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Metodi alternativiColture cellulari
Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACHDott.ssa Teresa Rosaria Verde
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Uno degli obiettivi peculiari della ricerca ecotossicologica, è lavalutazione degli effetti delle sostanze chimiche a livello di popolazioni edecosistemi che, per alcune decadi, è stata realizzata principalmenteattraverso studi in vivo.
Tuttavia, l’entrata in vigore (1 giugno 2007) del Regolamento REACH(Registration, Evalutation and Authorisazion of Chemicals), CE n.1907/2006, che disciplina la produzione, l’uso e l’importazione dellesostanze chimiche in ambito comunitario, ha dato un nuovo impulsoallo sviluppo dei metodi alternativi in vitro, anche in ambitoecotossicologico.
Tuttavia, l’entrata in vigore (1 giugno 2007) del Regolamento REACH(Registration, Evalutation and Authorisazion of Chemicals), CE n.1907/2006, che disciplina la produzione, l’uso e l’importazione dellesostanze chimiche in ambito comunitario, ha dato un nuovo impulsoallo sviluppo dei metodi alternativi in vitro, anche in ambitoecotossicologico.
Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACH
Tuttavia, l’entrata in vigore (1 giugno 2007) del Regolamento REACH(Registration, Evalutation and Authorisazion of Chemicals), CE n.1907/2006, che disciplina la produzione, l’uso e l’importazione dellesostanze chimiche in ambito comunitario, ha dato un nuovo impulsoallo sviluppo dei metodi alternativi in vitro, anche in ambitoecotossicologico.
Tuttavia, l’entrata in vigore (1 giugno 2007) del Regolamento REACH(Registration, Evalutation and Authorisazion of Chemicals), CE n.1907/2006, che disciplina la produzione, l’uso e l’importazione dellesostanze chimiche in ambito comunitario, ha dato un nuovo impulsoallo sviluppo dei metodi alternativi in vitro, anche in ambitoecotossicologico.
I metodi alternativi sono stati proposti in sostituzione dei testsull’animale per la identificazione del profilo tossicologico e
ecotossicologico dei composti chimici
Al momento nessun test alternativo, preso singolarmente, puòritenersi sufficientemente predittivo per sostituirsi completamente
all’informazione complessa che si ricava dai dati sperimentalisull’animale
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Lo sviluppo di metodi alternativi in vitro costituisce uno degli obiettividel Regolamento REACH sulle sostanze chimiche.
Lo sviluppo di metodi alternativi in vitro costituisce uno degli obiettividel Regolamento REACH sulle sostanze chimiche.
Al momento nessun test alternativo, preso singolarmente, puòritenersi sufficientemente predittivo per sostituirsi completamente
all’informazione complessa che si ricava dai dati sperimentalisull’animale
Tuttavia l’integrazione di approcci innovativi sia che richiedanosaggi di laboratorio o si basino su metodologie computed-
assisted possono fornire strumenti potenti in grado di identificarela pericolosità di composti chimici, individuarne il meccanismod’azione e consentirne la classificazione ai fini regolamentativi.
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Possono essereincubate a
temperaturaambiente(20±2
°C) e in atmosferanormale
Possono essereesposte a matrici
liquide didifferenteosmolarità
(caratteristichemorfologiche egenotipiche) e
l’assenza dacontaminazioni.
Alcuni vantaggi delle Linee cellulari continue di pescerispetto a mammifero
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Alcune di loropossono essereconservate perlunghi periodi
(fino a 2 anni) a4°C
Possono essereacquistate pressoEnti certificati chene garantisconorigorosi controlli
di qualità
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Le colture cellulari, oltre il loro potenziale di sostituzione e/oriduzione del numero di animali nei saggi di tossicità, hanno
altri vantaggi:
La valutazione rapida, diun elevato numero di
sostanzepotenzialmente
tossiche, con l’analisispettrofluorimetrica inpiastre multi-pozzetto.
