Metode proučevanja molekularnih osnov in

identifikacije biokemijskih označevalcev

endometrioze

izbirni predmet

Endometrioza: klinični in biokemijski vidiki

22. april, 2014

T. Lanišnik Rižner

T. Lanišnik Rižner. M. Ribič-Pucelj, Med. Razgl. 2010, 49: 263-274; slika prirejena po Guidice L.C. in Kao L.C. Lancet 2004, 364: 1789-1799.

Različne oblike endometrioze

Teorije o nastanku

Burney R. in Giuidice L., Fertil. Steril. 2012, 58, 511-519

Retrogradna menstruacija

Anger D.L. in Foster W.G. 2008, Frontiers in Bioscience 13, 1578-1593.

moteni procesi

spremembe v eutopičnem endometriju

moten imunski sistem

pospešena sinteza estrogenov pospešena adhezija

pospešena angiogeneza

motena apoptoza

pospešena proliferacija

povečana invazivnost

razrast ektopičnega endometrija

zmanjšan zaščitni učinek progesterona

kronični vnetni odziv

Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena

Podrobno razumevanje patofiziologije: vpletenost in

pomen posameznih procesov in posameznih

molekul v teh procesih.

Razlike v patogenezi in patofiziologiji med

različnimi oblikami endometrioze.

RAZUMEVANJE PATOFIZIOLOŠKIH PROCESOV

NA MOLEKULSKI RAVNI

NOVE TARČE ZA RAZVOJ

ZDRAVILNIH UČINKOVIN

NOVI DIAGNOSTIČNI

OZNAČEVALCI

RAZVOJ DIAGNOSTIČNIH METOD ZA ZGODNJE ODKRIVANJE

ENDOMETRIOZE

IN ZDRAVILNIH UČINKOVIN ZA USPEŠNO ZDRAVLJENJE

modelni sistemi

modelne živali

celične linije

vzorci tkiva

metode genomika

transkript-omika

proteomika metabolomika

primeri

etična vprašanja

Modelne živali

Endometrioza se razvije samo pri človeku in primatih.

Modelne živali: primati, miši, podgane .

(transplantacija koščkov endometrija, homologni, heterologni modeli)

modelni sistemi

Tirado-Gonzalez I. in sodelavci, J. Reprod. Immunol. 2010, 86, 141-147.

primeri peritonealne endometrioze

Zakon o zaščiti živali, registracija in dovoljenje!

Primarne kulture ektopičnega endometrija

„Eksplant“ 3D kulture:

koščki tkiva v hranilnem mediju.

Epitelijske ali stromalne celice.

modelni sistemi

Fasciani A. in sodelavci Fertil. Steril. 2003, 80, 1137-1143.

http://humrep.oxfordjournals.org/conte

nt/16/5/836/F1.expansion.html

primarna kultura

Zeitvogel A. in sodelavci

Am. J. Pathol. 2011, 159,

1839-1852.

Celične linije endometrioze

Celične linije: epitelijske in stromalne.

Modela peritonealne in globoko-infiltrativne endometrioze.

ATCC: stromalna celična linija ovarijske

endometrioze CRL-7566.

modelni sistemi

epitelijske 11Z stromalne 22B

Ektopični endometrij peritonealne endometrioze,

transfekcija s SV40 T antigen.

Zeitvogel A. in sodelavci Am. J. Pathol. 2011, 159, 1839-1852. Boccelino M. in sodelavci J. Cell.

Biochem. 2012, 113, 1292-1301.

epitelij

ske

str

om

aln

e

Ekto

pič

ni endom

etr

ij

glo

bo

ko

-in

filtra

tivn

e e

nd

om

etr

ioze

transfe

kcija

s h

TE

RT.

Vzorci ektopičnega tkiva

Ektopični endometrij odvzet ob laparoskopiji:

za izolacijo DNA, RNA, proteinov, metabolitov ...

za pripravo parafinskih rezin.

modelni sistemi

http://www.microarraystation.com/tissue-

microarray/

http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index

Tkivne mikromreže LCMD

lasersko zajemanje z mikrorezom

Ustrezen načrt raziskave

Soglasje Komisije RS za medicinsko etiko

(http://www.kme-nmec.si/)

Raziskave v skladu s

1. Helsinško deklaracijo o biomedicinskih raziskavah,

2. Konvencijo Sveta Europe o varovanju človekovih

pravic in dostojanstva človeškega bitja v zvezi z

uporabo biologije in medicine (Oviedska konvencija).

3. Slovenskim kodeksom medicinske deontologije.

Pisno soglasje vseh udeleženih oseb.

etična vprašanja

„Standard operating procedure“

Natančen načrt študije, protokol zbiranja vzorcev in podatkov.

Ustrezen, ponovljiv način zbiranja in shranjevanja vzorcev, ki

omogoča najboljšo kvaliteto vzorcev za nadaljnje analize.

Vprašalniki za ustrezno zbiranje vseh pomembnih podatkov o

preiskovani in kontrolni skupini.

metode

Možni pristopi proučevanja metode

Epigenomika/Genomika ~ 25 000 genov

Transkriptomika ~ 100 000 mRNA

> 1 000 miRNA, ...

