., Pickle, C.S., Ralston, E.J., Lee, A.H., Amora, R., Miller, J.C., Leung, E., Meng, X., Zhang, L., Rebar, E.J., Gregory, P.D., Urnov, F.D., Meyer, B.J. (2011). Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science Vol. 333, Issue 6040: 307 DOI: 10.1126/science.1207773.

Xu, H., Xiao, T., Chen, C. H., Li, W., Meyer, C. A., Wu, Q., Wu, D., Cong, L., Zhang, F., Liu, J. S., Brown, M., dan Liu, X. S. (2015). Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome research, 25(8): 1147–1157. DOI: 10.1101/gr.191452.115.

Zheng, T., Hou, Y., Zhang P., et. al. (2017). Profiling single-guide RNA specificity reveals a mismatch sensitive core sequence. Sci. Rep. 7, 40638.

PROFIL PENULIS

286 | Metode Biologi Molekuler

Miftahul Jannah, S.Si., M.Sc Penulis adalah Dosen Jurusan Biologi, sekaligus Kaprodi Biologi dan Kepala Divisi Bidang Penelitian LPPM Universitas Islam As-syafiiyah, Jakarta Timur, merupakan pendiri sekaligus ketua komunitas IGBC (Indonesian Genetic and Biodiversity Community) dan Yayasan Gendivsia (Genetika dan Biodiversitas Indonesia). Lulus S1 Biologi tahun 2011 dari Universitas

Negeri Malang, dan S2 Biologi tahun 2014 dari Universitas Gadjah Mada melalui program Beasiswa Unggulan DIKTI. Bidang yang ditekuni adalah Sistematika Tumbuhan dengan berbagai macam pendekatan baik morfologis atau molekuler, khususnya kajian lichenologist. Pendekatan baik morfologis atau molekuler telah ditekuninya untuk membantu penyelesaian upaya konservasi serta mengungkap biodiversitas lichen (organisme simbiosis antara alga dan jamur). Di Indonesia, Ia yang pertama kali berhasil mensekuen dan melaksanakan penelitian DNA Barcode pada lichen, mulai tahun 2013. Penulis telah berkesempatan mengikuti training 5 hari bersama tim IBRC (Indonesian Biodiversity Research Center) pada acara Penyegaran Biologi Molekuler dan Filogenetik di Universitas Gadjah Mada. Penulis aktif sebagai Reviewer beberapa jurnal nasional terakreditasi. Penulis pernah mendapatkan hibah penelitian dosen muda dari Kopertis wilayah III pada tahun 2017, 2019, dan 2021. Email: mifta.frozi01@gmail.com/miftahuljannah.fst@uia.ac.id.

Nila Kartika Sari, S.Si., M.Si Penulis menempuh pendidikan SD sampai SMP di kota Gresik dan melanjutkan SMA sampai kuliah di Kota Malang. Lulus SMA tahun 2005, melanjutkan studi di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Malang dengan tugas akhir berjudul “Proses Regenerasi Sirip Ekor pada Ikan Zebra (Danio rerio)”. Lulus S2 melalui

Program Beasiswa Unggulan dari Program Pasca Sarjana Fakultas MIPA Jurusan Biologi Universitas Brawijaya. Mulai tahun 2015 hingga Saat ini aktif menjadi Dosen Jurusan Pendidikan Biologi di Fakultas Pendidikan

Profil Penulis | 287

Ilmu eksakta dan Keolahragaan (FPIEK) IKIP Budi Utomo Malang dengan mengampu matakuliah Evolusi, Biologi terapan (Bioteknologi), Struktur Perkembangan hewan, Fisiologi Hewan dan genetika. Pada tahun 2018 mendapatkan Hibah Penelitian Dosen Pemula (PDP) dari KEMENRISTEK DIKTI tentang pengembangan bahan ajar (Handout) Evolusi berbasis hasil penelitian DNA Fingerprinting dan pada tahun 2020 mendapatkan Hibah Penelitian Dosen Pemula (PDP) dari KEMENRISTEK DIKTI mengenai pengembangan buku ajar Perkembangan Hewan berbasis model REACT. Fokus objek penelitian yang ditekuni yaitu dibidang Bioteknologi yang mengenai DNA Forensik atau DNA Fingerprinting dan Evolusi mengenai genetika populasi. Penulis dapat dikontak melalui: nilahakam@gmail.com