La possibilità distudiare i meccanismi
d’azione delle sostanzetossiche.
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La notevolediminuzione di quantità
di sostanzapotenzialmente tossica
impiegatanell’esecuzione dei
saggi e, di conseguenza,di rifiuti prodotti dalla
sperimentazione.
L’opportunità dirisparmiare anche il
sacrificio dell’animaledonatore, se vengono
utilizzate le lineecellulari continue
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Obiettivo ReachObiettivo Reach
Utilizzare modelli cellulari in vitro, rappresentativi diorgani bersaglio, approcci di tossicogenomica e
metodologie QSAR per sviluppare un metodo alternativoper la predizione della tossicità dei composti chimici, con
particolare riferimento alla tossicità a dose ripetuta
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Utilizzare modelli cellulari in vitro, rappresentativi diorgani bersaglio, approcci di tossicogenomica e
metodologie QSAR per sviluppare un metodo alternativoper la predizione della tossicità dei composti chimici, con
particolare riferimento alla tossicità a dose ripetuta
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Tossicità a dose-ripetutaTossicità a dose-ripetuta
Comprende gli effetti tossicologici generali che si verificano inconseguenza di un'esposizione quotidiana ripetuta a una sostanza peruna parte della durata della vita
• esposizione sub-acuta– Test sull’animale a 28 giorni
• esposizione sub-cronica– Test sull’animale a 90 giorni– Per la maggior parte della durata della vita
• esposizione cronica– Test sull’animale roditore per 12-24 mesi
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Comprende gli effetti tossicologici generali che si verificano inconseguenza di un'esposizione quotidiana ripetuta a una sostanza peruna parte della durata della vita
• esposizione sub-acuta– Test sull’animale a 28 giorni
• esposizione sub-cronica– Test sull’animale a 90 giorni– Per la maggior parte della durata della vita
• esposizione cronica– Test sull’animale roditore per 12-24 mesi
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Il Regolamento REACH e le guide tecniche relative ai processi e aimetodi previsti, raccomandano che le informazioni da raccogliere inmerito alla tossicità ed ecotossicità delle sostanze chimiche venganoacquisite ricorrendo, ove possibile, a mezzi diversi dai test su animalivertebrati (REACH art. 13), che devono quindi essere considerati comeultima risorsa (REACH art. 25), adottando tutte le disposizioni possibiliper limitare ripetizioni inutili dei test.
La strategia delle “3R alternatives” (Russell e Burch, 1959),che fa riferimento atutte quelle procedure che riducono (Reduce) drasticamente il numero dianimali utilizzati negli esperimenti, alleviano o minimizzano (Refine) lesofferenze loro inflitte e sostituiscono (Replacement) in modo parziale ocompleto gli animali vertebrati con diverse tipologie di colture cellulari,costituisce, nell’era REACH, un impegno per tutti i ricercatori e va implementata,come indicato nel VII World Congress ALTernative to animal EXperimentation(Roma 30 agosto – 3 settembre 2009),con le R di: Reliable, Relevant, Ready-to-use e Robust,proprie dei metodi alternativi in vitro (Weighardt)
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La strategia delle “3R alternatives” (Russell e Burch, 1959),che fa riferimento atutte quelle procedure che riducono (Reduce) drasticamente il numero dianimali utilizzati negli esperimenti, alleviano o minimizzano (Refine) lesofferenze loro inflitte e sostituiscono (Replacement) in modo parziale ocompleto gli animali vertebrati con diverse tipologie di colture cellulari,costituisce, nell’era REACH, un impegno per tutti i ricercatori e va implementata,come indicato nel VII World Congress ALTernative to animal EXperimentation(Roma 30 agosto – 3 settembre 2009),con le R di: Reliable, Relevant, Ready-to-use e Robust,proprie dei metodi alternativi in vitro (Weighardt)
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
In particolare, gli obblighi introdotti dalla normativa REACH inmerito ai saggi con specie ittiche per la valutazione di pericolositàdelle sostanze chimiche riguardano: il saggio di tossicità a brevetermine con pesci giovanili e con pesci nelle fasi embrionali e diavannotto; il saggio di tossicità a lungo termine con pesci adulti; ilsaggio di accrescimento con pesci in fase giovanile e il saggio dibioaccumulo (REACH: allegati VIII, IX e X).