Proteomika > 300 000 proteinov*

Metabolomika ~ 40 000 metabolitov***

*Nishimura et al. 2005, J. Gastroenterol. 40, 7-13; **HMDB: The Human Metabolome Database 2013

Epigenomika metode

http://www.nature.com/scitable/topicpage/epigenomics-the-new-tool-in-studying-complex-694/

Dedne spremembe v genomu:

metilacije DNA,

modifikacije histonov

(metilacije, acetilacije,

ubikvitinacije)

Vpliv okolja.

Metode:

bisulfitno sekvenciranje

primerjalna hibridizacija metiliranih področij

Nekateri geni vpleteni v razvoj endometrioze so hipo/hiper metilirani

Guo S.W. Mol. Human Reprod. 2009, 15, 587-607.

Steroidogeni

faktor 1

primeri

Genomika /

transkriptomika

metode

http://www.sabiosciences.com/howpcrarrayworks.php

Primer DNA mikromrež Možnosti:

proučevanje SNP,

mikrosatelitov,

izražanja genov,

študije miRNA, ...

http://www.fastol.com/~renkwitz/microarray_chips.htm

Profil izražanja genov kot diagnostični označevalec?

primer

D- bolnice, N- zdrave osebe; rdeče P, rumeno ES, modro LS

DNA mikromreže

eutopični endometrij

21 bolnic III-IV faza

16 zdravih oseb

USA patent:7871778

PCA - analiza glavnih komponent Hierarhično grupiranje

Z B

Z

B

Transkriptomika

metode

http://www.sabiosciences.com/howpcrarrayworks.php

Kvantitativni PCR (qPCR)

proučimo izražanje genov

(mRNA)

določimo količino miRNA

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

84 ali 370 genov

Različni vpliv progestinov na vnetne procese

Beranič N. in Lanišnik Rižner T. neobjavljeni rezultati.

„PCR Array: Inflammatory Cytokines and Receptors“ (PAHS-011, Qiagen)

progestini

celice Z-12

izražanje genov

primeri

Visanne

Dabroston

Proteomika metode

http://kenyaforensics.blogspot.com/2012/05/application-of-

elisa-in-forensic.html

Validacija: ELISA

Proteinske mreže

http://www.stat.purdue.edu/sbc/protein_array_analysis.html

Iskanje biokemijskih označevalcev s proteinskimi mrežami

Antibody Array

725 specifičnih protiteles, ki prepoznajo proteine vključene

v ključne signalne poti in v uravnavanje izražanja genov.

http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Slides/Epoxy_Slides/epoxy_slides.html

primer

bolnice kontrole

„Multiplex“ ELISA metode

http://www.bio-rad.com/en-si/applications-technologies/bio-plex-multiplex-immunoassays

Proteini vnetnih procesov kot biokemijski označevalci

Bio-Plex metoda (IL-6, IL-8, IL-15, IL-18, IP-10,

MCP, VEGF, GROa, ICAM, VCAM)

ELISA (glikodelin A, RANTES, ficolin-2,

CRP, leptin)

serum in peritonealna tekočina

58 bolnic z endometriozo

40 brez endometrioze

Kocbek V., Vouk K., Bersinger N., Hevir N.,Mueller M.D. Lanišnik Rižner T. poslano v objavo

primeri

Model Vzorec AUC Specifičnost

(%)

Občutljivost

(%)

leptin/ glikodelin-A + bolečibne + starost + leptin/ glikodelin-A: starost

serum 0,912 83,3 83,6

fikolin2/ glikodelin-A + bolečine + starost

serum 0,887 83,3 83,6

fikolin2/ glikodelin-A + IL8PF/mg proteinov + bolečine + starost

PF 0,936 97,0 80,0

Metabolomika metode

http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n5/fig_tab/nprot.2012.024_F1.html

Masna spektrometrija

Lipidni metaboliti kot diagnostični označevalci?

Tarčna metabolomika ESI MS/MS

140 lipidnih metabolitov: glicerofosfolipidov,

sfingolipidov, acilkarnitinov

plazma

52 kontrol

40 bolnic z endometriozo jajčnika

primeri

90 % občutljivost, 84 % specifičnost

Študije metaboloma razkrijejo nove tarče

ESI MS/MS

140 metabolitov

52 kontrol

40 bolnic

Vouk K., Hevir N., Ribič-Pucelj M., ...Osredkar J....Lanišnik Rižner T. Human Reprod. 2012, 27, 2955-2965.

primeri

E.C. 2.3.1.23

LPCAT4

lizofosfatildil

acil transferaza

E.C. 3.1.4.4

PLD

fosfolipaza D

Študije metaboloma razkrijejo biokemijske označevalce

primeri

23 zdravih kontrol 22 bolnic z endometriozo

82 % občutljivost, 91 % specifičnost

Modelni sistemi endometrioze:

živalski modeli,

„explant“ kulture,

primarne celične kulture,

celične linije,

vzorci tkiva.

Pristopi proučevanja molekularnih osnov:

epigenomika/genomika//transkriptomika,

proteomika,

metabolomika,...

Metodološki pristopi so splošno uporabni pri proučevanju

molekularnih osnov in identifikacije biokemijskih označevalcev

različnih bolezni.

Trenutno razumevanje patofiziologije endometrioze