Miftahul Mushlih, M.Sc Penulis merupakan pengajar di Prodi Teknologi Laboratorium Medis, Universitas Muhammadiyah Sidoarjo. Jenjang sarjana di tempuh di Universitas Negeri Malang dan jenjang magister di Universitas Gadjah Mada. Penelitian berfokus pada pengkajian mutasi pada penyakit herediter dan identifikasi pathogen pada manusia. Selain itu penelitian juga

berfokus pada pengambangan metode forensic molecular. Beliau pernah mengikuti pelatihan pengambangan metode biologi molecular selama satu minggu di Poltekes Jakarta III serta beberapa pelatihan lainnya. Pernah juga di undang untuk mengisi kuliah tamu dan pembicara pada seminar nasional. Saat ini aktif sebagai penggiat dan cofounder dari Indonesian Genetic and Biodiversity Indonesia (IGBC)

Muhammad Rifqi Hariri, M.Si

Penulis merupakan staf Peneliti di Pusat Penelitian Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia sejak tahun 2018. Beberapa penelitian yang dilakukannya bersama kolega telah diterbitkan di beberapa jurnal nasional dan internasional yang berkaitan dengan Alien Flora, identifikasi jenis tumbuhan berbasis DNA barcoding,

288 | Metode Biologi Molekuler

dan analisis keragaman genetik tumbuhan berbasis marka dan sekuen DNA barcoding. Penulis menyelesaikan studi sarjana di Jurusan Biologi Universitas Negeri Malang dan melanjutkan ke jenjang Magister di Departemen Biologi Institut Pertanian Bogor.

Priyambodo, S.Pd., M.Sc Penulis lahir di Pacitan, 14 November 1986. Ia menyelesaikan pendidikan sarjana pada Program Studi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Jember. Sempat mengabdikan diri sebagai pengajar pada pendidikan menengah di Jember, Bondowoso, dan Bontang, ia melanjutkan program pascasarjana di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada dan mendapatkan gelar

Master of Science (M.Sc.). Pada saat studi S2, ia menekuni bidang Genetika dan Biologi Molekuler dengan tergabung pada payung penelitian thalassemia di bawah bimbingan Dr. Niken Satuti Nur Handayani. Sejak saat itu, ia aktif dalam kegiatan yang diselenggarakan oleh Perhimpunan Orangtua Penderita Thalassemia Indonesia (POPTI), khususnya di Yogyakarta. Saat ini, ia tercatat aktif sebagai dosen pada Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Lampung dengan riset bertemakan konservasi satwa liar di Lampung berbasis genetika populasi dan genetika molekuler. Selain itu, ia aktif dalam komunitas-komunitas ilmiah seperti Indonesian Genetic and Biodiversity Indonesia, Forum Konservasi Gajah Indonesia, Perhimpunan Biologi Indonesia, dan Perhimpunan Biokimia dan Biologi Molekuler Indonesia.

Dr. Rina Hidayati Pratiwi, M.Si Penulis merupakan staf pengajar perguruan tinggi di Universitas Indraprasta PGRI, Jakarta, program studi Pendidikan Biologi (S1) dan Pendidikan MIPA (S2). Penulis juga sebagai dosen Luar Biasa di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, dan Universitas Terbuka. Pendidikan S-1 diperoleh penulis dari Jurusan Biologi, Institut Pertanian Bogor (IPB) tahun 2003. Di