In particolare, gli obblighi introdotti dalla normativa REACH inmerito ai saggi con specie ittiche per la valutazione di pericolositàdelle sostanze chimiche riguardano: il saggio di tossicità a brevetermine con pesci giovanili e con pesci nelle fasi embrionali e diavannotto; il saggio di tossicità a lungo termine con pesci adulti; ilsaggio di accrescimento con pesci in fase giovanile e il saggio dibioaccumulo (REACH: allegati VIII, IX e X).
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In particolare, gli obblighi introdotti dalla normativa REACH inmerito ai saggi con specie ittiche per la valutazione di pericolositàdelle sostanze chimiche riguardano: il saggio di tossicità a brevetermine con pesci giovanili e con pesci nelle fasi embrionali e diavannotto; il saggio di tossicità a lungo termine con pesci adulti; ilsaggio di accrescimento con pesci in fase giovanile e il saggio dibioaccumulo (REACH: allegati VIII, IX e X).
Test tossicologici/ecotossicologici di base fino ad1 tonnellata/anno
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Tossicologia su mammifero(ratto)
Ecotossicologia
Tossicità acuta orale Tossicità acuta su pesce
Tossicità acuta Tossicità acuta su DaphniaTossicità acuta inalatoria Inibizione di crescita algale-
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Tossicità acuta inalatoria Inibizione di crescita algale-Sensibilizzazione cutanea BiodegradazioneTossicità subacuta (18 giorni) Degradazione abioticaTest di Ames-MutagenesiMutagenesi (micronucleo)
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Test tossicologici di base fino ad 10 tonnellata/anno
Tossicologia su mammifero(ratto)
Ecotossicologia
Studio di fertilità Tossicità cronica su pesce
Teratogenesi (su una specie) Tossicità cronica su DaphniaTossicità subcronica Accumulo nel pesce
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Tossicità subcronica Accumulo nel pesceTossicità subacuta (18 giorni) Tossicità nella piantaTest supplementari diMutagenesi
Tossicità su lombrico
Studi prolungati dibiodegradazione
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Test tossicologici di base fino ad 100 tonnellata/anno
Tossicologia su mammifero EcotossicologiaTossicità cronica Tossicità cronica su pesce
Test di cancerogenesi Riproduzione nel pesce
Tossicità acuta e subacuta in altraspecie
Tossicità acuta e subacuta negliuccelli
Teratogenesi su non roditori Studi supplementari dibiodegradaziione e accumulo
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Teratogenesi su non roditori Studi supplementari dibiodegradaziione e accumulo
Test di fertilità su 3 generazione Tossicocinetica ambientale
Tossicocinetica Test flessibile a vari livelli(catene alimentari a livello dicomunità su microcosmi)
Test tossicologici (GLP!) irritazione (corros.) cutanea “in vitro” irritazione oculare “in vitro” sensibilizzazione cutanea (LLNA) test di reversione batterica (Ames) tossicità acuta orale
Test ecotossicologici (GLP) tossicità acuta daphnia tossicità acuta alga biodegradazione
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
ALLEGATO VIII
Test tossicologici (GLP!) irritazione (corros.) cutanea “in vitro” irritazione oculare “in vitro” sensibilizzazione cutanea (LLNA) test di reversione batterica (Ames) tossicità acuta orale
Test ecotossicologici (GLP) tossicità acuta daphnia tossicità acuta alga biodegradazione
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ALLEGATO VIII –Informazioni aggiuntive
Test tossicologici (GLP!)
