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Metodi di Conferma per la rivelazione delle SE nel cibo: ELISA quantitativa e spettrometria di massa
Sabine Herbin, Anne-Laure Prufer, Annick Ostyn, Jac ques-Antoine Hennekinne
Unità Caractterizzazione delle tossine, equipe tossi ne battericheLR-UE per CPS
V workshop del laboratorio nazionale di riferimento (NRL) per gli stafilococchi coagulasi positivi compreso S. aureus
14 - 15 giugno 2012, Torino
���� Exoproteine prodotte da ceppi CPS enterotossigenici
(principalmente S. aureus)
La capacità di produzione dipende dal ceppo: da 1 ng/mL a piu’ di 1µg/mL
���� Proteine preformate in cibi ad alto contenuto proteico
���� MW: da 22 a 30 kDa
���� Attualmente ci sono piu’ di 20 SE descritte (SEA ����
SElV)
La rivelazione di solo 5 delle 20 é possibile grazie à kit
disponibili nel commercio!
���� Presenza tra le SE di sequenze altamente conservate
ricche di AA (SEA e SEE, SEB e SEC)
Ono et al., 2008
30 81 % AA homology
Caratteristiche delle enterotossine stafilococciche (SE)
2
•• BioBio--assays (test animali e cellulari) assays (test animali e cellulari)
•• Biologia molecolare Biologia molecolare (PCR, RT(PCR, RT--PCR, iqPCR) PCR, iqPCR)
•• Immunologia diagnostica Immunologia diagnostica (RPLA, ELISA, ELFA)
•• Spettrometria di massaSpettrometria di massa
-- 2D PAGE/Maldi ToF2D PAGE/Maldi ToF
-- nanoLC/MS/MSnanoLC/MS/MS
Rivelazione delle SE : quali mezzi ?
3
ELISA quantitativa
Contesto generale:
� Dagli anni ‘80 al 2010,
� LRUE usa l’ELISA quantitativa con degli anticorpi “made by hand” per rivelare e
quantificare le tossine di tipo A, B, C, D, E.
� Questi anticorpi non sono disponibili nel commercio (non accessibili) …
� … Grazie al progetto francese « UMT TERESA » é stata sviluppata una ELISA
quantitativa che usa anticorpi disponibili nel commercio per quantificare SEA, B, C, D
e SEE . Questo metodo é utilizzato in rutine dall’LRUE per i ceppi CPS
� Tale metodo deve esser trasferito ai centri tecnici francesi e ai LNR
� Perche si usa questo metodo ?
� La risposta é veloce (1 giorno) nel caso di intossicazioni alimentari stafilococciche
colletive o di controlli ufficiali : per informazione personale � non c’é bisogno di
spedire i campioni al LRUE per i ceppi CPS
� Questo metodo sarà usato su del materiale certificato di riferimento per
l’assegnazione di un valore di referimento
Metodo ELISA quantitativa: criteri sviluppati
� Scelta degli anticorpi piú competitivi tra tutti gli anticorpi disponibili in
commercio
� Sviluppo del protocollo ELISA quantitativa usando sia il metodo diretto
che indiretto ("single and double sandwiches“)
� (a seconda della tossina)
� I risultati ottenuti con gli anticorpi disponibili nel commercio sono stati
confrontati ai risultati ottenuti con gli anticorpi “made by hand”:
� Ottimizzazione delle concentrazioni usate
� Curva di taratura (gamma standard)
� Valori di LOD e LOQ (limite di rivelabilità e limite di quantificazione)
� Reazioni crociate con altre tossine (test effettuati alla concentrazione di 4ng/ml)
� reazione crociata tra SEA e SEE / e viceversa reazione crociata tra SEE e SEA
� Analisi di alimenti naturalmente e artificialmente contaminati
� 2 schemi diversi d’ELISA quantitativa usando una piastra PCR da 96 :
1/metodo diretto (per SEB); 2/metodo indiretto (per SEA, SEC, SED e SEE)
Metodo ELISA quantitativa: informazioni generali
Ab anti-SE labeled
with peroxydase
Metodo diretto(Single
Sandwich)
Ab anti-SE
GARPOX (Ab labeled with peroxydase)
Metodo
indiretto (double
sandwich)
Substrat + chromogen (ABTS)
Colore blu/verde e lettura della
piasta a 405/630 nmCapture Ab
Concentrated treated extract
Nota: corrisponde all’anticorpo; l’anticorpo deve esser verificato prima dell’uso
Concentrated treated extract
Capture Ab
Metodo ELISA quantitativa: Esigenze
� Se il metodo é realizzato per la prima volta:
�é necessario utilizzare degli anticorpi che siano stati già provati e la cui
concentrazione sia stata verificata dal LRUE
� I LNR devono provare ogni nuovo lot di anticorpi e di tossine e, devono
comparare i risultati con quelli ottenuti con i lot precedenti
� Il metodo d’ELISA quantificativa deve essere realizzato e quindi valutato anche su
alimenti naturalmente contaminati
� Fare attenzione a:
� I reagenti selezionati (ogni nuovo lot ricevuto deve esser provato e confrontato a quelli usati
precedentemente)
� Il tipo di piastra usata
� I tamponi di lavaggio
� Il tempo, la temperatura, la velocità di miscelazione per l’incubazione delle piastre
Metodo ELISA quantitativa – conclusioni e prospettive
� La 1a formazione sulla ELISA quantitativa é prevista nel 2012
� Sviluppo di un test ELISA per la rivelazione di SEG e SEI (numerosi SFPO in
Francia contengono i geni seg e sei !)