Universitas yang sama, penulis juga menyelesaikan pendidikan masternya

Profil Penulis | 289

(S-2) pada Program Studi Bioteknologi melalui program beasiswa BPPS Dikti. Pendidikan S-3 diselesaikan di Jurusan Biologi, Universitas Indonesia (UI) tahun 2016 menggunakan beasiswa BPPDN Dikti. Dari skripsi hingga disertasi, riset yang penulis lakukan ialah di bidang Mikrobiologi Kesehatan. Hingga saat ini, penulis juga aktif melakukan penelitian dalam berbagai bidang Mikrobiologi, Bioinformatika dan drug discovery dari hibah riset Kementerian, baik KemenristekDikti maupun Kemendikbud-Ristek. Pencarian senyawa bioaktif, baik dari mikroorganisme fage maupun bakteri endofit hingga mendesign obat menjadi fokus dari bidang risetnya. Selain menulis buku, penulis juga aktif menulis di berbagai jurnal ilmiah internasional dan nasional. Saat ini penulis juga aktif sebagai editor dan reviewer di jurnal nasional maupun internasional serta reviewer penelitian Dikti. E-mail penulis: rina.hp2012@gmail.com.

Dr. Dwi Sendi Priyono, S.Si., M.Si Penulis lahir di Jember, 30 September 1992. Saat ini penulis berafiliasi sebagai Dosen di Laboratorium Sistematika Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada (UGM). Penulis juga merupakan konservasionis muda dan sebagai Conservation Genetics Specialis di Wildlife Conservation Society, salah satu organisasi konservasi internasional non

profit terkemuka di dunia. Sejak saat kuliah (S1 hingga lulus Doktor) dan hingga saat ini, fokus riset penulis adalah genetika konservasi dan sistematika molekuler satwa dilindungi dan terancam punah, seperti anoa, harimau sumatra, gajah sumatra, hiu. Penulis aktif memberikan pelatihan-pelatihan analisis genetik dan bioinformatika pada beberapa universitas, NGO, dan lembaga pemerintah.

290 | Metode Biologi Molekuler

Yana Rubiyana, M.Si Penulis lahir di Bogor, Jawa Barat, pada tanggal 21 Februari 1984. Lulus pendidikan Diploma III jurusan Analis Kimia, di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor (IPB) pada tahun 2002, lalu pada tahun 2009 melanjutkan pendidikan Sarjana (S1) melalui Program Alih Jenjang di Departemen Kimia FMIPA IPB. Pada

pertengahan tahun 2017, mendapatkan beasiswa SDM-IPTEK (Saintek) Kemenristekdikti untuk melanjutkan studi S2 pada program studi Bioteknologi IPB. Sejak tahun 2008 sampai saat ini bekerja sebagai peneliti di Laboratorium Protein Terapeutik dan Vaksin, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI dengan kepakaran Bioteknologi dan Biologi Molekuler. Tahun 2020 sampai saat ini dipercaya sebagai manager laboratorium In-Vitro Diagnostic (IVD) LIPI, Tim deteksi pemeriksaan Virus SARS COV-2 di Laboratorium BSL2 LIPI dan pengelola di laboratorium Biosafety Level 3 (BSL-3) Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI. Email: yana.rubiyana@biotenologi.lipi.go.id.

Dr. rer. nat. Pratiwi Prananingrum, S.Si., M.Sc Penulis lahir di Malang pada 18 Desember 1986. Penulis menyelesaikan studi S1 di Universitas Negeri Malang. Studi jenjang Master ditempuh di Nagoya University-Jepang pada tahun 2011-2013 dengan biaya dari pemerintah Jepang (MEXT), kemudian penulis bekerja sebagai asisten peneliti di pusat penelitian Bioteknologi LIPI tahun 2014. Studi doktoral ditempuh

di TU Kaiserslautern-Jerman dengan biaya dari pemerintah Jerman (DAAD) pada tahun 2015-2020. Pada akhir Septermber 2020, penulis kemudian kembali bekerja sebagai asisten peneliti di Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Selama studi S2 dan S3 penulis melakukan penelitian di bidang biologi molekuler tumbuhan, perkembangan tumbuhan, fisiologi tumbuhan, dan bioteknologi. Selama proses studi tersebut, penulis banyak melakukan eksperimen dengan berbagai teknik biologi molekuler, salah satunya adalah real-time PCR,