- irritazione (corrosione) cutanea “in vivo”- irritazione oculare “in vivo”- mutagenesi- test di citogenetica/ Test di mutazione genica- tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria)- tossicità a dosi ripetute (28 gg)(No se il rischio di esposizione è limitato)- tossicità riproduttiva/ tossicocinetica
Test ecotossicologici (GLP!)
- tossicità acuta su pesce- studio di inibizione respiratoria su fanghi- degradazione abiotica-screening (HPLC) dell’assorbimento/desorbimento
nel terreno
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Test tossicologici (GLP!)
- irritazione (corrosione) cutanea “in vivo”- irritazione oculare “in vivo”- mutagenesi- test di citogenetica/ Test di mutazione genica- tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria)- tossicità a dosi ripetute (28 gg)(No se il rischio di esposizione è limitato)- tossicità riproduttiva/ tossicocinetica
Test ecotossicologici (GLP!)
- tossicità acuta su pesce- studio di inibizione respiratoria su fanghi- degradazione abiotica-screening (HPLC) dell’assorbimento/desorbimento
nel terreno
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ALLEGATO IX –Informazioni aggiuntive fino 100 tonnellate
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-test “in vivo” (opzionale)-tossicità a dosi ripetute (28-90 gg) (opzionale)-tossicità riproduttiva: studio di fertilità su due generazioni (opzionale)
Test ecotossicologici (GLP!)-tossicità prolungata su pesce e Daphnie-identificazione dei prodotti di degradazione-studio di bioaccumulo nel pesce e studi speciali su pesci giovani-effetti sugli organismi del suolo (lombrichi, microorganismi, piante)
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Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-test “in vivo” (opzionale)-tossicità a dosi ripetute (28-90 gg) (opzionale)-tossicità riproduttiva: studio di fertilità su due generazioni (opzionale)
Test ecotossicologici (GLP!)-tossicità prolungata su pesce e Daphnie-identificazione dei prodotti di degradazione-studio di bioaccumulo nel pesce e studi speciali su pesci giovani-effetti sugli organismi del suolo (lombrichi, microorganismi, piante)
ALLEGATO X –Informazioni aggiuntive-oltre 100 fino a1000 tonnellate
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-studi supplementari-tossicità a dosi ripetute (12 mesi) (opzionale)-cancerogenesi (una specie)
Test ecotossicologici (GLP!)-altri studi di degradazione biotica-altri studi sul destino ambientale (accumulo nel suolo, etc)-tossicità a lungo termine su: -lombrichi-invertebrati-piante/ organismi deisedimenti-uccelli
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Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-studi supplementari-tossicità a dosi ripetute (12 mesi) (opzionale)-cancerogenesi (una specie)
Test ecotossicologici (GLP!)-altri studi di degradazione biotica-altri studi sul destino ambientale (accumulo nel suolo, etc)-tossicità a lungo termine su: -lombrichi-invertebrati-piante/ organismi deisedimenti-uccelli
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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I pesci sono la principale specie di vertebrati impiegata per valutazioniecotossicologiche nella sorveglianza ambientale,nel monitoraggio e nellaricerca.
Il saggio con pesci maggiormente effettuato è quello di tossicità a brevetermine che, sulla base del metodo riportato nella linea guida OCSE n° 203(1992), richiede il sacrifici di un numero elevato (da 126 a 180) di animali per lavalutazione di un solo composto chimico.
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Le colture di cellule sono un sistema di facile impiego per valutazionipreliminari di composti tossici.
Progetto ISPRA riguarda l’uso di linee cellulari di pesce per valutazioniecotossicologiche, gli aspetti metodologici sviluppati in merito al mantenimentoe alle caratteristiche di crescita della linea cellulare RTG-2(Rainbow TroutGonad).
