Upload
others
View
7
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
09.02.2009
1
Metode de analiză a cromozomilor
Când putem presupune o anomalie crs de NR sau de structură ?
• Anomalii de dezvoltare mutiple – sindrom plurimalformativ
• Anomalii de sexualizare
• Anomalii de reproducere
– Nou născut mort plurimalformat
– Avorturi spontane repetate
– Sterilitate primară
Are 4 anişori (arată de 2 ani)
Bagaj de cuvinte minim
Reacţionează inadecvat la cei din jur
Nas mic, urechi mici, gură mică cu limba protruzionată
Mâini scurte
Are viciu cardiac, rinichi în potcoavă
Sindrom plurimalformativ
Ce cariotip are?
09.02.2009
2
1. Colectăm sîngele pentru a obţine celule nucleate
(!!! leucocitele sîngelui periferic au n uclee în interfaz ă)
2. Obţinerea culturii de celule în diferite perioade ale mitozei
Termostat
37º C
72 ore
Cel sâgelui
+ mediu de
creştere
Cel în diferite faze ale mitozei
P r o l i f e r a r e
Peste 72 ore
09.02.2009
3
3.Pregătirea cromozomilor pentru microscopie
Celule în diferite faze ale mitozei
Sol hipotonică
Citostatic -colhicină
Stoparea metafazei
Sedimentarea celulelor
Dispersarea cromozomilor
Lamă cu cel fixate Lamă cu plăci metafazice
Colorare
4. Colorarea şi microscopia preparatului cromozomic
09.02.2009
4
5. Analiza cariotipului
Fotografierea
plăcii metafazice
Decuparea cromozomilor
Realizarea cariogramei = cariotipului
Are 4 anişori (arată de 2 ani)
Bagaj de cuvinte minim
Reacţionează inadecvat la cei din jur
Nas mic, urechi mici, gură mică cu limba protruzionată
Mâini scurte
Are viciu cardiac, rinichi în potcoavă
Sindrom plurimalformativ
47,XY,+21 – sindrom Down
12
Tehnici de citogenetică – de analiză a cariotipului:
Pentru identificarea anomaliilor de număr – analiza cromozomilor metafazici cu colorate omogenă.
Pentru identificarea anomaliilor de număr şi de structură –analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R; analiza cromozomilor prometafazici cu colorare diferenţiată Q, G, R.
Pentru identificarea polimorfismului cromozomial – analiza cromozomilor metafazici cu colorare diferenţiată C, T.
09.02.2009
5
Studiul cariotipului uman
Analiza crs metafazici
Analiza crs prometafazici
Analiza crs interfazici
colorare uniformă
colorareîn benzi G,Q,R,C,T
colorare în benziG, R
Testul cromatinei
sexualeX şi Y
Metode molecular
citogeneticeFISH, mFISH
SKYCGH
*** NR benzi pentru setul haploid: 300-400 m / 550 pm / 850p
14
Tipul bandării Colorant
G Giemsa
Q Quinacrin
(fluorescent)
R (revers) Giemsa sau
fluorescent
C (centromer) Giemsa sau
fluorescent
T (telomer) Giemsa sau
fluorescent
Colorarea cromozomilor
Omogenă Diferenţiată, în benzi
G Q R C T
Benzile G+ = Q+ = R –
Benzile G- = Q- = R +
09.02.2009
7
Colorare omogenă
•Stabilirea numărului de cromozomi
•Stabilirea cariotipului
•Identificarea anomaliilor
cromozomiale numerice
Bandare C•Stabilirea numărului de cromozomi
•Stabilirea cariotipului
•Concretizarea cromozomilor implicaţi
în anomalie
09.02.2009
8
Nomenclatura benzilor
Cromozomul
benzi
braţe
subbenzi
4p22.2
5q13.4
9p21.3
regiuni
Bra
ţ
Re
giu
ne
Ba
nd
ă
46,XY,del(1)(p11-p34)
1p35
1p22
1q23
1q41
Bra
ţe
Re
giu
ni
Be
nz
i
46,XY,del(1)(p11-p34)
09.02.2009
9
46,Y,del(X)(q12.1-q24.3)
Subbenzi
Benzi
Prometafază Metafază
26
Cromosomul 4 Stabilirea crs. X şi 18 Stabilirea crs. X, Y şi 18
Stabilirea crs. 18 şi 21 Stabilirea crs. 18 şi 21
Utilizarea tehnicii
FISH în analiza
cromosomială
46,XX 47,XX,+21
47,XX,+2147,XX,+21
09.02.2009
11
Cariotip
46,XX
46,XY
46,XX,9qh+
46,XY,16qh-