Profil Penulis | 291

selain itu penulis juga mengembangkan metode penggunaan senyawa analog gula yang memiliki fluoresensi untuk deteksi aktivitas protein transporter pada heterelogous expression system sel ragi (Saccharomyces cerevisiae). Hasil penelitian ini telah dipublikasikan di Jurnal Ilmiah Internasional bereputasi tinggi di mana penulis berperan sebagai salah satu kontributor utama (first author). Selama studi S3 penulis tergabung dalam International Research Training Group 1830 (IRTG1830) yang merupakan kolaborasi dari 3 universitas dari 2 negara (Kanada dan Jerman), keikutsertaan penulis dalam kelompok ini semakin mengasah skill dan kemampuan penulis dalam penelitian di bidang Biologi molekuler. Selama studi S2 dan S3 penulis memperoleh beberapa penghargaan, di antaranya: undangan presentasi oleh International Max Planck Research Training Group Plant Physiology (pada tahun 2012) dengan biaya Max Planck, presenter poster terbaik dan memenangkan Irena Mantor Poster Award (2018) pada konferensi ilmiah Society of Experimental Biology di Swedia, memenangkan research grant for Women in Science dari TRR177 SEB (didanai oleh DFG Jerman), dan dinominasikan sebagai 10 poster terbaik dari 300 poster yang ada pada konferensi ilmiah Arabidopsis (ICAR) 2018 di Finlandia. Penulis dapat dihubungi melalui email: p.prananingrum@gmail.com

Dwi Anggorowati Rahayu, S.Si., M.Si Penulis adalah Dosen di Jurusan Biologi, Universitas Negeri Surabaya dan Pengurus Pusat Indonesian Genetic and Biodiversity Community. Bidang yang ditekuni adalah Sistematika Hewan, khususnya kajian Iktiologi. Lulus S1 tahun 2011 dari Universitas Negeri Malang dan Lulus S2 tahun 2013 dari Universitas Negeri Brawijaya. Pendekatan Biologi molekuler

khususnya DNA Barcoding telah ditekuni hampir 10 tahun untuk membantu penyelesaian upaya konservasi dan pengungkapan biodiversitas ikan lokal Indonesia. Fokus objek penelitian yang ditekuni adalah konservasi ikan Tor (Famili: Cyprinidae) Lokal Indonesia, ikan Famili Poeciliidae, ikan laut lokal Tarakan dan ikan Famili Gobiidae, serta upaya pemetaan genetik dan pengelompokan ikan air tawar maupun laut

292 | Metode Biologi Molekuler

Indonesia. Ia juga telah berkesempatan kesempatan mengikuti training 1 minggu bersama tim Jerman (Indonesian-Jerman Networking) pada acara Student Course of Module III on Plant Population Genetic by Nuclear Microsatellite Analysis di Universitas Brawijaya. Sampai saat ini, penelitian terkai DNA Barcode Ikan Lokal Jawa Timur masih terus dilakukan.

Dr. Eng. Sapto Andriyono, S.Pi., M.T Penulis saat ini adalah staff pengajar pada Program Studi Akuakulture, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya yang mendalami biologi laut, Ekologi dan Molekuler ekologi. Pendidikan S1 ditamatkan di Institut Pertanian Bogor tahun 2001 di Program Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Bogor. Beberapa tahun kemudian, tahun