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Progetto ISPRA riguarda l’uso di linee cellulari di pesce per valutazioniecotossicologiche, gli aspetti metodologici sviluppati in merito al mantenimentoe alle caratteristiche di crescita della linea cellulare RTG-2(Rainbow TroutGonad).
Uno dei sistemi in vitro proposto per ridurre l’utilizzo di pesci èrappresentato dalle cellule di pesce in coltura
Uno dei sistemi in vitro proposto per ridurre l’utilizzo di pesci èrappresentato dalle cellule di pesce in coltura
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
In ambito ecotossicologico sono stateimpiegate sia colture primarie che lineecellulari stabilizzate (o continue).
Queste ultime rappresentano unsistema armonizzato e di facileimpiego con una variabilitàrelativamente bassa. Il loro uso èconveniente da un punto di vistaeconomico e meno laboriosorispetto sia agli animali che allecolture primarie,sebbene talesistema cellulare risulti scarsamentecaratterizzato dal punto di vista delleproprietà cellulari e funzionali.
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Attualmente, esistono più di 150linee cellulari stabilizzate di pesce(Castaño et al., 2003). La maggiorparte sono di tipo fibroblastico oepiteliale, crescono quindi aderenti alsubstrato e hanno avuto origine datessuti di salmonidi e ciprinidi
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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Le linee cellularistabilizzate dipesce hannoalcuni indubbivantaggi tecnici:
- alcune di essepossono essereincubate atemperaturaambiente (20°C) ein atmosferanormale (quindinon è necessariol’incubatore a CO2come per le celluledi mammifero);
- possono essereconservate perlunghi periodi a 4°C per cui ilcongelamento inazoto liquido puòessere evitato;
- possono essereesposte a variematrici liquide condifferentiosmolarità
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Da molti anni, i ricercatori propongono, per valutare la pericolosità deicomposti chimici, l’uso dei saggi di citotossicità basale con cellule di pesce.Alcuni tra i metodi più frequentemente utilizzati sono: il Test del RossoNeutro (NRU, Neutral Red Uptake) e il test MTT (Tetrazolium salt reductionassay).
Da molti anni, i ricercatori propongono, per valutare la pericolosità deicomposti chimici, l’uso dei saggi di citotossicità basale con cellule di pesce.Alcuni tra i metodi più frequentemente utilizzati sono: il Test del RossoNeutro (NRU, Neutral Red Uptake) e il test MTT (Tetrazolium salt reductionassay).
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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Nonostante la risposta citotossica in vitro possa variare tra le diverse lineecellulari in funzione di differenze nell’attività metabolica o di variazioni
metodologiche(composizione del siero, tempo di esposizione, temperaturad’incubazione, modalità di esecuzione dei saggi), molti studi hanno
mostrato una buona correlazione con i risultati della tossicità acuta in vivo.In particolare, la sensibilità delle linee cellulari di pesce nel valutare la
tossicità delle sostanze chimiche, è stata studiata analizzando lacorrelazione tra i valori di EC50 in vitro (ottenuti con i diversi saggi di
citotossicità basale) e i valori di LC50 in vivo (ottenuti nel saggio acuto conpesci).
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Infatti molti studievidenziano per lamaggior parte deigruppi di sostanzechimiche sottoposte avalutazione, uncoefficiente dicorrelazione
r ≥ 0,80 (correlazionelineare positiva).
Sebbene questi risultatidimostrino unacomparabilità tra i sistemiin vitro con linee cellularidi pesce e il test acuto invivo con pesci, tuttavia, intermini assoluti, i valori diEC50 in vitro sono, inmedia, più elevati di 1-2ordini di grandezza, deicorrispondenti valori diLC50 in vivo.
Questo significa che,per indurre un effettotossico misurabile, lecolture cellulari invitro richiedonoconcentrazioni(nominali) di sostanzachimica più elevaterispetto a quellenecessarie nei saggi invivo (Fent, 2001;Kramer, 2009)
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Sebbene questi risultatidimostrino unacomparabilità tra i sistemiin vitro con linee cellularidi pesce e il test acuto invivo con pesci, tuttavia, intermini assoluti, i valori diEC50 in vitro sono, inmedia, più elevati di 1-2ordini di grandezza, deicorrispondenti valori diLC50 in vivo.