� Validazione del metodo ELISA quantitativa secondo la norma francese
AFNOR NF V03-110 :
� La validazione richiede molte analisi e quindi molto tempo !
� Validazione di 5 tipi di cibi e di 5 tossine (SEA, B, C, D e SEE) :
� Piú di 1000 analisi sono necessarie per realizzare la validazione!
� Partecipazione collettiva dei diversi LNR (ciascuno responsabile della
validazione per un alimento)(un po’ per ciascuno non fa male a
nessuno):
questo tipo d’organizzazione é stata menzionata al workshop di
Malta in modo da attirare l’attenzione dei LNR (23 to 25th May 2012)
Spettrometria di massa per la rivelazione e/o la
quantificazione delle SE
Spettrometria di massa: quali benefici ?
• Obbiettivo: sviluppare e validare un metodo che usi un principio diverso dall’EIA per rivelare specificatamente e quantificare le SE in campioni complessi (surnatante di cultura, camplioni di alimenti …)
• Principio: identificare peptidi specifici (ottenuti dalla digestione tripsinica delle tossine) grazie alla sequenza AA, al loro tempo di ritenzione et alla proporzione m/z
Vantaggi MS vs EIA:
- Alta specificità (tutte le SE potrebbero esser identificate se le loro sequenze fossero disponibili nelle banche dati)
- Un’alta sensibilità (LOD : fM, aM)
Svantaggi MS vs EIA:
- Bisogno di standard altamente purificati per la quantificazione
- Il costo dell’apparecchiatura (400 k€!) e delle analisi ( > 200 €) é elevato
- Il tempo di preparazione dei campioni e delle analisi (4 giorni vs 1,5 giorni)
12
Il metodo scelto per identificare i peptidi: MRM =
Multiple Reaction Monitoring
• Q1 seleziona uno ione [M+H]+
• Q2 frammenta lo ione selezionato
• Q3 identifica uno solo di questi frammenti (detto
anche “ione di transizione”)
Come funziona? Rivelazione e quantificazione
N2 CAD GasPrecursor ion selection
Fragmentation
Q0 Q1 Q2 Q3
Ion transition selected
Strategia globale della spettrometria di massa
1- Disegnare in silico dei peptidi specifici (provenienti dalla digestione
delle SE con la tripsina)
2- Scelta della straregia quantitativa, acquisto / creazione degli standard
3- Estrazione / concentrazione e purificazione
4- Digestione con la tripsina su gel
5- Cromatografia separativa
6- Identificazione / Quantificazione
Da 1 a 6 : nanoLC/ESI/MS/MS : per campioni complessi
1, 3, 4, 6 : Maldi ToF : per campioni purificati
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 mass 0
100
%
147.1
361.2 474.3
603.3 731.4
802.4
903.4 1002.5
1115.6 1243.7
Enterotoxin H (SEH)– S. aureus. 218 aa
(25210 da / 5.6)
… fk nk nvdiygasfyyk cek isenisecly ggttlnsek laqer viganvwvdgiqk etelir tnk k nvtlqeldik irk ilsdk yk iyyk dseisk gliefdmk tprdysfdiydlk gendyeidk iyednk tlk sddishidvnlytk k k v
CPS strainGenotype (sea
à seu)Accession number (Swiss-Prot Trembl)
Description
379 F seh
ATL_STAAC Bifunctional autolysin precursor [Includes: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase - Staphylococcus aureus (strain COL)
ETXH_STAAU Enterotoxin type H precursor - Staphylococcus aureusGPMA_STAAB 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase
Q1Y2T4_STAAU Aldo/keto reductase
SODM_STAXY Superoxide dismutase [Mn/Fe]
Esempio 2D PAGE / Maldi ToF : analisi di un surnatante (BHI) di cultura CPS
1- Costruzione di un peptide "trypsico": esempio per SEA
Brun et al. (2007) Mol Cell Proteomics 6 (12) 2139-2149.