2008 berhasil menamatkan pendidikan Magister di Program Teknologi Kelautan, minat Studi Teknik dan Manajemen Pantai. Pada tahun 2016-2019, kesempatan studi di Pukyong Nasional University Korea, dilakukan dibawah beasiswa BUDI-LN LPDP (Beasiswa Unggulan Dosen Indonesia Luar Negeri, Kementrian Pendidikan Nasional - Lembaga Pengelola Dana Pendidikan, Kementrian Keuangan). Pada kesempatan S3 ini di Interdisiplinary Program of Biomedical, mechanical and Electrical Engineering, PKNU – Busan, penelitian di bidang molekuler dimulai dengan melakukan DNA barcoding pada ikan laut, studi DNA mitokondrial pada beberapa ikan laut dan ikan air tawar, serta DNA metabarcoding dengan pendekatan DNA lingkungan (eDNA) yang kemudian dijadikan riset utama dalam desertasinya. Sejumlah publikasi complete genome ikan telah berhasil dipublikasikan selama 3 tahun studi di Korea. Sekitar 169 spesies ikan laut telah dilakukan identifikasi molekuler, termasuk 77 sequence pada region parsial 12S-16S rDNA yang merupakan data baru di NCBI. Selain itu, pada complete mitokondrial telah dipublikasikan 7 spesies ikan laut Indonesia, 2 spesies ikan Afrika, 4 species ikan Korea, 2 species ikan Bangladesh, 15 species Indo-west pasifik, 4 spesies udang dan 1 spesies kepiting. Pada penelitian DNA lingkungan, 3 publikasi telah di bukukan yaitu eDNA ikan air tawar di sungai Korea, eDNA ikan laut di Malang dan Pelabuhanratu. Saat ini, penelitian tentang molekuler masih terus

Profil Penulis | 293

dilakukan dan menjadi salah satu pendiri INMAFIGEN (Indonesia Marine and Fisheries Gene Network) dan menjadi pengurus IGBC di bidang Zoologi. Selain itu, penulis juga aktif dalam komunitas masyarakat Ikhtyologi Indonesia, masyarakat moluska Indonesia, Himpunan Pengelola Pesisir Indonesia Jatim, dan Masyarakat Biodiversity dan Bioinformatik Indonesia.

Dr. rer. nat. Mo Awwanah, S.Si., M.Sc Penulis adalah dosen program studi S1 Biologi di Fakultas MIPA Militer Universitas Pertahanan RI (UNHAN RI), Sentul-Bogor, sejak tahun 2020. Sebelum mengabdi di UNHAN RI, penulis konsisten mempelajari Biologi khususnya ilmu tumbuhan selama menempuh studi S1-S3. Dia menyelesaikan studi S1 Biologi (spesialisasi Botani) di Universitas Negeri Malang

(2011), kemudian melanjutkan studi Master in Biology (for Plant Sciences and Natural Products) di Leiden University, Belanda (2014-2016) dengan beasiswa LPDP. Studi S2 di Belanda mewajibkan dua kali riset dan penulisan master thesis. Riset pertamanya tentang plant-derived drugs dikerjakan di Leiden University, sedangkan riset keduanya tentang plant-microbe interactions dirampungkan di Utrecht University, Belanda. Selama studi S2 dia mendalami konsep dan teknik biologi molekuler, serta berkesempatan untuk mengikuti pertukaran pelajar ke University of Helsinki, Finlandia selama 4 bulan dengan dana dari Erasmus+ mobility. Setelah lulus S2, dia mendapatkan kesempatan untuk melanjutkan S3 di departemen Plant Cell Biology, Georg August University of Göttingen, Jerman (2016-2020) sebagai ‘Ph.D mitarbeiter’ untuk proyek yang didanai oleh BMBF (Federal Ministry of Education and Research) Jerman dan berhasil lulus (cumlaude) dengan gelar Doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.). CRISPR-Cas9 adalah salah satu metode rekayasa genetika yang dia gunakan untuk mengkarakterisasi mekanisme transduksi sinyal kimia (chitin signaling) pada tumbuhan sebagai respon terhadap infeksi jamur patogen. Selain aktif di bidang akademik, penulis juga aktif mengikuti kegiatan ilmiah seperti konferensi internasional dan menjuarai berbagai kompetisi di bidang sains, serta ikut berpartisipasi dalam aktivitas kemanusiaan dengan pernah menjadi Pengajar Muda - Gerakan Indonesia

294 | Metode Biologi Molekuler

Mengajar (angkatan III, 2011-2012). Untuk mengenal dan terhubung dengan penulis, pembaca dapat membuka tautan berikut:

https://www.linkedin.com/in/mo-awwanah-23856634/ atau menscan qr code di samping.