Questo significa che,per indurre un effettotossico misurabile, lecolture cellulari invitro richiedonoconcentrazioni(nominali) di sostanzachimica più elevaterispetto a quellenecessarie nei saggi invivo (Fent, 2001;Kramer, 2009)
(Bols et al., 1985; Babich et al., 1990; Castaño et al. 1994, 2003; Lange et al., 1995; Saito et al., 1991, 1993, 1994; Segner,2004; Schirmer, 2006)
Il problema della minore sensibilità è una peculiarità di tutti i sistemi in vitro in quanto tali.Infatti è stato dimostrato (Clemedson et al., 1998a, 1998b) che la sensibilità delle linee
cellulari stabilizzate di pesce è confrontabile, con quella delle cellule umane e dimammifero in coltura
Il problema della minore sensibilità è una peculiarità di tutti i sistemi in vitro in quanto tali.Infatti è stato dimostrato (Clemedson et al., 1998a, 1998b) che la sensibilità delle linee
cellulari stabilizzate di pesce è confrontabile, con quella delle cellule umane e dimammifero in coltura
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Recentemente, diversi autori hannostudiato alcune modalità per
aumentare la sensibilità dei saggi dicitotossicità con cellule di pesce,
attraverso:
la sostituzione/riduzione dellapercentuale di Siero Fetale Bovinoaddizionato al terreno di crescita
(Teneva et al., 2003; Schirmer et al.,2004; Dayeh et al., 2005)
la valutazione della concentrazioneeffettiva di composto chimico che
viene a contatto con le cellule(Gülden and Seibert, 1997; 2005;
2007)
Colture cellulari
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la selezione di endpoint citotossiciappropriati (Schirmer et al., 2000;
Shuilleabhain et al., 2004; Davorenet al., 2005; Jos et al., 2005, 2009;
Zurita et al., 2007)
l’utilizzo di batterie di saggi dicitotossicità;
l’uso combinato di diverse lineecellulari di pesce che rappresentino i
vari siti bersaglio(fegato, gonadi,branchie, cervello) dell’animale
(Knauer et al., 2007; Kramer et al.,2009)
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
In linea con le indicazioni del Regolamento REACH in merito allapromozione dei metodi alternativi in vitro e con gli adempimentiprevisti per ISPRA dal DM 22 novembre 2007, il Servizio diMetrologia Ambientale di ISPRA, ha avviato un progetto (approvatodal Comitato Tecnico di Coordinamento REACH), triennale (2010-2012), dal titolo:
“Applicazione e armonizzazione di metodi in vitro pervalutazioni ecotossicologiche delle sostanze chimiche ai
fini del Regolamento REACH: utilizzo della lineacellulare stabilizzata di pesce RTG-2
(Rainbow Trout Gonad)”
In linea con le indicazioni del Regolamento REACH in merito allapromozione dei metodi alternativi in vitro e con gli adempimentiprevisti per ISPRA dal DM 22 novembre 2007, il Servizio diMetrologia Ambientale di ISPRA, ha avviato un progetto (approvatodal Comitato Tecnico di Coordinamento REACH), triennale (2010-2012), dal titolo:
“Applicazione e armonizzazione di metodi in vitro pervalutazioni ecotossicologiche delle sostanze chimiche ai
fini del Regolamento REACH: utilizzo della lineacellulare stabilizzata di pesce RTG-2
(Rainbow Trout Gonad)”
Colture cellulari
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In linea con le indicazioni del Regolamento REACH in merito allapromozione dei metodi alternativi in vitro e con gli adempimentiprevisti per ISPRA dal DM 22 novembre 2007, il Servizio diMetrologia Ambientale di ISPRA, ha avviato un progetto (approvatodal Comitato Tecnico di Coordinamento REACH), triennale (2010-2012), dal titolo:
“Applicazione e armonizzazione di metodi in vitro pervalutazioni ecotossicologiche delle sostanze chimiche ai
fini del Regolamento REACH: utilizzo della lineacellulare stabilizzata di pesce RTG-2
(Rainbow Trout Gonad)”
In linea con le indicazioni del Regolamento REACH in merito allapromozione dei metodi alternativi in vitro e con gli adempimentiprevisti per ISPRA dal DM 22 novembre 2007, il Servizio diMetrologia Ambientale di ISPRA, ha avviato un progetto (approvatodal Comitato Tecnico di Coordinamento REACH), triennale (2010-2012), dal titolo:
“Applicazione e armonizzazione di metodi in vitro pervalutazioni ecotossicologiche delle sostanze chimiche ai
fini del Regolamento REACH: utilizzo della lineacellulare stabilizzata di pesce RTG-2
(Rainbow Trout Gonad)”
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Monostrato di cellule RTG-2 in coltura (ingrandimento 40 X).
