Upload
ngoque
View
278
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
Metode za analizu proteina
• Imunohistohemija
• Western blot
• Ko-imunoprecipitacija
ZAJEDNIČKI REAGENS
ANTITELO
Imunohistohemija
Imunohistohemijske metode omogućavaju vizuelizaciju definisanih antigena u tkivnim presecima, vezivanjem antitela za male, specifične regione antigena, antigene determinante ili epitope.
Imunohistohemija kao metoda zasniva se na korišćenje obeleženih antitela kao specifičnih reagenasa za lokalizaciju i detekciju tkivnih konstituenata (antigena) in situ.
Antigen Antitelo + Antigen – Antitelo kompleks
Imunocitohemija
Imunohistohemija
Primarno antitelo
Specifično locira antigen u tkivnom preseku
POLIKLONSKA ANTITELA
Prvootkrivena ili prvosintetisana antitela
• Potrebno je bilo izolovati antigen
• Uraditi imunizaciju životinje
• Dobro biohemijski okarakterisati Ag
Primarno antitelo
MONOKLONSKA ANTITELA
• 1975. godine - George Kohler i Cesar Milstein
• Razvoja hibridoma tehnologije – hibridizacija somatskih ćelija - fuzija splenocita (ćelije koje stvaraju antitela) i ćelija mijeloma (ćelije koje se kontinuirano dele)
Direktan metod obeležavanja antitela
Indirektan metod obeležavanja antitela
Enzim kao obeleživač antitela
• Peroksidaza – supstrat vodonik peroksid - razlaže vodonik peroksid do vode, a oslobođeni elektroni polimerizuju hromogenu supstancu koja se taloži na mestu reakcije antigen – antitelo.
• Talog je nerastvoran i time je omogućena vizuelizacija reakcije – STABILNA, TRAJNA I VIDLJIVA SVETLOSNIM MIKROSKOPOM
• Alkalna fosfataza – supstrat naftol fosfati
PAP tehnika (Peroksidaza anti-peroksidaza)
• Tercijerni sloj PAP kompleks – peroksidaza antiperoksidaza - solubilni imunokompleksi molekula peroksidaze i antitela visokog titra na peroksidazu.
APAAP tehnika (Alkalna fosfataza anti-alkalna fosfataza)
Imunocitohemija
http://www.youtube.com/watch?v=gPpn8LxQjaU&feature=related
Pozitivne i negativne kontrole Automatizacija metode
Primena imunohistohemije
Western blot analiza
Western blotting
• Identifikacija proteina
• Određivanje količine ispitivanog proteina
• Određivanje molekulske težine polipeptida
• Procena efikasnosti ekstrakcije proteina
• Detekcija proteina
• Za izolovanje i karkaterizaciju antitela iz poliklonalnih seruma
• Priprema uzorka – izolovanje protein iz biološkog materijala
• Razdvajanje uzorka proteina elektroforezom na gelu
• Transfer uzorka proteina sa gela na membranu
• Blokiranje nespecifičnog vezivanja antitela na membrani
• Inkubacija membrana sa antitelom za protein od interesa
• Detekcija kompleksa antigen - antitelo
Gel za koncentrovanje 4% akrilamid/N'N'-bis akrilamid
Western blotting
Gel za razdvajanje 15% akrilamid/N'N'-bis akrilamid
Razdvajanje po molekulskoj tezini
SDS – PAGE elektroforeza korišćenjem poliakrilamidnog gela
Western blotting
KO – IMUNOPRECIPITACIJA metoda za ispitivanje interakcije između proteina
• Metoda ko-imunopercipitacije zasniva se na principu precipitacije ciljnog proteina, korišćenjem primarnog antitela, iz rastvora nedenaturisanih totalnih proteina, u prisustvu protein G sefaroze - streptokokni protein sa velikim afinitetom vezivanje za sve klase imunoglobulina različitog porekla.
KO - IMUNOPRECIPITACIJA
Nakon precipitacije, u talogu se nalazi ciljni protein, kao i svi proteini koji su sa njim, u formi dimera, bili povezani slabim nekovalentnim vezama.
KO-IMUNOPRECIPITACIJA
• Nakon imunoprecipitacije prisustvo različitih proteina, analizira se primenom Wester blotting metode (SDS-PAGE)