46,XX,14s++
47,XX,+21
45,XY,-12
48,XXXY
45,X
69,XXX
69,XXY
46,XX,1q-
46,XY,16p+
46,X,r(X)
46,XY,del(5p)
46,XX,t(12,22)
Normal Normal cu polimorfisme
Aneuploid Poliploid Cu aberaţiicromosomiale
Fenotip normal
invt
rob
Anomalii de structură echilibrate
Fenotip patologic
Trisomii – 47,XXX; 47,XXY; 47,+21; 47,+13; 47,+18; 47,+8
Monosomii – 45,X
Anomalii de număr
Fenotip normal
Crs D şi G – variaţii ph sau s:Crs 1,9,16,9,Y – variaţii qh
Polimorfisme
Fenotip normal
46,XX
46,XY
Cariotip normal
Fenotip patologic
deldup
r
i
Anomalii de structură neechilibrate
09.02.2009
12
??? polimorfisme
• p şi q – conţin segmente cromozomiale codificatoare şi necodificatoare
• p+ sau p- - anomalii• q+ sau q- - anomalii• c mai mare sau mai mic – polimorfism• t mai mare sau mai mic – polimorfism• h+ sau h- - polimorfism• s+ sau s- - polimorfism
Testul cromatinei sexule
Testul cromatinei sexule X = testul Barr - vizualizarea crs X inactiv, heterocomatinizat pe nucleele interfazice ale celulelor somatice
Testul cromatinei sexule Y = testul F – vizualizarea a 2/3 din braţul qY pe nucleele interfazice ale celulelor somatice sau ale spermatozoizilor
Cariotip normal
09.02.2009
13
Cromozomul Y- 255 gene:
• gene reglatoare masculinizante
• pseudogene
• !!! Braţul q conţine heterocromatină constitutivă
Cromozomul X - 1141 gene:
•gene structurale somatice
•gene reglatoare feminizante;
•gene structurale feminizante;
•gene structurale masculinizante
!!! Important
• Cromozomul X – este indespensabil celulei somatice şi :
• În cel 46,XX – este activ numai un X
• În cel 46,XY – este activ şi X şi Y
• În cel 47,XXX - este activ numai un X
• În cel 47, XXY- este activ numai un X şi un Y
• În cel 48, XXXY- este activ numai un X şi un Y
• Cromozomul Y – este obligator pentru
De ce? Există o explicaţie?
Dimorfismul sexual - echilibrat
• Caractere sexuale primare - diferite
• Caractere sexuale secundare - diferite
• Caractere somatice - asemănătoare
09.02.2009
14
45,X 47,XXY
46,XX 46,XY
Crs X – activ
eucromatinizat
Crs X – activ
eucromatinizat
Crs Y
Braţ p - activ
Braţ q - inactiv
Crs X – neactiv
heterocromatinizat
Corpuscul F
= 0,25 μm
Corpuscul Barr
= 1μm
09.02.2009
15
Corpuscul Barr – cromatina sexuală X
NrBarr = X - 1
Test Barr
XXX X XXXX XXXXX
Y YY
Test F
48,XXXY 45,X 50,XXXXYY 49,XXXXX
09.02.2009
16
Testul BarrCromatina sexuală X:
- reprezintă cromozomul X inactiv, heterocromatină facultativă,
în celulele somatice 46,XX;
- se prezintă sub forma unui corpuscul Barr de 1 m în nucleii interfazici ai celulelor somatice;
- testul Barr este util în identificarea nr de crs X în celulele somatice: NR crsX = nr corpusculilor Barr + 1 (un crs X activ).46,XX – 1 corpuscul Barr46,XY – 0 47,XXX – 247,XXY - 145,X – 048,XXXX – 3!!! Explicaţ ia o riginii cro matinei X – ipoteza M. Lyon (1961)
Ipoteza Mary Lyon
După a 16 zi
!!! Celule 46,XX - după a 16 zi de dezvoltare au numai un crs X activ
În 50% de cel – este activ crs matern şi în 50% - crs X patern
46,XX
45,X activi +Xpatern inactiv
45,X activi + Xmatern inactiv
09.02.2009
17
Testul FCromatina sexuală Y:
- reprezintă braţul q al crs Y, heterocromatină constitutivă (2/3q), în cel. somatice 46,XY sau în spermatozoizii 23,Y;
- se prezintă sub forma unui corpuscul F (fluorescent) de 0,25 m în nucleele interfazice;
- testul F este util în identificarea crs Y (determinarea prenatală a sexului):
NR crsY = NR corpusculilor F46,XX – 046,XY – 1 47,XYY – 247,XXY - 148,XXYY – 246,X,i(Yp) – 046,X,i(Yq) – 1 (0,5 m)