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Scopo del suddetto progetto è la diffusione presso i laboratori delle AgenzieRegionali e Provinciali per la Protezione dell’Ambiente (ARPA/APPA) dei saggidi citotossicità basale con linee cellulari stabilizzate di pesce, in alternativa alsaggio di tossicità a breve termine con pesci .
Scopo del suddetto progetto è la diffusione presso i laboratori delle AgenzieRegionali e Provinciali per la Protezione dell’Ambiente (ARPA/APPA) dei saggidi citotossicità basale con linee cellulari stabilizzate di pesce, in alternativa alsaggio di tossicità a breve termine con pesci .
Monostrato di cellule RTG-2 in coltura (ingrandimento 40 X).
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
La corretta applicazione del Regolamento REACH prevede l’organizzazione di unsistema di controllo e vigilanza, che nel nostro Paese è stato adeguato direcente, attraverso l’Accordo tra Stato, Regioni e Province autonome di Trentoe Bolzano (29 ottobre 2009, G.U. del 7 dicembre 2009). Le regioni e provinceautonome, nell'ambito della propria organizzazione e legislazione, hanno ilcompito di individuare l'Autorità per i controlli sul REACH, e di nominare i propriesperti per il “Gruppo tecnico”, provenienti dai ruoli delle medesime Regioni/Province o delle Aziende Sanitarie Locali, ASL, o delle AgenzieRegionali/Provinciali per la Protezione Ambientale, ARPA/APPA.
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La corretta applicazione del Regolamento REACH prevede l’organizzazione di unsistema di controllo e vigilanza, che nel nostro Paese è stato adeguato direcente, attraverso l’Accordo tra Stato, Regioni e Province autonome di Trentoe Bolzano (29 ottobre 2009, G.U. del 7 dicembre 2009). Le regioni e provinceautonome, nell'ambito della propria organizzazione e legislazione, hanno ilcompito di individuare l'Autorità per i controlli sul REACH, e di nominare i propriesperti per il “Gruppo tecnico”, provenienti dai ruoli delle medesime Regioni/Province o delle Aziende Sanitarie Locali, ASL, o delle AgenzieRegionali/Provinciali per la Protezione Ambientale, ARPA/APPA.
Viene inoltre stabilito che le regioni e le province autonome, debbanoindividuare, sulla base delle strutture analitiche già esistenti, i laboratori cheeseguiranno le analisi chimiche e i saggi tossicologici ed ecotossicologici suicampioni prelevati durante le attività di controllo
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Da questo punto di vista, il progetto REACH, portato avanti dal Servizio diMetrologia Ambientale, si prefigge lo scopo di promuovere e diffondere pressoi laboratori ARPA/APPA le colture cellulari di pesce il cui uso, oltre ad aprirepossibilità di rinnovamento scientifico, potrebbe alleggerire l’impegnorichiesto alle Agenzie che si troveranno a dover eseguire i saggiecotossicologici, in particolare il saggio acuto in vivo con pesci.
