Metode introducere gene

Metode de transfer a Metode de transfer a genelor de la un genelor de la un

organism la altul organism la altul

Curs: Alimente modificate Curs: Alimente modificate geneticgenetic

CEPA IVCEPA IV

Anca NicolauAnca NicolauFacultatea de Stiinta si Ingineria Facultatea de Stiinta si Ingineria

AlimentelorAlimentelorUniversitatea Universitatea Dunarea de JosDunarea de Jos Galati Galati

Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Structura primară a acizilor nucleiciStructura primară a acizilor nucleici



Metode pentru sinteza chimica a oligonucleotidelor si genelor

Tehnici care au la bază sinteza chimica a oligonucleotidelor:PCR (Polymerase Chain Reaction) Real-Time PCRDNA sequencingSite direct mutagenesisMicroarrays

Metode:Phosphoramidite methodePhosphoramidite building blocks

Metode de determinare a secventelor de nucleotide: SECVENȚIEREA –identifică ordinea bazelor nucleotidice din catena polinucleotidicăChain-terminator methodutilizează ddNTP ca și terminatori ai reacției; ADN-primer; ADN-polimerază; dNTP.



Dye-terminator sequencing-secventiere într-o singura reactie, ddNTP marcate fluorescentIdentificarea nucleotidelor prin electroforeza capilară



Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Replicarea și biosinteza ADNReplicarea și biosinteza ADN:: 1957, M. Delbruck și G.S. Stent- mecanismul de 1957, M. Delbruck și G.S. Stent- mecanismul de

replicare ADN semiconsevativreplicare ADN semiconsevativ Enzime implicate în replicareEnzime implicate în replicare::ADN-helicazeADN-helicazeADN-topoizomerazeADN-topoizomerazeUnwindaze –proteine destabilizatoare ale dublului helixUnwindaze –proteine destabilizatoare ale dublului helixPrimaza (ARN polimeraza ADN-dependentă)Primaza (ARN polimeraza ADN-dependentă)ADN-polimeraze ADN-dependenteADN-polimeraze ADN-dependenteADN-ligazaADN-ligaza



Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat Metode pentru izolarea unor gene si Metode pentru izolarea unor gene si

clonarea lorclonarea lor Vectori utilizati pentru transferul de Vectori utilizati pentru transferul de

genegene Metode de includere a vectorilor in Metode de includere a vectorilor in

celula pro si eucariotacelula pro si eucariota



Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinat EEndonucleazelendonucleazele de restrictie de restrictie



Vectori pentru transferul de Vectori pentru transferul de genegene

Vectori pVectori plasmidlasmidialiiali• Molecule circulare de ADN, nelegate de Molecule circulare de ADN, nelegate de

cromozomicromozomi• Masa moleculara 10Masa moleculara 1066 – 2x10 – 2x1088 D Daa• Contin gene pentru rezistenta la Contin gene pentru rezistenta la

antibiotice, producere de toxine, formare antibiotice, producere de toxine, formare de tumoride tumori

• Pot fi conjugative sau non-conjugativePot fi conjugative sau non-conjugative• Exemple: pBR 313, pSC101-ColE1, Ti Exemple: pBR 313, pSC101-ColE1, Ti



Descoperiri care au permis Descoperiri care au permis aparitia tehnologiei ADN-ului aparitia tehnologiei ADN-ului recombinatrecombinatEtape în cadrul tehnologiei ADN Etape în cadrul tehnologiei ADN

recombinantrecombinant



TRANSDUCȚIATRANSDUCȚIA

Virusuri cu ciclu lizogeVirusuri cu ciclu lizogen/liticn/litic (fagi) (fagi)



Vectori pentru transferul de Vectori pentru transferul de genegene Cosmide = combinatiiCosmide = combinatii plasmide cu plasmide cu

fagifagi



Transferul genelorTransferul genelor

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

Tumori-crown ball



Transfer de gene intermediat Transfer de gene intermediat de de AgrobacterAgrobacteriumium tumefaciens tumefaciens ––Transformarea geneticăTransformarea genetică



Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica)



Pusca de genePusca de gene- creată de John Sanford, 1987- creată de John Sanford, 1987



Pusca de genePusca de gene



Pusca de genePusca de gene



Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica)



Transfer de gene prin Transfer de gene prin metoda biolistica (balistica metoda biolistica (balistica biologica)biologica) Embrion de Embrion de

porumb porumb bombardat cu bombardat cu CaMV35SCaMV35S marcat marcat cu cu GFPGFP. .

Fotografie Fotografie realizata dupa realizata dupa 48h48h de la de la bombardarebombardare

Frecventa de Frecventa de transformare: transformare: 15%15%



Transfer de geneTransfer de gene



ElectroporareElectroporare



Transfer de gene Transfer de gene

prin prin electroporareelectroporare



Transfer de gene – fuziune de Transfer de gene – fuziune de protoplaprotoplaștiști



Identificarea transformerilorIdentificarea transformerilor

Evidentierea rezistentei la antibioticeEvidentierea rezistentei la antibiotice




Marcare cu GFPMarcare cu GFP




Metode imunologiceMetode imunologice Hibridizare si autoradiografieHibridizare si autoradiografie Analiza cu endonucleaze de restrictieAnaliza cu endonucleaze de restrictie Evidentierea unor activitati Evidentierea unor activitati

enzimaticeenzimatice

Documents

Metode introducere gene