Brun et al. (2009) Journal of proteomics. 72:740-749
2- Scelta della strategia quantitativa (1/2)
3 strategie quantificative al confronto(SEA / urine)
Brun et al. (2007) Mol Cell Proteomics 6 (12) 2139-2149.
���� La strategia PSAQ é stata scelta!
2- Creazione degli standard (2/2)
2.2 Digestione dell’isotopo della SE con la tripsina
2.3 Analisi NanoLC/MS/MS dei peptidi trypsici della SE per determinare la loro sequenza, il loro tempo di ritenzione e il rapporto m/z
2.1 Clonaggio, espressione e
purificazione di SE (RTS 500 ProteoMaster E.
coli HY kit).
Uso di [13C6, 15N
4] L-Arg & [13C
6, 15N
2] L-Lys per
ottenere l’isotopo di SE
• Per ogni SE, bisogna caratterizzare 2 peptidi specifici per effettuare l’identificazione e quantificare (idealmente 3 peptidi):
18
SE type Peptides selected
SEAQNTVPLETVK
NVTVQELDLQAR
SEBIEVYLTTK
VTAQELDYLTR
SECSVTAQELDIK
TELLNEDLAK
SEDVSYDLFDVK
LYNNDTLGGK
SEEEVTVQELDLQAR
ESDDQFLENTLLFK
SEGFATADLAQK
GENDYEIDK
• Per ogni peptide, 1, 2 o 3 frammenti sono
ricercati specificatamente per esser sicuri
d’identificare correttamente la proteina,
esempio con SEA/SEA*:
Peptid
selected
Ion parent
(m/z)
Ion fragment
(m/z)
CE
(eV)
QNTVPLETVK 564,82 686,433,4
QNTVPLETVK* 567,82 692,4
NVTVQELDLQAR 693,37
487,3
39,8
972,5
1172,6
NVTVQELDLQAR
*696,37
493,3
978,5
1178,63
Definiion: m/z = mass of ion / charge of the ion
CE = Collision energy
• Per quantificare, scegliere tra frammenti diversi
Come funziona? Rivelazione e quantificazione
Progetto PSAQ - Risultati
19
Esempio dei risultati per SEA/SEA* (soluzioni standard):
Peptide 1:
QNTVPLETVK for SEA and
QNTVPLETVK* for SEA*
Peptide 2:
NVTVQELDLQAR for SEA and
NVTVQELDLQAR* for SEA*
1 ion fragment / peptide
followed
3 ion fragments / peptide followed
3- Estrazione / concentrazione (DC) e purificazione
Obbiettivo : estrarre e concentrare le SE (concentrazione via dialisi), poi purificare via l’immunocattura (colonne o biglie) per eliminare tutte le proteine non pertinenti e concentrare le SE
+
100 ng100 ng
ArgArg LysLys
TrypsinTrypsin
PSAQ 1
Cheese contaminated by a CPS strain
encoding for sea / sed / sej / ser genes
100 ng
21
y = 3,0411x + 0,103R2 = 0,9866
y = 4,144x + 0,087R2 = 0,8859
y = 0,6038x + 0,047R2 = 0,9995
y = 0,4124x + 0,083
R2 = 0,9969
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25
[SE] ng/mL
Abs
U.A
. (40
5/63
0 nm
)
Gamme SEA Gamme SEBGamme SED Gamme SEC
Linéaire (Gamme SEA) Linéaire (Gamme SED)
Linéaire (Gamme SEC) Linéaire (Gamme SEB)
Esempio SEA / formaggio (1/3)Studio di fattibilità
4
5
6- Esempio SEA / formaggio (2/3)
AL IM T O X _ 1_A (2+ 8 )
m /z693 69 4 69 5 696 69 7 69 8 6 99 700 701
%
0
10 0
U F 87 11 1 345 (29 .96 8 ) T O F M S E S + 4826 9 8 .3 1
4 82
6 9 3 .3 33 2 5
6 9 3 .3 130 8
6 9 3 .2 11 8 2
6 9 2 .9 67 3
6 9 2 .3 37 2
69 8 .2 22 7 5
6 9 3 .8 22 1 8
6 9 3 .7 51 7 3
6 9 3 .6 91 2 6
6 94 .3 31 7 6
6 9 7 .871 0 8
69 4 .8 41 0 76 9 4 .7 7
1 0 46 9 5 .28
9 46 94 .8 9
7 3
69 6 .2 99 3
6 9 5.3 48 5 6 9 6.1 8
6 36 9 5 .6 6
6 3
6 9 5 .9 44 7
6 9 7 .3 37 9
6 9 7 .2 574
6 9 6 .8 15 4
6 9 6 .6 94 9
6 9 8 .3 34 6 8
6 9 8 .8 535 2
6 9 8.8 33 4 0
6 9 8.8 03 2 3
6 9 8 .7 82 8 6
6 9 8 .6 71 31
6 9 9 .3 12 7 2
6 9 9 .2 72 63
69 9 .2 01 4 6
69 9 .3 52 2 4
6 9 9.8 01 6 3
6 9 9 .741 0 7 7 0 0 .3 0
1 0 7
7 0 1 .186 57 0 0 .6 5
6 37 0 0 .9 5 ;5 6
SEA native trypsic
peptide
3774
SEA PSAQ 1 trypsic
peptide
6179
ESI + spectrum after injection of trypsic peptides on C18 column (75µm x 150mm).