Da questo punto di vista, il progetto REACH, portato avanti dal Servizio diMetrologia Ambientale, si prefigge lo scopo di promuovere e diffondere pressoi laboratori ARPA/APPA le colture cellulari di pesce il cui uso, oltre ad aprirepossibilità di rinnovamento scientifico, potrebbe alleggerire l’impegnorichiesto alle Agenzie che si troveranno a dover eseguire i saggiecotossicologici, in particolare il saggio acuto in vivo con pesci.
Il progetto prevede coinvolte direttamente : ARPA Veneto, ARPASicilia, ARPA Marche, ARPA Campania:
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Il progetto prevede coinvolte direttamente : ARPA Veneto, ARPASicilia, ARPA Marche, ARPA Campania:
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
La linea cellulare RTG-2 è stata originariamente sviluppata dalle gonadi ditrota arcobaleno
Le cellule RTG-2 possono sopportare ampie variazioni di temperatura (4 - 26°C), e possono crescere con diverse formulazioni di terreno in funzione dellemodalità d’incubazione delle cellule.
Colture cellulari
Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACH
Le cellule RTG-2 possono sopportare ampie variazioni di temperatura (4 - 26°C), e possono crescere con diverse formulazioni di terreno in funzione dellemodalità d’incubazione delle cellule.
Per studiare le condizioni ottimali di crescita (terreno e siero), la durata dellafase di latenza (lag) e il Population Doubling Time (PDT) della linea cellulareRTG-2, incubata in atmosfera normale, sono state effettuate curve di crescitacon differenti formulazioni di terreno e concentrazioni di siero, utilizzandofiasche.
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
25 cm2
25 cm2 25 cm2
Split 1:2
FRIGO 4°C75 cm2
Split 1:2
6 gg di crescita
1 settimana di crescita
1 settimana di crescita
75 cm275 cm2
Semina in fiasca grande
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Distacco con try+ 20,5 ml di terreno
Distacco con try+ 20,5 ml di terreno
Conta 0,5 + 19,5Miscelare in un’unica fiasca(volume tot. 40 ml) = SCp
SM
75 cm275 cm2
In beuta:110 ml con 400,000 ±
50,000 cells/ml
3 Conte1+ 19 Foglio Excell:
400,000 ± 50,000
SIINOCULO nelle 20 fiaschette
e inizio crescita
NO
Aggiustamenti SM eripetizione delle 3 conte
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Curve di crescita cellulare: I fase disperimentazione
Curve di crescita cellulare: I fase disperimentazione
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Curva di crescitaTerreno: E-MEM (con sali di Hank’s, NEAA e L-Glu)senza sodio bicarbonato, siero FBS 10%, P/S 50UI/50µg/ml; Contenitori: Piastre multipozzetto da 24;PDT: 2,5 giorni
Curva di crescitaTerreno: E-MEM (sali di Earle) senza sodiobicarbonato,siero FBS 10%, Neomicina solfato 5g/L, NEAA 1%;Contenitori: piastre multipozzetto 24; PDT: 2,1 giorni
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
Curve di crescita cellulare: I fase disperimentazione
Curve di crescita cellulare: I fase disperimentazione
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Curva di crescitaTerreno: E-MEM (sali di Earle) senza sodiobicarbonato,siero FBS 10%, Neomicina solfato 5g/L;Contenitori: fiasche da 25 cm2; PDT: 2,1
giorni
Curva di crescitaTerreno: E-MEM (con sali di Hank’s, NEAA e L-Glu)senza sodio bicarbonato, siero FBS 10%, P/S 50UI/50µg/ml; Contenitori: Piastre multipozzetto da 24;PDT: 2,5 giorni
6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi
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