Elution par ACN (10 – 80 %) / Acide formique (0.1 – 0.08%). Flow rate 200 nL/min.
[SEA] = (3774 / 6179) *100
= 61.1 ng dans 25 g
= 2.4 ng/g
12C / 14N
m
13C / 15N
m’ = m + ∆∆∆∆m
∆∆∆∆m
22
6 - Esempio SEA / formaggio (3/3)
sample CPS strain PCR result
RPLA
result
(BHI )
ELISA/ELFA results on
concentrated extractQuantitative ELISA
result on
concentrated extract
(ng/g)
nanoLC/MS/MS
result
(ng/g)ELISA ELFA
Cheese361 F
3.108 cfu/g
S.aureus
sea / sed / sej
SEA +
SED ++ +
SEA = 2.9 ±±±± 0.3 *
SED = 4.6 ng/g
SEA = 2.4 ±±±± 0.2
*/**
* : n = 3
** : quantification usingPSAQ1
Hennekinne et al. (2009) Appl Environ Microbiol 75 (3) 882-884
Dupuis et al. (2008) Proteomics 8 (22) 4633-4636
23
� Risultati soddisfacenti nel formaggio
�Questo metodo é stato applicato a dei campioni proveniti
da intossicazioni alimentari stafilococciche collettive
Lavoro realizzato e prospettive
� Realizzazione del metodo all’Anses
� PSAQ SEA*, SED*, SEE*, SEH* già disponibili, SEB*, SEC* e SEG*
prossimamente disponibili
� Ottimizzazione delle condizioni MS (DP, CE)
� Prospettive e azioni dell’EURL CPS:
� Parametri della digestione con la tripsina (attesi per Giugno
2012)
� Ottimizzazione della tappa di immunocattura (attesa per
l’estate 2012)
� Esecuzione del metodo per un tipo di PSAQ in campioni di
cibo artificialmente e naturalmente contaminati (2012-2013)
� Esecuzione del metodo per varie PSAQ in campioni di cibo
(artificialmente e naturalmente contaminati ) (2012-2013)
� Validazione del metodo secondo la norma francese NF V03-
110 (2014?)
Hennekinne et al. (2011) FEMS microbiol rev. DOI: 10.1111/j.1574-69 76.2011.00311.x.
Staphylococcal enterotoxinstraductiontranscription
se mRNA
RT-PCR
ELISA and/or RPLA
CPS counts
SEA to SEE detection
ELISA
se genes
Broth culture
PCR
DC and IA coupled to
nanoLC/ESI/MS
2D PAGE coupled to Maldi ToF
A L IM T O X _1_ A ( 2+ 8)
m /z6 9 3 6 94 69 5 6 9 6 6 9 7 6 98 69 9 7 0 0 7 0 1
%
0
1 00
U F 8 7 1 1 1 34 5 (2 9. 9 68 ) T O F M S E S+ 48 26 98.3 1
482
693 .3332 5
693 .3130 8
69 3.2 1182
69 2.9 673
692 .3372
698 .2227 5
693 .8221 8
69 3.7 5173
6 93.6 9126
694 .3317 6
697 .8710 8
69 4.841 0769 4.7 7
10469 5.2 8
94694 .89
7 3
6 96. 2993
69 5.3485 69 6.18
6 3695 .66
6 3
695 .944 7
697 .337 9
69 7.2574
696 .8154
69 6.6 949
69 8.334 68
6 98.8 5352
6 98. 8334 0
698 .8032 3
698 .7828 6
69 8.671 31
699 .3127 2
69 9.272 63
69 9.2 0146
699 .3522 4
69 9.8 01 63
6 99.7 4107 7 00. 30
107
7 01. 186570 0.6 5
63700 .95 ;56
Grazie per la vostra attenzione !